INTRODUCCIÓN La salud de todos los organismos celulares, incluidos los seres...

INTRODUCCIÓN
La salud de todos los organismos celulares, incluidos los seres humanos, depende no sólo de que el cuerpo sea
capaz de producir nuevas células, sino también de que sus células puedan destruirse cuando son inservibles o
sufren alguna alteración. La evolución ha determinado que las células de tejidos irremplazables ofrezcan
mayor resistencia a estos procesos de muerte celular, como ocurre en el caso de las neuronas; sin embargo,
células fácilmente sustituibles, como las sanguíneas, son más propensas a morir.
Durante mucho tiempo se pensó que la muerte de las células se derivaba siempre de agresiones externas: paso
del tiempo, enfermedad..., pero el estudio de las fases iniciales de la vida supuso un cambio de enfoque en el
significado de la muerte celular. El desarrollo embrionario se caracteriza por fenómenos incesantes de
proliferación celular, pero también durante este periodo se producen fenómenos de muerte celular
generalizada sin que existan envejecimiento ni enfermedad. Gracias a estos procesos de muerte celular se
modela la forma del embrión, eliminando tejidos antiguos y formando otros nuevos, de manera que los
procesos de muerte celular participan en la apertura de orificios en el tubo digestivo, diferenciación sexual y
formación de diversos tejidos y órganos, como los riñones, huesos y cartílagos.
Muchas células se destruyen de forma programada durante la vida adulta. Por ejemplo, las células de la piel
comienzan su vida en las capas más profundas, y después emigran a las superficie, sufriendo en esta
migración procesos de muerte celular. Posteriormente, las células muertas forman la capa exterior de la piel.
Otro ejemplo se da en el sistema inmunitario, en el que células como los linfocitos T (timodependientes), en
su proceso de maduración experimentan la autolisis antes de producir daño al propio organismo. Un último
ejemplo es la muerte que sufren las células de la pared uterina durante la menstruación. Por otra parte, la
incorrecta regulación de estos procesos de muerte celular programada contribuye a patologías muy dispares,
del cáncer a la artritis reumatoide pasando por el SIDA y la enfermedad de Alzheimer.
CICLO CELULAR
El ciclo celular consta de cinco fases : Go, G1, S, G2 y M, y su funcionamiento está regulado por enzimas del
grupo de las quinasas (CDK), que están constituidas por subunidades reguladoras (ciclinas) y catalíticas
(quinasas dependientes de ciclinas, o CDKs).
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En cada fase intervienen ciertas ciclinas y quinasas:
• G1: ciclinas D1, D3/CDK 2, 4, 5 y 6.
• G1 tardía: ciclina E/ CDK2.
• S: ciclina A/ CDK2 .
• S−G2 tardía: ciclina A/ CDK2 .
• G2−M: ciclina B/ CDK2.
De tal modo se favorece el paso de una a la siguiente. Conviene recordar, a modo de resumen, que la ciclina
D1 es necesaria para que la célula pueda entrar en la fase S, y que la ciclina A permite que aquélla progrese en
la fase de síntesis. Asimismo, existen unos puntos, denominados de control, necesarios para revisar la
integridad y calidad del ADN , de tal modo que si está alterado se proceda a su reparación y si ello no es
posible a la destrucción celular. En ambos casos se busca evitar que lesiones del ADN pasen a las células hijas
y se favorezcan errores genéticos, malformaciones o enfermedades (tumores). El más conocido es el punto de
control G1−S, donde intervienen una serie de sustancias como son la p53 , GADD45, ERCC3, p21, p27 y p57
(estos tres últimos son miembros de la familia CIP/ KIP e inhibidores universales de CDKs en la fase G1) y la
familia INK−4 (p15, p16, p18 y p19) inhibidores específicos de la cdk4/6. La p27 actúa sobre el complejo
ciclina D/ CDK4/6, E/ CDK2 y A/ CDK2, mientras que la p15 lo hace sólo sobre el complejo D/ CDK4/6.7.
Especial relevancia tiene el TGFb que, a través de la p15, redistribuye la p27 dentro de la célula.
DEFINICIÓN DE APOPTOSIS
La apoptosis celular es un proceso, fisiológico en la mayoría de los casos, controlado genéticamente en el que
determinadas células dirigen su propia muerte en beneficio del organismo. El término apoptosis fue
introducido por Kerr en 1972 . Deriva del griego apo (fuera de) y ptosis (cayendo) .
Todas las células del organismo están programadas para destruirse por apoptosis, ya sea porque hubiesen
realizado por completo sus funciones, porque hayan sufrido un daño en su material genético o porque les
falten las señales que las mantengan en plena actividad funcional.
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La apoptosis está desencadenada por señales celulares controladas genéticamente. Estas señales pueden
originarse en la célula misma o proceder de la interacción con otras células. Tiene un significado biológico
muy importante, que es opuesto al de la mitosis en la regulación del volumen tisular. La apoptosis contribuye
a dar la forma a los órganos durante la morfogénesis y elimina células inmunológicamente autorreactivas, las
células infectadas y las genéticamente dañadas, cuya existencia es potencialmente dañina para el huésped. La
apoptosis se ha conocido con otros nombres: cuerpos de Councilman (hígado), cuerpos cariolíticos (criptas
intestinales), cuerpos tingibles (ganglio linfático), cuerpos de Civatte (piel), cuerpos hematoxilínicos (varios).
DIFERENCIAS APOPTOSIS−NECROSIS
Las células que sufren apoptosis experimentan cambios muy distintos a las que sufren necrosis. En la
apoptosis destacan las alteraciones morfológicas del núcleo frente a las del citoplasma, a la inversa de lo que
ocurre en la necrosis en general, y los orgánulos permanecen inalterados incluso hasta la fase en que aparecen
los cuerpos apoptóticos. A diferencia de la apoptosis, la necrosis es una forma de muerte celular que resulta de
un proceso pasivo, accidental y que es consecuencia de la destrucción progresiva de la estructura con
alteración definitiva de la función normal en un daño irreversible, siempre de manera patológica, y nunca
regulada; este daño está desencadenado por cambios ambientales como la isquemia, temperaturas extremas y
traumatismos mecánicos, y también por diversas enfermedades, agentes infecciosos, carencia de oxígeno, etc.
Las células que mueren por necrosis sufren un hinchamiento característico, aumentando considerablemente el
volumen celular. Los orgánulos internos se hinchan, como consecuencia de un desequilibrio del balance de
agua e iones, quedando alterada toda su estructura, y produciéndose la ruptura de la membrana celular.
Resultado de esta ruptura es la liberación de enzimas nocivas que destruyen células circundantes. También es
característico en el proceso necrótico las pocas alteraciones del núcleo. Por otro lado, los macrófagos
circulantes y otros glóbulos blancos convergen en las células necróticas e ingieren los restos celulares
derivados de dicha ruptura celular, de modo que se produce una respuesta inflamatoria. Esta participación de
los glóbulos blancos generalmente lesiona también el tejido vecino sano.
En la apoptosis se observan cambios muy distintos:
Cambios morfológicos:
• No se produce hinchamiento.
• Las células que se están muriendo se encogen, quedando el citoplasma retraído y observándose un
descenso del volumen celular, apartándose de sus vecinas.
• La superficie celular adquiere un aspecto vesiculado, pero no se rompe la membrana, de modo que no
se dispersan los productos tóxicos.
• Cambios notables en el núcleo: La cromatina se condensa formando acúmulos cerca de la membrana
nuclear. Los cromosomas y el genoma se parten en trozos regulares: el ADN se fragmenta en
segmentos que son múltiplos aproximadamente de 1856 pb, debido a una hendidura especial que
existe entre los nucleosomas. En este momento, las células apoptóticas son ingeridas por células
cercanas sin que se produzca respuesta inflamatoria.
• Las células no ingeridas sufren una desintegración del núcleo y la célula se divide en numerosos
cuerpos apoptóticos, que contienen una o varias piezas nucleares y mantienen la integridad de la
membrana plasmática, y cuyos orgánulos se mantienen intactos.
Cambios funcionales y bioquímicos:
• Aumento de la concentración de calcio libre.
• Interacción bcl2/BAX.
• Deshidratación celular.
• Pérdida de potencial de membrana mitocondrial.
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• Proteolisis.
• Externalización de la fosfatidilserina.
• Desnaturalización del ADN.
• Escisión intranucleosomal.
• Es un proceso programado genéticamente, que afecta selectivamente a determinadas células y que
está finamente regulado.
Ambos mecanismos pueden combinarse en situaciones de muerte celular masiva, cuando la cantidad de
células a eliminar excede la capacidad de fagocitosis por células vecinas, lo que determina que los restos de
células apoptóticas se acumulen y sean degradadas por un proceso denominado necrosis secundaria.
FASES DE LA APOPTOSIS
Desde el punto de vista morfológico, la apoptosis presenta cuatro fases :
• Fase de Precondensación. La inducción de los genes requeridos para la apoptosis
determina la transcripción y translación activa en proteínas y enzimas.
• Fase de Condensación. Se produce una reducción del volumen de núcleo y citoplasma, con condensación
de la cromatina en el margen nuclear. Hay una pérdida de las interacciones entre la célula apoptótica y las
vecinas.
• Fase de Fragmentación. Las proteínas de la matriz nuclear se solubilizan, lo que hace al ADN susceptible
de degradación por endonucleasas dependientes de calcio y magnesio. Estas enzimas degradan la cromatina
nuclear y originan los llamados cuerpos apoptóticos, que son múltiples y muestran un patrón en escalera en
la electroforesis. Estos corpúsculos aumentan progresivamente en número hasta que el núcleo se hace
picnótico.
• Fase de Fagocitosis. Los cuerpos apoptóticos son fagocitados y degradados por las enzimas lisosomales de
las células vecinas sin respuesta inflamatoria alguna, por lo que no queda ni rastro de su presencia unas
horas tras el comienzo del proceso.
Los dos criterios morfológicos fundamentales que definen la apoptosis son la degradación del ADN y la
formación de nucleosomas en escalera. Sin embargo, no es fácil aislar células apoptóticas individuales, debido
al pequeño número de células que sufren apoptosis y a la rapidez en que ésta ocurre (6−12 horas). Se ha
desarrollado una técnica histoquímica denominada TUNEL ("Terminal Transferase dUTP−biotin Nick
End−Labeling"), aunque tiene el inconveniente de no permitir en ocasiones diferenciar entre la formación de
ADN en escalera y la degradación de ADN al azar que ocurre durante la necrosis, por lo que para una
identificación exacta de la apoptosis se requiere la combinación de esta técnica y criterios morfológicos .
ESTUDIO GENÉTICO DE PROCESOS APOPTÓTICOS
Los estudios genéticos en Caenorhabditis elegans han proporcionado una gran cantidad de datos interesantes
en el conocimiento de los genes implicados en la apoptosis. En este nematodo se han caracterizado como
genes promotores de la muerte celular ced−3 y ced−4. Por el contrario, el gen ced−9 antagoniza la función de
ced−3 y ced−4 bloqueando la apoptosis. Se ha propuesto que ced−9 actuaría en un paso anterior a la
activación de ced−3 y ced−4, previniendo la activación de estos últimos. Diversos estudios funcionales y de
secuenciación del ADN han evidenciado una estrecha semejanza entre estos genes del C. elegans y algunos
genes en los vertebrados. Así, la enzima conversora de la interleucina Iß (ICE), responsable del procesamiento
in vivo de la prointerleucina Iß en su forma funcional y capaz de inducir apoptosis in vitro, presenta una alta
homología con el gen ced−3 . De la misma forma, ced−9 presenta una homología elevada con Bc1−2, primer
miembro de una nueva familia de genes implicados en la regulación de la apoptosis en los mamíferos.
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Una evidencia clara de la semejanza de estos genes es que la hiperexpresión de un transgen de Bcl−2 en C.
elegans previene la muerte de células que en condiciones normales sufren apoptosis.
La proteína CED−3 de C. elegans interacciona con ProCED−3 y CED−4, de modo que la muerte celular
programada no se produce en los animales mutantes en el gen ced−4. En las células que han de sobrevivir, la
CED−9 [que pertenece a la familia bcl−2 (B−cell lymphoma/leukemia−2 gene)] se une a la CED−4, y la
mantiene en una conformación inactiva, impidiendo por tanto la activación de la ProCED−3 mediada por la
CED−4. La capacidad de CED−9, CED−4 y CED−3 de formar un complejo multiproteico ha conducido al
modelo del apoptosoma en la regulación de la muerte celular.
Se conocen varias situaciones que aumentan la probabilidad de suicidio celular:
1. Cuando la célula recibe menos señales de supervivencia, disminuyendo la expresión de los genes
inhibidores de suicidio, como bcl−2.
2. Cuando la célula recibe señales que desencadenan señales de multiplicación celular, es decir, expresión de
genes llamados protooncogenes, como c−myc, c−fos y c−ras, y, por otra parte, la activación de unas enzimas,
las ciclinas, que garantizan el correcto ciclo celular.
Aunque pueda parecer sorprendente que estos sucesos desencadenen suicidio celular, se ha comprobado que
la célula receptora de las señales de multiplicación se autodestruye si no recibe con anterioridad o al mismo
tiempo señales de supervivencia, determinantes de la expresión de genes del tipo bcl−2.
3. Moléculas superficiales que actúan cuando las células entran en contacto, o que son dispersadas en el
medio, y que interaccionarán con receptores superficiales de las células diana.
Ejemplos de estas moléculas son las generadas por el sistema inmune: TNF (factor de necrosis tumoral) y el
ligando del receptor Fas. Ambas provocan la muerte con mucha rapidez, y sólo se las puede resitir en casos en
que previamente se hayan expresado los productos de los genes bcl−2.
Sin embargo, el sistema inmunitario siempre puede obligar a una célula a que se destruya, cualesquiera que se
sean las circunstancias de expresión genética y de recepción de señales. Cuando diferentes agentes
infecciosos: virus, bacterias, parásitos... se multiplican en el interior de las células del organismo, el sistema
inmunitario los elimina, sacrificando a las células infectadas. Del mismo modo actúa frente a las células
cancerosas.
