ISSN 1695-7504 Actividad bactericida en la hemolinfa de la langosta espinosa

Revista Electrónica de Veterinaria REDVET
ISSN 1695-7504
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Vol. VII, Nº 02, Febrero/2006 –
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Actividad bactericida en la hemolinfa de la langosta espinosa
Panulirus argus (Antibacterial activity in haemolyph af the spiny lobster
Panulirus Aarhus)
Raico E. Laria Lamela, Grettel Cuevillas Guerra, Juana Rosa Plasencia, Maylé
Pozo.
Centro de Investigaciones Pesqueras (Cuba) 5ta Avenida y 246, Barlovento
Santa Fe Ciudad de la Habana, Cuba Telephone: 53 07 2097851 ext 31 Email:
raico@cip.telemar.cu
Resumen
La actividad antibacteriana constituye un
importante mecanismo de defensa tanto
en crustáceos como en otras especies de
invertebrados. En el presente trabajo se
llevo a cabo un estudio de la actividad
bactericida presente en la hemolinfa de la
langosta espinosa Panulirus argus frente a
cepas de Vibrio algynolíticus, Vibrio
pónticus y Vibrio parahemolyticus sin
previa estimulación. El estudio se realizó
mediante
el
empleo
la
técnica
turbidométrica. Como resultado se detectó
actividad bactericida contra cepas de V.
algynolíticus y V. parahemolyticus, no así
para V. pónticus. En las muestras
analizadas solo se aislaron cepas de V.
vulnificus y V. alginolyticus, no así de V.
parahemolyticus. De esta forma se
demostró por primera vez la presencia de
actividad bactericida innata en la langosta
P.
argus
contra
cepas
bacterianas
presentes en los ambientes acuáticos.
Palabras claves: actividad bactericida,
Vibrio, hemolinfa, Panulirus argus
Abstract
Antibacterial activity is an important
defense mechanism both in crustaceans as
in another invertebrates. In this work was
studied the antibacterial activity present in
haemolyph af the spiny lobster Panulirus
argus against Vibrio algynolíticus, Vibrio
pónticus y Vibrio parahemolyticus species
without previous stimulation. This was
meassured by the turbidometric assay.
Results
showed
the
presence
of
bactericidal activity against V. algynolíticus
and V. parahemolyticus, but no for V.
pónticus. From samples were isolated V.
vulnificus and V. alginolyticus, but no V.
parahemolyticus. In thsi way we are
demostrating for the first time the
presence of antibacterial activity in the
haemolyph of the lobster P. argus against
bacterias
presents
in
the
aquatic
environment.
Keywords: bactericidal activity, Vibrio,
haemolymph, Panulirus argus
Introducción
Las proteínas de acción antibacteriana o endobióticos constituyen moléculas naturales
presentes en la hemolinfa de los crustáceos que pueden inhibir o matar a las bacterias y
otros patógenos (Noga et al., 1996).
La presencia de endobióticos ha sido probada en diferentes especies incluyendo las del
cangrejo Limulus polyphemus (Pistole and Furman, 1976), Callinectes sapidus, Carcinus
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maenas (proteína de 6.5 Kda); en los camarones Litopenaeus vannamei (paneidinas)
(Destoumieux et al., 1997), Penaeus monodon y Penaeus setiferus y en las langostas
Homarus americanus y Panulirus argus (Noga et.al, 1996; Roch, 1999). Estas moléculas
residen fundamentalmente en el interior de los hemocitos y solo son liberados bajo
estímulos adecuados (Noga, 2000), aunque también se ha demostrado la presencia de esta
actividad en hemolinfa de animales no estimulados (Noga et.al, 1996).
Existen muy pocas referencias sobre estudios de los endobióticos presentes en la hemolinfa
de las langostas. Un estudio llevado a cabo por Stewart y Zwicker (1972) reportó que la
actividad antibacteriana en la hemolinfa de la langosta americana Homarus americanus era
residente en el plasma, pero requería la presencia de factores en los hemocitos para ser
activada. Por otro lado Evans y colaboradores (1968) demostraron la presencia de actividad
bactericida inducida en P. argus no así de manera innata. (Noga et. al., 1996).
