Microscopia - ubacbcbio54mercedes
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Microscopia . Existen diversas formas de investigar el universo celular. Seguidamente describiremos algunas de ellas: Microscopía Optica Los microscopios ópticos están formados básicamente por estructuras de tipo mecánico, un sistema de lentes y una fuente luminosa. En el sistema óptico están integrados 3 tipos de lentes: el condensador, el objetivo y el ocular. Por el condensador pasa un haz de luz (producida por una lámpara y desviada generalmente por un espejo ) que incide sobre el objeto que se quiere estudiar. El objetivo aumenta la imagen de la pieza proyectándola sobre el ocular. Los objetivos son intercambiables de acuerdo al aumento que se necesite para ver un objeto determinado. El ocular aumenta más la imagen del objeto y a su vez la proyecta sobre el ojo (o os ojos si es un microscopio binocular) de la persona que observa. Al igual que el objetivo los oculares también son intercambiables. Marcha de rayos y formación de imágenes en el microscopio óptico. Existen diferentes tipos de instrumentos que se utilizan en microscopía óptica según lo que se quiera observar. La lupa binocular o estereomicroscopio permite una visión en relieve, ampliada, de pequeños objetos tanto trasnparentes como opacos. En biología se utiliza para visualizar en detalle partes de individuos visibles al ojo desnudo, como ser: artrópodos, algas, hongos,cigotos de anfibios, etc. El microscopio óptico común se utiliza para observar células o tejidos, vivos o postmortem,de un tamaño que varía entre 100 y 0,1 micrómetros aproximadamente. Este tipo de material requiere el empleo de una técnica específica, la técnica histológica, que consta de los siguientes pasos: a) Obtención de la muestra: debe hacerse con instrumental adecuado y con mucho cuidado para no dañarla. b) Fijación: es el procedimiento destinado a impedir la autodegradación enzimática de las células tratando de evitar, en lo posible, la alteración de las estructuras originales. Pueden utilizarse fijadores químicos como el formol, el alcohol etílico (100%), el alcohol metílico o mezclas fijadoras. También se utilizan métodos físicos como la desecación, el calor seco, el frío o la congelación. c) Deshidratación: tiene por objeto retirar el agua de las piezas fijadas para que, luego, puedan ser incluidas en un elemento que es insoluble en solventes acuosos, se logra realizando pasajes sucesivos por alcoholes de concentración creciente: alcohol 70%, alcohol 96% y alcohol 100%. d) Aclaración: consiste en impregnar la muestra con un solvente no acuoso, soluble en parafina, como el xileno, el tolueno o el benceno. Se realiza para eliminar de la misma los restos de alcohol y toda sustancia hidrosoluble que pueda contener. e) Inclusión: se incluye el material en parafina o celoidina previamente calentada, la que al solidificarse sirve de sostén de la muestra y posibilita su corte, se forma así el “taco”. f) Corte: debe ser lo suficientemente delgado como para ser atravesado por la luz, esto se obtiene mediante la utilización de un micrótomo que realiza cortes uniformes del espesor deseado. g) Rehidratación: se realiza retirando la parafina con xilol y, luego, lavando con alcoholes de concentración decreciente, ya que los colorantes son solubles en agua, lo que hace indispensable rehidratar la muestra. h) Coloración: es el proceso por el cual las células o tejidos toman una coloración que permite mayor contraste y facilita su observación. Existen distintos tipos de coloración que se utilizan en forma diferencial dependiendo del material y de lo que se desee estudiar, la más común es la coloración con hematoxilina-eosina que tiñe los núcleos de azul y el citoplasma en rosa. i) Montaje: es la colocación del corte en un portaobjetos. Para proteger el preparado se utiliza un cubreobjetos que se adhiere con el uso de selladores, de esta manera, el preparado se puede conservar durante décadas. El