Para realizarlo, los linfocitos T citotóxicos segregan determinado tipo de proteínas, al entrar en contacto con
las células que consideran anormales o infectadas. Estas proteínas son las granzimas y las perforinas. Las
granzimas actúan escindiéndose y activando los precursores de las proteasas de la familia ICE de la célula
anormal.
Cuando el sistema inmunitario identifica una célula normal infectada procede a su destrucción,
independientemente de las señales que reciba esa célula. Sin embargo, determinados virus son capaces de
esquivar este proceso, como el HIV, virus de Epstein−Barr, algunos papilomavirus, como los causantes de
cánceres genitales y algunos adenovirus.
GENES BCL−2 Y BCL−X EN LA REGULACIÓN DE LA APOPTOSIS
El gen bcl−2 fue identificado por primera vez en un linfoma de células B−2, motivo al que debe su
denominación. Este gen presenta una expresión anormal en el 85% de los linfomas foliculares de células B y
en un 20% de los linfomas difusos. En estos tumores se produce una translocación cromosómica t(14:18) que
sitúa a bc1−2 en la misma orientación de trascripción que el locus de las cadenas pesadas de las
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inmunoglobulinas (Ig), lo que provoca la desregulación de bc1−2. El gen se compone de 3 axones, de los que
el primero no se traduce, y se puede producir una serie de ARN m de tamaños heterogéneos. La proteína
Bc1−2 es una molécula integral de membrana de 26 kDa que ha sido localizada en la membrana externa de las
mitocondrias, el retículo endoplásmico liso y la envoltura perinuclear.
A diferencia de la mayoría de los oncogenes descritos previamente, bc1−2 se caracteriza funcionalmente por
inhibir la muerte celular programada y no por estimular la proliferación celular. bc1−2 es capaz de inhibir la
apoptosis inducida por glucocorticoides, irradiación con rayos , deprivación de factores de crecimiento o la
muerte asociada a procesos de diferenciación celular. Sin embargo, no puede afirmarse que este efecto sea
generalizado, dado que bc1− 2 no inhibe la muerte de ciertas líneas celulares tras la deprivación de
determinados factores de crecimiento o mediante activación a través de ciertos receptores. Estudios de
mutagénesis dirigida en el gen bc1−2 indican que su función inhibitoria de apoptosis, así como su capacidad
de interaccionar con otras proteínas, se encuentra localizada principalmente en dos dominios, conocidos como
BH1 y BH2. Además, BH1 y BH2 son dos dominios altamente conservados que definen toda una familia de
genes relacionados con bcl−2.
La distribución tisular de bc1−2 es amplia. Mediante técnicas inmunohistoquímicas, se ha detectado su
expresión en órganos linfoides y hematopoyéticos, tiroides, próstata, intestino delgado, páncreas, sistema
nervioso y riñón. En los embriones se ha observado que la distribución de bc1−2 es más amplia que en los
adultos, lo que le confiere un papel no sólo en la homeostasis tisular sino también en los procesos de
morfogénesis.
Gen
bcl−2
bcl−Xl
bcl−Xs
mcl−1
bax
a1/bfl−1
bak
bad
bik
Efecto sobre la apoptosis
Inhibición
Inhibición
Inducción
Inhibición
Inducción
Inhibición
Inducción
Inducción
Inducción
Tabla 1. Genes de la familia de Bcl−2. Efecto regulador de los fenómenos apoptóticos
Curiosamente, el patrón de expresión tisular de bcl−2 está restringido principalmente a los tejidos que se
caracterizan por requerir supervivencia a largo plazo. Sin embargo, su expresión en las neuronas del sistema
nervioso central es baja y no se observa en otras células con una supervivencia larga, como las células
musculares o los hepatocitos, indicando la existencia de otros genes capaces de realizar funciones similares en
diferentes tejidos. En este sentido, se han aislado múltiples genes relacionados estructural y/o funcionalmente
con bcl−2. Esta familia de genes conocida como familia de bc1−2. comprende hasta el momento actual los
siguientes genes: bcl−X , mcl−1, bax, A1/bfl− 1, bak ,bad y bik. La función de estos genes es en ocasiones
contradictoria desde el punto de vista de la protección frente a la apoptosis (tabla 1).
El gen bcl−X presenta una homología del 56% con el gen bcl−2. En humanos se han descrito dos transcritos
diferentes de este gen, producidos por corte y empalme o splicing alternativo del ARNm, que se han
denominado bcl−X largo (bcl−X) y bcl− X corto (bcl−Xs). Esta última forma carece de los dominios
funcionales BH1 y BH2 presentes en bc1−2 y bcl−Xl. Al igual que bcl−2, bcl−Xl funciona como elemento
inhibidor de la apoptosis cuando se eliminan del medio factores de crecimiento necesarios para el
mantenimiento de la supervivencia de las células y presenta una localización intracelular superponible a la
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descrita para bc1−2. Por el contrario, bcl−Xs antagoniza el efecto inhibitorio de la apoptosis de bcl−XL y
bc1−2. En los ratones se ha descrito otra variante de bcl−X que no posee el extremo carboxilo de anclaje a la
membrana. Esta forma, denominada bcl−X, también actúa como inhibidor de la muerte celular.
Durante el desarrollo embrionario, bcl−Xl se expresa en la mayoría de los órganos, siendo esta expresión más
perceptible en el cerebro y los riñones. En los adultos, bcl−Xl se expresa en múltiples órganos, tales como el
sistema nervioso (especialmente en las neuronas sensoriales y ganglionares), linfocitos activados y células
plasmáticas en ganglios linfáticos, células precursoras de la médula ósea, tejidos reproductores y una gran
variedad de células epiteliales. Estudios de inmunohistoquímica y Western blot en humanos indican que
bcl−Xl presenta un patrón de expresión tisular diferente al de bc1−2. En el timo, por ejemplo, bcl− Xl se
expresa predominantemente en la corteza, mientras que bc1−2 se expresa más en la región medular. Hasta el
momento, no existen datos concluyentes sobre la expresión de bcl−Xs tanto en humanos como en ratones.
Los mecanismos por los que bc1−2 y Bcl−Xl inhiben la muerte celular no han sido todavía esclarecidos. Sin
embargo, el hecho de que ambas proteínas presenten una gran homología, fundamentalmente en los dominios
funcionales BH1 y BH2, y de que presenten una localización intracelular superponible, permite sugerir que
los mecanismos por los que inhiben la apoptosis son idénticos. Estudios previos han demostrado cómo las
células anucleadas pueden sufrir apoptosis, indicando que tales procedentes del citoplasma son indispensables
para iniciar el programa de muerte celular. En este sentido, recientemente se ha demostrado que en las células
en apoptosis, antes incluso de que comiencen a aparecer cambios a nivel nuclear, se observan poros en la
membrana mitocondrial, responsables de la reducción de su potencial transmembranal. Este fenómeno se ha
analizado más en profundidad in vitro empleando agentes químicos como el atractilósido (Atr) o el
hidroxiperóxido de tercbutilo (ter−BHP), que producen poros en las mitocondrias.
La formación de estos poros en las mitocondrias coincide con la aparición de fenómenos apoptóticos en el
núcleo, que pueden prevenirse utilizando fármacos que inhiben la formación de tales poros. El hecho de que
bc1−2 se localice en la membrana mitocondrial, y que, además, sea capaz de inhibir la apoptosis inducida por
Atr y ter−BHP, ha hecho pensar que la función antiapoptótica de bc1−2 podría relacionarse con el
mantenimiento de la integridad de la membrana mitocondrial y, en un sentido más amplio, con la regulación
de los procesos de tráfico intracelular. En este sentido, cabe destacar que la cooperaci6n de bc1−2 con c−myc
inhibe la translocación de p53 desde el citoplasma al núcleo durante la fase GO/G1 del ciclo celular, periodo
en el que la célula es susceptible a la inducción de apoptosis dependiente de p53. Muy recientemente, se ha
descrito que la liberación de citocromo c (componente de la cadena respiratoria mitocondrial) desde el espacio
intermembranoso de la mitocondria al citosol es un fenómeno necesario para que se inicie la cadena
apoptótica.
Se ha sugerido que los genes de la familia de bc1−2 podrían regular los fenómenos de apoptosis inhibiendo el
tráfico de citocromo c. Además de la posible implicación de bc1−2 en la regulación de los procesos de tráfico
intracelular, se ha observado que esta proteina inhibe la activación de proteasas de la familia ICE/ ced−3, que
constituyen uno de los elementos más distales en la vía inductora de apoptosis. Finalmente, también se ha
postulado que bc1−2 podría estar involucrado en el control de la producción de radicales libres de oxígeno.
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Figura 1
Regulación de la apoptosis en linfocitos B y T por los genes Bcl−2 y Bcl−X
El sistema inmunitario debe cumplir dos misiones fundamentales: asegurar una respuesta eficaz frente a
cualquier agente externo y prevenir la reacción frente a los componentes propios. Ambas funciones se basan
en la existencia de elementos celulares, los linfocitos T y B, que disponen de receptores de membrana
antígenos específicos.
La generación de diversidad antigénica en el repertorio de estas células se logra mediante la recombinación al
azar de los genes que codifican las regiones variables de las Ig y del TCR.
Este proceso tiene lugar durante los períodos mas tempranos del desarrollo linfoide, en los estadios de células
pro−B (figura 1) y CD4− CD8− (figura 2). A este nivel acontecen los primeros fenómenos de apoptosis en
aquellas células que no logran culminar con éxito la recombinación genética de las regiones variables de las Ig
o del TCR. Los fenómenos de recombinación genética pueden dar lugar a mas de 109 regiones variables
distintas en las Ig o incluso hasta 1011 en el TCR. Adicionalmente, los genes reordenados de las regiones
variables de las Ig sufren mutaciones puntuales somáticas tras el encuentro de la célula B madura con el
antígeno (Ag).
El gran inconveniente de esta amplia gama de receptores antigénicos es que una elevada proporción de
linfocitos va a ser capaz de reconocer estructuras propias y, por lo tanto, de generar autorreactividad. En
condiciones normales, estas células sufren apoptosis cuando interaccionan con auto−Ag. Este fenómeno,
conocido como selección negativa, tiene lugar sobre todo en etapas tempranas de la maduración de los
linfocitos B y T (figuras 1 y 2). Los linfocitos T sufren un proceso de selección adicional en el timo. Este
mecanismo, conocido como selección positiva, consiste en que solo recibirán una señal positiva de
maduración los timocitos cuyo receptor TCR sea capaz de interaccionar con las moléculas MHC de las células
del estroma tímico (figura 2).
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Figura 2. Configuración del repertorio de linfocitos T en el timo.
El sistema inmunitario gasta la mayor parte de su energía en estos procesos de selección, de tal forma que más
de un 90% de los linfocitos inmaduros (células T CD4+ CD8+ TCR low y células B IgM+ IgD−) mueren por
apoptosis antes de convertirse en células maduras. Las células que sobreviven van a emigrar a la periferia,
donde podrán iniciar una segunda fase de diferenciación funcional dependiente del encuentro con el Ag.
Las células B maduras están sujetas a un nuevo proceso de selección en los órganos linfoides secundarios
como consecuencia del encuentro con el Ag (figura 1). Cuando estas células B reconocen al Ag y reciben las
señales coestimuladoras adecuadas se activan y pasan a formar parte de los centros germinales. Allí, los
linfocitos B entran en fase de proliferación, en cuyo proceso son altamente susceptibles de experimentar
mutaciones puntuales al azar en los genes de las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras de sus Ig.
El objetivo de este proceso es incrementar la afinidad por el Ag primitivo.
El destino posterior de estas células B va a estar en función de la nueva afinidad por el Ag primitivo tras el
proceso de mutación: las células con gran avidez por el Ag sobreviven y se expenden, mientras que las de baja
afinidad sufren apoptosis. En esta selección positiva son esenciales las células dendríticas foliculares, que van
a presentar el Ag a la célula B estimulada. Además de encontrarse de nuevo con el Ag, las células B van a
establecer una interacción clave para el rescate de la apoptosis: la unión del CD40 con su ligando (CD40L) en
la célula dendrítica (figura 1). Las células cuya afinidad por el Ag disminuye no reciben la señal accesoria a
través del CD40 y mueren.
Estos fenómenos de hipermutación somática pueden convertir en autorreactivos a algunos linfocitos B que no
lo eran antes del encuentro con el Ag. Estas células, potencialmente dañinas para el organismo, pueden ser
neutralizadas por dos mecanismos. Por un lado, pueden sufrir la selección negativa anteriormente señalada,
como consecuencia de su perdida de afinidad por el Ag primitivo. Por otro lado, pueden entrar en un estado de
anergía si reconocen el auto−Ag para el que se acaban de hacer específicas, pero no reciben señales accesorias
de linfocitos T cooperadores específicos para el mismo auto−Ag. Si las células autorreactivas superan estos
procesos de inactivación podrían ocasionar una enfermedad autoinmune, como se comenta mas adelante.
Las células que reconocen auto−Ag no son las únicas expuestas a sufrir apoptosis. Los linfocitos B y T que
reconocen un Ag extraño y reciben las señales coestimuladoras adecuadas experimentan un proceso de
activación. Esta activación puede tener como resultado la proliferación y posterior diferenciación del linfocito
hacia célula efectora. Algunas células no completan este proceso de diferenciación y permanecen en un
estadio intermedio, subsidiario a experimentar una futura activación ante un nuevo contacto con el Ag,
denominado linfocito B o T memoria. Estos linfocitos van a tener una vida media muy larga (del orden de
meses o de años) y son los responsables de que la respuesta ante un segundo contacto con el Ag sea mas
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rápida y de mayor intensidad (respuesta secundaria). Los que completan el proceso de diferenciación van a
convertirse en células efectoras: célula plasmática, linfocito T−citolítico o T−cooperador. Sin embargo, el
sistema inmunitario debe ejercer un estrecho control sobre estas células, cuyo número se ha multiplicado de
forma considerable tras el encuentro con el Ag. La potente actividad biológica de estas células puede
representar un grave peligro para la integridad del organismo, en el caso de que permaneciesen activadas de
forma indefinida. En este sentido, se ha descrito una forma de muerte celular, denominada apoptosis inducida
por activación, en la que están implicados la molécula Fas y su ligando (Fas−L).
