Introducción. El desarrollo del conocimiento biológico es muy acelerado, acompañado de un glosario que se hace cada vez más difícil para el clínico. Editoriales de revistas médicas y quirúrgicas han recomendado estudiar la biología moderna y ponerse en contacto con investigadores a fin de comprender estos avances. Introducirse en la biología molecular al nivel actual implica la comprensión de interrelaciones moleculares y de complejos mecanismos, para entender el control genético que regula el ciclo celular y las alteraciones que producen las mutaciones de tales genes permitiendo una proliferación descontrolada. Los avances extraordinarios de la biología en los últimos años conforman un campo de gran interés para el clínico. En los últimos 5 años se ha producido un desarrollo acentuado en el conocimiento del fenómeno contrario a la proliferación y neoplasia, cual es la "muerte celular programada" o apoptosis. Normalmente existe un equilibrio entre la reproducción celular y la apoptosis a fin de mantener la población adecuada al momento en que los tejidos han llegado al estado adulto de desarrollo. La división autosómica es permanente con excepción de algunos grupos celulares, como las neuronas y cardiomiocitos. Durante el desarrollo embriológico, la reproducción celular es mayor que la apoptosis, aunque en ciertos momentos, la segunda predomina cuando deben desaparecer tejidos como las membranas interdigitales, branquias, elementos cloacales, etc. cuya persistencia forman alteraciones congénitas. Fisiológicamente la apoptosis juega un rol importante en las atresias, como sucede en la atresia folicular del ovario. La división somática produce en forma constante miles de millones de células nuevas y para mantener la homeostasis tisular debe desaparecer alrededor de la mitad de ellas. Así mitosis y apoptosis mantienen el equilibrio celular en los tejidos. Un autor ha señalado en forma muy acertada, que la muerte del organismo humano es una tragedia; pero la muerte permanente de la mitad de sus células es esencial para su existencia. La apoptosis es un fenómeno biológico fundamental, permanente , dinámico e interactivo. Existen mecanismos pro o anti apoptósicos, regulados genéticamente, que actúan en forma activa (pues consumen energía) y equilibrada. Como función necesaria para evitar la sobreproducción celular era sospechada por los biólogos; pero es un proceso ordenado y "silencioso" que no produce reacción tisular y por ello difícil de captar. Recién en 1972, Kerr y col., estudiando organelos en células neoplásicas, detectaron que muchas células desaparecían en los cultivos. Esto llevó al estudio de imágenes cinemáticas, que mostraron mediante microscopía electrónica las alteraciones que sufre la célula en un proceso que es de corta duración, demorando en tales cultivos menos de una hora. La apoptosis puede estar frenada, en equilibrio o estimulada. Por ejemplo, está frenada durante el desarrollo de espermatogonias, en las criptas de las glándulas intestinales (que es un epitelio de crecimiento rápido) y durante la lactancia en su período preparatorio, en que el tejido mamario aumenta su masa celular. Está 1 en equilibrio respecto de la mitosis en los tejidos adultos sanos. Se ha observado en epitelios adultos normales del hígado, mama, corteza suprarrenal y tubo digestivo. Es muy significativo su rol homeostático en la médula ósea, donde debe destruir en forma permanente, la mitad de una inmensa cantidad de células que solo en leucocitos significa 5 x 10 elevado a 11, cada 24 Hrs. Está estimulada cuando existen células envejecidas, mutadas neoplásicas o no neoplásicas, alteradas por tóxicos y las que están en proceso de metamorfosis o atresia. Se ha estudiado esta condición en neutrófilos envejecidos, en megacariocitos con citoplasma agotado por producción excesiva de plaquetas, en la atresia folicular del ovario, en folículos pilosos en evolución y en la mama durante la involución post−lactancia. Apoptosis. Dos formas de muerte celular son habituales en el organismo: necrosis y apoptosis. Las características morfológicas de ambas, permiten, en la mayoría de los tejidos establecer claras diferencias. En la necrosis se observan numerosas células vecinas sometidas a este proceso, cubriendo una extensión variable con desintegración. La destrucción de la membrana celular permite el escape al exterior de elementos tóxicos que provocan un proceso inflamatorio que tendrá efecto nocivo en el organismo, según la extensión del proceso. El material cromatínico sufre una dispersión irregular. Las causas son agentes tóxicos, traumáticos e hipóxicos; siempre patológicos. En la apoptosis el proceso afecta a determinadas células, no necesariamente contiguas y no a todas en un área tisular. La membrana celular