Inmunofluorescencia

I. INTRODUCCIÓN
El sistema inmune es capaz de reconocer estructuras de superficie de macromoléculas con pesos
moleculares mayores de 5000. Sin embargo, la proporción contra la cuál va dirigido el anticuerpo, es
decir, el determinante antigénico, comprende solamente una parte menor de la molécula. Las
macromoléculas que estimulan la formación de anticuerpos se denominan inmunogénicas. Otras
moléculas pequeñas no inmunogénicas, pero que son reconocidas por los anticuerpos, denominadas
haptenos, pueden desencadenar una respuesta inmune si se acoplan a moléculas mayores, generalmente
denominadas portadoras.
El anticuerpo que reconoce un determinante antigénico específico es un miembro de la familia de
proteínas séricas denominadas inmunoglobulinas. Cada molécula de inmunoglobulina es un complejo
de cuatro polipéptidos que forman una estructura simétrica a modo de Y, y contiene dos cadenas
idénticas de bajo peso molecular llamadas cadenas ligeras, y otras dos de alto peso molecular, también
idénticas, llamadas cadenas pesadas. Las cadenas están unidas por puentes disulfuro. Hacia el segmento
amino−terminal cada cadena presenta una posición variable, que es por donde reconoce al antígeno y
donde tiene lugar la reacción antígeno!anticuerpo.
Hay cinco clases de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, que se diferencian por las cadenas
pesadas que poseen. El tipo de anticuerpo que se produce a gran escala en la respuesta secundaria, y
que se utiliza fundamentalmente para todas las técnicas inmunocitoquímicas, es la IgG. La molécula de
IgG se separa frecuentemente en fragmentos proteolíticos para estudiar los fragmentos de unión al
antígeno (Fab) comparados con la que une al complemento (Fc).
Las propiedades de estas técnicas son:
• Alta especificidad, por lo que se unen fuertemente.
• Alta selectividad, por lo que pueden diferenciar dos antígenos muy similares.
• Alta sensibilidad, porque pueden detectar cantidades muy bajas de antígeno.
• Estequiometricidad, existe una proporción entre la cantidad de antígeno y la cantidad de
reacción antígeno !anticuerpo.
El propósito de estas técnicas es el de localizar el complejo específico antígeno!anticuerpo, ya que éstos
no son visibles directamente al microscopio. Se han desarrollado varios métodos, directos e indirectos,
para la detección del complejo Ag!Ac. Así, mientras que en los métodos directos el marcador se acopla
al anticuerpo específico, en los métodos indirectos el complejo antígeno!anticuerpo se detecta con un
anticuerpo secundario marcado, dirigido contra el anticuerpo primario específico.
A. TÉCNICAS DE INMUNOFLUORESCENCIA
Las pruebas de inmunofluorescencia (IF) se basan en que, cualquier antígeno, puede ser marcado
específicamente con un fluorocromo coloreado, a través de un anticuerpo (Ac) específico. Cuando se
irradia este elemento con luz ultravioleta o azul se hace fluorescente. Dos de los métodos utilizados son:
• Método directo
En este método se utiliza antisuero marcado para cada sustancia que se investigue (bacteriano, vírico o
proteico); así, cuando el suero antisalmonela fluorescente se aplica a una extensión, procedente de un
cultivo que contenga microorganismos del género Salmonella, reacciona con el antígeno homólogo,
demostrándose una reacción específica antígeno!anticuerpo por fluorescencia de las bacterias
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revestidas con el anticuerpo.
B. Método indirecto
El antisuero (por ejemplo el de antisalmonela preparado en conejo) no se marca, sino que se emplea
conjugado con suero antiglobulina fluorescente, a través de una técnica en dos tiempos. La extensión
con la bacteria en cuestión se inunda con el suero conejo antibacteriano. Después de 10−30 minutos, el
suero que no haya reaccionado se elimina mediante lavado, tratándose a continuación con globulina
anticonejo fluorescente. Las células bacterianas que hayan reaccionado con el antisuero, estarán
revestidas con el anticuerpo (globulina) de conejo, y en consecuencia, reaccionarán con la globulina
anticonejo marcada, de tal manera que se pueden identificar por la fluorescencia.
Cuando es preciso detectar el antígeno, la elección entre estos métodos, están en parte determinada por
el número de microorganismos diferentes, que hayan de ser identificados en la muestra, por ejemplo,
los corpúsculos rábicos cerebrales sólo tienen un antígeno, y en consecuencia, se debe emplear el
método directo. Los virus respiratorios de las secreciones tienen muchos antígenos, por lo que estaría
más indicado el método indirecto, ya que, si no se hace así, sería preciso conjugar cada suero. Si todos
los antisueros empleados, en los métodos indirectos, se obtienen en el mismo huésped, únicamente será
necesario un conjugado antiespecie. El método indirecto es más sensible que el directo porque tiene
mayor número de sitios para que se produzca la combinación, al mismo tiempo que, permite la
identificación de anticuerpos específicos. El isotiocianato de fluoresceína es el conjugado más empleado,
presenta una banda de adsorción primaria de 495nm y produce la emisión verde a un máximo de
520nm.