Las células activadas expresan en su membrana concentraciones altas de ambas moléculas, y se establecen
interacciones Fas/ Fas−L bidireccionales, mediante las cuales las células activadas se aniquilan entre sí. Estas
moléculas no tienen ninguna relación estructural con la familia de Bc1− 2.
Finalmente, la mayoría de los linfocitos no llega a reconocer ningún Ag a lo largo de su existencia. Estas
células no activadas sufren apoptosis a las pocas semanas de vida. En este caso la muerte celular no parece
depender de Fas, y se desconocen en la actualidad los mecanismos moleculares implicados.
En definitiva, la apoptosis durante el desarrollo linfoide tiene por objetivo eliminar los linfocitos defectuosos
o autorreactivos, en las fases tempranas, y los linfocitos innecesarios o potencialmente dañinos en las fases
mas avanzadas.
Regulación de Bcl− 2 y Bcl− X durante el desarrollo linfoide
Los procesos de muerte y supervivencia celular durante el desarrollo linfocitario deben estar sujetos a un
minucioso control, en el que cabe creer que Bc1−2 y Bcl−Xl pudieran actuar como proteínas inhibidoras de la
apoptosis a múltiples niveles.
Esta posibilidad se ha analizado durante el desarrollo de los linfocitos B y T utilizando técnicas de Western
blot y citometría de flujo. Con estas técnicas se ha caracterizado la expresión de Bc1−2 y Bcl−Xl en los
diferentes estadios de diferenciación linfocitaria, correlacionándola con la aparición o ausencia de fenómenos
apoptóticos. Además, empleando animales que hiperexpresan (transgénicos) o que son deficientes (knockout)
en estos genes, se ha evaluado in vivo su influencia en tales procesos de diferenciación. A continuación se
describen las conclusiones mas destacadas de estos estudios.
El análisis de la expresión de Bc1−2 y Bcl−Xl en el timo o en la medula ósea indica que estas proteínas se
regulan de forma distinta durante la diferenciación linfocitaria (figura 3). Bc1−2 se expresa en los estadios
mas primitivos de diferenciación, las células pro−B y los timocitos CD4− CD8− , así como en linfocitos B y T
maduros. Por el contrario, Bcl−Xl se expresa en los estadios de celarla pre−B y timocitos T CD4+CD8+TCR
low, así como tras la activación de células T y B maduras. Cabe destacar que Bc1−2 y/o Bcl−Xl son
prácticamente indetectables en dos estadios de la diferenciación en donde son especialmente frecuentes los
procesos de apoptosis:
• La transición de célula pro−B a pre−B o de timocito CD4− CD8− a CD4+CD8+TCR low, períodos en los
que tienen lugar los reordenamientos en los genes de las Ig y del TCR, respectivamente.
• En linfocitos inmaduros B/ IgM+ IgD− y T/CD4+CD8+TCR low, estadios ambos en los que ocurren los
procesos de selección negativa tras reconocimiento de auto−Ag.
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Figura 3. Regulación de la expresión de Bc1−2 y Bcl−X a lo largo del desarrollo de los linfocitos T (A) y de
los linfocitos B (B).
Los resultados descritos anteriormente son muy esclarecedores del papel que estas dos proteínas pueden
desempeñar en la regulación de la muerte celular programada en las células linfoides. En primer lugar, se
observa que, con la excepción de los linfocitos B inmaduros IgM+IgD− , todas las poblaciones linfocitarias
analizadas expresan concentraciones elevadas de alguna de estas proteínas inhibidoras de la apoptosis. Esto
indica que se requiere una mínima actividad protectora de la muerte celular para permitir una linfopoyesis
adecuada. De hecho, la hiperexpresión de Bc1−2 o Bcl−Xl en linajes T y B provoca un aumento significativo
en todas las poblaciones linfoides, aunque en mayor grado en linfocitos T o B maduros. Esta hipótesis se ha
visto confirmada tras el estudio de ratones deficientes en Bcl−X, donde se observa una disminución selectiva
en el número de células pre−B y CD4+CD8+TCR low, y en animales deficientes en Bcl−2, en los que el
sistema inmunitario prácticamente desaparece en las primeras semanas de vida.
En segundo lugar, se observan concentraciones muy bajas o indetectables de bcl−2 y bcl−Xl en poblaciones
celulares que experimentan reordenamientos en los genes que codifican para las regiones variables de las Ig o
del TCR. En estas células, los fenómenos de apoptosis son muy abundantes como consecuencia de la elevada
tasa de reordenamientos inadecuados. De hecho, se ha observado recientemente que animales transgénicos
que hiperexpresan bcl−Xl en el linaje B presentan un aumento significativo en el número de células pro−B
con reordenamientos inadecuados de las cadenas pasadas de las Ig. No obstante, estas células defectuosas son
incapaces de continuar su proceso de maduración y acaban siendo eliminadas. Esto indica, o al menos sugiere,
11
que en los precursores de linfocitos B y T las concentraciones de bcl−2 y bcl−Xl sólo regulan la
susceptibilidad a la muerte celular de un determinado clon, pero no intervienen en su diferenciación.
La situación contraria a la previamente descrita ocurre en linfocitos T y B activados. En condiciones basales,
las células T y B maduras presentan concentraciones elevadas de bcl−2, pero no expresan bcl−Xl. Tras la
activación de las células T, vía TCR o CD28, o de las células B, vía IgM de superficie o CD40, las
concentraciones endógenas de bcl−Xl aumentan considerablemente, sin que se modifiquen las de bcl−2.
Sin embargo, las concentraciones elevadas de bcl−Xl no se mantienen indefinidamente y retornan a su estado
basal en el curso de la activación. Múltiples estudios han demostrado que la activación linfocitaria, al mismo
tiempo que promueve la proliferación celular, induce apoptosis. Como se señaló en el apartado anterior, este
fenómeno es crucial para limitar la duración y la intensidad de la respuesta inmunitaria. Por lo tanto, cabe
especular que la presencia de bcl−2 y bcl−Xl durante al menos las primeras fases de la activación linfocitaria
es fundamental para permitir la proliferación celular y la diferenciación ulterior a linfocito T o B memoria. En
este sentido, se ha demostrado que la hiperexpresión conjunta de bcl−2 y bcl−Xl en los linfocitos B inhibe la
aparición de apoptosis secundaria a la activación celular in vivo. Así mismo, la hiperexpresión de bcl−2
incrementa la formación de linfocitos B memoria.
Relación de la apoptosis con el desarrollo de autoinmunidad
Como se ha expuesto previamente, durante el desarrollo de los linfocitos los fenómenos de selección deben
guardar un equilibrio tal que, conservando el máximo de efectivos para no menoscabar la resistencia del
organismo frente al microentorno, se evite cualquier riesgo de reacción autoinmune. No obstante, en algunas
ocasiones este equilibrio se rompe en uno u otro sentido originando alteraciones patológicas. Así, uno de los
factores a los que se ha atribuido un papel patogénico en autoinmunidad es la alteración en los procesos de
muerte apoptótica. Un ejemplo de ello son las manifestaciones autoinmunes asociadas a dos defectos
genéticos, las alteraciones Ipry gld, descritas en modelos experimentales murinos. Recientemente, se ha
demostrado que la mutación Ipr consiste en un defecto en la expresión del Ag Fas, proteína traductora de
señales de apoptosis1 , mientras que gld se ha caracterizado como una mutación puntual en el ligando de Fas.
Estas asociaciones clínicas y experimentales entre modificaciones en la apoptosis y autoinmunidad han dado
pie a varios estudios tratando de implicar otros genes relacionados con la muerte celular, como Bcl− 2. Sin
embargo, hasta la fecha ningún estudio ha demostrado datos consistentes de alteraciones en los patrones de
expresión de estos genes en los pacientes con enfermedades autoinmunes.
A pesar de ello el empleo de modelos experimentales, en los que se induce una expresión aumentada y/ o
mantenida de bcl−2 o bcl−X, puede resultar una herramienta útil para analizar si la alteración de la muerte
celular de los linfocitos puede influir en la eliminación de células autorreactivas y en la producción de
reacciones autoinmunes.
Estos modelos han consistido básicamente en la construcción de ratones transgénicos de Bcl− 2 y Bcl− X, en
los que el transgén se expresa selectivamente en linfocitos B o T, y en la transfección de líneas celulares con
estos genes. Respecto a la influencia que la hiperexpresión de estas proteínas inhibidoras de apoptosis pudiera
tener sobre la selección negativa de linfocitos B o T, los resultados son contradictorios. Por un lado, la
hiperexpresión tanto de Bcl− 2 como de Bcl− Xl no evita la deleción de linfocitos T específicos para ciertos
super−Ag propios. Asimismo, en un modelo in vitro con una línea de linfoma de células B inmaduras (células
WEHI−231), la hiperexpresión de bcl− 2 no fue capaz de proteger a estas células de la muerte por
entrecruzamiento de la IgM de superficie. Sin embargo, utilizando otra línea de linfoma B inmaduro, CH31,
bcl−2 protegió parcialmente de la apoptosis inducida por un anticuerpo (Ac) anti−IgM. En experimentos in
vivo, Hartley et al. demostraron que la hiperexpresión de bcl− 2 previene la eliminación de las células B
autorreactivas en la médula ósea. No obstante, las células autorreactivas rescatadas de la selección negativa
permanecían en estado inmaduro y terminaban muriendo.
12
Por último, otros experimentos han demostrado que bcl−2 y bcl−Xl son capaces de inhibir en los órganos
linfoides periféricos la deleción de linfocitos T y B autorreactivos.
Las discordancias observadas entre los estudios previamente descritos podrían atribuirse a diferencias en la
afinidad entre el receptor linfocitario y el autoAg. En este sentido, se ha demostrado que células WEHI−231
transfectadas con bcl−Xl sufren apoptosis tras incubación con un Ac anti−IgM de alta afinidad, pero
sobreviven si el Ac anti−IgM es de afinidad intermedia o baja. Por otro lado, la apoptosis inducida con Ac
anti−IgM puede ser regulada por el nivel de expresión del transgén en las células B, tanto en el caso de bcl−2,
como de bcl−Xl.
La persistencia de linfocitos autorreactivos, por modificación de sus patrones de muerte celular, debería
repercutir en la producción de manifestaciones clínicas autoinmunes. En efecto, la hiperexpresión de un
transgén de bcl−2 en linfocitos B provoca una enfermedad parecida al lupus en ratones de la estirpe SJL,
caracterizada por producción de diversos Auto−Ac y glomerulonefritis. Sin embargo, en otros ratones
transgénicos de bcl−2 o bcl−Xl, construidos en estirpes de base genética diferente, no se han reproducido
estas observaciones patológicas. El hecho de que en la estirpe SJL se hayan descrito rasgos genéticos
asociados a autoinmunidad indica que, por sí sola, la alteración de los mecanismos de apoptosis no provoca
manifestaciones autoinmunes, requiriendo para ello la intervención de otros factores genéticos y/ o
ambientales.
El lupus eritematoso sistémico (LES) es el prototipo de enfermedad autoinmune mediada por auto−Ac, la
mayoría de los cuales van dirigidos contra componentes celulares no organospecíficos. Existe un acuerdo
general en considerar la activación de las células B autorreactivas de los pacientes con lupus como un
fenómeno dependiente de los linfocitos T. A este respecto, se está concediendo cada día más relevancia al
subtipo funcional Th2. Sin embargo, aún quedan numerosas incógnitas por desvelar en la colaboración T/B
responsable de la producción de auto−Ac en estos pacientes.
Como se ha mencionado previamente, en los últimos años se ha observado un creciente interés en analizar la
implicación de las alteraciones en los patrones de muerte celular en diversas enfermedades autoinmunes, entre
ellas el LES. Según esto, se ha evaluado si la suma de una activación policlonal de células B, dependiente de
células Th2, junto con una alteración en sus programas de muerte celular es suficiente para que se
desencadene autoinmunidad.
Para ello, se ha utilizado un modelo experimental de enfermedad autoinmune semejante al lupus, la
enfermedad hospedador contra injerto. Esta enfermedad se induce mediante inyección de células esplénicas de
un ratón híbrido F1 en ratones neonatos de estirpe paterna. De este modo, se consigue un estado de tolerancia
a los aloinjertos del donante, junto a un síndrome autoinmune autolimitado, que no acelera la mortalidad de
los ratones. Este síndrome esta causado por la activación policlonal de las células B del donante F1, las cuales
son estimuladas por células Th2 alorreactivas del receptor (figura 4). La estrategia empleada para alterar los
patrones de apoptosis fue utilizar ratones F1 transgénicos de Bcl−2 que hiperexpresan la proteína en las
células B. Los resultados demostraron, en primer lugar, que la prolongación en la vida media de las células B
del donante incrementó las concentraciones auto−Ac en los ratones tolerantes. Sin embargo, el dato mas
significativo fue la modificación del repertorio del auto−Ac producido por estas células B, con aparición de
auto− Ac con alto poder patogénico. Este cambio en el repertorio puede atribuirse a dos motivos, no
excluyentes entre sí.
Por un lado, la hiperexpresión de bcl−2 podría evitar la eliminación de las células B autorreactivas durante su
desarrollo. Estas células, que en el donante F1 no serían capaces de madurar al faltarles la cooperación de
células T, al ser colocadas en el contexto de la interacción alogénica se diferenciarían hasta células
productoras de auto−Ac. Además, Bcl−2 prolongaría la supervivencia de los clones de células B
autorreactivas capaces de escapar a la periferia, que normalmente no producen concentraciones altas de
auto−Ac.
13
Figura 4. Interacción celular que se establece en el modelo de enfermedad del huésped contra injerto.
A la luz de estos datos, podrían explicarse algunas de las manifestaciones autoinmunes observadas en las
enfermedades linfoproliferativas. Los procesos mencionados incluyen entre otros leucemias linfocíticas
crónicas de células B o linfomas, tanto el Hodgkin como linfomas no Hodgkin. En estos procesos se ha
descrito la aparición de hipergammaglobulinemia policlonal con presencia de múltiples auto−Ac.
