Leucosis Bovina: No todo est á perdido

Leucosis Bovina: No todo está perdido
Laboratorio de Virus
Adventicios
Instituto de Virologia
INTA Castelar
ktrono@cnia.inta.gov.ar
APROCAL 23 / 09 /2010 Rafaela
Virus de la Leucosis Bovina=Infección Persistente
Retroviridae Linfocitos B
Provirus
Glóbulos blancos, plaquetas (teñidas de
violeta), un linfocito T (teñido de verde) y
monocitos (teñidos de dorado) vistos a través
de un microscopio electrónico.
© 2000 Dennis Kunkel, Ph. D.
1. Respuesta
serológica
Persistente
2. Recuento de
blancos
normal (70%) o
elevado
3. Carga proviral
variable (1-50%)
4. Linfosarcoma
(≤10%)
FUNCIONAN
LAS ESTRATEGIAS ACTUALES ?
(AGUJA/JERINGA/GUANTE/etc)
Diagnóstico 2010 (%)
94
100
100
100
95
100
94
97
94
99
95
92
99
94
96
86
99
95
93
100
94
91
100
93
96
85
95
67
100
94
ELISA P24 – INSTITUTO DE VIROLOGIA-INTA N=30, todos controlan iatrogenia
Que hay que hacer ?:
Cortar el ciclo
epidemiológico
de transmisión
1.Conocer la progresión desde el
nacimiento
2. Evaluar fuentes de infección natural y
puntos de control
Conocer la progresión desde el nacimiento
100%
85,8%
90,7%
rp24-ELISA positive animals (%)
80%
63,7%
Terneras nacidas durante
2 meses de madres infectadas
60%
40%
Seguimiento hasta 36 meses
20%
2006-2009
0%
Total
n = 802
Vacas
n = 656
Vaquillonas
n = 146
Calostrado-Leche en balde-60 días estaca
15-18m=IA, 27-30m: 1ºlactancia
Animales infectados (%)
Periparto y primer año
100
Consumo
Calostro + leche
80
60
40
20
11,5%
10,2%
11,1%
11,1%
11,3%
3 meses
6 meses
9 meses
12 meses
0
1 semana
7/61
6/53
Nuevas Infecciones
7
0
0
0
Inmunidad calostral (%)
Ac Virus
87
73
19
0
Ac p24
88
58
23
0
nacim
3meses
6 meses
9meses
Correlación título/duración, Spaerman p= -0.77, p= -0.61
Animales infectados (%)
Segundo año
100
IA
80
60
40
20
15.09%.
17%
19.23%
21,5%
0
15 meses
18 meses
21 meses
24 meses
Nuevas Infecciones
2
1
2
2
Animales infectados (%)
Tercer año
100
80
61.76%
60
40
40%
24%.
20
0
27 meses
30 meses
36 meses
Edad
27
30
36
Tambo
3
15 (65% BLV)
31
Preñadas
47
35 (28% BLV)
3
NUEVAS
INFECCIONES
1
5
7
11% nacen infectados
Durante 12 meses no hay progresión de la
infección (11%)
A los 24 meses la infección se duplica (21%)
La entrada al tambo es un punto crítico en la
progresión de la infección (60%)
2- Evaluar fuentes de infección natural y puntos de
control
CARGA PROVIRAL : CANTIDAD DE PROVIRUS EN CELULAS DE
SANGRE CIRCULANTE (CC + / CC -)
A
PCR
tiempo
real
A
ALTA
>26
+ 5%
M
MEDIA
2626-30
1-5%
B
BAJA
3030-36
0.050.05-1-%
I
INDETECTABLE
>36
- 0.05%
M
B
I
CARGA PROVIRAL SANGRE
PVL
TOTAL (%)
VACAS (n=38)
VAQUILLONAS (n=10)
A
29.1
26.3
40
M
31.2
34.2
20
B
20.8
21
20
I
18.7
18.4
20
correlacion recuento de blancos/carga proviral
11200 LP 3ºq
copias provirus/ug DNA
1400000
1300000
1200000
1100000
1000000
900000
800000
700000
600000
500000
25% cc infectadas
400000
300000
200000
100000
5% cc infectadas
0
1% cc infectadas
0
2500
5000
7500
10000
12500
15000
17500
20000
22500
25000
blancos/ul sangre
22/48 ≤ 5% cc infectadas
19/48 ≤ 1% cc infectadas
(39,5%)
27500
30000
32500
35000
37500
CARGA PROVIRAL CALOSTRO
PVL
TOTAL
VACAS (n=38)
VAQUILLONAS (n=10)
A
0
0
0
M
0
0
0
B
74
75
66
I
26
25
34
50% calostros = nPCR +
CARGA PROVIRAL Leche
PVL
TOTAL
A
0
M
0
B
19
I
81
42% LECHES = nPCR +
Cual es la razón de la progresión rápida ??
