REDVET. Revista electrónica de Veterinaria. ISSN 1695-7504 Rev. electrón. vet.

REDVET. Revista electrónica de Veterinaria. ISSN 1695-7504
2007 Volumen VIII Número 9
REDVET Rev. electrón. vet. http://www.veterinaria.org/revistas/redvet
Vol. VIII, Nº 9, Septiembre/2007– http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n090907.html
Estudio anatomopatológico, citogenético y molecular del síndrome
freemartin
en
el
bovino
doméstico
(Bos
taurus)
(ANATOMOPATHOLOGIC, CYTOGENETIC AND MOLECULAR STUDIES OF THE FREEMARTIN
SYNDROME IN CATTLE (BOS TAURUS))
Ayala-Valdovinos, Miguel Angel; Villagómez, Daniel; Galindo-García,
Jorge; Sánchez-Chiprés, David; Avila-Figueroa, David; Taylor-Preciado,
Juan de Jesús; Merlos-Barajas, Miguel y Guerrero-Quiroz Luis.
Instituto de Biotecnología Animal, Departamento de Producción Animal,
División de Ciencias Veterinarias, Centro Universitario de Ciencias
Biológicas y Agropecuarias, Universidad de Guadalajara, A. P. 218 Zapopan
1, C. P. 45101, Zapopan, Jalisco, (México). Tel y Fax: (52-33) 37-96-4073. e-mail: manayala@cucba.udg.mx
R7EDVET: 2007, Vol. VIII Nº 9
Recibido: 03 Julio 2007 / Referencia: 09012_REDVET / Aceptado: 15 Agosto 2007 / Publicado: 01 Septiembre 2007
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Resumen
A través del análisis citogenético utilizando la presencia de los cromosomas sexuales como
marcadores y mediante el análisis molecular (PCR-RFLP), utilizando oligonucleótidos
iniciadores para los genes Zfx y Zfy del bovino, se diagnosticaron con la condición intersexual,
síndrome freemartin, 19 individuos (Bos taurus) procedentes de partos múltiples
heterosexuales; asimismo, se estudiaron anatomopatológicamente cuatro de estos animales,
enfatizando en las características del tejido gonadal (ovárico y/o testicular) presente,
procediendo a la identificación molecular (PCR-RFLP) de células masculinas en este tejido.
El quimerismo cromosómico hematopoyético (60,XX/60,XY) caracterizó a los animales
estudiados, excepcionalmente un individuo mostró complemento cromosómico 60,XY.
Mediante la técnica de PCR, se amplificó un fragmento de 447 pb, del cual después de ser
digerido con la enzima de restricción Pst I, se obtuvieron los RFLP de los animales estudiados,
hembras normales (447 pb) así como machos normales y animales freemartins (447, 344 y
103 pb). Los hallazgos anatomopatológicos de dos de los cuatro freemartins estudiados hasta
su sacrificio mostraron pseudohermafroditismo masculino, de estos dos intersexos además se
obtuvo ADN de tejido gonadal, del cual se identificó a nivel molecular (PCR) la presencia de un
patrón de RFLP específicos de freemartin. Los dos freemartins restantes presentaron una
marcada hipoplasia del tracto reproductor sin gónadas diferenciadas como tales.
Palabras clave: Freemartin, Bovino, Análisis Anatomopatológico, Análisis Citogenético, PCRRFLP.
Estudio anatomopatológico, citogenético y molecular del síndrome freemartin en el bovino doméstico
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Abstract
by means of the cytogenetic analysis using the presence of the sexual chromosomes as
markers and through the molecular analysis (pcr-rflp), using primers for the zfx and zfy genes
of the bovine, 19 individuals (bos taurus) coming from heterosexual multiple parturitions, were
diagnosed
as
syndrome
freemartin
intersexes;
likewise,
there
were
studied
anatomopathologically four of these animals, emphasizing the characteristics of the gonadal
tissue (ovaric and/or testicular) present, proceeding to the molecular identification (pcr-rflp) of
masculine cells in this tissue.
the presence of hematopoyetic chromosomic chimerism (60,xx/60,xy) characterized to the
animals studied, exceptionally a freemartin showed chromosomic complement 60,xy. by
means of pcr's technique, a fragment of 447 bp was amplified, and digested with pst i
restriction enzyme, the rflp of the studied animals was obtained, normal females (447 bp) as
well as normal males and freemartin animals (447, 344
and 103 bp). the
anatomopathologically findings of two of the four freemartins studied at slaughter showed
masculine pseudohermaphroditism, of these two intersexes besides dna of gonadal tissue was
obtained, of which was identified to molecular level (pcr) the presence of a pattern of rflp
specific of freemartin. the remaining two freemartins presented a marked hypoplasia of the
reproductive tract without differentiated gonads.