Modelo conjunto de Bcl−2 y Bcl−X en el desarrollo linfoide
A partir de los datos expuestos anteriormente, se puede establecer un modelo en el que las dos proteínas
podrían desempeñar papeles diferentes y complementarios en los procesos de selección y homeostasis
linfoide.
En el desarrollo de las células B, sería Bcl−2 el primero en expresarse de forma clara en las células pro−B,
facilitando así la formación de una enorme reserva de células en el estadio previo al de célula pre−B.
Entonces, Bcl−2 decae facilitando el que puedan morir los precursores B que no hayan reordenado
convenientemente los genes de las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras de las Ig. Sólo
sobrevivirán aquellas células pre−B que posean un receptor funcional. Es en este momento cuando se
incrementa significativamente la expresión de Bcl−Xl para permitir la viabilidad de la pequeña población de
células pre−B que han realizado un reordenamiento productivo. Posteriormente, la expresión de ambas
proteínas decae en el estadio inmaduro IgM+ IgD−, lo que facilita la eliminación de las células B
autorreactivas. Por último, en el estadio de célula B madura se induce Bcl− 2, lo que va a ayudar a mantener
las células B periféricas.
En células T, la expresión de Bcl− Xl es máxima en el timocito CD4+CD8+. Mas tarde, en la población
CD4+CD8+ que no se selecciona positivamente, Bcl−Xl disminuye y no se expresa Bcl−2. En cambio, en los
timocitos CD4+CD8+ una señal asociada con la selección positiva es el aumento en la expresión de Bcl−2.
De este modo, Bcl−2 actuaría mas tarde que Bcl−Xl y funcionaría como una señal de supervivencia para los
timocitos CD4+CD8+ durante el proceso de selección positiva. Por otro lado, el distinto patrón de regulación
demostrado por Bcl−2 y Bcl−Xl es consistente con un mecanismo sensor por el que se coordinarían de forma
alterna la expresión de Bcl−2 y Bcl−Xl durante el desarrollo linfoide. Sería un ejemplo de genes homólogos
con redundancia funcional y que tendrían papeles fisiológicos ligeramente diferentes en el mantenimiento de
las células durante su ontogenia. En definitiva, dada la importancia de Bcl− 2 y Bcl− X durante el desarrollo
linfoide, las posibles alteraciones funcionales de estos genes pueden modificar la formación de un repertorio
linfoide normal con persistencia de células autorreactivas en la periferia y la consiguiente aparición de
fenómenos autoinmunes.
14
Receptores implicados en la apoptosis: señales y
modulación.
Ciertas células tienen en su superficie los denominados receptores de muerte (death receptors). Estos
receptores detectan la presencia de señales extracelulares y, en respuesta, ponen en marcha la maquinaria de la
apoptosis. Las señales de supervivencia de las células vecinas y las propias señales internas, normalmente
mantienen la maquinaria apoptótica de la célula reprimida y en circunstancias en las que las células pierdan el
contacto con sus vecinas o sufran daños irreparables, las células inician la apoptosis. Ciertos receptores
situados en la superficie de la célula, a través de la unión de sus respectivos ligandos, transmiten a la célula las
señales para su muerte. Dichos receptores, pueden activar caspasas, que llevarán a cabo los mecanismos de
muerte apoptótica.
Los receptores de muerte pertenecen a la superfamilia génica de los receptores TNF (factor de necrosis
tumoral), que se caracterizan por poseer dominios extracelulares ricos en cisteina. Los receptores de muerte
contienen secuencias homólogas en su dominio citoplasmático, denominadas dominios de muerte (death
domains). Estos dominios son los que facultan al receptor en su papel del inicio de la apoptosis, sin embargo,
en algunas circunstancias llevan a cabo funciones diferentes, llegando incluso a inhibir la maquinaria
apoptótica.
A continuación se muestra una lista de los receptores mejor caracterizados y sus respectivos ligandos :
RECEPTORES
CD95 (Fas o Apo1)
TNFRl (p55 o CD120a)
CAR1
DR3 (Apo3, WSL−1,TRAMP o LARD)
DR4
DR5 (Apo2, TRAIL−R2, TRICK 2 o KILLER)
NGF (p55)
LIGANDOS
CD95L
TNF y linfotoxina ð
Desconocido
Apo3L
Apo2L
Apo2L
Tabla 2
Los ligandos con excepción de NGF, presentan estructuras moleculares relacionadas que pertenecen a la
superfamilia génica de TNF.
Receptor CD95
Los receptores CD95 y CD95L desempeñan un papel importante en tres tipos de apoptosis :
− Delección de las células T maduras al final de la respuesta inmune.
− Muerte de células infectadas por virus o células cancerígenas por células T citotóxicas o por células Natural
Killer (NK).
− Muerte de células inflamatorias en lugares como el ojo.
El papel de CD95 se ha estudiado en pacientes humanos con genes CD95 o CD95L defectuosos. Como otros
miembros de la familia TNF, CD95 es una molécula homotrimérica: cada trímero de CD95L se liga a tres
moléculas de CD95. Como los dominios de muerte son propensos a asociarse con otros, la ligación de CD95
permite la asociación de dominios de muerte. Posteriormente, actúa una proteína denominada FADD (Fas
15
associated death domain) que se une a través de su dominio de muerte a la agrupación de dominios de muerte
del receptor. FADD también contiene un dominio de muerte efector que se une a dominios homólogos
repetidos en tandem situados en la forma precursora de la caspasa−8. El dominio de muerte efector es un
ejemplo de una interacción más global denominada CARD (caspase recruitment domain) que se encuentran
en varias caspasas como caspasa−2, −8, −9, y −10. Sobre el agrupamiento constituido por FADD, la
caspasa−8 conduce su propia activación mediante una escisión de sí misma. La caspasa−8, entonces, activa
una cascada en la que participan otras caspasas y que dan lugar propiamente al comienzo de la apoptosis.
Estudios con ratones transgénicos que expresan un mutante de FADD en células T establecen que FADD es
esencial para la activación de la apoptosis por CD95.
Una familia de proteínas víricas denominadas vFLIPs y una proteína celular relacionada denominada Cflip
(llamada también Casper, 1−FLICE, FLAME o CASH) contienen un dominio de muerte efector que es similar
al fragmento en FADD y caspasa−8. El papel de FLIP es controvertido, ya que su sobreexpresión puede
inhibir o activar apoptosis.
Otras proteínas citoplasmáticas además de FADD pueden unirse a CD95, incluyendo Daxx, que reconoce el
dominio de muerte de CD95. Daxx puede activar un camino de muerte independiente de FADD que involucra
a c−Jun NH2−terminal quinasa (JNK).
Receptor TNFR1
TNF es producido principalmente por macrófagos y células T activadas en respuesta a la infección. Para unir
TNFR1, TNF activa la transcripción de factores NF−kB y AP−1, permitiendo la inducción de genes
proinflamatorios e inmunomoduladores. En algunos tipos de células, TNF sólo induce apoptosis a través de
TNFR1. A diferencia de CD95, sin embargo, TNF rara vez activa la apoptosis a menos que la síntesis de
proteínas esté bloqueada, lo que sugiere la preexistencia de factores celulares que pueden suprimir el estímulo
apoptótico generado por TNF. La expresión de estas proteínas supresoras probablemente es controlada a
través de NF−kB y JNK/AP−1.
TNF trimeriza TNFR1 induciendo la asociación de los dominios de muerte del receptor. Posteriormente, un
adaptador denominado TRADD (TNFR−associated death domain) se liga a través de sus propios dominios de
muerte a la agrupación de dominios de muerte del receptor. TRADD funciona como una plataforma
adaptadora que agrupa varias señales moleculares al receptor activo :TNFR−asociado al factor 2 (TRAF2) y
RIP (receptor−interacting protein) estimulando caminos hacia la activación de NF−kB y de JNK/AP−1,
mientras que FADD media la activación de la apoptosis. De éstas, sólo RIP tiene actividad enzimática,
serina−treonina quinasa.
TRAFF2 y RIP activan a NIK (NF−kB inducing kinase) la cual activa al complejo IKK (inhibitor kB kinase).
IKK fosforila a I−kB, conduciendo a la degradación de I−kB y permitiendo a NF−kB la movilización hacia el
núcleo para activar la transcripción. El camino desde TRAF2 y RIP hasta JNK involucra una cascada que
incluye a MEKK1 (mitogen−activated protein kinase), JNKK (JNK kinase) y JNK.
Células de ratones transgénicos que expresan un mutante de TRAF2 sólo tienen un ligero defecto en su
respuesta de NF−kB hacia TNF. Hasta ahora TRAF2 parece no ser esencial para la activación de NF−kB por
TNF, alternativamente habría otro miembro de la familia TRAF que uniría a TRADD y NIK y sustituiría a
TRAFF2. Las células carentes en TRAF2 son totalmente carentes de la activación de JNK en respuesta a
TNF, demostrando el crítico papel de TRAF2 en esta respuesta.
El FADD aparea los complejos TNFR1−TRADD hacia la activación de caspasa−8, y en relación a esto,
comienza la apoptosis. Las células de ratón que no poseen FADD son resistentes a la inducción de la
apoptosis por TNF, demostrando el papel obligatorio de FADD en esta respuesta.
16
Receptor DR3
DR3 muestra una similitud muy estrecha con TNFR1. Como TNFR1, DR3 activa a NF−kB a través de
TRADD, TRAFF2 y RIP y apoptosis a través de TRADD, FADD y caspasa−8. DR3 une a Apo3L, que está
estrechamente relacionado con TNF. Apo3L activa a NF−kB a través de TRADD, TRAF2, RIP y NIK y
dispara la apoptosis a través de TRADD y FADD. De este modo con respecto a la regulación de NF−kB y
apoptosis, Apo3L recuerda en gran medida a TNF. Hay notables diferencias, sin embargo, en la expresión de
esos ligandos y receptores.
La expresión de TNF tiene lugar principalmente en linfocitos y macrófagos activados, mientras que Apo3L es
expresado constitutivamente en muchos tejidos. Opuestamente, TNFR1, es expresado siempre, mientras que
DR3 se presenta principalmente en bazo, timo y sangre periférica y son inducidos por la activación en células
T. Apo3L−DR3 y TNF−TNFR1 probablemente tienen diferentes papeles biológicos.
Receptores DR4 y DR5
Se ha identificado un miembro de la familia TNF que muestra similitudes con CD95L y al que se ha
denominado TRAIL o Apo2L. De modo parecido a CD95L, Apo2L dispara rápidamente la apotósis en
muchas líneas de células tumorales. A diferencia de la expresión de CD95L que está restringida
principalmente a células T activadas y células NK, Apo2L se expresa constitutivamente en muchos tejidos; sin
embargo, como CD95L, la transcripción de Apo2L está elevada en células T en sangre periférica. Las células
T maduras adquieren sensibilidad a Apo2L induciendo apoptosis después de una estimulación por interleucina
2, sugiriendo que Apo2L puede desempeñar algún papel en la delección de células T. Además, las células T
infectadas con el virus de la inmunodeficiencia humana muestran un incremento significativo de Apo2L,
implicando a este ligando en la muerte de células infectadas por virus.
La inducción de la apoptosis por Apo2L requiere actividad caspasa. Sorprendentemente, la expresión de
FADD−DN ligando FADD mutado en cantidad suficiente para bloquear la muerte celular inducida por CD95,
no bloquea la inducción de la apoptosis por Apo2L, lo cual sugiere que un camino independiente de FADD
vincula a Apo2L y caspasas. La sobreexpresión de DR4 o DR5, que unen a Apo2L activan la apoptosis, sin
embargo, no está claro el efecto de la transfección con FADD−DN en esta respuesta : algunos investigadores
no observan efecto mientras que otros, observan inhibición. El desacuerdo, se extiende también a la habilidad
de DR4 y DR5 para unir adaptadores conocidos. Algunos experimentos no muestran interacción, mientras que
otros muestran una unión a TRADD, FADD, TRAF2 y RIP.
Como Apo2L, DR4 y DR5 se expresan en varios tejidos sugiriendo que serían un mecanismo de protección de
las células frente a la apoptosis inducida por Apo2L. Un tipo de protección está basada en DcRs (decoy
receptors) que compiten con DR4 y DR5 por unir a Apo2L. DcR1, también llamado TRAIL−R3 o LIT es un
glucosilfosfatidilinositol. DcR1 liga a Apo2L reduciendo la respuesta al ligando, por este motivo, parece
funcionar como una señal que previene la unión de Apo2L a su receptor. Sin embargo, DcR2 es otro receptor
que actúa como una señal que compite con DR4 y DR5 por su unión a Apo2L.
Los genes que codifican para DR4, DR5, DcR1 y DcR2 se encuentran en el mismo cromosoma humano
8p21−22, sugiriendo que todos ellos surgieron a partir de un gen ancestral común.
La idea de que los receptores de muerte inducen apoptosis en los tumores es atractiva, porque los receptores
de muerte tienen acceso directo a la maquinaria de caspasas. Mas aun, a diferencia de la quimioterapia y
radioterapia, los receptores de muerte inician la apoptosis independientemente de la supresión del gen p53,
que es inactivado por mutación en mas de la mitad de los cánceres humanos.
La utilidad clínica de TNF y de CD95L es menor de lo que se pensaba, debido a que tienen muchos efectos
tóxicos, consistentes en una severa respuesta inflamatoria, incluyendo un shock séptico.
17
Apo2L podría ser un posible agente terapéutico por tres motivos:
• Aunque DR4 y DR5 pueden activar NF−kB, Apo2L induce por si mismo esta respuesta.
• Muchos tejidos expresan constitutivamente Apo2L.
• DR4 y DR5 se expresan en tejidos normales, y en muchos tipos de células tumorales, mientras que
DcR1 y DcR2 se expresan frecuentemente en tejidos normales, pero infrecuentemente en células
tumorales.
CASPASAS
Las caspasas son una familia de proteasas cisteínicas que escinden específicamente proteínas con residuos
Asp (ácido aspártico). Lo novedoso es que conforman una completa red proteolítica en el citosol celular
(cuando lo habitual es encontrar éste tipo de cascada proteolítica en el exterior celular, como ocurre en los
procesos de coagulación sanguínea). Esta red implica la proteolisis limitada de un gran número de sustratos
celulares.