microscopio de contraste de fase es útil para observar componentes de células vivas. Las ondas luminosas al incidir sobre el objeto se difractan originando un desfasaje de las ondas que provoca distintos grados de interferencias entre ellas. Este fenómeno es acentuado por un sistema óptico especial, de manera que la amplitud de luz de ondas procedente de diversos componentes celulares es diferente, por lo tanto el ojo las ve como objetos más claros o más oscuros unos de otros. El microscopio de interferencia también se usa para estudiar células vivas y se basa en elmismo fenómeno de desfasaje e interferencia de las ondas luminosas, pero a diferencia el haz luminoso se divide en dos, uno atraviesa el objeto y el otro pasa alrededor del mismo. Elprimero al difractar sufre una modificación de fase y va a llegar al objetivo retrasado con respecto al segundo. Como el retraso es una función del índice de refracción y del grosor de la muestra, el valor del retraso se puede usar para determinar la masa por unidad de superficie del preparado y por lo tanto la masa de los elementos celulares individuales. El microscopio de campo oscuro se emplea en el estudio de partículas pequeñas y su principal aplicación clínica es en la determinación del Treponema pallidum, espiroqueta que produce Sífilis. Se basa en la utilización de un condensador especial, de manera que la luz no llega directa al objetivo sino desviada o esparcida por las partículas pequeñas que se investigan. Es el mismo fenómeno por el cual se visualizan las partículas de polvo por la dispersión que realizan de la luz de un rayo de sol. El microscopio de luz ultravioleta posee un sistema óptico construido en cuarzo que permite el paso de los rayos ultravioletas (UV), pero como éstos son invisibles la formación de la imagen se registra sobre una película fotográfica. Este microscopio es útil para localizar ácidos nucleicos debido a la propiedad que poseen de absorber los rayos UV de una longitud de onda específica (260 nm) El microscopio de luz polarizada ofrece información sobre la estructura a nivel molecular de células y tejidos, tanto en preparados post-mortem como en células vivas. Posee un sistema de filtros que polarizan (luz que gira exclusivamente en un plano) el rayo luminoso, de manera que luego de atravesar el objeto se divide en dos componentes de distinta velocidad o no se divide, según sea la orientación y distribución de las moléculas en las estructuras estudiadas. Microscopía Electrónica - Técnicas La microscopía electrónica se aplica al estudio de estructuras muy pequeñas, hasta 10 Angstrom, o también cuando se necesita observar organoides aislados enteros. Existen dos tipos de microscopios electrónicos, el de Transmisión (MET) y el de Barrido (MEB), ambos son similares en cuanto a la fuente de energía, el tubo y sistema de lentes, pero en el MEB el haz de electrones no atraviesa el espécimen sino que recorre toda la superficie del mismo y al reflejarse proyecta en una pantalla de televisión todas las irregularidades que presenta dicha superficie, dando una imagen tridimensional de las estructuras en estudio. Las principales diferencias estructurales y de funcionamiento entre el microscopio óptico (M.O.) y el electrónico (M.E.) se muestran en el siguiente cuadro: MICROSCOPÍA ÓPTICA MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA Fuente de Energía Luz visible Haz de electrones Sistema de Lentes Cristal o Cuarzo Bobinas electromagnéticas Tubo No requiere vacío Requiere alto vacío Poder de resolución 0.2 micrómetros 0.2 nanómetros Aumento 500 veces más 500.000 veces más Las principales diferencias estructurales y de funcionamiento entre el microscopio electrónico de transmisión (M.E.T.) y el de barrido (M.E.B.) se presentanen el siguiente gráfico: . La técnica utilizada para observar una preparación en el MET es la siguiente: a) Fijación: se puede realizar con paraformaldehído, con tetróxido de osmio, y últimamente con glutaraldehído, en