Key words: Freemartin, Cattle, Anatomopathologic Analysis, Citogenetic Analysis, PCR-RFLP.
Introducción
Los factores que alteran los mecanismos de la diferenciación sexual son múltiples y su estudio
anatomopatológico, citogenético y molecular está permitiendo una mejor comprensión de la
diferenciación sexual normal y sus anormalidades (Salamanca, 1992). Aunque el principal foco
de interés en el estudio de la diferenciación sexual, ha sido la especie humana, muchos
aspectos del proceso han sido mejor estudiados en otras especies (Wilson y col., 1981).
El término freemartin designa a una vaquilla estéril (farrow = animal infecundo y mart =
vaquilla), pero por extensión se aplica a una hembra genética concebida en una gestación
múltiple heterosexual. En más del 90% de estas gestaciones se establece una anastomosis
vascular placentaria entre los 30 y 40 días de gestación, es decir, antes del dimorfismo sexual,
originando un intercambio de células (quimerismo hematopoyético) y sustancias plasmáticas
como hormonas (Harvey, 1976; Gustavsson, 1979; Long, 1990) que conllevan a la hembra a
un estado intersexual en donde los genitales externos preferentemente son femeninos y el
grado de afección de los genitales internos es muy variado; es característica la hipoplasia
gonadal, represión de los conductos de Müller, masculinización de las gónadas y estimulación
los conductos de Wolf (Tran, 1977; Sysa y col., 1980; Wilkes y col., 1981; Edwards y col.,
1994).
La frecuencia de síndrome freemartin ha sido estimada en 92% de los partos gemelares
heterosexuales (macho y hembra) del bovino (McFeely, 1967; David, 1976; Potter y
Blackshaw, 1980), sin embargo, las freemartin también pueden producirse en nacimientos de
hembras únicas, como consecuencia de la muerte fetal precoz y reabsorción del gemelo macho
en el útero después del establecimiento de la anastomosis vascular (Smith y col., 1977; Sysa y
col., 1980; Van Haerigen y Van de Nieuwenhuizen, 1980).
El quimerismo XX/XY ha sido reportado en tejido gonadal de gemelos bovinos heterosexuales
(Ohno y col., 1962; Teplitz y col., 1967; Ford y Evans, 1977), sin embargo, este hallazgo no
ha sido confirmado en algunas investigaciones (Dun y col., 1979; Short y col., 1969; Vigier y
col., 1973). La presencia de este tipo de células fue reportada en quimeras artificiales de
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ratón, en etapa fetal, por McLaren y col. (1972), quien mencionó que no hay observación de
meiosis XX en este tipo de ratones en estado adulto. Rejduch y col. (2000), reportaron
quimerismo XY/XX en células germinales (espermatogonias) mediante fluorescencia en
hibridación in situ (FISH) en dos de tres toros de parto gemelar heterosexual, raza Polaca
Negra y Blanca de 12-15 meses de edad, debido al intercambio de células germinales en etapa
embrionaria. Sin embargo, no encontraron indicadores de que las espermatogonias fueran
capaces de entrar en el proceso de diferenciación celular. El quimerismo hematopoyético
(XY/XX) fue corroborado en los tres animales del estudio.
El presente trabajo comprendió el estudio de 19 (95%) bovinos diagnosticados como
freemartin de un total de 20 hembras procedentes de parto gemelar heterosexual, a través del
diagnóstico citogenético y molecular, así como el posterior análisis anatomopatológico del
tracto reproductor y el análisis molecular en tejido gonadal de freemartins con
pseudohermafroditismo masculino. Los hallazgos son discutidos en torno a la información
actual sobre la entidad patológica.
MATERIAL Y MÉTODOS
Se seleccionaron 20 bovinos hembras de la especie Bos taurus que tenían el antecedente de
proceder de partos múltiples heterosexuales (Cuadro 1). Se procedió con la historia clínica de
cada individuo y se realizó la toma de muestras sanguíneas por punción en la vena yugular con
aguja vacutainer y tubos al vacío de 5 ml con heparina (14 U) o EDTA para el análisis
citogenético y molecular, respectivamente.