Las caspasas , según parece, son el resultado de la evolución en organismos multicelulares, y en mamíferos al
menos siete de los trece tipos conocidos actualmente, participan en uno de los dos caminos de señalización
siguientes:
• Activación de citoquinas proinflamatorias
• Promoción de la muerte celular apoptótica
Estructura, mecanismo y especificidad
Se sabe de la implicación de las caspasas en los procesos apoptóticos desde el descubrimiento de CED−3,
relacionado éste con la ICE o caspasa−1, que, aunque no tiene un papel obvio en la muerte celular, se ha
convertido en el primer miembro identificado dentro de una gran familia de proteasas, con importantes
papeles en inflamación y apoptosis. En la apoptosis las caspasas actúan como efectores y como iniciadores de
la señal apoptótica.
Las caspasas comparten similitudes en secuencia aminoacídica, estructura y especificidad al sustrato. Todas
ellas se expresan como proenzimas (30−50 kD) que contienen tres dominios: un dominio −NH2 terminal, una
subunidad grande de unos 20 kD y una subunidad pequeña de unos 10 kD.
En la activación se lleva a cabo un procesamiento proteolítico entre dominios, seguido de una asociación entre
las subunidades grande y pequeña para formar un heterodímero. Se ha determinado la estructura cristalina de
dos caspasas activas: las caspasas−1 y −3 , que en ambos casos forman dos heterodímeros para formar un
tetrámero, con dos centros activos que parecen funcionar independientemente.
El lugar de reconocimiento S1 está adaptado para aceptar una ramificación de Asp en el sustrato, y los lugares
de reconocimiento S2−S4 distinguen las caspasas entre si.
Dos características de la estructura del proenzima son fundamentales para el mecanismo de activación de las
mismas:
1º) El dominio −NH2 terminal, que es altamente variable en secuencia y longitud está involucrado en la
regulación de la activación.
18
2º) Todos los dominios se derivan del proenzima por escisión en lugares consenso de la caspasa, lo cual
implica que estas enzimas pueden ser activadas o autocatalíticamente o en cascada por enzimas con
especificidad similar.
Las caspasas escinden un número de proteínas celulares siendo el proceso una proteolisis limitada
produciéndose por lo general un único corte en regiones interdominio. A veces la escisión resulta en la
activación de la proteína, a veces en la inactivación , pero nunca en la degradación, ya que la especificidad del
sustrato distingue a las caspasas como las más restringidas de las endopeptidasas. La escisión de proteínas por
caspasas es muy específica y muy eficiente (kcat/Km>106M−1s−1). La especificidad se observa con el hecho
de que la apoptosis no está acompañada con la digestión indiscriminada de proteínas sino que más bien una
selección de proteínas es escindida de manera coordinada por lo general en un único lugar y que da como
resultado una pérdida o un cambio en la función.
La caspasa−1 es enormemente específica para los precursores IL−1 y IL−18 (interferon−−inducing
factor), haciendo un único corte inicial en cada procitoquina que las activa y permite la salida desde el citosol.
El procesamiento del precursor de la caspasa−1, requerido para la activación se ve raramente en modelos
experimentales de apoptosis y así, aunque se requiere para la activación de las citoquinas anteriormente
mencionadas, su papel en la apoptosis (si tiene alguno) es todavía incierto. La íntima relación en la secuencia
de actividad y en la especificidad de sustrato de las caspasas−4 y −5 las relacionan como efectores de la
activación de las citoquinas posiblemente como activadores upstream de la propia caspasa−1.
Mientras que la caspasa−1 (y posiblemente las caspasas−4 y −5) están principalmente implicadas en la
activación de procitoquinas, otras caspasas como las 2,3,6,7,8 y 10 se considera que promueven caminos hacia
la apoptosis.
Hasta ahora aproximadamente se han encontrado una docena de proteínas que se escinden específicamente
durante la apoptosis. Es muy simple demostrar qué cortes son causados por caspasas (resultan ser casi todos
ellos) por el análisis en el lugar de escisión, pero es más difícil determinar que caspasas son responsables in
vivo. Por ejemplo, la primera proteína que se descubrió que era escindida por caspasas durante la apoptosis
fue la poli(ADP− ribosa) polimerasa, que es un sustrato para la mayoría de las caspasas bajo condiciones
extremas in vitro, pero in vivo son probablemente blanco de caspasas−3 y −7. Por lo tanto, al combinar
observaciones in vivo con tests in vitro de las proteínas sospechosas se puede reconocer distinciones en la
especificidad de sustrato dentro de la familia de caspasas, que se ajustan a los lugares de reconocimiento
S4−S1, cuyas preferencias se deducen con sustratos peptídicos sintéticos.
Figura 9
¿Cómo matan las caspasas a las células?
19
La apoptosis comportan una serie de cambios: fragmentación del DNA, condensación de la cromatina,
´emburbujamiento´ de la membrana (blebbing), disminución del tamaño de la célula y la desacoplación en
vesículas cerradas por membranas (cuerpos apoptóticos). In vivo, este proceso acaba con el englobamiento de
estos cuerpos apoptóticos por otras células, previniendo las complicaciones que podrían resultar como
resultado de la liberación de los contenidos intracelulares. Estos cambios ocurren en una secuencia predecible
y reproducible y pueden ser completados de 30 a 60 minutos.
Los efectores de las caspasas son los responsables de los cambios celulares que ocurren durante la apoptosis y
que nos ayudan a entender el mecanismo de la misma.
Figura 10
Uno de los papeles de las caspasas es inactivar proteínas que protegen células vivas de la apoptosis. Un
ejemplo es la escisión de ICAD/DFF45, un inhibidor de la nucleasa responsable de la fragmentación del
DNA, el CAD(caspase−activated deoxyribonuclease).
En células no apoptóticas, el CAD está presente como un complejo inactivo con ICAD. Durante la apoptosis,
el ICAD es inactivado por las caspasas, con lo que CAS puede hacer su función de nucleasa. Pero el
mecanismo es más complicado: el CAD que se sintetiza en ausencia de ICAD no es activo, lo cual implica
que el complejo CAD−ICAD se forma de forma cotranslacional, y que el ICAD es necesario para la actividad
y la inhibición de la nucleasa.
Otros reguladores negativos de la apoptosis escindidos por caspasas son las proteínas Bcl−2. Parece que la
escisión no sólo inactiva estas proteínas, sino que también producen un fragmento que promueve la apoptosis.
Las caspasas contribuyen a la apoptosis a través de la desbandada de las estructuras celulares, como se ve en
la destrucción de la lamina nuclear, una estructura rígida que está situada por debajo de la membrana nuclear
y que está implicada en la organización de la cromatina. La lamina está formada por polímeros cabeza−cola
de proteínas filamentosas intermedias llamadas laminas. Durante la apoptosis, estas laminas son escindidas en
un único lugar por las caspasas, causando que la lamina se colapse, lo cual contribuye a la condensación de la
cromatina.
Las caspasas también reorganizan las estructuras celulares indirectamente al escindir varias proteínas que
están implicadas en la regulación del citoesqueleto, incluyendo la gelsolina, la quinasa de adhesión focal
(FAK), y la quinasa−2 activada por p21(PAK2).
La disociación de los dominios reguladores y efectores es uno de los hitos de la función de caspasas. Por
20
ejemplo, inactivan o desregulan proteínas que están implicadas en la reparación del DNA (como las
DNA−PKcs) splicing de mRNA (como la U1−70k) y replicación del DNA, (como la replicación del factor
C.).
Un estudio de éstos y otros sustratos sugieren que las caspasas participan en la apoptosis cortando contactos
con células vecinas, reorganizando el citoesqueleto, interrumpiendo tanto la replicación y reparación del DNA
como el splicing, destruyendo el DNA, desorganizando la estructura nuclear, induciendo a la célula a mostrar
señales que la marcan para la fagocitosis y desintegrando la célula en cuerpos apoptóticos.
Las caspasas son necesarias para la apoptosis
Una demostración de la importancia de las caspasas se realizó activando la muerte a partir de la expresión del
factor proapoptótico Bax en células bañadas en el inhibidor de caspasas Z−VAD−fluorometil cetona.
Los resultados demostraron que, aunque la muerte celular fue aplazada, no se impidió aún con las caspasas
fuertemente inhibidas. Sin embargo, la subsiguiente muerte no fue apoptótica, y se parecía enormemente a una
necrosis. En contraste con esto, al ligar el receptor de muerte Fas con células expresando el inhibidor de
caspasas CrmA no se observó efecto alguno (las células estaban completamente vivas en casos en que estos
niveles de Fas habrían provocado la muerte, y no exhibían signos ni de apoptosis ni de necrosis. La
explicación para los diferentes resultados nos da la respuesta a lo que es la muerte celular. En la iniciación de
la muerte vía Fas, la primera señal es la activación de Caspasa−8 en la cara citosólica del receptor, pero en la
activación vía Bax, la señal está integrada en el interior de la célula, y da como resultado una muerte celular
que es caspasa−independiente y una apoptosis paralela que es dependiente de caspasas para su resultado final.
Las caspasas no son las únicas enzimas que participan en la apoptosis, ya que las nucleasas y las
proteinquinasas pueden participar, pero son absolutamente necesitadas para la proteolisis limitada y precisa
que tipifican este tipo de muerte celular programada.
Regulación de las caspasas
La regulación de las caspasas es efectiva y al mismo tiempo complicada. Ésta complicación en la regulación
explica un dato muy significativo: mantienen la proteasa efectora inactiva, pero son capaces de activar
rápidamente grandes cantidades de proteasa en respuesta a pequeñas cantidades del inductor apropiado. Dada
la función de las caspasas como mediadores de la muerte celular, la complejidad de su regulación iguala con
facilidad la del sistema de coagulación o el sistema del complemento.
Se dan diferentes posibilidades:
• Activación de caspasas efectoras: hay numerosas experiencias que apoyan la teoría del modelo en
cascada.
21
Figura 11
Una señal proapoptotica culmina en la activación de una caspasa iniciadora, la cual, a su vez, activa las
caspasas efectoras, dando como resultado el desmontaje de la célula. Según sea la señal actúan unas caspasas
iniciadoras u otras. Por ejemplo, la caspasa−8 está asociada con la apoptosis que provoca la muerte de los
receptores. En cambio, la caspasa−9 está implicada en la muerte inducida por agentes citotóxicos. Éste
modelo explica como las distintas señales apoptóticas inducen los mismos cambios bioquímicos y
morfológicos.
• Activación de iniciadores de caspasas: la evidencia disponible indica que la activación de los
iniciadores de caspasas requiere uniones a cofactores específicos, un mecanismo observado por lo
general en proteasas. Ésta unión es disparada por una señal proapoptotica y mediada a través de una
de al menos dos motivos estructurales que residen en el prodominio caspasa y en su correspondiente
cofactor. La activación de la procaspasa−8 necesita la asociación con su cofactor FADD
(Fas−associated protein with death domain) a través del DED (death recruitment factor), mientras
que la activación de la procaspasa−9 necesita un complejo con el cofactor APAF−1 mediado por el
CARD (caspase recruitment domain). La activación de la caspasa−9 también necesita citocromo c y
dATP, lo cual indica que la caspasa requiere múltiples cofactores.
Se puede llegar a explicar porque la unión de los cofactores lleva a la activación a través del modelo de
oligomerización o de proximidad inducida. Éste modelo está basado en tres observaciones:
• Las procaspasas tienen una actividad baja pero detectable.
• Se requiere la dimerización para la activación.
• Las procaspasas que están sobre expresadas en las células y entrecruzadas se convierten en activas.
Este modelo teórico postula que las caspasas están presentes en la célula de forma latente, ya que existen en
las células en forma de monómeros. Los cofactores sirven para acercar dos o mas precursores, permitiendo la
activación intermolecular autoproteolítica. Este modelo tiene ciertos puntos no muy claros.
Por ejemplo, no está claro que los precursores de la caspasa de iniciación sean monómeros dentro de la célula
viva.
El modelo autocatalítico facilitado postula que los precursores de las caspasas están presentes en células en
una conformación o un complejo que previene la autocatálisis. Los cofactores facilitan la activación al
cambiar la conformación de los precursores directamente o quitando el inhibidor. Se dan dos aproximaciones
para conocer el mecanismo de activación: a) obtener la estructura de un precursor de caspasa, b) estudios de la
activación de las caspasas usando componentes purificados de las células.
22
Se sabe muy poco sobre la regulación de la activación entre procaspasas y sus cofactores. Un ejemplo son
unas proteínas inhibidoras del tipo FADD−ICE (FLIPs). Estas proteínas son similares en secuencia a las
procaspasas−8, excepto en que les falta residuos catalíticos esenciales. Estas proteínas probablemente
compiten con la procaspasa−8 para la unión a su cofactor, FADD, y así impiden la activación de las caspasas.
Parece ser que la procaspasa−8 no es la única que tiene un doble (decoy), como se ve por el descubrimiento
del dominio CARD−proteína que la contiene, ARC (apoptosis represor with caspase recruitment domain).
Los factores que determinan cómo los cofactores seleccionan entre procaspasas y sus dobles no se conocen
todavía.
La compartimentalización de las caspasas y sus cofactores seguro que es otra forma de regular la activación
de las caspasas. Este concepto está apoyado por el descubrimiento de que extractos de algunas células vivas
pueden activar a las caspasas espontáneamente, lo cual sugiere que todos los componentes requeridos para la
activación de las caspasas están presentes aunque latentes en las células vivas. Esta observación llevó al
descubrimiento de que el citocromo c es necesario para la activación in vitro de caspasa−9 y la subsiguiente
hipótesis de que la apoptosis puede ser activada por cambios mitocondriales inducidos que dan como
resultado la liberación de este cofactor.
Otro ejemplo se da por el descubrimiento de que la caspasa−8 está activada cuando es secuestrada por el
complejo receptor FAS.