no se destruye, lo que impide el escape al espacio extracelular de su contenido , resultando un proceso "silencioso", sin inflamación. En el citoplasma se produce granulación fina, con conservación de algunos organelos, en especial las mitocondrias que tienen un rol interactivo importante. A nivel nuclear la cromatina se condensa agrupada en varios sectores formando cuerpos apoptósicos. La membrana celular se recoge sobre las eminencias globuliformes que forman los elementos deteriorados del citoplasma y núcleo. Finalmente, fagocitos captan la célula en su totalidad impidiendo en una acción impecable, que se produzca alarma en el resto del tejido. Se ha demostrado, al menos en tejidos epiteliales, que si algo de material apoptósicos escapa a la acción de los fagocitos, es captado por células vecinas. La participación de células vecinas en este proceso se manifiesta además por la capacidad de éstas de enviar señales moleculares a la célula que debe morir, como mecanismo complementario al que desarrolla la célula misma cuando se determina molecularmente su autodestrucción. El proceso de apoptosis demora entre 30 y 60 minutos en células en cultivo. Uno de los más lentos se produce en células hepáticas empleando como promedio 3 horas. El estudio e identificación específica de cuerpos apoptósicos se ha logrado con tinciones derivadas de la uridina ( aparece en publicaciones en inglés con el nombre de TUNEL en que la U 2 corresponde a uridina). Sin embargo, en algunas células como las neuronas, la uridina tiñe también tejidos necróticos perdiendo la especificidad. En tales casos se recurre a anticuerpos monoclonales capaces de reconocer fragmentos de ADN integrados en los cuerpos apoptósicos. La imagen que da la apoptosis al microscopio electrónico se caracteriza por la presencia de fragmentos de cromatina agrupados en conglomerados globuliformes, la granulación fina del contenido citoplasmático, la persistencia de algunos organelos hasta el final del proceso, como las mitocondrias y la integridad de la membrana celular. Dado que la apoptosis actúa como oponente a la mitosis, es muy importante su relación con el ciclo celular. En el ciclo celular hay cuatro fases: mitosis, fase de control celular G1, síntesis de ADN y fase de control G2. La apoptosis puede iniciarse en el tercio final de G1 para impedir que una célula dañada ingrese a la fase de síntesis de manera que las mutaciones no se reproduzcan durante la réplica del ADN ingresando así a la especie y en la fase G2 para impedir que las células que no hayan llegado a la madurez entren en mitosis. Los motores del ciclo celular son complejos proteicos, formados por subunidades llamadas ciclinas y kinasas ciclino dependientes, sintetizados por genes específicos. La síntesis de estos complejos es constante porque son inestables. De ahí que el nivel de ellos varía de acuerdo al momento evolutivo de la fase a que están asignados. Así en el avance de la fase G1 a la de síntesis actúa la ciclina D asociada a las kinasas ciclinodependientes 2, 4 y 6 (cdk 2 4 6). En la segunda mitad del G 1 aumenta la presencia de ciclina E con la kinasa ciclinodependiente 2. En la fase de síntesis actúa la ciclina A con cdk 2 y en la fase G2, la ciclina B con cdk 2. En la fase G1 se han podido determinar dos puntos importantes: G o (en la mitad de la fase) donde el ciclo puede detenerse, la célula bloquea su crecimiento; pero se mantiene metabólicamente activa y un punto de restricción (en unión de los 2/3 con 1/3 final de esta fase) en que se puede detener el ciclo para corregir defectos celulares (en especial de su ADN), lo que si no se consigue induce el mecanismo de muerte celular. En la fase G2 también existen elementos de detección de inmadurez celular que inducen la apoptosis cuando la célula no está capacitada para entrar en mitosis. De esta manera, durante el ciclo celular se determina cuándo la célula debe entrar en el proceso de autodestrucción o continuar el ciclo y dividirse. Se ejerce así un balance entre mitosis y apoptosis, regulando la población celular de cada tejido. En el mecanismo molecular que controla la apoptosis actúan varios agentes, de los cuales uno de los más importantes y mejor estudiados es el complejo de cisteino−aspártico proteasas denominadas "caspasas". Se han descrito 10 caspasas en células humanas que provocan una degradación proteica bien definida hasta llegar a la formación de cuerpos apoptósicos. Algunas caspasas son "iniciadoras" y otras "efectoras" del proceso catalítico, actuando sobre endonucleasas que son las responsables directas de la fragmentación del ADN. La cadena de degradación proteica tiene sucesivos clivajes dependientes de la ubicación del ácido aspártico 3 que se repite en la estructura de la enzima. Se han descrito