En el siguiente trabajo nos hemos propuesto como principal objetivo evaluar la respuesta
antibacteriana presente en la hemolinfa de la langosta espinosa P. argus sin previa
estimulación frente a tres cepas bacterianas del género Vibrio.
Materiales y Métodos
Para este estudio se emplearon 5 langostas Panulirus argus adultas, capturadas en la zona
suroccidental de Cuba
Hemolinfa
La extracción de hemolinfa se efectuó en condiciones asépticas, por el sinus venoso dorsal
ubicado entre el cefalotorax y el primer segmento del abdomen con el empleo de agujas
hipodérmicas 21G y jeringuillas plásticas desechables. La extracción se realizó con solución
anticoagulante pH 4.3. La hemolinfa una vez colectada se centrifugó a 13000 rpm por 4
minutos, y se separaron las fracciones solubles del pellet de células, conservándolas a -20°C
hasta realizar el análisis.
Aislamiento e identificación bacteriana en la hemolinfa
El asilamiento primario de Vibrio spp presentes en la hemolinfa de las langostas
muestreadas se realizó en medio Tripticasa-Soja-Agar (TSA) al 3% y como medio selectivo
diferencial se empleó el Tiosulfato-Citrato-Bilis-Sacarosa (TCBS). Para la identificación de
género y especies se realizaron pruebas bioquímicas a las colonias aisladas previamente en
TSA inclinado, clasificándose según la tabla de Cowan y Steel (1966) (Prieto y Rodríguez,
1993)
Bacterias usadas para el ensayo turbidométrico
Se emplearon cepas de Vibrio algynolíticus, Vibrio pónticus y Vibrio parahemolyticus
provenientes del cepario del laboratorio de Microbiología del Centro de Investigaciones
Pesqueras (CIP). Las mismas fueron refrescadas en medio sólido de TCBS a 30°C durante 24
horas y luego las colonias se transfirieron a medio con agua peptonada alcalina (APA 5%)
(5 ml) e incubadas a 30°C durante 24 horas.
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Actividad antibacteriana
Se midió mediante un ensayo turbidométrico según la metodología propuesta por Noga et.
al. (1996) con modificaciones. Se tomaron los inóculos obtenidos en medio APA 5% de las
diferentes cepas y se centrifugaron en un tubo Eppendorf estéril a 3000 rpm durante 10
min, se desechó el sobrenadante y se adicionó un volumen de solución de PBS a
temperatura ambiente (TA). Esta suspensión se volvió a centrifugar y se resuspendió el
precipitado en el mismo volumen que tenía el inóculo. Se procedió luego a leer el valor de la
Absorbancia en un espectrofotómetro a 570nm y se ajustó la suspensión de Vibrio a 0.100
mediante la adición de PBS y luego se diluyó 1:100 con PBS. En un tubo de 1.5 ml
(eppendorf), se añadieron 38 µl de PBS frío, 2 µl de la muestra de suero o plasma de
hemolinfa de langosta y 10 µl de la suspensión bacteriana diluida anteriormente. Esta
mezcla se incubó 30 min a TA. Al cabo de este tiempo se detuvo la reacción colocando los
tubos a 4°C y se añadieron 450 µl de medio TSB líquido frío, colocando luego los tubos a
30°C de 1 - 1.5 horas. Transcurrido este tiempo se leyó la absorbancia de las muestras a
570 nm contra un control positivo preparado de igual forma que las muestras pero
sustituyendo el plasma por PBS. Los resultados se recogieron como la relación de la
absorbancia de la muestra contra el control (M/C) lo cual representa el porciento de
inhibición del crecimiento.