Inhibidores como reguladores: dada la importancia de los inhibidores en la regulación de sistemas
proteolíticos complejos, no es sorprendente encontrarles también implicados en el control de proteasas de
muerte celular. La identificación de los inhibidores de caspasas se ha realizado en virus. Se han descrito tres
tipos distintos de inhibidores virales: el CrmA, el p35 y una familia de proteínas IAP( inhibidores de
apoptosis). La vacuna del virus CrmA es un miembro de la familia de las serpinas que es un potente inhibidor
de algunas caspasas iniciadoras activas y de las implicadas en la inflamación.
Los blancos selectivos de caspasas de las IAPs siguen siendo poco definidos. Se observó in vitro una
inhibición selectiva y fuerte de caspasa−3 y caspasa−7 con IAP ligado en x, lo cual sugiere que las IAPs
inhiben la apoptosis a través de la inhibición de las caspasas efectoras.
Sin embargo, esto no es tan sencillo porque también previenen la activación de estas enzimas hasta la
sobreexpresión, lo cual sugiere que las proenzimas de las caspasas efectoras u otras proteínas en el complejo
de activación son los auténticos blancos en las células. Alternativamente, si las caspasas efectoras amplifican
la señal apoptótica, activando caspasas iniciadoras, las IAPs funcionarán como reguladores negativos.
Objetivos y terapias potenciales
Hay dos tipos opuestos de enfermedades que implican la desregulación de la apoptosis son aquellos que
involucran una apoptosis excesiva, causando daño al tejido normal, y aquellos en los que se previene la
apoptosis, permitiendo el crecimiento de tejido maligno. De la misma forma, las dos estrategias para la
intervención terapéutica involucran la inhibición de las caspasas o la inducción de la apoptosis a través de la
activación de las caspasas.
La inhibición de las caspasas. Se culpa a una apoptosis excesiva de varias patologías graves, para las cuales
hay pocas alternativas terapéuticas, incluyendo entre ellas las enfermedades neurodegenerativas, trastornos
autoinmunes o el rechazo de los injertos. Las caspasas son blancos atractivos para el tratamiento de estas
enfermedades por el papel necesario de estas enzimas en la apoptosis y por la atractiva posibilidad de una
terapia inhibidora con moléculas pequeñas. De hecho, hay creciente evidencia de que esta aproximación
puede tener éxito. Por ejemplo, la supresión de la apoptosis a través de la expresión del p53 previene la
ceguera en mutantes de Drosophilla melanogaster en la degeneración retinal, indicando que la inhibición de
las caspasas puede mantener las células vivas. Además, los inhibidores de las peptidil caspasas son efectivos
23
en modelos animales de infarto, enfermedad del hígado y lesiones cerebrales traumáticas.
En cuanto a la aplicación terapéutica de estos descubrimientos, aún quedan por responder muchas preguntas
significativas, particularmente en el tratamiento de trastornos crónicos. ¿Cuáles son los mejores blancos para
la inhibición de la apoptosis? Para responder a esta pregunta, se necesita un mejor entendimiento de los
papeles de las caspasas individuales en tejidos diferentes. ¿Se podrían tratar las enfermedades crónicas con
seguridad sin el riesgo de enfermedades autoinmunes o de metástasis del cáncer? Se necesitará la distribución
específica tisular del inhibidor selectivo. Probablemente es mas realista, al menos inicialmente, el considerar
las perspectivas de tratamiento en las enfermedades agudas, asumiendo, claro está, que hay una ventana
terapéutica adecuada para la enfermedad en cuestión.
En un nivel más práctico, ¿se puede identificar un inhibidor de caspasas que tenga las propiedades adecuadas
para ser usado in vivo? Aunque hay dos clases de fármacos que funcionan inhibiendo proteasas, como los
inhibidores de las enzimas inhibidoras de angiotensina (IECAs) o los inhibidores de proteasa del VIH, y pocos
más. Por ejemplo, los trabajos en la inhibición de la proteasa cisteínica ha significado un comienzo, dando un
punto de partida en la identificación de varios casos de inhibidores de caspasas reversibles e irreversibles.
Tratamiento del cáncer: dos de los principales problemas de la quimioterapia son la toxicidad en las células
normales y el fracaso en matar todas las células cancerígenas. Ambos problemas proceden del mecanismo
indirecto por el cual los fármacos quimioterápicos y la irradiación mata a las células. Dañan las células
normales y las cancerígenas a la vez, y este daño se traduce a través de múltiples pasos a la muerte celular,
probablemente a través de la activación de las caspasas y la apoptosis
Una estrategia alternativa es diseñar un tratamiento que active a las caspasas directamente. Una posibilidad
implica la activación de los complejos receptores de muerte celular que están directamente vinculados a las
caspasas iniciadora (fig.4). Ya que los receptores de muerte también se expresan en las células normales, el
principal desafío para esta estrategia es activar estos receptores selectivamente en las células cancerígenas.
Otra aproximación al problema viene de la observación de que las oncoproteínas que desregulan el ciclo
celular pueden activar a las caspasas e inducir apoptosis. Por lo tanto, la transformación oncogénica se puede
considerar como una señal proapoptótica que está presente sólo en las células transformadas. Cuando ésta
señal está desacoplada debido de la activación de la caspasas, las células transformadas sobreviven. El
entender cómo esta señal puede ser asociada a la activación de las caspasas dará una oportunidad para matar
selectivamente células transformadas.
Figura 12
24
MITOCONDRIAS
Regulación mitocondrial de la muerte en apoptosis y necrosis
La muerte celular fisiológica (apoptosis) y, en algunos casos, la muerte celular accidental (necrosis) se dan en
dos pasos:
En primer lugar, numerosos estímulos fisiológicos y patológicos disparan un incremento de la permeabilidad
en la membrana mitocondrial. La mitocondria excreta factores apoptóticos a través de la membrana externa y
disipa el gradiente electroquímico de la membrana interna. El poro mitocondrial transmembrana (PT)
involucra un complejo dinámico multiproteína formado en el lugar de contacto entre las membranas interna y
externa. El complejo PT puede actuar como sensor del stress y el daño, y también de ciertas señales
dependientes de los receptores. La inhibición del PT por la intervención de fármacos en las estructuras
mitocondriales o la expresión mitocondrial de la oncoproteína inhibidora de apoptosis (Bcl−2) previene la
muerte celular, lo cual sugiere que el PT es un factor limitante en el proceso de muerte celular.
En segundo lugar, las consecuencias de la disfunción mitocondrial (colapso del potencial transmembranal
interno de la mitocondria, desacoplamiento de la cadena respiratoria, hiperproducción de aniones superóxido,
disrupción de la biogénesis mitocondrial, pérdida de la matriz del calcio y del glutation y liberación de
proteínas solubles intermembrana) conllevan una catástrofe bioenergética, que culmina en la disrupción de la
integridad de la membrana citoplasmática (necrosis) y/o la activación de proteasas apoptóticas específicas
(caspasas) por mediación de proteínas mitocondriales que se filtran al citosol (citocromo c) con activación
secundaria de endonucleasas (apoptosis).
El grado relativo de estos dos procesos (catástrofe bioenergética frente a activación de endonucleasa)
determina si una célula sufrirá una apoptosis o una necrosis primaria. La adquisición de las características
bioquímicas y estructurales de la apoptosis se apoyan críticamente en la liberación de proteasa apoptóticas o
activadores de proteasas de la mitocondria. El hecho de que la mitocondria controle la muerte celular tiene un
impacto importantísimo en el desarrollo de fármacos citoprotectores y citotóxicos.
Apoptosis y necrosis: similitudes y papel de la mitocondria
Aunque la apoptosis y la necrosis se han contemplado frecuentemente como opuestas, en la actualidad se
asume que ambas formas de muerte celular constituyen dos extremos de una misma cosa.
Mas aun, varias observaciones nos hacen dudar de que estas dos operaciones sean opuestas en función. Así, la
misma toxina puede inducir apoptosis ó necrosis a una dosis baja (subnecrótica) ó alta, respectivamente. El
equilibrio entre necrosis y apoptosis se puede influenciar por la manipulación de los niveles de ATP y en la
activación de las caspasas. Así pues, el mantenimiento de altos niveles de ATP favorece la apoptosis sobre la
necrosis, mientras que la inhibición de la activación de la caspasa transforma la apoptosis en necrosis. Los
timocitos responden normalmente a una estimulación con glucocorticoides con una apoptosis, seguida por una
necrosis secundaria. Sin embargo, en presencia del inhibidor de caspasas
N−benciloxicarbonil−Val−Ala−Asp−fluorometilcetona (Z−VAD.fmk), las células no llegan a dar apoptosis
nuclear y mueren de histolisis sin apoptosis (necrosis primaria). Hay un gran número de patologías que
anteriormente se pensaba estaban relacionadas con la necrosis y que actualmente se relacionan con la
apoptosis: apoplejía, infarto de miocardio, daño isquémico, etc.
Mas importante aún, la hiperexpresión de la oncoproteína inhibidora de apoptosis Bcl−2 inhibe varios
ejemplos de muerte celular por necrosis: necrosis neuronal inducida por kainita (sulfato magnésico
cristalizado con cloruro potásico, usado como fertilizante), oclusión de la arteria cerebral, anoxia o hipoxia
química. Al menos en algunos casos, el PT mitocondrial, que se regula con el Bcl−2, constituye una función
en apoptosis y necrosis.
25
Así, las fases primeras de ambos fenómenos de muerte celular implican una posibilidad similar en la
permeabilidad de la membrana de la mitocondria.
Cambios mitocondriales en la necrosis: el m
El potencial transmembranal de la mitocondria ( m) se puede monitorizar en células vivas usando
diferentes tinciones sensibles al potencial: rodamina 123, yoduro de 3,3´− dihexiloxicarbocianina [DiOC6 (3)]
, yoduro de 5,5´,6,6´−tetracloro−1,1´3,3´−tetraetil−bencimidazolcarbocianina (JC−1) y
clorometil−x−rosamina (CMX Ros). Todos estos colorantes comparten una estructura lipofílica catiónica que
les permite distribuirse libremente a través de la membrana de la matriz mitocondrial como una función de la
ecuación de Nernst relacionada con el m. Se ha podido ver en numerosos ensayos in vitro modelos de
necrosis que, tras la exposición al colorante, el m se disipa antes de que la membrana plasmática se altere y
antes de que las células manifiesten signos de daño como la vacuolización o hinchamiento citoplasmático.
El m resulta de la diferente distribución de iones (principalmente protones) en la membrana interna
mitocondrial. La disrupción de m sugiere que la fuerza que mueve a los protones y/ o la permeabilidad de
la membrana interna se han visto afectadas durante el daño celular.
Experimentos farmacológicos han dado como resultado que la ciclosporina A puede prevenir o retardar la
disrupción de m y la subsiguiente muerte celular. Además, un derivado de ciclosporina A, la
N−metil−Val−ciclosporina A, que pierde sus efectos inmunosupresores dependientes de calcineurina, pero
conserva su efecto en la ciclofilina D de la mitocondria, es capaz aún de estabilizar el m y de dar efectos
citoprotectores. Basados en estos experimentos, se ha propuesto que un canal mitocondrial que se puede
inhibir por Ciclosporina A puede estar implicado en la necrosis. Este canal, también llamado el poro de
transición de permeabilidad (PT), ha sido estudiado extensamente desde los puntos de vista farmacológico y
funcional.
Dependiendo de los diferentes efectores fisiológicos, el poro PT puede adoptar una conformación abierta o
cerrada. En circunstancias normales, la mayoría si no todos los poros PT están cerrados. Abrir el poro tiene
consecuencias drásticas para la fisiología de la mitocondria, incluido el colapso del m, desacoplación de la
cadena respiratoria., etc. Además de la ciclofilina D, la diana de la ciclosporina A, y la
N−metil−Val−ciclosporina A, otras proteínas como el receptor benzodiazepínico periférico (PBR) y el
translocador del nucleótido adenina (ANT) están implicados en la formación y/o regulación del poro PT. Las
sustancias que actúan específicamente en las estructuras mitocondriales para inducir el PT pueden modular la
26
necrosis. Así pues, la protoporfirina IX (PPIX), un ligando de PBR, induce al PT y a las subsiguientes
necrosis en los hepatocitos. Otros ligandos del PBR, como el PK11195 y el clordiazepam, pueden facilitar la
necrosis inducida por el −TNF de células L929. Mas aún, se ha visto que se puede inducir el PT en varios
modelos de muerte celular con un gran número de metabolitos tóxicos como las especies reactivas del
oxigeno, óxido nítrico y concentraciones por encima de lo normal de Ca2+.
Figura 13
Involucración de la mitocondria en la apoptosis
La ausencia de cambios en la ultraestructura de la mitocondria, junto con el hecho de que las células sin ADN
mitocondrial pueden sufrir la apoptosis (por ejemplo, las células que poseen mitocondrias deficientes respecto
a la respiración), dio una primera idea de que la mitocondria no intervenía en el proceso de apoptosis. Esta
interpretación es incorrecta, como se verá en este capítulo en tres puntos diferentes:
• Evidencia cronológica: se ha observado que las células que están en apoptosis exhiben una reducción
del consumo celular de m. La disipación del m es una característica general de la apoptosis, sin
tener en cuenta el tipo de célula que sea(neuronas, fibroblastos, timocitos, monocitos, hepatocitos,
linfocitos, células tumorales, etc) y del inductor de apoptosis: toxinas, condiciones de cultivo no
optimas, intervenciones en sistemas de segundos mensajeros, ocupación de receptores de
glucocorticoides, o ausencia de factores de crecimiento necesarios. La disrupción del m también se
observa en células a las que les falta ADN mitocondrial. Cuando una manipulación farmacológica o
genética tienen éxito en prevenir la apoptosis, también frena la disrupción del m que suele preceder
a la histolisis (tabla 4). El colapso de m constituye un suceso temprano respecto a las otras
manifestaciones de apoptosis detectables en los niveles del núcleo (condensación de la cromatina y
fragmentación del ADN), del citoplasma (activación del CPP32, entrada de calcio y salida de
potasio), o de la membrana plasmática (exposición a la fosfatidilserina y posterior incremento en la
permeabilidad), como se ve en la figura 2 de la página siguiente. Sin embargo, el colapso de m
27
significa una etapa irreversible del proceso de la apoptosis. Así pues, las células purificadas con un
bajo m llegan a una apoptosis completa, incluso después de retirar el estímulo que ha inducido la
apoptosis. Basado en estos descubrimientos, se puede concluir que la disrupción del m define una
etapa irreversible del proceso de apoptosis. Además de los cambios en m , se han descubierto otros
cambios en la permeabilidad de la membrana mitocondrial. El citocromo c, el cual está normalmente
confinado en el espacio intermembrana mitocondrial, se encuentra en el citosol de las células que
están sufriendo apoptosis. Una vez mas, este proceso se anticipa a la apoptosis del núcleo. Aun es una
cuestión debatible si el citocromo c es una causa o una consecuencia de la apertura del poro PT.
