Manual de colección, recepción, manejo, transporte y conservación de muestras para análisis bacteriológico Código: M-CCBA-LB-01 1 Revisión: 01 Fecha de emisión: 19/04/10 Página: 1 de 16 CONTROL DE CAMBIOS Y MEJORAS NIVEL DE REVISIÓN SECCIÓN Y/O PÁGINA DESCRIPCIÓN DE LA MODIFICACIÓN Y MEJORA FECHA DE MODIFICACIÓN 01 1 Actualización de las firmas Octubre 2012 02 03 04 05 Elaboró Revisó Aprobó QFB Ana María Sofía Rejón Magaña Responsable del laboratorio Coordinador de la Unidad de Diagnóstico Coordinador de la Unidad de Diagnóstico 1.-OBJETIVO Proporcionar al personal del laboratorio la información sobre la colección, recepción, manejo, transporte y conservación de muestras para análisis bacteriológico. 2.- ALCANCE Aplica para todo el personal del laboratorio de bacteriología. 3.- POLITICAS Todas las muestras enviadas al laboratorio para analisis bacteriologico deberan apegarse a lo establecido en este manual. 2 INDICE Introducción …………………………………………………..………………….… 4 Material para estudio bacteriológico …………………………………….………. 4 Muestras Bacteriológicas: Colección y transporte ……………………….…….. 5 Colección de muestras ……………………………………………..…………….. 5 Transporte de muestras ………………………………………………...………… 5 Recepción y manejo de muestras diagnósticas ……………………..………… 6 Muestras para estudio bacteriológico ……………………………………..…….. 8 Órganos …………………………………………………………………….….…… 8 Piel …………………………………………………………………….……….……. 8 Fluidos …………………………………………………………………….…….….. 9 Exudados o Líquidos …………………………………………………………...…. 9 Exudados nasales ……………………………………………………………….... 9 Exudados vaginales ……………………………………………………………….. 10 Exudados óticos ……………………………………………………………...……. 10 Exudados oculares ……………………………………………………………..…. 10 Orina …………………………………………………………………….………….. 11 Heces …………………………………………………………………….…………. 11 Absceso …………………………………………………………………….…….… 11 Leche para Mastitis ………………………………………………………………... 12 Agua………………………………………………………………………….……… 13 Agua de red de distribución (llave, filtro) ……………………………………...… 13 Agua estancada (estanque, cisterna, pozo y tinacos) ………………………… 13 Alimento …………………………………………………………………….………. 14 Abejas …………………………………………………………………….……….... 14 Referencias …………………………………………………………………….…... 15 3 INTRODUCCIÓN El procedimiento usado para la identificación de agentes infecciosos varía ampliamente. Es importante que la muestra remitida al laboratorio lleve una historia clínica completa, e incluya un diagnóstico tentativo que permita al personal del laboratorio decidir sobre un rango de los posibles agentes y además seleccionar las pruebas y procedimientos adecuados para identificar al patógeno. Un problema común en la microbiología clínica veterinaria es el que resulta a consecuencia del envío inadecuado de muestras que además carecen de historia clínica o comentarios del médico que las envía. Hay que tener en cuenta que poco antes de ocurrir la muerte, los tejidos pueden ser invadidos por un número considerable de bacterias intestinales. El significado sobre la presencia de estos microorganismos, de los cuales algunos pueden ser patógenos, resulta difícil de establecer cuando las muestras fueron recolectadas poco después de la muerte. Por este motivo las mejores muestras son las que se obtienen de animales enfermos sacrificados para realizar necropsias. De cualquier manera, es necesario considerar la importancia de colectar muestras frescas lo más pronto posible después de la muerte. Este capitulo detalla algunos aspectos importantes sobre colección y remisión de muestras al laboratorio de bacteriología. MATERIAL PARA ESTUDIO BACTERIOLOGICO 1.-Antes de iniciar la recolección de la muestra para estudios bacteriológicos, se debe revisar la historia clínica para saber si el animal ha recibido tratamiento con antibióticos en los últimos tres días. 2.-El material para la recolección de la muestra deberá estar en condiciones estériles. La esterilización puede llevarse a cabo en una autoclave en una olla de presión de tipo casero (121°C, 15lb, 15 min.). Si los instrumentos por usar se han sumergido previamente en soluciones antisépticas, debe tenerse cuidado de no usarlos mojados, ya que el contacto con ellas podría inhibir el crecimiento de los microorganismos. Siempre debe trabajarse frente a un mechero de gas o lámpara de alcohol. 