Resultados y Discusión
La caracterización de la hemolinfa arrojó solamente la presencia de 2 cepas de Vibrio
vulnificus y 6 de Vibrio alginolyticus. Los Vibrio spp pueden encontrarse en los ambientes
estuarinos tanto en las zonas tropicales como en las templadas (FDA, 2001). Es conocido
que los crustáceos en general presenta una microflora interna en la que están presentes
todos estos microorganismos y que bajo condiciones de estrés o patológicas, alcanzan
concentraciones elevadas en la hemolinfa y órganos de la langosta y pueden ocasionar una
enfermedad (Evans, 1999).
Los resultados del análisis de la actividad bactericida en las langostas muestreadas
aparecen reflejados en la tabla 1. Según esta técnica no se encontró actividad bactericida
frente a V. pónticus (100% negativos), mientras que si se mostraron actividades
bactericidas contra V. alginolyticus (16.7% de inhibición del crecimiento) y V.
parahemolyticus (26.7 % de inhibición).
La presencia de actividad bactericida en muestras de hemolinfa de la langosta espinosa P.
argus sugiere la existencia de una respuesta inmune innata frente a estos microorganismos.
Los porcientos de inhibición mostrados contra las diferentes cepas probadas (16,7% para
Vibrio alginolyticus y 27,4% para Vibrio parahemolyticus) coinciden con los reportados por
Noga et al. (1996ª) para el cangrejo azul Callinectes sapidus contra cepas de Vibrio
parahemolyticus y Vibrio vulnificus aisladas del carapacho de los animales (20% y 14%
respectivamente).
La generación de moléculas de defensa no específica está reconocida como uno de los
mecanismos de defensa inmune que tiene los crustáceos y otros invertebrados, entre las
que se encuentran el sistema de la fenoloxidasa, las lectinas y las bactericidinas (Khoo et
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al., 1999). En varias especies de crustáceos ha sido demostrada la presencia de moléculas
de naturaleza proteica que tienen acción antibacteriana. A partir de hemocitos granulares
del cangrejo Carcinus maenas se aisló y caracterizó parcialmente un péptido de 6.5 kDa con
actividad antibacteriana (Chisholm and Smith, 1992; Schnapp et al., 1996) y del camarón
Litopenaeus vannamei se aislaron tres moléculas llamadas paneidinas (Pen 1, 2 y 3) con
actividad antifúngica y antibacteriana. (Destomieux et al., 1997).
Esta actividad generalmente está presente en las células de la hemolinfa como es el caso de
las paneidinas de los hemocitos de L. vannamei y P. monodon (Adams, 1991) o en los
hemocitos granulares del cangrejo de costa Carcinus maenas (Chisholm and Smith, 1992).
Sin embargo en la langosta Americana Homarus americanus la actividad antibacteriana
reside en el plasma, pero requiere de factores presentes en los hemocitos para ser activada.
En este trabajo estamos reportando por primera vez la presencia de una actividad
antibacteriana en el plasma libre de células de la langosta espinosa P. argus en animales sin
previa estimulación. Noga et al (1996) reportaron también la presencia de actividad
antibacteriana contra tres especies de bacterias Gram negativas (E. coli D31, Vibrio fluvialis
y Pseudomona diminuta) en el suero del camarón blanco Penaeus setiferus sin estimular,
sugiriendo la existencia de una actividad bactericida endógena en este crustáceo, la cual
pudiera estar implicada en los mecanismos de defensa de estas especies contra la flora
endógena. Este hallazgo pudiera contribuir al desarrollo de nuevas pruebas que permitan
evaluar el estado de salud de las poblaciones de langostas.
Tabla 1 Resultados de la actividad bactericida por la técnica turbidométrica presentes en muestras
de hemolinfa de la langosta cubana P. argus enfrentados a tres cepas de Vibrio sp.
Vibrio spp.
Abs 570 nm
% Inhib.