• Evidencia funcional: la inhibición de la primera fase de la pre−apoptosis (colapso del m) por la
ciclosporina A y el N−metil−Val−ciclosporina A estableció el vínculo con el PT, un proceso
mitocondrial que está específicamente inhibido por los ligandos de ciclofilina D. Observamos que la
disrupción del potencial mitocondrial transmembranal inducido por protoporfirina IX lleva a la
apoptosis. En contraste, dos agentes que actúan en la mitocondria para inhibir el PT, ácido
bongcrécico (un ligando del translocador de nucleótidos de adenina, otro constituyente del megacanal
anteriormente citado), y el CMXRos (el cual actúa en los tioles de la matriz mitocondrial), inhiben la
disrupción del m y también la posterior fragmentación del ADN nuclear (Tabla 3). La inhibición
28
de PT previene la histolisis y todas las alteraciones apoptóticas a nivel de la membrana plasmática, el
núcleo y el citoplasma. Estos resultados evidencian que el PT mitocondrial constituye un elemento
crítico del proceso de la apoptosis. Esto también se ve sugerido por el hecho de que la oncoproteína
Bcl−2 puede funcionar como un inhibidor endógeno de PT, como se explicará en el siguiente
capítulo.
Evidencia obtenida en sistemas libres de células (Cell−free): los resultados descritos demuestran que las
mitocondrias están implicadas en la apoptosis. Sin embargo, no aclaran la relación causa−efecto entre las
perturbaciones mitocondriales y las perturbaciones nucleares. Para intentar explicar esto, se ha desarrollado un
sistema experimental libre de células en el cual núcleos aislados son cultivados en presencia de mitocondrias
aisladas. Se averiguó que la presencia de los productos mitocondriales eran necesarios para la inducción de la
apoptosis en los núcleos de las células de mamíferos, y se ha visto que las mitocondrias humana y de ratón
son normalmente inertes en ese sistema. Sólo cuando se abren sus megacanales puede la mitocondria provocar
cambios apoptóticos (condensación de la cromatina, fragmentación del ADN) en núcleos purificados. Esta
actividad apoptogenética se debe a las proteínas solubles liberadas desde la mitocondria. Se han purificado y
analizado un factor inductor de apoptosis (AIF) y se ha visto que no tiene funciones directas de ADNsc; actúa
por la rápida activación (<5 minutos) de las endonucleasas nucleares. Mas aún, el AIF puede estimular la
activación proteolítica de la caspasa 3 (CPP32/Yama/Apopain). Además del AIF, se libera la proteína
intermembrana citocromo c desde la mitocondria, que está en el proceso de PT. El citocromo c por si solo no
es apoptogenético, pero sin embargo, puede cooperar con otros factores para activar las caspasas y
endonucleasa nucleares.
Como conclusión, parece que las proteasas apoptogenéticas y/o los activadores de las proteasas son liberados
desde la mitocondria sobre el PT y que estos productos son necesarios para que ocurra la apoptosis nuclear.
29
El complejo Bcl−2: un regulador mitocondrial
La familia de las proteínas relacionadas con el Bcl−2 constituye una de las clases más importantes de
productos génicos relacionados con la regulación de la apoptosis. Bcl−2 pertenece a una creciente familia de
productos genéticos reguladores de la apoptosis que pueden ser o antagonistas de la muerte (como el Bcl−2,
Bcl−L, Bcl−w) o agonistas de la muerte (como el Bax, Bak, Bcl−Xs, Bad). La cantidad relativa de agonistas y
de antagonistas de la familia de Bcl−2 constituyen un aparato regulador cuya función está determinada, al
menos en parte, por proteínas selectivas−interacciones de proteínas. Recombinaciones homólogas revelan que
las proteínas inhibidoras de apoptosis semejantes al Bcl−2 ejercen funciones citoprotectoras esenciales; su
deficiencia provoca la ablación de determinados tipos de células, como las células linfoides en Bcl−2. La
importancia funcional de estas proteínas se ve también en el hecho de que muchos tumores hiperexpresan o
hipoexpresan miembros de la familia de las Bcl−2 para inhibir o inducir la apoptosis, respectivamente. La
sobreexpresión de Bcl−2 inducida por transfección o transgen tiende a proteger a las células contra la mayoría
de los protocolos de apoptosis inducida, y también protege contra regímenes que provocan necrosis. La
transfección con bcl−2 o bcl−xL inhibe o retarda los cambios mitocondriales tempranos asociados con la
apoptosis. Este descubrimiento se ha obtenido en células y en citoplastos (células anucleadas). En contraste, la
hiperexpresión del antagonista de Bcl−2 Bax causa una disipación de m. Estos descubrimientos sugieren
que las proteínas relacionadas con Bcl−2 regulan funciones mitocondriales.
Muchas proteínas codificadas por la familia de genes del bcl−2 están preferentemente localizadas en la
membrana mitocondrial externa, en el sitio de contacto con la membrana interna. En células linfoides, la
expresión de Bcl−2 se relaciona estequiométricamente con la de PBR, lo cual sugiere que la Bcl−2 podría
interactuar con el PBR o con una proteína asociad a PBR, quizás carnitina palmitoltransferas I, con la cual
Bcl−2 interacciona directamente. Varios miembros importantes de la familia de las Bcl−2 poseen dominios
transmembranarios C−terminal (TM), permitiendo la incorporación a membranas intracelulares. La deleción
de mutantes o el reemplazo del dominio TM han mostrado que, al menos en algunos sistemas experimentales,
Bcl−2, Bcl−XL y Bax actúan en las membranas mitocondriales mas que en las membranas de otros
compartimentos intracelulares para prevenir (Bcl−2, Bcl−XL) o inducir (Bax) la muerte celular. En sistemas
de apoptosis libres de células el Bcl−2 también debe estar presente en la mitocondria mas que en la envoltura
nuclear para inhibir la apoptosis. Las mitocondrias purificadas a partir de células que hiperexpresan Bcl−2
están protegidas contra el efecto inductor de PT de varios inductores de apoptosis como prooxidantes, bajas
dosis de calcio, protoporfirina IX y las células del citosol tratadas con ceramida. El Bcl−2 protege contra la
liberación de AIF y el citocromo c. Sin embargo, Bcl−2 no bloquea el efecto inductor de PT de otros agentes
como altas concentraciones de Ca2+ (500 g), altas dosis de caspasa 1 recombinante (ICE), etc. Así pues, el
Bcl−2 ejerce efectos inhibitorios de PT en la mitocondria, aunque con un espectro inhibitorio limitado. En
contraste, el Bcl−2 no afecta a la formación de AIF y sólo tiene efectos marginales en la acción del citocromo
c o el AIF en el núcleo aislado in vitro.
La estructura tridimensional del monómero Bcl−XL en ausencia de su dominio hidrofóbico C−terminal
(Bcl−XLTM) consiste en dos hélices hidrofóbicas rodeadas por cinco hélices anfipáticas y 60 lazos flexibles
residuales. Debido a la proximidad espacial de los dominios BH1, BH2 y BH3 se forma un espacio cerrado
hidrofóbico.
Esta estructura tiene cierta similitud a los dominios formadores de poros de varias toxinas bacteriológicas, en
concreto las colicinas A y E1 y la toxina diftérica. Como estas toxinas bacteriológicas, el Bcl−XLTM se
puede insertar en vesículas lipídicas sintéticas o en bicapas lipídicas, formando un canal conductor de iones.
Este canal es sensible al pH (un pH bajo lo abre) y se convierte en catión selectivo a pH fisiológico
(K+=Na+Ca2+>Cl−), pH al cual desarrolla un estado de conductancia múltiple con idéntica selectividad
iónica. Los dominios formadores de canales (−hélices 5 y 6 entre BH1 y BH2) varían entre diferentes
miembros de la familia de la Bcl−2. De la misma forma, Bax posee una selectividad iónica diferente
(Cl−>K+). Ahora mismo no está claro si Bcl−2 y Bax regulan el PT directamente o indirectamente, como por
ejemplo al regular otras funciones mitocondriales como la liberación de citocromo c o la actividad de las
30
enzimas mitocondriales.
Integración de señales de muerte especificas
La composición exacta del poro PT no es conocida; hoy en día se cree que está compuesto por proteínas
citosólicas (hexoquinasas), proteínas de membrana externa (PBR), porinas, proteínas intermebrana (creatinin
quinasa), al menos una proteína de membrana interna (el translocador del nucleótido adenina (ANT), y al
menos una matriz proteínica (ciclofilina D). También puede interaccionar con proteínas de complejos
multiproteína adicionales, llamados el complejo Tim (transporter of the inner membrane), el complejo Tom
(transporter of the outer membrane) y el complejo Bcl−2.
El poro PT contiene múltiples blancos para intervenciones farmacológicas y está regulado por numerosos
efectores fisiológicos endógenos (ver tabla 6)
Tales efectores incluyen iones (cationes divalentes sobre todo Ca2+ y Mg2+), protones, m, la
concentración de nucleótidos de adenina (ADP, ATP), el estado de reducción de la pirimidina (NAD o
NADH2; NADP o NADPH2), el estado de reducción del tilo (controlado por glutation), especies reactivas de
oxígeno y óxido nítrico, las concentraciones de cuerpos lipídicos (ácidos lipídicos, Acetil−CoA, ceramidas y
derivados), las concentraciones de determinados péptidos (péptidos anfipáticos) y cambios en la composición
o función del complejo Bcl−2. Como regla, parece que cualquier gran cambio en el balance de energía
(ausencia de oxígeno, deplección de ATP y ADP, deplección de NAD(P)H2, disrupción de m) o cambios
en el equilibrio redox (oxidación / deplección de glutation no oxidado o NAD(P)H2, hiperproducción de
especies reactivas con oxígeno) pueden provocar PT. Esto implica que el PT integra respuestas al stress y que
el daño principal de las células causará invariablemente PT. Mas aún, ya que el propio PT causa tales cambios
en el balance rédox y de energía, un PT muy elevado bloquea la célula en un estado irreversible.
Además, determinados caminos de transducción estimulados vía intracelular o receptores de la superficie de la
célula pueden dar PT. Así pues, el PT está facilitado por un gran número de segundos mensajeros:
31
incrementos en la concentración de calcio en el citosol, ceramidas y enzimas semejantes a la caspasa 1 como
la ICE (interleukin 1 converting enzime). Como el PT es regulada por el complejo Bcl−2, los cambios en la
estequiometría del complejo (por ejemplo, síntesis aumentada del antagonista de Bcl−2, Bax) o señales de
caminos de transducción, culminando en modificaciones postranslacionales del complejo Bcl−2, pueden
facilitar PT. La fotofosforilación del Bcl−2 o los homólogos de Bcl−2 (ejemplo: Bad), junto con la
distribución subcelular de las proteínas relacionadas con Bcl−2 (ejemplo: Bad), o las proteínas asociadas al
Bcl−2 (ejemplo: Bag−1, Raf−1) están regulados por receptores del factor de crecimiento, con lo que sugiere
como la retirada del factor de crecimiento puede desencadenar PT indirectamente, por medio de los cambios
en la composición del complejo Bcl−2 que regula PT.
Estos descubrimientos indican que, además de integrar varias respuestas de daño, el PT puede ser activado por
caminos conectados al receptor. El PT puede constituir la encrucijada de las respuestas a daños no específicos
junto con las respuestas mediadas por receptores específicos.
Cómo ejecuta la mitocondria la muerte celular
Bajo circunstancias normales, la membrana mitocondrial interna es casi impermeable. Esta característica es
necesaria para mantener el potencial transmembranal interno, m. La apertura del poro PT permite la
difusión de los solutos con un Mw>1500 KDa, de acuerdo con cálculos aproximados basados en el uso de
polímeros de polietilenglicol. El resultado evidencia una disipación inmediata del m, con la consecuente
pérdida de RNA mitocondrial y síntesis proteica, parada del suministro de la mayoría de las proteínas
sintetizadas en el citosol (el cual depende del m), liberación de Ca2+ y glutation de la matriz mitocondrial,
desacoplamiento de la fosforilación oxidativa con parada de la síntesis de ATP, oxidación de NAD(P)H2 y
glutation e hiperproducción de anión superóxido en la cadena respiratoria.
El análisis de fluorescencia multiparámetro revela que el colapso de m está ligado íntimamente a grandes
cambios en los potenciales rédox de la célula, cosa que se observa en la deplección de NAD(P)H2,
deplección/oxidación de GSH, posteriores incrementos en la generación del anión superóxido y masivas
elevaciones del Ca2+ mitocondrial. Curiosamente, estas consecuencias del PT pueden provocar por si mismas
PT, lo cual sugiere la existencia de uno o varios procesos autoamplificados que pueden explicar por qué el PT
(y la muerte celular) es un fenómeno de todo o nada.
Los cambios bioenergéticos y rédox del PT son por si mismos suficientes para dar una necrosis. Pero para
causar una apoptosis la cosa es diferente: el PT permite la liberación de las proteínas que están habitualmente
recluidas a la mitocondria. Así, el PT provoca la liberación del citocromo c del espacio intermembranal al
citosol. La proteína precursora del citocromo c (apocitocromo c) se sintetiza en el citosol y es transportado al
espacio intermembranal, donde la enzima hemoliasa la junta a un grupo hemo, dando el holocitocromo c. Ni
el citocromo c ni su precursor el apocitocromo c provocan por si mismos apoptosis, pero el holocitocromo c,
al cual le falta un grupo hemo, puede interaccionar con otros factores citosólicos aún desconocidos para
activar las caspasas 3 (CPP32/Yama/Apopain) y 6 (Mch−2) e inducir apoptosis nuclear in vitro. El CPP32
puede entonces activar el factor de fragmentación del DNA (DFF), el cual actúa a su vez para activar las
nucleasas.