INMUNOFLUORESCENCIA EN EL DIAGNÓSTICO DE SÍFILIS
La prueba emplea la técnica indirecta antes explicada y cuyos reactivos son antígeno, Treponema
pallidum (cepa de Nichols) cultivado en testículos de conejo, el conjugado fluorescente, suero de cabra
(antiglobulina humana) unido al isotiocianato de fluoresceína, y el suero problema, tomado del paciente
e inactivado a 56°C durante 30 minutos. La prueba, denominada FTA−200 por utilizar suero del
paciente diluido a 1:200, si bien es de gran utilidad en la sífilis temprana, no lo es en la enfermedad
tardía, debido a la alta dilución del suero que es necesario lograr para evitar resultados falsos positivos
y que, sin embargo, alcanzan hasta 20 por ciento. Con la llamada FTA−ABS se eliminan los falsos
positivos, absorbiendo previamente con el treponema de Reiter los anticuerpos treponémicos
inespecíficos, creados por el organismo en respuesta a especies saprófitas.
De existir anticuerpos específicos, los treponemas aparecen fluorescentes (reactiva o positiva), con
variación desde moderada hasta fuerte. En caso de ausencia de anticuerpos específicos, los treponemas
no mostrarán fluorescencia o lo harán apenas débilmente (no reactiva o negativa). La sensibilidad de la
prueba FTA−ABS se estima de 80% en la sífilis primaria y 100% en la secundaria. En la tardía es tan
específica como la prueba de inmovilización del treponema y más sensible.
II. REALIZACIÓN DE LA PRÁCTICA
En la práctica vamos a utilizar el método de inmunofluorescencia indirecta para averiguar si en un
suero problema dado existen anticuerpos frente a Treponema pallidum.
• MATERIALES
Disponemos de un porta con diez pocillos en cuyo interior hay T. pallidum inmovilizado; control
positivo, que contiene anticuerpos frente a T. pallidum; control negativo, sin anticuerpos frente a T.
pallidum; tampón BABS, conjugado antiinmunoglobulina G marcado con fluoresceína, que cuando se
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estimula con luz ultravioleta emite fluorescencia verde.
• MÉTODO DE REALIZACIÓN
• Cubrimos dos de las extensiones con 10l de tampón BABS (testigo conjugado), otros dos con 10l de
sorbente (testigo sorbente). Cubrimos las otras extensiones con 10l de cada dilución de los sueros
problemas y los sueros testigos.
• Incubamos 30 minutos a 37° C en una cámara húmeda. Lavamos en PBS−Tween 2 veces durante 5
minutos. Enjuagamos rápidamente en un baño de agua destilada. Escurrimos y dejamos secar.
• Cubrimos cada extensión de 10l de globulina anti−humana diluida en tampón BABS.
• Incubamos 30 minutos a 37° C en una cámara húmeda. Lavamos los portas en PBS−Tween 2 veces
durante 5 minutos. Pasamos rápidamente por un baño de agua destilada. Dejamos secar.
• Observación de los resultados en microscopio de campo oscuro.
• RESULTADOS
Resultados esperados
En los pocillos en los que se añadió suero con anticuerpos frente a T. pallidum éstos se unirán a los
antígenos de T. Pallidum contra los que son específicos, y al añadir el complejo antiinmunoglobulina G
marcado, se unirá a los anticuerpos. Al mirar en el microscopio de campo oscuro. Se observará
fluorescencia.
En los pocillos en los que el suero añadido no lleva anticuerpos frente a T. Pallidum no se unirá al
antígeno, y al añadir la antiinmunoglobulina G marcada éste tampoco se unirá al anticuerpo. No se
observará fluorescencia.
Resultados observados
Podemos observar en el microscopio de campo oscuro células treponémicas de color verde debido a la
fluorescencia; por tanto, concluiremos decidiendo que
Se observan treponemas en las muestras estudiadas
ELISA O INMUNOABSORCIÓN LIGADA A ENZIMAS
• INTRODUCCIÓN
La prueba de inmunoabsorción ligada a enzimas (ELISA) constituy uno de los inmunoensayos
primeramente descritos por Engvall y Perlmann en 1971, y posteriormente, aplicados por Voller y
colaboradores. ELISA tiene la ventaja sobre las técnicas de inmunofluorescencia de su mayor
sensibilidad ya que, el enzima actúa catalíticamente y de forma objetivable, por lo que es posible medir
la densidad óptica de la coloración final.