soluciones acuosas de pH neutro y concentración salina semejante al medio; luego se lava la pieza y se postfija con tetróxido de osmio durante una hora, el osmio reducido se une a estructuras lipoproteicas (membranas celulares) ofreciendo mayor contraste en la imagen, esto se conoce como coloración o contrastado. b) Deshidratación: con alcohol o acetona de 50ºC ó 100ºC durante 10 a 15 minutos cada baño. c) Inclusión: se utilizan resinas sintéticas tipo epoxi que luego de secarse se transforman en un material muy duro, apto para efectuar cortes extremadamente delgados. d) Corte: se efectúa con un ultramicrótomo que posee una cuchilla de vidrio y produce cortes de 20 a 100 nm de espesor. e) Montaje: en pequeñas grillas de cobre. f) Contrastado: con acetato de uranilo, citrato de plomo u otras sustancias. La observación de especimenes en el MEB requiere una técnica histológica especial. Luego de obtener la pieza se lava en solución buffer, se fija y se deshidrata con acetonas o alcoholes de 50 a 100 grados. Posteriormente, se procede a desecación y, por último, se depositan sales de plata u oro en su superficie para realizar el sombreado, lo que crea el efecto de tridimensionalidad. Métodos de cultivo en laboratorio Tal como postula la “ teoría celular” todos los organismos vivos están compuestos por células y productos celulares. Para poder estudiar el comportamiento (crecimiento, reproducción, metabolismo) de estas células se recurre al método de cultivo en laboratorio, que puede involucrar a células libres o tejidos. El cultivo de células consiste en la extracción de los ejemplares de interés (bacterias, protistas, hongos o algas unicelulares, etc.) de su medio natural, mediante el uso de jeringas o pequeñas pipetas. Luego se los coloca en recipientes de vidrio esterilizados (libres de todo tipo de microorganismos) que contengan un medio de cultivo apropiado. Este consiste en una mezcla de nutrientes que puede ser líquida, sólida, o líquida y sólida (medio bifásico), según el organismo que se desea cultivar. Es importante cerrar herméticamente el recipiente de cultivo para evitar la contaminación por gérmenes provenientes del medio ambiente. Muchas veces se procede a agregar unas gotas de antibiótico al medio de cultivo para asegurar su condición aséptica. Otros factores a tener en cuenta son: la oxigenación de las células, la temperatura de crecimiento y la renovación periódica del medio de cultivo. Para asegurar una adecuada provisión de oxígeno a organismos aeróbicos debe elegirse un recipiente tal que el volumen del medio de cultivo ocupe sólo 1/3 del volumen total del recipiente; así los 2/3 del volumen restante contendrán aire estéril. La temperatura de crecimiento dependerá del tipo de células a cultivar: para bacterias suelen colocarse los recipientes en estufas a 37ºC mientras que para cultivo de Trypanosoma cruzi la temperatura adecuada es 28ºC. En todos los casos, el aumento del número de células del cultivo ocasiona el agotamiento de nutrientes y la acumulación de productos de deshecho, por esto es necesario renovar el medio de cultivo en forma periódica manteniendo, estrictamente, las condiciones de asepsia y de oxigenación. El cultivo de tejidos implica la extracción de trozos muy pequeños de tejido vivo bajo Esquema rigurosas condiciones de esterilidad, luego se los coloca en un medio apropiado de cultivo a 37º C ó 38º C, manteniendo condiciones adecuadas de humedad y oxigenación. Para evitar la acumulación de productos de deshecho del metabolismo celular que resultan tóxicos para el tejido cultivado, se procede al lavado aséptico del cultivo con solución salina esterilizada y el agregado, nuevamente, de medio fresco. También puede realizarse un repique (clonación) consistente en tomar pequeñas porciones de tejido desarrollado o simplemente una célula y colocarlas en un nuevo medio de cultivo preparado como el original. Estos procedimientos repetidos periódicamente pueden prolongar