3.-Deberá recogerse la mayor cantidad posible de muestras, tomadas de diferentes sitios (tejidos, líquidos, exudados etc.) para tener una buena oportunidad de aislar el agente causal. 4.-Las muestras no procesadas inmediatamente se conservarán en el refrigerador a 4°C. 4 5.-Durante su transporte se deberán enviar en refrigeración. 6.-Las muestras para análisis bacteriológico deben ser tomadas de un animal recién muerto, en todo caso, en un lapso no mayor de 2 horas. 7.-Si pasan más de dos horas después de la muerte del animal se recomienda tomar fracciones de médula hematopoyética de un hueso largo, ya que éste es el último tejido en sufrir invasión bacteriana postmortem. MUESTRAS BACTERIOLOGICAS: COLECCIÓN Y TRANSPORTE. Colección de muestras. Uno de los tres siguientes tipos de muestras es usualmente colectado para cultivo: hisopo, fluido aspirado y muestra de tejido. Las muestras de hisopos son menos satisfactorias. Los hisopos se contaminan con bacterias comensales de las superficies, pequeños volúmenes de muestra puede ser absorbido en los intersticios y puede inhibirse su crecimiento, sobretodo en el caso de bacterias anaerobias debido a que el oxígeno se queda atrapado dentro de las fibras del hisopo. Hisopos de rayón o alginato son los ideales ya que el algodón inhibe el desarrollo bacteriano. Los hisopos pueden ser usados para obtener muestras de conjuntiva y oídos, pústulas de la piel recientemente rotas, heridas profundas e infecciones de tejidos suaves. Muestras de fluido aspirado son convenientes para cultivo y cualquier fluido del cuerpo normalmente estéril (por ejemplo, líquido pleural, peritoneal, pericardio, sinovial ó líquido cerebroespinal así bien como sangre y orina) o para cultivo de exudados líquidos de heridas, abscesos e infecciones profundas. Las muestras pueden ser transportadas en la misma jeringa donde fueron colectadas. Cuando la muestra es tomada por aspiración, el riesgo de contaminación es mínimo y mayores volúmenes son disponibles para cultivo. Las biopsias de tejido es cultivado cuando fluido no puede ser obtenido. Ellos están indicados para cultivo de animales con pyoderma bacteriana, infecciones profundas de tejidos suaves, infecciones de médula y cualquier infección asociada con necrosis de tejido o formación de gas. Las muestras de tejido también tienden a conservar su núcleo microambiental, por medio de eso aumenta la sobrevivencia de las bacterias. 5 Transporte de las muestras. Una especial atención a los métodos y la prontitud del transporte de muestras al laboratorio es necesaria para mantener la sobrevivencia de las bacterias, particularmente bacterias anaerobias y bacterias sensibles a cambios de temperatura, pH (incluyendo muchas bacterias entéricas patógenas. Los hisopos para cultivos aerobios deben ser transportados en un medio de transporte así como el medio de transporte modificado de Stuart. Para anaerobios, los hisopos deberán ser colocados en un medio de transporte especial para anaerobios. Muestras aspiradas pueden ser transportadas dentro de la jeringa o colocadas en un tubo estéril. Muestras aspiradas de líquido cerebroespinal, líquido de coyuntura o sangre puede también ser introducidos asépticamente en botellas de cultivo de sangre y transportadas y cultivadas de la misma manera. La muestras de tejido son mejor transportadas en frascos de vidrio estériles o medios de transporte anaeróbicos. Las muestras fecales si se va a demorar 2 ó 3 horas deberán ser colocadas en un medio de transporte (1 gr. de heces por 10 ml de medio). Un medio de transporte Cary-Blair es conveniente para transportar la mayoría de los patógenos entéricos incluyendo Campylobacter jejuni. Algunas muestras (especialmente líquido cerebroespinal, heces y muestras anaeróbicas) no deberán ser refrigeradas y deben ser cultivadas tan pronto como sea posible. Las muestras remitidas para cultivo deberán ser claramente marcadas (identificación del animal y origen de la muestra) y una historia breve de las condiciones del animal y tratamiento incluidos. El empaque propio o adecuado de las muestras ayuda a proteger de ruptura o extremos de temperatura. RECEPCIÓN