Cultivo de linfocitos
Los cultivos de linfocitos de sangre periférica se realizaron acorde a la técnica de Moorhead y
col. (1960), con algunas modificaciones: se adicionaron 0,5 ml de células sanguíneas en tubos
con 8 ml de medio de cultivo RPMI 1640 (Sigma®), 20% de suero fetal de ternero (Gibco®),
0,3 ml de fitohemaglutinina (Sigma®) y antibióticos (25 UI de penicilina y 25 µg de
estreptomicina por ml de medio de cultivo). Se incubaron 72 horas a 37,5ºC. Posteriormente se
adicionó colchicina (Sigma®) al medio de cultivo (100 µg/ml) por 30 minutos y después se
incubaron por 20 minutos a 37,5ºC en una solución de KCl (0,075 M), subsecuentemente se
fijaron en solución Carnoy (metanol:ácido acético en proporción 3:1) y se extendieron en
portaobjetos previamente desengrasados (Crossler y Clarke, 1962; Smith y col., 1976).
Análisis citogenética
Las preparaciones cromosómicas fueron teñidas con Giemsa al 5% en solución amortiguadora
de fosfatos. El análisis cromosómico se empleo para el diagnóstico de animales freemartin, a
través del quimerismo hematopoyético, identificando los cromosomas sexuales como
marcadores, con base en las recomendaciones de la Primera Conferencia Internacional para la
Estandarización de Cariotipos en Animales Domésticos (Ford y col., 1980).
Extracción de DNA de células sanguíneas
El DNA genómico fue obtenido a partir de muestras de sangre completa siguiendo protocolos
estándares. De cada muestra de sangre se tomaron 100 µl y fueron tratados con 900 µl de
buffer A (sacarosa, 0,32 M; Tris HCI, 10 mM; pH 7.6; Mg Cl2, 5 mM; Triton X-100, 1%), hasta
lograr un botón celular blanco. A continuación se incubó la muestra por una hora a 50ºC en
una solución de proteinasa K (8 mg/ml) en buffer D (KCl, 50mM; Tris HCl, 10 mM; MgCl2,
2,5mM; NP-4O, 0,455; Tween 20, 0,45%). La proteinasa K se inactivó incubando la muestra a
94ºC durante 10 minutos (Kawasaki, 1990).
Análisis anatomopatológico
Para el estudio anatomopatológico, después del sacrificio de los animales se recolectó su tracto
reproductor, el cual subsecuentemente fue fotografiado, diseccionado y preservado en
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formalina al 10%. Los especimenes fueron procesados bajo técnicas estándar de histología con
inclusión en parafina y tinción con hematoxilina y eosina.
Extracción de DNA de tejido incluido en parafina
De los animales freemartin con pseudohermafroditismo masculino, se obtuvo ADN a partir de
tejido testicular montado en bloques de parafina, acorde a la técnica de Wright y Manos
(1990): la parafina fue removida a partir de secciones de 4-5 µm colocadas en tubos de 1,5
ml, para posteriormente agregar 1 ml de n-octano (Sigma®), mezclar, centrifugar por 5
minutos (14000 rpm) y eliminar el sobrenadante. Después se adicionaron 0,5 ml de etanol
absoluto (Aldrich®), se mezclaron y fueron centrifugados durante 20 minutos (10000 rpm)
para eliminar el etanol. Una vez secas las muestras, se agregaron dos gotas de acetona a cada
tubo dejándolos destapados (12 horas a 37°C) para eliminar la acetona. Subsecuentemente se
agregaron 100 µl de buffer de digestión conteniendo 20 µg de proteinasa K y se incubaron (12
horas a 37°C). Para la inactivación de la proteinasa K los tubos fueron colocados a 94°C
durante 10 minutos (Peñalosa-Plascencia y col., 2000).
Análisis molecular (PCR-RFLP)
•
Amplificación de DNA genómico (PCR)
De acuerdo a los datos de la secuencia de ADN para los genes Zfx y Zfy (Ashworth y
col., 1989; Aasen y Medrano, 1990; Bredbacka y Peippo, 1992), se seleccionaron dos
primers (directo: 5´-ATA ATC ACA TGG AGA GCA ACA AGC T-3´, reverso: 5´-GAG CCT
CTT TGG TAT CTG AGA AAG T-3´) para seguir un protocolo estándar, donde 100 ng de
DNA fueron amplificados en una reacción de 100 µl, conteniendo 100 pmol de cada
iniciador, 200 µM de dNTPs y 2,5 U de enzima Taq polimerasa (Gibco®). Los ciclos de
amplificación se realizaron en un termociclador (Eppendorft®), con 35 ciclos de
desnaturalización a 94ºC por 50 segundos; alineación a 54ºC por 50 segundos y
polimerización a 72ºC por 60 segundos, así como una extensión final de 72°C durante 5
minutos.