hasta 40 substratos en la catálisis, proceso que en células cultivadas demora entre 30 y 40 minutos. La activación de las caspasas, que existen en calidad de procaspasas inactivas, se produce por diversas vías en que participan varios complejos moleculares. La vía de "receptores transmembrana" establece conexiones con el espacio extracelular, recibiendo señales proapoptósicas desde el exterior y de las células vecinas. Dos familias de receptores se han identificado con estas características: la " proteína compleja Fas" y el factor de necrosis tumoral TNF (tumor necrosis factor). La proteína transmembrana Fas en su porción intracelular enlaza con un factor intermedio denominado FADD (factor associated death domain), nombre que sólo señala que está comprometido con la zona de la molécula Fas que participa en la muerte celular, activando las caspasas 8 y 10. En cambio, si la parte interna de la molécula se asocia a otro factor llamado DaXX, se activan proteinoquinasas que conducen al efecto contrario; es decir, estimulan el ciclo celular y la mitosis. Esta vía Fas permanece inactiva hasta que se produce en su parte externa el enlace con un cofactor llamado Fas ligand, proteína que actúa como detonador que enciende la vía, en que solo las caspasas están inactivas y el resto de la cadena está preparado para recibir el enlace exterior. Esta característica permite actuar con gran rapidez sin necesidad de sintetizar otros factores . Algo similar sucede con el otro "receptor de membrana" TNF. Su porción intracelular conecta con complejos intermedios como el Tradd (TNF receptor associated death domain) y Raidd (receptor associated interleukine death domain) que activan caspasas "iniciadoras" de la apoptosis. Pero si se asocian a otro complejo llamado Traf (TNF receptor associated factor) activan proteinoquinasas y estimulan la proliferación celular; es decir, el efecto contrario. Las alternativas de una misma vía de actuar en pro o en contra de la apoptosis se repite en otros mecanismos. Otra vía importante es la vía llamada "ceramida" que es un glucolípido sintetizado en el retículo plasmático y en las mitocondrias, cuya mayor concentración se ubica junto a la porción interna de la membrana plasmática. En el interior de la membrana misma existe otro fosfolípido, la esfingomielina. Se ha podido determinar que agentes externos como la radiación UV, agentes oxidantes y el calor activan la esfingomielinasa ácida, que provoca una reacción aún no bien conocida, sobre la esfingomielina, aumentando la concentración de ceramida. Las vias Fas y TNF también tienen una acción activadora sobre la ceramida. La ceramida actúa sobre las mitocondrias que tienen un doble rol en la apoptosis, como veremos enseguida. Las mitocondrias, que son el último organelo que desaparece en el proceso de apoptosis, al ser fagocitado con los restos de la célula, ejercen un rol pro y antiapoptósico fundamental. La ceramida puede ser activada por factores externos a través de receptores de membrana y directamente por glucocorticoides. Además las alteraciones no corregidas del ADN (en especial mutaciones cancerígenas) activan una proteína sintetizada por el gen p 53, que provoca apoptosis a través de la activación de la ceramida. 4 La ceramida provoca cambios iónicos entre la matriz de la mitocondria y el citosol del citoplasma, que producen un descenso del potencial transmembrana con aumento de la permeabilidad de su membrana interna, permitiendo el escape de citocromo C y de un factor inductor de apoptosis AIF (cuya estructura no se conoce bien), que estimulan a las caspasas 8 y 10 e indirectamente a la 3 y 9, conduciendo a la apoptosis. El factor frenador de la apoptosis más importante que se conoce hasta hoy es la familia de proteínas sintetizadas por el gen bcl 2 y similares. Es interesante anotar que la familia de proteínas bcl se sintetiza justamente en la membrana de la mitocondria, apareciendo este organelo jugando un rol pro a antiapoptósico, ya que tales proteínas disminuyen la permeabilidad de la membrana hasta bloquear el escape de citocromo C y AIF. El bcl 2 es homólogo del proto− oncogen responsable del linfoma folicular humano. Los factores proteicos del bcl 2 se producen entre ambas membranas de la mitocondria. Los elementos sintetizados por este gen son: el Bcl 2, el Bcl XL, el Bcl W y el BRAG. De estos, el BCL XL ha sido cristalizado, lo que permite un mejor estudio de su estructura y acción. Estos factores son antiapoptósicos; pero mediante fosforilación originan proteínas con acción proapoptósica y son: el Bax, Bak, Bad, y Bcl x 5, ya que producen una caída del potencial transmembrana favoreciendo la liberación de citocromo c y AIF. Además actúan como activadores de las vías proapoptósicas Fas y TNF y de algunas caspasas. Es