Existen dos importantes variaciones en relación con ELISA. En rimer lugar, que los anticueros o
antígenos soluble se pueden hacer insolubles por adsorción a una fase sólida, como pueden ser las
placas de microtitulación o los tubos de poliestireno. La adsorción depende también dl tiempo,
temperatura y pH. Algunos métodos precisan que las placas se mantengan durante toda la noche a 4°
C, en un tampón de pH elevado. En segundo lugar, los antígenos o anticuerpos se pueden conjugar al
enzima sin pérdida de actividad. Se han utilizado toda una variedad de enzimas, entre los que citaremos
la fosfatasa alcalina, la peroxidasa dl rábano picante y la glucosa−oxidasa. El 4−nitrofenil fosfato o
sustrato usado para la fosfatasa alcalina no es peligroso, a diferencia del ácido 5−aminosalicílico o
sustrato de la peroxidasa del rábano, que se considera carcinognético. La hidrólisis de éstos sustratos
da, respectivamente, un color amarillo (: 405nm) y oscuro (: 450nm).
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La preparacion de conjugados se consigue, en el caso de la fosfatasa alcalina, mediante la unión
covalente con glutaraldehido. La fracción inmunoglobúlinica de la globulina antiespecie se aisla por
precipitación salina. Ésta se combina con el enzima en la proporción 3:1. La mezcla se incuba con
glutaraldehído al 0.2% durante 2−4 horas a temperatura ambiente. El glutaraldehído libre se elimina
por diálisis. Se debe añadir un estabilizante enzimático antes de proceder a su conservación a 4°C,
quepud prolongarse hasta 12 meses.
Las técnicas ELISA tienen numerosas aplicaciones en bacteriología, parasitología y virología.
• Método indirecto
• Añadir sobre cada excavación de la placa de microtitulación 200l de antígeno a la concentración
óptima. Incubar toda la noche a 4°C con tampón para baño.
• Aclarar dos veces en tampón para lavado, manteniendo la duración del enjuagado entre 5 y 10
minutos.
• Adicionar 200l de suero diluido e incubar a temperatura ambiente , durante 2 horas. Repetimos el
punto 2.
• Añadir 200 l de antiglobulina fosfatasa alcalina a la concentración óptima. Incubar durante 2 horas
a temperatura ambiente. Repetir el punto 2.
• Adicionar 200l de sustrato con fosfatp en tampón dietanolamina, bien permitiendo que la reacción
tenga lugar hasta que presente el color adecuado, al compararlo con un control positivo, bien
manteniéndola a lo largo de 30 minutos.
• Para la reacción añadir 50l de NaOH 3 M.
• El nivel de hidrólisis o de cambio de color es proporcional a la cantidad de anticuerpo de la muestra
problema. Este cambio de color se puede comparar con los controles y efectuar la lectura
directamente o se lee en un espectrofotómetro a 405nm.
• Método del sandwich con doble anticuerpo para la detección de antígenos.
Es similar a la técnica anterior con la excepción de que el anticuerpo se fija a la placa. Se añade la
solución problema con el antígeno, así como un enzima marcado con un anticuerpo específico.
• ELISA de competencia para detección de antígenos
El anticuerpo se adsorbe a la placa y se comparan los resultados de dos series de pruebas, una de ellas
se prepara con antígeno marcado con el enzima y, la otra, con antígeno marcado con el enzima, más
antígeno problema o desconocido. En este último caso se produce competencia entre el antígeno
marcado y el antígeno problema, con respecto al sustrato representado por el anticuerpo.
Resultados
Se pueden expresar de diversas formas:
• Positivo o negativo, determinando el umbral de absorbacia, mediante pruebas con varios negativos
conocidos.
• Título, en el que la dilución final se considera equivalente a una serie de muestras negativas
conocidas.
• Proporcional a un grupo de negativos conocidos.
• Mediante un valor de absorbancia, haciéndose la prueba bajo condiciones normalizadas y definitivas.
2. REALIZACIÓN DE LA PRÁCTICA
Nosotros vamos a utilizar el método competitivo. Tenemos una serie de tubos que están sensibilizados
frente al antígeno que queremos detectar. En el método competitivo adicionamos al mismo tiempo el
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suero problema y el conjugado.
In antiT4 tubes (R1) In EIA tubes
Dispense:
Standars (R2)
Control (R3)
Samples
Conjugate solution
Standars
50 l
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_
500 l
Control
_
50 l
_
500 l
Samples
_
_
50 l
500 l
Reagent blank
_
_
_
_
• Mover en un Vortex o equivalente.
• Incubar 1 hora a 18−25° C alejado de la luz.
• Tirar el líquido sobrante.
• Rápidamente (en menos de 2 minutos) dispensar la solución de lavado.
• Tirar el líquido sobrante.
• Repetir el procedimiento de lavado.
Color working solution 500 l
500 l
500 l
500 l
− Incubar durante 30 minutos a 18−25 °C en la oscuridad.
Stopping reagent
500 l
500 l
500 l
500 l
• Mover en un Vortex o equivalente.
• Leer a 492 nm frente al blanco.
• RESULTADOS
Tubos
Control
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4
5