•
Análisis de Fragmentos de Restricción de Longitud Polimórfica (RFLPs)
Para el análisis de RFLP se tomaron 15 µl del producto de reacción de PCR y fueron
digeridos por 2 horas con 15 unidades de la enzima de restricción Pst I (Gibco®).
Posteriormente fueron analizados en electroforesis en gel de agarosa al 3%
(Gibco®) teñido con bromuro de etidio en buffer TBE 1x, subsecuentemente las
bandas fueron observadas bajo luz UV en un sistema de documentación de geles
(UVP®).
Resultados
El análisis citogenético permitió determinar el número cromosómico e identificar los
cromosomas sexuales (Figura 1a-b) en los 20 animales estudiados procedentes de
partos múltiples heterosexuales. Observándose en 14 de los 19 (95%) animales definidos
como freemartin, en los cuales se analizaron 100 metafases, una variación en el grado de
quimerismo cromosómico sexual desde 29% hasta 100% de células con complemento
cromosómico 60,XY (Cuadro 1).
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Figura 1a-b. Microfotografías de células en metafase mostrando diferente complemento
cromosómico sexual correspondientes a una bovino freemartin del estudio. Complemento
cromosómico 60,XX (figura a) y complemento cromosómico 60,XY (figura b). Objetivo 100 X.
La temperatura óptima de alineación de los primers (54°C) se determinó mediante PCRGradiente en un termociclador Mastercycler Gradient (Eppendorf®). En la figura 2 se
observan 12 muestras que contienen ADN del mismo bovino (macho control), las cuales
fueron amplificadas con diferente temperatura (°C) de alineación de acuerdo al programa
del equipo.
Figura 2. Electroforesis en agarosa de ADN bovino amplificado por PCR-Gradiente para
determinar la temperatura óptima de alineación (°C) de los primers (P1-5EZ y P3-3EZ). Carriles 1
– 12, muestras de DNA de acuerdo a las diferentes temperaturas (°C) de alineación del programa.
El análisis molecular (PCR-RFLP) permitió la amplificación de fragmentos de ADN
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genómico de 447 pb correspondientes a los genes Zfx y Zfy de los 22 animales en
estudio, así como de los animales controles. Los RFLP produjeron patrones de bandeo
para bovino macho (447, 344 y 103 pb), para bovino hembra (447 pb) y para bovinos
quiméricos (freemartin; 447, 344 y 103 pb) (Figura 3).
Figura 3. Electroforesis en agarosa de ADN bovino. Carril 1, marcador molecular (50 pb Life
Technologies®); 2, macho control; 3, hembra control; 4, macho quimérico; 5, 6, 8 y 9, hembras
freemartin; 7, hembra de parto múltiple heterosexual con genotipo normal (Zfx, 447 pb); 10,
blanco; Las bandas de 103 pb correspondientes a uno de los productos de digestión del gen Zfy
fueron débiles y no son visibles en la figura pero sí en el gel.
Quince de las terneras (animales 1, 3, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 y 20), no
mostraron anormalidades externas aparentes de la diferenciación sexual. En tanto que
tres vaquillas (animales 5, 7 y 8), presentaron rasgos característicos de algunas
freemartin, tales como una vagina corta cranealmente ciega con ausencia de cervix
(animal No. 5), o una vulva con un clítoris hipertrófico y una borla de pelos en la
comisura vulvar inferior (animales No. 7 y 8), tras el sacrificio de estos dos freemartin se
observó un tracto reproductor marcadamente hipoplásico sin gónadas diferenciadas como
tales. Los análisis citogenético y molecular practicados a estos animales revelaron la
presencia de quimerismo hematopoyético (Cuadro 1).
El animal No. 2, producto de la cruza Holstein x Simmental, desde los tres meses de
edad, hasta su sacrificio a los 18 meses, presentó anormalidades de la diferenciación
sexual que consistieron en un prepucio no bien diferenciado con orificio externo
funcional, una estructura peneana de implantación posterior y ventral al ano, además de
dos pliegues cutáneos que representaban bolsas escrotales no bien diferenciadas (Figura
4a-b).
Así pues este intersexo (animal No. 2) se preservó vivo para continuar el estudio hasta
aproximadamente los 18 meses de edad y en el análisis anatomopatológico se
observaron, además, dos testículos hipoplásicos intraabdominales con epidídimo y
conductos deferentes (Figura 4c), vesículas seminales, próstata y un pene hipoplásico.