Y MANEJO DE MUESTRAS DIAGNÓSTICAS. Es lógico suponer que todas las muestras clínicas son potencialmente infecciosas, y es prudente manejar estos materiales en forma tal que permita impedir razonablemente la exposición franca del personal a los patógenos cuya presencia es más probable, en consecuencia y como precaución mínima los laboratorios clínicos deberán utilizar numerosas prácticas dictadas por el simple sentido común en la recepción y manejo inicial de todas las muestras diagnósticas. Una consideración fundamental que no se puede olvidar es el hecho de que la mayor parte de las muestras para microbiología no son obtenidas por el laboratorista sino por el Médico Veterinario por lo tanto una técnica cuidadosa no es suficiente sin una toma adecuada y correcta de la muestra, por lo que es 6 necesario que dentro de la organización del laboratorio se incluya la provisión de recipientes adecuados y en número suficiente, al igual que un ambiente de cooperación entre el laboratorista y el recolector proporcionando informes y datos completos. Las muestras obtenidas para cultivo bacteriano de un sitio de la infección idealmente deberán ser aquellas más probables a contener el patógeno bacteriano presente. La flora normal podría contaminar las muestras bacteriológicas ya que la piel y las superficies de las membranas mucosas de animales contienen gran población de bacterias. El examen microscópico directo de la muestra es de gran ayuda para confirmar la infección presente y debería ser desarrollado rutinariamente en conjunto con el cultivo. En general, las muestras ideales para cultivo son; tejidos, exudados y pus colectados asépticamente. Cualquier muestra obtenida de sitio estéril por aspiración es conveniente para cultivo. Los resultados de cultivos de muestras obtenidas de piel, especialmente cerca de la superficie de membranas mucosas, deberá ser interpretado cautelosamente. Por ejemplo, hisopos de tractos drenados son inapropiados para el diagnóstico de osteomelitis debido a la alta probabilidad de contaminación por comensales de la superficie y bacterias colonizantes. En su lugar una muestra debe ser colectada por aspiración con una aguja fina o por biopsia. Para maximizar el desarrollo bacteriano, los cultivos deberán ser tomados antes de que el tratamiento antimicrobiano sea iniciado. El volumen de la muestra obtenida es también importante especialmente en fluido cerebroespinal, sangre y líquido sinovial, en los cuales la concentración de los microorganismos es a menudo muy baja. Para cultivo de líquido cerebroespinal de humano varios ml son recomendados de la muestra. Volúmenes muy pequeños de animales pequeños deberán ser suficientes. Hay algunos factores que deben tenerse en cuenta para el estudio microbiológico de una muestra: 1.-Las muestras deben ser lo más frescas posible. 2.-El material debe ser tomado bajo estrictas normas de asepsia. 3.-Cada muestra debe ser rotulada, de modo que sea fácil de identificar. 4.- En caso de enviar órganos el peso de la muestra debe ser mínimo de 100 gr. 5.-La muestra debe venir acompañada de la historia clínica completa. 6.-Especificar claramente el análisis que solicite. 7 7.-Muestras de fluido deben ser de un mínimo de 5 ml. (Ver sección de fluidos) 8.-Muestras de materia fecal para grandes especies deben ser aproximadamente de 4 gramos y para pequeñas especies pueden ser muestras de hisopos en tubos estériles con medio de transporte para estudio de Laboratorio (Ver sección de Heces). 9.- Muestras de leche o agua deben ser traídas en un frasco con tapa de rosca de cierre hermético con una capacidad mínima de 15 ml en el caso de la leche y de 100 ml si se trata de agua. La muestra deberán mantenerse a 4°-5°C. Hasta el momento de ser trabajadas (Ver sección Leche para mastitis). 10.- Muestras de órganos debe ser mínimo de 100 g. En caso de que el órgano sea menor se debe enviar completo. Contenidas en bolsas o frascos limpios (Ver sección de órganos). 11.- En caso de que las muestras se encuentren refrigeradas, dejar a temperatura ambiente por 30 minutos antes de procesarlas. 12.