hasta cincuenta generaciones la vida del tejido cultivado. A fin de evitar la contaminación de los cultivos de laboratorio, debe trabajarse en condiciones de perfecta esterilidad. Esto se logra mediante el uso de cámaras o cuartos aislados e iluminados con tubos U.V. (ultravioleta) que sólo se desconectan en el momento de trabajar dentro de la cámara, ya que la luz U.V. resulta nociva tanto para los seres humanos como para las células y/o tejidos a cultivar. Para acceder a estas cámaras es necesario el uso de barbijo y ropa esterilizada. Un equipo especial filtra el aire que circula en la cámara y lo mantiene libre de contaminación. Los recipientes de cultivo más comúnmente utilizados son: Caja de Petri: caja cilíndrica de vidrio de alrededor de 1,5 cm de altura con tapa hermética de vidrio. Se utiliza, en general, para bacterias en medio de cultivo sólido. Roux: botellón de vidrio con tapón aislante que se usa en posición horizontal con medio de cultivo líquido o bifásico. Posibilita una mayor superficie de cultivo. Erlenmeyer: recipiente de vidrio con tapón aislante, ideal para medio líquido aunque también puede utilizarse con medio bifásico. Tubo de ensayo: tubo de vidrio que se usa con medio líquido a 45ºC para aumentar la superficie de intercambio de oxígeno. Para seguimiento y control del número de células de un cultivo, se recurre al conteo de las mismas, proceso que se realiza periódicamente extrayendo una microgota de volumen conocido de cultivo que, luego, se diluye y se observa a microscopio óptico para proceder al conteo y posterior construcción de la curva de crecimiento poblacional. Materiales para el laboratorio : a: vaso de precipitado, b: erlenmeyer, c: balón, d: vidrio de reloj, e: gotero, f: embudo, g: soporte con tubo de ensayo, h: termómetro, i: mechero, j: botellón con tubo aireador, k: probeta graduada y l: mortero. Fraccionamiento celular Si bien mediante la microscopía se pueden estudiar los componentes celulares (organelas), el estudio detallado de estos requiere un análisis más minucioso, para el cual la microscopía óptica resulta insuficiente. Así como los tejidos pueden ser separados en sus células constituyentes, también éstas pueden ser separadas en sus organelas funcionales y macromoléculas. Con el fin de aislar los diversos componentes celulares se han desarrollado diversas técnicas para romper las células, permitiendo que las organelas salgan sin dañarse y, así, poder estudiarlas en detalle. Las células pueden romperse de varias maneras: por shock osmótico, por vibración con ultrasonido, haciéndolas pasar por un pequeño orificio o bien, moliéndolas. Este procedimiento rompe gran parte de la membrana celular en fragmentos que se cierran formando vesículas selladas, permitiendo de esta forma que se liberen organelas tales como el núcleo, mitocondrias, sistema de Golgi, lisosomas y peroxisomas, el método no tiene que ser tan drástico como para romper también las membranas de las organelas. El resultado es un extracto celular soluble y espeso denominado “homogenato” formado por diversos componentes que poseen distintos tamaños, carga y densidad. La separación de estos componentes se logra mediante el uso de una centrífuga, donde los extractos celulares son expuestos a altas velocidades de giro para que las organelas se separen por acción de la fuerza centrífuga. Esta técnica se denomina fraccionamiento celular y es útil para separar componentes de muy distintos tamaños, en general, las unidades mayores experimentan mayor fuerza centrífuga y se mueven más rápidamente. Una separación más fina se logra llenando el tubo de la centrífuga con una dilución salina y poniendo la muestra en la boca del tubo. Las técnicas de separación preservan la función de varios componentes celulares, no siendo así en los análisis bioquímicos, que requieren una rotura de la anatomía de la célula. Según la velocidad de centrifugación las organelas se depositan en diferentes niveles de acuerdo a su