Cada gónada pesó 15 g y en ambas se observaron células de Sertoli y de Leydig, así
como túbulos seminíferos hipoplásicos carentes de células germinales (Figura 6),
condición que fue corroborada en el tejido del epidídimo (Figura 7) de este animal.
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Figura 4a-c. Genitales de un freemartin de 18 meses de edad bastante masculinizado (caso No. 2).
Región posterior del animal en donde se puede observar el desarrollo del prepucio (flecha, figura
5a); vista de cúbito dorsal de la región pélvica donde también se observa el prepucio (flecha blanca,
figura 5b) y dos pliegues cutáneos que representan desarrollo de bolsas escrútales (flechas oscuras,
figura 5b) y algunos de losgenitales internos observados en misma posición de cubito dorsal (figura
c: CD = conductos deferentes; PG = pliegue genital; ACD = ámpulas de los conductos deferentes; V
= vejiga)
En este freemartin como en su hermano gemelo se encontró un complemento
cromosómico 60,XX/60,XY y se corroboró tal quimerismo en el análisis molecular
(Cuadro 1). A la edad de aproximadamente de 18 meses, el freemartin presentó una
conformación física (Figura 5a) y comportamiento sexual masculinos.
Figura 5a-b. Comparación de la conformación física de dos freemartin de aproximadamente
18 meses de edad. La freemartin No. 2 (figura 5a) presentó pseudohermafroditismo
masculino, en tanto que la freemartin No. 8 (figura 5b) presentó disgenesia gonadal.
Figura 6. Microfotografía
histológica de la gónada
derecha del freemartin
caso No. 2. Se observan
túbulos seminíferos
irregulares e hipoplásicos
(flechas) carentes de
células germinales.
SE = células de sertoli. H
& E. 400 X.
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Figura 7. Microfotografía histológica del epidídimo de la gónada derecha del freemartin caso
No. 2. Se observan túbulos tortuosos carentes de células germinales. H & E. 100 X.
El análisis molecular (PCR) realizado en el tejido gonadal del freemartin animal No. 2 que
evidenció pseudohermafroditismo masculino, permitió identificar un patrón de RFLP
específico de freemartin (447, 344 y 103 pb) en el ADN obtenido de células de este
tejido.
El animal No. 4 fue un bovino intersexo de dos años de edad, producto de un parto de
triates en la raza Pardo Suizo Americano, en el momento del estudio sólo sobrevivía
además, una hermana gemela y de acuerdo con el veterinario y los registros del establo,
el tercer animal fue un macho que ya había sido sacrificado. El intersexo presentaba una
apariencia externa típica de freemartin, como una borla de pelos en la comisura vulvar
inferior y un clítoris hipertrófico. Sin embargo, el análisis citogenético reveló un cariotipo
60,XY en 100 células observadas. En la sala de matanza sólo se pudieron obtener sus
gónadas, las cuales presentaron aspecto testicular, con pesos de 6.7 g para la gónada
derecha y de 5.0 g para la izquierda. La sección histológica la gónada derecha presentó
túbulos seminíferos hipoplásicos carentes de células germinales (Figura 8), sin embargo,
en la gónada izquierda se evidenciaron algunos túbulos seminíferos bien delineados con
aparentes células germinales y escasas células de Sertoli, así como túbulos seminíferos
obliterados (Figura 9). El estudio histológico de ambos epidídimos demostró ausencia de
células germinales.
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Figura 8. Microfotografía histológica de la gónada derecha del freemartin caso No. 4. Se
observan túbulos seminíferos irregulares, carentes de células germinales y con calcificación
distrófica. S = células de sertoli; CD = calcificación distrófica. H & E. 100 X.
Figura 9. Microfotografía histológica de la gónada izquierda del freemartin caso No. 4. Se
observan túbulos seminíferos obliterados (flechas oscuras) y túbulos seminíferos bien delineados
con aparentes células germinales y escasas células de Sertoli (flechas claras). H & E. 400 X.
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El análisis molecular (PCR) realizado en el tejido gonadal de este otro freemartin con
pseudohermafroditismo masculino (animal No. 4), también reveló un patrón de RFLP
específico de freemartin (447, 344 y 103 pb) en el ADN obtenido de células de este
tejido.
Fue necesario estudiar a la hermana gemela del animal No. 4 para entender el posible
fenómeno involucrado, esta vaquilla a la palpación transrectal presentó un tracto
reproductor femenino y de acuerdo con su registro había presentado celos regulares,
recibiendo servicio por monta natural o inseminación artificial (IA), sin lograr procrear.