- Todas las muestras procesadas y analizadas deberan permanecer en refrigeración 4°C, en los 2 días posteriores a la entrega de resultados. MUESTRAS PARA ESTUDIO BACTERIOLOGICO ORGANOS Los órganos sanos por lo general están libres de bacterias, por lo que hay que evitar su contaminación con exudados ó contenido intestinal, lo que haría prácticamente imposible un interpretación correcta de los hallazgos bacteriológicos. Se cortan trozos de tejido de un grosor no mayor de 4 cm 2 colocarlos en frasco con tapa hermética o bolsa estériles individuales, de la parte afectada o con lesiones características del agente causal de que se sospeche y se guarda en refrigeración a 4°C hasta el momento de ser procesadas. Generalmente se obtienen por procesos quirúrgicos; la necropsia debe realizarse en condiciones de esterilidad o con la mayor asepsia posible para evitar contaminaciones. Cuando se obtienen especimenes de necropsia es mejor anticipar cuales se requerirán para análisis microbiológico antes de iniciar y obtener éstos primero, antes que la manipulación y la exposición excesivas del tejido causen mayor contaminación. Las muestras de tubo digestivo se toman al final para evitar la contaminación de otros tejidos. 8 Enviar porciones amplias (300 gr. aproximadamente; mínimo 100 gr.) del área de la muestra que presenta la lesión característica de la enfermedad. Deben recolectarse a más tardar una o dos horas después de la muerte del animal. PIEL Seleccionar un área de piel en que se encuentren pústulas intactas. Lavese bien con algodón y alcohol al 70%. Déjese evaporar el alcohol y exprímase el contenido (pústula) entre el pulgar y el índice. Imprégnese hisopos (3 mínimos) con el líquido. En tubos estériles con Solución Salina Fisiológica al 0.85% ó algún Medio de Transporte. El envío será en condiciones de refrigeración. FLUIDOS Estos se pueden obtener con jeringas estériles por medio de punción directa, desinfectando un área de aproximadamente 10 cm. La muestra deberá conservarse en refrigeración. Se recomienda enviar la muestra en la misma jeringa con que se obtuvo para evitar contaminaciones. EXUDADOS O LIQUIDOS Cuando las muestras son exudados o líquidos, se deben aspirar con aguja y jeringa o pipetas Pasteur estériles y vaciar en tubos estériles, siempre cerca del mechero. Si las jeringas son de plástico, puede quemarse la punta de las mismas una vez llenadas, para sellarlas herméticamente Muestras de absceso o de tejido suave sin drenar son fácilmente obtenidas por aspiración con aguja; si la lesión ha sido drenada, la muestra deberá ser obtenida por aspiración con aguja en un punto lejos del sitio drenado ó por aspiración del fondo del tejido infectado. EXUDADOS NASALES Para disminuir la contaminación al mínimo, se deben limpiar las fosas nasales por fuera con un algodón con alcohol al 70% exprimido. Si hay exudado nasal se puede usar un hisopo para obtener la muestra, introduciéndolo lo más lejos posible o lo más profundo de la fosa nasal. 9 Las muestras de hisopos faríngeos o de saliva no son convenientes para algunas enfermedades. Deberán tomarse dos muestras (dos hisopos) de la misma área. Cuando la muestra es obtenida con hisopo hay peligro de que este se seque, por lo tanto hay que colocarlo inmediatamente en un medio de cultivo adecuado para transportarlo (medio de transporte) como el Stuart, para evitar la pérdida de agentes infecciosos durante el envío, al colocar los hisopos en el medio de transporte no romper el aplicador. Las muestras deberán enviarse lo más pronto posible al Laboratorio en una nevera de nieve seca con hielo. EXUDADOS VAGINALES Se realiza un lavado del área con solución jabonosa. Se toma el contenido del fondo del saco vaginal con hisopos o con pipetas estériles. El material extraído se suspende en un tubo estéril con solución salina o en medio de transporte Stuart. Se recomienda enviar la muestra en condiciones de refrigeración. EXUDADOS OTICOS Las excreciones o secreciones para frotis y cultivo deberán obtenerse con hisopo estéril. Debe evitarse la irrigación con agentes desinfectantes o antimicrobianos que reducen la población bacteriana, si no es posible recolectar la muestra con anterioridad a la irrigación se deja pasar un lapso de tiempo razonable (varias horas) entre la irrigación y la colección