Control
0,156
-
V.algynoliticus
0,13 ± 0,04
16,7
Control
0,069
-
V. pónticus
0,153 ± 0,07
0
Control
0,164
-
V. parahemolyticus
0,119 ± 0,05
27,4
Los valores de absorbancia para las muestras se representan por la media ± error estándar % Inhib. Por
ciento de inhibición del crecimiento 1 - (Abs muestra / Abs control) x 100 (-) inhibición negativa
Conclusiones
•
Se detectó la presencia de actividad bactericida innata en la hemolinfa de la langosta
Panulirus argus contra cepas de Vibrio alginolyticus y Vibrio parahemolyticus
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Referencias Bibliográficas
1. Adams, A. 1991. Response of penaeid shrimp to exposure to Vibrio species. Fish and Shellfish
Immunol 1, 59-70.
2. Chisholm, J.R.S. and Smith, V.J. 1992. Antibacterial activity in the haemocytes of the shore
crab, Carcinus maenas. J Mar Biol Assoc UK 72, 259-542.
3. Destoumieux, D., Bulet, P., Loew, D., van Dorsselaer, A., Rodríguez, J. and Bachère, E. 1997.
Penaeidins, a new family of antimicrobial peptides isolated from the shrimp Penaeus vannamei
(Decapoda). J. Biol. Chem. 272, 28398-28406.
4. Evans LH, 1999. Lobster health and disease: basic concepts. Proceeding international
symposium on lobster health managements, Adelaide, September 1999, pp 3-8
5. Evans, E.E., Painter, B., Evans, M.L., Weinheimer, P., and Acton, R.Y. 1968. An induced
bactericidin in the spiny lobster Panulirus argus. Proceedings of the Society of Experimental
Biology and Medicine 128, 394-398.
6. FDA.
2001.
Draft
Risk
Assessment
on
the
Public
Health
Impact
of
Vibrio parahaemolyticus in Raw Molluscan Shellfish. U. S. Food and Drug Administration.
Center
for
Food
Safety
and
Applied
Nutrition
January 2001. URL: FDA-CFSAN - Draft Risk Assessment on the Public Health Impact of Vibrio
parahaemolyticus in Raw Molluscan Shellfish.htm
7. Khoo, L., Robinette, D.W., Noga, E.J. 1999. Callinectin, an antibacterial peptide from Blue
Crac, Callinectes sapidus, Hemocytes. Mar Biotechnol 1, 44-51.
8. Noga E., Arroll, T.A., Bullis, R.A., Khoo, L. 1996. Antibacterial activity in hemolimph of white
shrimp Penaeus setiferus. J Mar Biotechnol 4, 181-184.
9. Noga EJ. 2000. Hemolymph biomarkers of crustaceans health. Recent advenaces in Marine
Biotechnology Vol 5. Immunobiology and Pathology. Science Publishers, Inc. USA, pp 125-163
10. Noga, E.J., Arroll, T.A., Fan, Z., 1996a. Specificity and some physicochemical characteristics of
the antibacterial activity from blue crab Callinectes sapidus. Fish and shellfish Immunology, 6 :
403-412
11. Pistole, T.G., Furman, R.M. 1976. Serum bactericidal activity in the horseshoe crab, Limulus
polyphemus. Infect Immun. 14 (4), 888–893.
12. Prieto, A., y Rodríguez, Ma.C. 1993. Diagnóstico y control de enfermedades bacterianas en el
camarón de cultivo. Proyecto Aquila 11, GCP/RLA/102/ITA: pp. 61.
13. Roch P, 1999. Defense mechanisms and disease prevention in farmed marine invertebrates.
Aquaculture 172 : 125-145
14. Schnapp, D., Kemp, G.D., Smith, V.J. 1996. Purification and characterization of a praline-rich
antibacterial peptide, with sequence similarity to bactenecin-7, from the haemocytes of the
shore crab, Carcinus maenas. Eur J Biochem 240, 532-539.
15. Stewart, J.E. and Zwicker, B.M. 1972. Natural and induced bactericidal activities in the
haemolymph of the lobster, Homarus americanus: products of hemocytes plasma interaction.
Canadian Journal of Microbiology 18, 1499-1509.
Trabajo recibido el 17/11/2005, nº de referencia 020614_REDVET. Enviado por su autor principal. Publicado en
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