En el estudio citogenético se observó un complemento cromosómico 60,XX en 100
metafases analizadas. Después del sacrificio, este animal mostró un tracto reproductor
aparentemente normal, gónadas a primera vista funcionales con folículos en desarrollo y
en los cortes histológicos se observaron folículos primordiales y folículos primarios,
además de un cuerpo lúteo, un cuerpo albo y quistes foliculares.
El animal No. 5 fue una vaquilla Holstein-Friesian de dos años de edad, nacida de parto
gemelar con un macho y de acuerdo con su registro reproductivo, nunca presentó celos.
En la palpación transrectal presentó una vagina cranealmente ciega y ausencia de cérvix.
El estudio citogenético y molecular
corroboró el diagnóstico clínico de síndrome
freemartin mediante la presencia de un cariotipo 60,XX/60XY y RFLP propios de un
freemartin (447, 344 y 103 pb).
El animal No. 6 fue una vaca adulta raza Holstein-Friesian, nacida de parto dicigótico con
un macho que no estuvo disponible para el estudio. Esta vaca tenía siete años de edad
en el momento del estudio y de acuerdo con el propietario y con el registro reproductivo
del animal, esta vaca había parido tres terneros machos, dos mediante monta natural y
uno por inseminación artificial (IA), su último parto se registró a la edad de 5 años.
Además esta vaca había tenido una buena producción láctea. En el estudio citogenético
se analizaron 100 metafases, 99% mostraron un complemento cromosómico femenino
(60,XX) y 1% mostró complemento cromosómico sexual con un cromosoma X más otro
cromosoma sexual de identificación no precisa, aparentemente un cromosoma Y (Figura
10). Con base en este hallazgo fue necesario realizar una prueba de PCR para obtener el
genotipo para el gen Zfx/Zfy del bovino, encontrándose un genotipo propio de las
hembras normales (Zfx, 447 pb).
Figura 10a-b. Microfotografías de células en metafase mostrando complemento cromosómico
sexual, el animal No. 6 mostró complemento cromosómico sexual con un cromosoma X más otro
cromosoma sexual de identificación no precisa (60,X?, figura 10a), más pequeño que el
cromosoma X pero más grande que el cromosoma Y de un bovino macho normal (60,XY, figura
10b). Objetivo 100 X.
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El animal No. 7 fue una vaquilla de la raza Holstein Freisan, nacida de parto dicigótico
con un macho, el cual murió momentos después del nacimiento. En el momento del
estudio la vaquilla tenía 2 años de edad y mostraba una apariencia externa típica de
algunos freemartin, esto es, una vulva con un clítoris hipertrófico y una borla de pelos
(Figura 11a). De acuerdo con el médico veterinario encargado del hato, ésta nunca
presentó celos. Tras el sacrificio del animal se observó un tracto reproductor hipoplásico
al igual que sus dos pequeñas gónadas como ovarios vestigiales (Figura 11b). En el
estudio citogenético se encontró un complemento cromosómico 60,XX/60,XY, y el análisis
molecular corroboró el estado intersexual a través de RFLP propios de la condición
freemartin (447, 344 y 103 pb).
Figura 11 a-b. Genitales de una freemartin raza Holstein Freisan de 2 años de edad (caso No. 7).
Genitales externos en donde se puede observar la vulva con un clítoris hipertrófico y una borla de
pelos en la comisura vulvar inferior (figura 11a). Parte del tracto reproductor en donde se observa
la marcada hipoplasia del útero con ovarios vestigiales (flechas, figura 11b).
El animal No. 8 fue una vaquilla de la raza Holstein Freisan, nacida de parto
dicigótico heterosexual, cuyo ternero murió el día de su nacimiento. En el
momento del estudio la vaquilla tenía 18 meses de edad y no había presentado
celos, según el médico veterinario responsable del hato y los registros del
mismo. Este individuo también mostró una apariencia externa típica de algunos
freemartin, es decir, labios vulvares con un clítoris hipertrófico y una borla de
pelos (Figura 12). En el momento del sacrificio del animal se observó un tracto
reproductor marcadamente hipoplásico sin gónadas aparentes. En el estudio
citogenético
se
encontró
un
complemento
cromosómico
60,XX/60,XY, en tanto que el
análisis molecular corroboró que se
trataba de un caso de síndrome
freemartin (447, 344 y 103 pb).