1- latencia y reactivación periparto
2-transmisión por leche vía
ascendente
3- transmisión por contacto
Puntos de control temprano
Al nacimiento
Al año
Generar un rodeo de baja carga proviral
1.
Segregació
Segregación selectiva
2.
Vacuna atenuada: fase experimental
Vacuna atenuada : ??????
GENES REGULATORIOS
GENES ESTRUCTURALES
TAX
POL
LTR
REX
GAG
ENV R3
LTR
G4
PROVIRUS
PARTICULA VIRAL
Gillet et al, 2007, Retrovirology 4:18
CONSTRUCCION PROVIRUS MODIFICADO
1- clonado provirus salvaje
env
BLV
pol
tax/rex
R
LT
8476
LT
R
gag
Infeccioso en
bovinos y ovinos
Produce enfermedad
en ovinos
0
Plasmido
ampR Ori
Willems et al, (1992) Virology 189: 775-777
Willems et al (1993) Journal of Virology 67: 4078-4085.
CONSTRUCCION PROVIRUS MODIFICADO
2- modificación provirus salvaje
POL
LTR
GAG
ENV
TAX
REX LTR
R3
G4
Proviral load
100
80
60
pBLV DX es infeccioso pero replica con
menor eficiencia en ovinos
40
Willems et al, 1994 PNAS
20
***
0
BLV
DX
pBLV DX no es
patogenico en ovinos
Florins et al, 2007, J. Virol.
CONSTRUCCION PROVIRUS MODIFICADO
3- modificación provirus salvaje
POL
LTR
GAG
ENV
TAX
REX LTR
R3
G4
env
BLV 6073 reduce replicacion viral in vitro
Willems et al, 1995, Journal of Virology
CONSTRUCCION PROVIRUS MODIFICADO
4- doble mutante
LTR GAG
POL
TAX
ENV
REXLTR
R3
G4
ENV
TAX
REXLTR
pBLVDX
pBLV6073
pBLV6073DX
6073
6614
pol
6997
Variante vacunal
env
HindIII
tax/rex
gag
R
LT
LT
R
LTR GAG
POL
ENV
TAX
REXLTR
R3
/G4
LTR GAG
POL
8476
(3000bp)
SP
0
6 pSP64
(650bp)
(450bp)
HindIII
R
amp Ori
pBLV6073DX es una potencial vacuna
Ensayo#1
Ensayo controlado a box (2009-INTA)
Autorizacion CONABIA y SENASA
n=3 (doble mutante )+ cepa salvaje (3) +
centinelas (3)
- pBLV6073DX es infeccioso en bovinos (3/3)
-Baja carga proviral (indetectable 3/3)
-Respuesta inmune persistente
-No se transmite a centinelas en contacto
pBLV6073DX es una potencial vacuna
Ensayo#2
Ensayo controlado a campo
(2010-2011 INTA)
Autorizacion CONABIA y SENASA
n=10 (doble mutante) + salvaje (5)
+centinelas (35) + infectados naturales
(10)
- se transmite al ternero?
-se transmite a centinelas por contacto?
-Genera inmunidad calostral?
-Cinètica de carga proviral y expresiòn viral
-Protege frente al desafìo natural
pBLV6073DX es una potencial vacuna
Ensayo#3
Ensayo controlado a campo en
condiciones productivas
(2012)
Autorizacion CONABIA y SENASA
n=10 (doble mutante) + + infectados
naturales + centinelas
SE BUSCAN VOLUNTARIOS
Infectar para proteger ?
Irene Alvarez
Dr. Luis Calvinho
Proyecto INTA AESA 203992
Geronimo Gutierrez
Dr Mario Poli
Proyecto MinCYT PAE
Cintia Gonzalez
Dr Luc Willems
Proyecto CONICET-FNRS DS932
Romina Politzki
Luciana Caviglia
Cecilia Martinez
Mariela Gammella
Victoria Tomassini
Dra. M. J Dus Santos
Gracias
ktrono@cnia.inta.gov.ar