peso, produciendo un sedimento o “pellet”, lo que no sedimenta es el sobrenadante. Cuanto más chico es el tamaño de la partícula, mayor debe ser la fuerza centrífuga para que sedimente. A velocidades relativamente bajas, sedimentan los núcleos y las células rotas, a velocidades más altas, sedimentan las mitocondrias y, con un período más largo de centrifugado, precipitan los ribosomas. Todas las fracciones que sedimentan tienen impurezas y, por eso, deben someterse a sucesivas centrifugaciones con el fin de purificarla, esto se logra resuspendiendo el pellet y repitiendo la centrifugación. La velocidad a la que sedimenta cada componente se expresa como “coeficiente de sedimentación (S)” dependiendo del tamaño y la forma de la partícula. Algunas centrífugas pueden alcanzar velocidades de hasta 80.000 revoluciones por minuto (rpm), produciendo fuerzas de hasta 500.000 veces la de gravedad. Estas velocidades permiten separar no sólo las organelas sino, también, macromoléculas relativamente pequeñas. Algunas centrífugas pueden alcanzar velocidades de hasta 80.000 revoluciones por minuto (rpm), produciendo fuerzas de hasta 500.000 veces la de gravedad. Estas velocidades permiten separar no sólo las organelas sino, también, macromoléculas AUTOEVALUACION – MACAR CON UNA X 1. La teoría del Big Bang se refiere a: a. El origen de los seres vivos. b. El origen del universo. c. El origen de las células procariontes. d. El origen de las células eucariontes. 2. La Teoría Celular, fundamento de la Biología moderna, postula que: a. Algunos seres vivos pueden desarrollarse espontáneamente a partir de sustancias del medio ambiente. b. La vida comenzó con un evento semejante a una gran explosión hace 10 ó 20 mil millones de años. c. Los primeros seres vivos fueron procariontes autótrofos y anaeróbicos d. En la actualidad, toda célula se origina a partir de otra preexistente. 3. Se llama homeostasis a la capacidad que poseen los seres vivos para: a. Elaborar sus propias estructuras y auto reproducirse. b. Mantener su medio interno relativamente constante. c. Reaccionar ante las señales que perciben de su entorno. d. Intercambiar permanentemente materia y energía con su entorno. 4. Indique la opción que ordena en forma decreciente, según sus niveles de organización, los siguientes ejemplos: a. Protón – agua – carbono – prión bacteriófago – Escherichia coli – caballo. b. Caballo – Escherichia coli – bacteriófago – prión – agua – carbono – protón. c. Caballo– Escherichia coli– prión – bacteriófago– agua –- carbono protón. d. Protón – carbono – agua – prión – bacteriófago – Escherichia coli –caballo. 5. Señale la opción correcta respecto del ciclo de multiplicación viral: a. Todos los virus siguen ciclos líticos. b. Todos los virus siguen ciclos lisogénicos. c. El ácido nucleico viral ingresa totalmente a la célula en la etapa de contracción. d. El material genético del virus ingresa totalmente a la célula en la etapa de penetración. 6. Un organismo pluricelular, capaz de utilizar el CO2 atmosférico para fabricar azúcares, se clasifica dentro del reino: a. Fungi b. Plantae c. Animalia d. Protista 7. Qué tienen en común una célula eucarionte vegetal y una célula animal: a. Membrana celular y cloroplastos. b. Aparato de Golgi y centríolos. c. REL, REG y mitocondrias. d. Pared celular y cloroplastos. 8. Una célula animal y un individuo del Reino Moneras tienen en común la presencia de : a. Ribosomas b. Pared celular c. Nucleolo d. Mitocondrias 9. La membrana plasmática, la envoltura nuclear y el ADN son componentes de: a. Células procariontes, eucariontes animales y eucariontes vegetales b. Virus, viroides y hongos c. Células de hongos y células procariontes d. Células eucariontes animales y vegetales. 10. Los microscopios ópticos tienen: a. Menor poder de resolución que los electrónicos. b. Mayor poder de resolución que los electrónicos. c. Igual poder de resolución que los electrónicos. d. Un haz de electrones como fuente de energía.