Figura 12. Genitales externos de una
freemartin de 18 meses de edad raza
Holstein Freisan (caso No. 8) en donde se
puede observar la vulva con un clítoris
hipertrófico y una borla de pelos en la
comisura vulvar inferior (flecha),
características inconsistentes que se
presentan en algunos animales con
síndrome freemartin.
11
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Cuadro 1. Constitución cromosómica, proporción de líneas celulares (XX : XY), genotipo (Zfx/Zfy)
y diagnóstico en las hembras de parto múltiple heterosexual estudiadas.
No. de Tipo de
animal parto
1
Gemelar
Edad
Raza
Holstein
Cariotipo
Sexo
fenotípico*
Hembra
4
meses
2
Gemelar Holstein /
Intersexo
3
Simmental
meses
3
Gemelar
Holstein
Hembra
15
días
4
Triple Pardo Suizo Intersexo
2
Americano
años
5
Gemelar
Holstein
Intersexo
2
años
6
Gemelar
Holstein
Hembra
7
años
7
Gemelar
Holstein
Intersexo
2
años
8
Gemelar
Holstein
Intersexo
18
meses
9
Gemelar
Holstein
Hembra
10
días
10
Gemelar
Holstein
Hembra
8
días
11
Gemelar
Holstein
Hembra
7
días
12
Gemelar
Holstein
Hembra
1
día
13
Gemelar Pardo Suizo
Hembra
8
Americano
días
14
Gemelar Pardo Suizo
Hembra
12
Americano
días
15
Gemelar Simmental
Hembra
5
días
16
Gemelar
Holstein
Hembra
8
días
17
Gemelar Simmental
Hembra
14
días
18
Gemelar
Holstein
Hembra
7
días
19
Gemelar
Holstein
Hembra
1
días
20
Gemelar
Holstein
Hembra
4
días
* El sexo fenotípico de los individuos se refiere a las
estudio.
Proporción de
líneas celulares
XX : XY
Genotipo
genes Zfx – Zfy
(RFLP)
Diagnóstico
60,XX/60XY
XX= 52 : XY= 48
Zfx – Zfy
Freemartin
(n= 100)
(447, 344 y 103 pb)
60,XX/60XY
XX= 7 : XY= 93
Zfx – Zfy
Freemartin
(n= 100)
(447, 344 y 103 pb)
60,XX/60XY XX= 21 : XY= 23
Zfx – Zfy
Freemartin
(n= 44)
(447, 344 y 103 pb)
60,XY
XY= 100
Zfx – Zfy
Freemartin
(n= 100)
(447, 344 y 103 pb)
60,XX/60XY
XX= 6 : XY= 38
Zfx – Zfy
Freemartin
(n= 44)
(447, 344 y 103 pb)
60,XX/60X?
XX= 99 : X?= 1
Zfx
Normal
(n= 100)
(447 pb)
60,XX/60XY
XX= 7 : XY= 3
Zfx – Zfy
Freemartin
(n= 10)
(447, 344 y 103 pb)
60,XX/60XY
XX= 6 : XY= 4
Zfx – Zfy
Freemartin
(n= 10)
(447, 344 y 103 pb)
60,XX/60XY XX= 37 : XY= 63
Zfx – Zfy
Freemartin
(n= 100)
(447, 344 y 103 pb)
60,XX/60XY XX= 71 : XY= 29
Zfx – Zfy
Freemartin
(n= 100)
(447, 344 y 103 pb)
60,XX/60XY XX= 35 : XY= 65
Zfx – Zfy
Freemartin
(n= 100)
(447, 344 y 103 pb)
60,XX/60XY XX= 61 : XY= 39
Zfx – Zfy
Freemartin
(n= 100)
(447, 344 y 103 pb)
60,XX/60XY
XX= 12 : XY= 5
Zfx – Zfy
Freemartin
(n= 17)
(447, 344 y 103 pb)
60,XX/60XY
XX= 59 :XY=41
Zfx – Zfy
Freemartin
(n= 100)
(447, 344 y 103 pb)
60,XX/60XY XX= 33 : XY= 67
Zfx – Zfy
Freemartin
(n= 100)
(447, 344 y 103 pb)
60,XX/60XY XX= 47 : XY= 53
Zfx – Zfy
Freemartin
(n= 100)
(447, 344 y 103 pb)
60,XX/60XY XX= 37 : XY= 63
Zfx – Zfy
Freemartin
(n= 100)
(447, 344 y 103 pb)
60,XX/60XY XX= 68 : XY= 32
Zfx – Zfy
Freemartin
(n= 100)
(447, 344 y 103 pb)
60,XX/60XY XX= 45 : XY= 55
Zfx – Zfy
Freemartin
(n= 100)
(447, 344 y 103 pb)
60,XX/60XY XX= 64 : XY= 36
Zfx – Zfy
Freemartin
(n= 100)
(447, 344 y 103 pb)
características anatómicas de los genitales externos al momento del
DISCUSION
Este estudio permitió identificar 19 (95%) bovinos freemartin a través del análisis
citogenético y molecular (PCR), lo que sin duda resalta la alta frecuencia (92%) de este
síndrome reportada en la literatura, cuando se presenta un parto múltiple heterosexual
en esta especie (Marcum, 1974).