otro ejemplo de reguladores pertenecientes a una misma familia de proteínas que actúan como pro o antiapoptósicos. La apoptósis es una función biológica muy importante en la patogenia de varias enfermedades estudiadas hasta el momento. Podemos destacar el cáncer, malformaciones, trastornos metabólicos, neuropatías, lesiones miocárdicas y trastornos del sistema inmunitario. Respecto del cáncer, el factor biológico más importante antineoplásico parece ser la proteína 53 sintetizada por el gen humano p53. Es una fosfoproteína proapoptósica que se activa ente la presencia de mutaciones del ADN, actuando en la fase G1 del ciclo celular. Controla la reparación de lesiones del ADN efectuado por polimerasas específicas, (contribuye a frenar el ciclo en tales circunstancias) y es capaz de detectar células neoplásicas agresivas frenando su capacidad de producir angiogénesis para facilitar las metástasis. La p 53 se agota rápidamente por lo que debe ser sintetizada en forma constante. Su rol es frenar el ciclo destruyendo células mediante la apoptosis antes de llegar a la etapa de síntesis a fin de impedir que se repliquen mutaciones carcinogenéticas, que producirán nuevas cepas tumorales cada vez más agresivas. Otro aspecto de importancia clínica es la relación entre apoptosis y neuropatías. En el desarrollo del sistema nervioso, las neuronas se generan a partir de células precursoras que una vez diferenciadas no se dividen más. Antes de emitir dendritas y axones, las neuronas inmaduras o las precursoras emigran desde el lugar de nacimiento en busca de la localización definitiva usando como camino el sistema glial. Esta migración tiene, además, como objetivo lograr las conexiones interneuronales correctas. Si ello no se efectúa la neurona no recibe la acción de factores de crecimiento secretados por 5 la célula receptora a que pertenece el axón conectado y la célula que hizo la conexión equivocada muere por apoptosis. Cualitativamente, en estudios realizados en la formación de la vía óptica en la rata, por oligodendrocitos que milienizan axones, mueren por apoptosis alrededor del 50 % de ellos debido a conexiones erróneas. De esta manera contribuye la apoptosis en el desarrollo correcto del sistema nervioso. Otro hecho de importancia observado recientemente es el rol que juegan la isquemia e hipoxia. En zonas periféricas de infartos cerebrales se han observado células en apoptosis con fragmentación de la cromatina y sobreexpresión de caspasas. En enfermedades neurodegenerativas se ha observado apoptosis en biopsias de pacientes con Alzheimer, Huntington y Parkinson, fallecidos por otra causa. La apoptosis en la Enfermedad de Alzheimer no es sistematizada, sino difusa, que coincide con el polímorfismo de la lesión. Cotman en 1998 ha detectado que el Alzheimer muestra mayor número de células apoptósicas, especialmente en neuronas del hipocampo. Se ha postulado que estas lesiones puedan deberse a un descontrol genético de la apoptosis. El bloqueo de caspasas para frenar la apoptosis abre nuevos campos terapéuticos en enfermedades neurodegenerativas. En cardiopatías, James en 1998 ha planteado que la apoptosis es importante en la destrucción exagerada de células durante el desarrollo del sistema excitoconductor produciendo trastornos como la bradicardia sinusal, arritmias graves y síndrome Q−T prolongado, en niños. Trastornos de oxigenación producen además de necrosis, cierta cantidad de apoptosis en partes periféricas de la zona dañada. En infartos recientes se ha encontrado sobre expresión de B cl 2 .En infartos antiguos, con células en apoptosis, se ha detectado presencia de Bax (que ya vimos, es una proteína proapoptósica de la familia del bcl 2 fosforilada). Dos autores sugieren que la insuficiencia cardíaca postinfarto sea debida en gran medida a la pérdida de cardiocitos por apoptosis. Universidad del Valle de México Neurociencias 1 Prof. Carlos Barraza Cedillo Bibliografía 2.− Ann. Rev. Physiol, 1988; vol 60: 1) pag. 525−553. Thompson E. B. : Special Topic Apoptosis. 2) Pag 532−573. Kidd V. J.: Proteolityc Activities that Mediate Apoptosis. 3) pag. 601−617. King K. L., Cidlowsky S. A. : Cell Cycle Regulation and Apoptosis. 4) Pag. 619−642. Kroenser G. Y Col.: The Mithochondrial Death−Life Regulator in Apoptosis and Necrosis. 5) Pag. 643−665. Kolesnick R. N. , Krönke M. Regulation of Ceramide Production and Apoptosis. 6 Comentarios: La apoptosis, es un tema apasionante y de actualidad. Lo extraordinario es que demuestra como la vida, a nivel celular depende de un proceso de muerte. Si no existiera la apoptosis, habría órganos como el timo que alcanzaría proporciones gigantescas, incompatibles con la vida. Por otra parte, la ausencia de apoptosis es una característica de las poblaciones cancerosas. 7