con el objeto de facilitar un aislamiento positivo. En casos de otitis media se debe obtener la muestra después de limpiar el canal auditivo externo. Este tipo de muestra se deberá trabajar inmediatamente de la obtención, pero si no es posible usar un medio de transporte como Caldo de Soya Tripticasa, Medio de Thioglicolate, Stuart etc. Enviar lo más pronto posible en condiciones refrigeradas EXUDADOS OCULARES Deberá realizarse en las etapas incipientes o en las más agudas de la infección y antes de la aplicación de antimicrobianos o de anestésicos locales ya que tienden a arrastrar los microorganismos del saco de la conjuntiva. Los materiales se recogen con hisopos estériles, si se va a hacer frotis directo, tomar con un asa de platino estéril ó cualquier otro instrumento quirúrgico adecuado. 10 Si hay suficiente secreción se podrá tomar con una pipeta Pasteur estéril. Deberán tomarse dos hisopos por área. Los hisopos deberán sembrarse lo más pronto posible; si no es posible colocarlos en un tubo de ensaye con solución Salina Fisiológica al 0.85% estéril en condiciones de refrigeración. ORINA La orina puede ser obtenida por punción de la vejiga, cateterización o estimulación mecánica de la micción en el orden de preferencia. Todo el material utilizado deberá ser esterilizado. Limpiar perfectamente la zona con un algodón impregnado con benzal diluido. Si la muestra es obtenida por micción mecánica se eliminan los primeros chorros de orina y el resto se colecta en frascos estériles de boca ancha y tapa hermética. La orina es un buen medio de cultivo por lo tanto todas las muestras deberán ser procesadas en el Laboratorio entre las dos horas de obtención o bien guardar en el refriger horas después de la obtención. El envío deberá ser en condiciones de refrigeración y lo más pronto posible. HECES Las muestras de materia fecal para grandes especies deben ser de 4 gramos aproximadamente para estudio de Laboratorio y deberán ser tomadas directamente del recto utilizando guantes de palpación o captarse en frascos estériles. Para animales pequeños o para pequeñas especies pueden utilizarse hisopos introduciendo directamente en el recto y colocándolos después en tubos estériles con medio de transporte. La conservación es en refrigeración en Solución Salina Fisiológica o Medio de Transporte Stuart. El envío debe ser lo más pronto posible y refrigeradas. Evitar que las muestras tarden más de 24 horas en llegar al Laboratorio. ABSCESO En caso de absceso abierto se toma 1 c.c. de exudado no expuesto de preferencia con jeringa estéril, si el animal esta muerto es útil colectar un trozo de cápsula. En caso de absceso cerrado, si se trata de una necropsia, enviarlo completo y con cápsula, si no es posible se envía 1 c.c. de exudado en jeringa estéril. 11 Si el animal está vivo se toma 1 c.c. con jeringa estéril, antes de debridar el absceso y colocar las muestras en Medio de Transporte. El envío será en condiciones de refrigeración. LECHE PARA MASTITIS Se recomienda en la práctica médica realizar periódicamente la prueba de California para detectar las ubres afectadas y prevenir la transmisión o complicación de la mastitis. Una vez detectados los cuartos positivos o afectados se procede a la obtención de la muestra para Análisis Bacteriológico. 1.- Las muestras deberán tomarse inmediatamente antes de la ordeña regular, sin eliminar los primeros chorros de leche, ya que estos contienen mayor número de microorganismos infectantes. Es importante que en el área de muestreo no haya corrientes de aire ni levantamientos de polvo. 2.- Es necesario lavar la ubre y las tetas con agua tibia y limpia y dejarse bien secas al concluir el lavado. 3.- Frotar la punta del orificio de la teta con un algodón humedecido con alcohol al 70% hasta que en el algodón no queden residuos sucios. El alcohol debe evaporarse completamente antes de tomar la muestra. 4.