Aparentemente cuando el grado de masculinización del freemartin es muy extenso, el
desarrollo de tejido testicular produce suficiente hormona masculina para causar
comportamiento sexual masculino y desarrollo de algunas de las características sexuales
secundarias, tal puede ser el caso del freemartin animal 2 que además de detectar
hembras en celo desarrolló conformación física masculina.
El análisis anatomopatológico de los freemartin con pseudohemafroditismo masculino
(animales 2 y 4), puede ser comparado con un informe similar, Hare (1976), reportó un
freemartin con testículos, conductos deferentes, vesículas seminales, un pene
subdesarrollado y sin evidentes conductos de Müller. Como el freemartin originalmente
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es una hembra genética (60,XX), la presencia de células de macho (XY) en circulación, es
característica diagnóstica, sin embargo, en este estudio en el animal 4, se observó un
porcentaje de células XY muy desviado (100%) y un genotipo Zfx/Zfy (447, 344 y 103
pb). Hare (1976), reportó un freemartin con cariotipo 60,XY en 60 linfocitos analizados y
60,XX/61,XX+c en fibroblastos.
En los freemartins los casos extremos de masculinización de las gónadas pueden formar
tejido testicular, como en los pseudohermafroditas masculinos (animales 2 y 4) de este
estudio. Por otro lado, en el grado menor de masculinización pueden desarrollar ambos
tejidos en las gónadas, testicular y ovárico, e incluso solamente inhibir el desarrollo del
tracto reproductor (Wilkes y col., 1981), tal fue el caso de los animales 7 y 8 de este
estudio.
La presencia de quimerismo (XY/XX) en células gonadales reportada previamente en
toros procedentes de partos múltiples heterosexuales (Rejduch y col., 2000), es
propuesta en los dos casos de síndrome freemartin con pseudohermafroditismo
masculino (animales 2 y 3) de este estudio, ya que en el análisis molecular de ADN de
tejido gonadal de ambos intersexos, se observó un patrón de RFLP para los genes
Zfx/Zfy de 447, 344 y 103 pb.
Entre los pocos reportes de vacas fértiles cogemelas con un macho y con quimerismo de los
cromosomas sexuales, se pueden citar a Eldridge y Blazar (1977), y Smith y col., (1977).
Es posible que la anastomosis vascular y el consecuente paso de células sanguíneas, entre
los gemelos heterosexuales bovinos, conlleve a un quimerismo hematopoyético, mas no
resulte invariablemente en la esterilidad de la ternera, ya que la futura gónada femenina
puede ser sensible al efecto de virilización sólo por un periodo relativamente corto durante
la gestación, y en algunas ocasiones la anastomosis de las membranas fetales pudiera
ocurrir después de la migración de las células germinales y probablemente después de un
periodo crítico de diferenciación del ovario fetal (Smith y col., 1977).
En este estudio se identificó una vaca fértil (animal No. 6) con posible quimerismo
hematopoyético, 99% de sus células mostraron un complemento cromosómico sexual XX y
1% mostró un cromosoma X, más otro cromosoma sexual de identificación no precisa,
aparentemente un cromosoma Y, sin embargo, al realizar una comparación relativa en
tamaño con otros cromosomas sexuales de animales normales, este cromosoma sexual
resultó ser más pequeño que el cromosoma X pero más grande que el cromosoma Y, por lo
que fue necesario realizar análisis moleculares (PCR) para identificar el genotipo para los
genes Zfx/Zfy, obteniéndose un patrón electroforético propio de una hembra (Zfx, 447 pb).
Cabe resaltar además, que dicho hallazgo citogenético fue observado en sólo una de las 100
metafases analizadas, por lo que en esta condición se propone la posibilidad de que este
presente una anormalidad estructural (v. gr., una deleción) del cromosoma X, no obstante,
se sugiere realizar análisis moleculares que incluyan otros marcadores específicos del
cromosoma Y del bovino doméstico, para una mejor comprensión del probable fenómeno
involucrado.
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