- La muestra deberá ser tomada en un frasco estéril con tapa de rosca con capacidad de por lo menos 15 ml. La teta no deberá tocar el frasco y mantenerlo inclinado protegiendo la boca del frasco con tapa, evitando contaminación con bacterias del medio ambiente. El técnico o persona que tome la muestra deberá desinfectarse las manos con alcohol entre cada hasta el momento de ser trabajadas. El envío se hará e n refrigeración identificando cada tubo apropiadamente por ejemplo 1-1, 1-2, 1-3, 1-4, indicando que es la vaca #1 y los números 1,2,3, y 4 corresponden a los cuartos delantero derecho, trasero derecho, trasero izquierdo y delantero izquierdo respectivamente. Es importante enviar una breve historia clínica con los datos del animal. Los mejores resultados se obtienen con muestras tomadas dentro de las 24 horas. 12 AGUA Se requieren frascos estériles de boca ancha, cierre hermético y con capacidad mínima de 100 ml. Obtención: Agua de Red de Distribución (llave, filtro). 1.- Abrir la llave y dejar correr el agua por 1 minuto. 2.- Improvisando un mechero (algodón mojado con alcohol y sostenido con una pinza) flamea la boca de la llave procurando especialmente esterilizar la superficie de la boca. Otra manera seria limpiar la salida del agua por medio de una torunda de algodón tallando hasta que no se desprenda más suciedad u óxido. 3.- Abrir nuevamente la llave y dejar correr el agua durante 1 minuto, al cabo del cual se puede tomar la muestra. 4.- Llenar el frasco 2/3 de su capacidad. Al destapar el frasco y durante toda la maniobra tener cuidado de no contaminar la boca del frasco ni el interior del tapón. 5.- Cerrar perfectamente el frasco y cerciorarse de que no hayan fugas. Agua Estancada (estanque, cisterna, pozo y tinacos). 1.- Introducir el frasco destapado, con la boca hacia abajo, sosteniéndolo por la base. 2.-Girar el frasco impulsarlo suavemente hacia arriba de manera tal que al salir de la superficie se haya llenado 3/4 partes de su volumen. Tapar el frasco. Si el agua va a ser tomada de agua en movimiento como la de un arroyo, se efectuara una maniobra similar, ejecutando el desplazamiento en dirección opuesta a la corriente. Conservación a temperatura de 4° a 10°C. Debe ser trabajada lo antes posible. El tiempo para almacenar o transportar muestras de agua y comenzar el análisis no debe exceder de 6 horas para las aguas impuras ni de 12 horas para las relativamente puras. Recogida y conservada la muestra, se produce un rápido cambio en su categoría bacteriana. Generalmente el número de microorganismos muestra un notable aumento, gradual unas veces y rápidos otras. 13 Esto obedece a la multiplicación de las bacterias típicamente acuáticas, pues las bacterias patógenas y otras que suelen albergarse en el intestino del hombre y de los animales tienden a morir muy pronto. El envío será en frasco estéril de boca ancha con los datos de identificación como la fuente, fecha y hora de muestreo. Nota: para muestreo de aguas cloradas, los frascos deberán prepararse depositando 0.1 ml de solución de Tiosulfato de Sodio al 10 % antes de la esterilización. ALIMENTO La obtención varía de acuerdo con la naturaleza y consistencia del alimento. Para las harinas de carne, pescado etc. la obtención se hará de diferentes niveles (fondo , parte media, y superficie), las muestras serán colectadas en bolsas de plástico limpias. En caso del sustituto y del concentrado la muestra tomada será de aproximadamente 100 gramos por nivel. Se deben conservar en un lugar fresco y seco. El envío será en bolsas de plástico nuevas, y se deben conservar en un lugar fresco y seco. ABEJAS Los panales de cría se seleccionan básicamente los que contengan crias en todos los estados de desarrollo y se corta un pedazo de uno 10 a 15cm2 asegurándose que esta sección lleve consigo cria afectada (muerta, con cambios de color, etc.). La muestra deberá envolverse en papel periódico u otro material que permita la ventilación y luego enviarse en una caja de cartón perfectamente identificada. Las muestras deberán conservarse en un lugar limpio y fresco. 14 REFERENCIAS Dow, S.D., Jones R.l., Rosychuck R.A.W. (1989).Colorado State University. 686 Vol.VI No.6 June 1989. Continuing Education Article # Alvarez M.C.I., Mendoza E.S.E.(1994). Manual básico de bacteriología. Facultad de Estudios Superiores Cuatitlan. UNAM. Carmona O., Gomez M.J., Montes T. Marcano C. Marino F.(1997). Microbiología Médica , de Divo. 5º.Edición. 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