Además del citocromo c, la mitocondria que está en PT libera AIF, una proteína inestable de unos 50 KDa,
que basta para causar apoptosis nuclear y activación de CPP32 en los sistemas libres de células. Se ha podido
identificar un inhibidor de AIF, la N−benciloxicarbonil−Val−Ala−Asp−fluorometilcetona (Z−VAD.fmk). Este
inhibidor de la proteasa anula toda actividad del AIF en el núcleo. El Z−VAD.fmk es también un inhibidor de
la apoptosis nuclear, sea cual sea el tipo de célula, con lo que se enfatiza la importancia in vivo del AIF.
Resumiendo, la mitocondria contiene varias proteínas que tienen la capacidad de estimular al menos algunos
aspectos del programa apoptótico en sistemas libres de células. Actualmente, parece que hay al menos dos
caminos bioquímicos que pueden unir la mitocondria a la apoptosis nuclear: AIF y el citocromo c junto con el
factor X! la caspasa 3!DFF.
32
APOPTOSIS Y PATOLOGÍAS
Apoptosis y glaucoma
Diversos estudios han demostrado que la apoptosis puede ser el mecanismo fundamental de muerte de las
células ganglionares en el glaucoma. La base genética y molecular de la apoptosis se está desvelando de forma
cada vez más precisa, lo que podría permitir, en un futuro no muy lejano, el desarrollo de tratamientos
neuroprotectores que complementarían la terapéutica antiglaucomatosa clásica.
Relación entre apoptosis y patología oftalmológica
La apoptosis es un mecanismo de muerte celular en diversas enfermedades oculares. Se ha comprobado la
presencia de apoptosis en las células ganglionares de la retina tras glaucoma experimental, sección del nervio
óptico y en neuropatía óptica isquémica anterior. Asimismo se ha visto que pueda estar de alguna manera
implicada en retinitis pigmentosa, desarrollo de catarata, retinoblastoma, isquemia retiniana y retinopatía
diabética.
Estímulos desencadenantes de la apoptosis
Se ha postulado que los dos factores desencadenantes fundamentales de la apoptosis en las células
ganglionares de la retina son:
• La deprivación de factores neurotróficos
• El incremento del nivel de excitotoxinas.
• Deprivación de factores neurotróficos (neurotrofinas)
La mayoría de las neuronas dependen de factores de crecimiento para su supervivencia. Estos factores son
pequeños péptidos (neurotrofinas, factores neurotróficos, citoquinas o factores de crecimiento) que actúan
uniéndose a receptores de la superficie de células diana, lo que desencadena una cascada de eventos
moleculares, que suelen comenzar con la activación de la proteinquinasa y que afectan a múltiples funciones
vitales del metabolismo de la célula. El más investigado es el BDNF (Brain derived neurotrophic factor), que
es producido por las células cerebrales durante el desarrollo, siendo transportado por flujo axoplásmico
retrógrado hacia la retina, por lo que las células ganglionares que fracasan en realizar sus conexiones con el
cerebro mueren por ausencia de este factor, que es un componente esencial para su metabolismo. Este hecho
explica la pérdida fisiológica de células ganglionares durante el desarrollo fetal.
La dependencia de las células ganglionares respecto al BDNF se mantiene a lo largo de toda su existencia, por
lo que en la retina adulta cualquier mecanismo que impida el flujo retrógrado de BDNF (y/o otras
neurotrofinas) compromete la viabilidad de las células ganglionares. Esto sucedería cuando se secciona el
nervio óptico, lo cual estimula la apoptosis, que podría retrasarse mediante la inyección intravítrea de BDNF.
Algo parecido, aunque menos drástico, ocurriría en el glaucoma, en el cual el aumento de la presión
intraocular (PIO) interrumpiría el flujo axoplásmico anterógrado y retrógrado, lo que impediría la llegada de
BDNF y estimularía la apoptosis. El mecanismo por el que podría actuar la deprivación de neurotrofinas
podría ser la disminución en expresión de bcl−2.
• Excitotoxinas y vía del óxido nítrico
La excitotoxina más estudiada es el glutamato, que en condiciones fisiológicas es un neurotransmisor
excitador. Sin embargo, niveles excesivos resultan tóxicos y determinan la muerte de las células ganglionares
33
retinianas. Olney acuñó el término de excitotoxicidad para describir este efecto (Excitador + tóxico =
Excitotoxina).
Una concentración local elevada de glutamato estimula receptores de la superficie celular, sobre todo NMDA
(N−metil−D−aspartato), que abre los canales del calcio, determinando una sobrecarga intracelular de este ión,
con la consiguiente activación de la enzima óxido nítrico sintetasa, que genera óxido nítrico, el cual posee
propiedades de radical libre. Tanto glutamato como óxido nítrico son neurotransmisores en condiciones
normales, pero cuando los receptores NMDA son hiperestimulados, el óxido nítrico se combina con
intermediarios reactivos al oxígeno y genera peroxinitritos que producen la nitrosilación y fragmentación del
ADN (figura 15)
Fig. 15
Se han encontrado niveles dos veces mayores de glutamato en el vítreo de pacientes glaucomatosos respecto a
pacientes con catarata aislada. Además existe una correlación entre la magnitud de incremento de glutamato y
el tiempo de evolución del glaucoma. Estudios de cultivo celular han observado que son las células
ganglionares grandes las que mueren de forma preferente cuando son expuestas a glutamato y NMDA, es
34
decir las que primero se dañan en el glaucoma.
Mecanismo de elevación de glutamato a niveles tóxicos (Excitotoxina)
Dreyer (1998) postula tres teorías:
• Liberación por las células que van muriendo en el glaucoma. Esta liberación súbita de
concentraciones elevadas de glutamato dañaría las células ganglionares adyacentes.
• Aumento de permeabilidad de las células retinianas dañadas debido al aumento de PIO sobre el soma
celular, que favorecería la entrada a la célula de glutamina, que normalmente se encuentra en elevada
concentración a nivel extracelular, con el consiguiente aumento de síntesis intracelular de glutamato.
• Alteración fisiológica de las células de Müller, que son las responsables del aclaramiento del exceso
de glutamato extracelular. Tanto el aumento de PIO como la anoxia alteran la capacidad de
aclaramiento de glutamato de las células de Müller.
La toxicidad mediada por glutamato es una respuesta primaria a la isquemia celular. La depleción de energía
determinaría un acúmulo de glutamato extracelular, que tras la hiperestimulación de receptores NMDA
determinaría una sobrecarga de calcio intracelular. Por tanto, el glutamato podría desempeñar un papel
importante en el mecanismo isquémico de daño del nervio óptico.
Parece que cuando la activación de los receptores de NMDA es leve se estimularía el mecanismo de la
apoptosis, mientras que si la activación es intensa predominaría el mecanismo de la necrosis, por lo que podría
ser que el glaucoma se deba a un estímulo leve a NMDA.
Estrategias neuroprotectoras y neurorregeneradoras
Basados en los mecanismos inductores de la apoptosis ya comentados podríamos establecer las siguientes
líneas de tratamiento:
1. Terapia genética.
2. Introducción de factores neurotróficos.
3. Neuroprotección.
4. Neurorregeneración.
• Terapia genética
Se podría bloquear la apoptosis intentando sobreexpresar genes bcl−2 en las células ganglionares. Así, en
ratones transgénicos que sobreexpresan el gen represor de la apoptosis bcl−2 se ha observado un incremento
de tamaño del nervio óptico y del tallo cerebral, aumento de espesor de las capas plexiforme interna y nuclear
interna y aumento de células ganglionares en un 50%.
La dificultad en colocar ADN extraño dentro de las células del organismo y en conseguir que se mantenga un
tiempo significativo ha impedido la difusión de estas técnicas. Una opción que se está experimentando es
utilizar vectores adenovirales benignos o liposomas para insertar ADN en cultivos de células retinianas.
La limitación principal de la terapia genética en el tratamiento del glaucoma es que se trata de una patología
crónica, por lo que en el mejor de los casos la terapia genética proporcionaría sólo una solución temporal para
una enfermedad prolongada.
35
• Introducción de factores neurotróficos exógenos
Inyecciones de BDNF podrían retrasar la pérdida progresiva de células ganglionares. Pero antes de que pueda
considerarse un tratamiento potencial habría que eliminar las serias complicaciones que presenta la
administración sistémica de estos agentes. Un método muy prometedor, utilizado en la esclerosis lateral
amiotrófica y cuyo uso podría plantearse en el glaucoma, consiste en la introducción de columnas de fibras
poliméricas semipermeables con el centro hueco donde albergan células manipuladas genéticamente para
segregar neurotrofinas.
• Fármacos bloqueadores de la apoptosis (neuroprotectores)
Los objetivos de los fármacos neuroprotectores serían no sólo proteger los cuerpos celulares de axones
dañados, sino también el rescate de axones no lesionados directamente, pero que pueden sufrir degeneración
secundaria tras la liberación y extensión de sustancias nocivas desde la lesión primitiva.
Los fármacos neuroprotectores presentan dos inconvenientes muy importantes: En primer lugar, sólo
producen protección parcial, ya que cada uno de ellos interfiere con un único evento desencadenante de la
apoptosis. En segundo lugar, pueden interferir con funciones esenciales, que están mediadas por los mismos
receptores que inducen daño secundario.
Se han desarrollado unos trescientos antagonistas del glutamato (tabla 7)
36
De entre ellos sólo comentaremos los más prometedores. Teniendo en cuenta el nivel de actuación dentro de
la vía metabólica del glutamato, destacamos los siguientes:
1. INHIBIDORES DE LA LIBERACIÓN PRESINÁPTICA DE GLUTAMATO. El rilulazol ha sido
aprobado en la esclerosis lateral amiotrófica.
2. ANTAGONISTAS de receptores NMDA. Las variantes de baja afinidad son las menos tóxicas, ya que
permiten el mantenimiento de la actividad glutamatérgica basal. De ellos la memantina puede prevenir la
muerte de células ganglionares mediada por activación de NMDA.
3. ANTAGONISTAS SEMEJANTES AL NMDA. Un analgésico no opiáceo, la flupirtina reduce el efecto de
los radicales libres, protegiendo así a las células frente a la muerte celular por necrosis y/o apoptosis.
4. BLOQUEADORES DE LOS CANALES DEL CA. La Flunarizina favorece la supervivencia de células
ganglionares tras la sección del nervio óptico en ratas adultas.
5. ANTIOXIDANTES. El mesilato de tirilazad, un 21−aminoesteroide bloquea la peroxidación de lípidos por
radicales libres, inhibiendo así la apoptosis.
6. ÁCIDO AURINTRICARBOXÍLICO. Previene la activación de la nucleasa que degrada el ADN.
37
7. BETAXOLOL. Además del efecto reductor de la PIO, mejora el flujo sanguíneo de la cabeza del nervio
óptico y se le ha atribuido efecto neuroprotector por sus propiedades bloqueadoras de los canales del calcio
tipo L.
8. BRIMONIDINA. Los agonistas ð2 son neuroprotectores en diversos modelos experimentales, como los de
isquemia cerebral focal, aplastamiento calibrado de nervio óptico de rata, exposición excesiva a la luz, etc. El
mecanismo neuroprotector podría estar relacionado con la producción de factores de crecimiento como el
factor de crecimiento fibroblástico básico. Para que la brimonidina ejerza este efecto neuroprotector sería
preciso que alcanzara niveles terapéuticos en el segmento posterior tras su aplicación tópica; así se ha
observado que alcanza en vítreo una concentración 50−80 veces superior a la necesaria para activar los
receptores a 2. Por otro lado, al igual que el timolol se une reversiblemente a la melanina ocular pudiendo
actuar como deposito de liberación sostenida en vítreo y retina neural.
Estos hallazgos sugieren un efecto beneficioso potencial en el tratamiento del glaucoma más allá de la simple
reducción de la PIO.
• Neurorregeneración
Su descripción detallada escapa de los límites de la revisión presente. Consistiría en inducir la regeneración de
las neuronas cuyos axones han sido dañados, antes de que sus cuerpos celulares se atrofien. En contraste con
las neuronas periféricas, la mayoría de las neuronas centrales maduras prácticamente no presentan
regeneración axonal. Como dato curioso reseñaremos que las células ganglionares retinianas pueden
regenerarse dentro de injertos del sistema nervioso periférico pero no dentro del SNC. En la tabla 8 se reseñan
diversas técnicas de neurorregeneración.
Tabla 8
En los injertos de nervios periféricos, un extremo del injerto es adherido al muñón de nervio óptico
seccionado y el otro puede ser dejado sin conectar o guiado hacia diferentes localizaciones como tubérculos
cuadrigéminos superiores o centros diana inadecuados para las fibras nerviosas ganglionares (cerebelo). Estos
injertos sintetizan NGF (nerve growth factor), BDNF, CNTF (ciliary neurotrophic factor) y FGF (fibroblast
growth factor), pero esta capacidad la pierden con el tiempo por lo que sólo ejercen efectos temporales sobre
la supervivencia de las células ganglionares y únicamente aquellas fibras que consiguen realizar conexiones
sinápticas sobreviven.
Respecto a la administración de factores tróficos, el más potente es el BDNF. Tras su inyección intravítrea se
retrasa la apoptosis de células ganglionares, aunque el efecto va disminuyendo con el tiempo conforme los
niveles de BDNF se van agotando. Se está investigando si una suplencia continua de BDNF podría permitir el
rescate de células ganglionares dañadas durante períodos más largos y en un número mayor. También se está
38
investigando la utilidad de CNTF, FGF y NGF.
Como conclusión, se puede decir que la prevención de la muerte de las células ganglionares no es probable
que reemplace los tratamientos habituales del glaucoma, ya que la apoptosis es sólo la evolución final de
muchas enfermedades y no la causa. El bloqueo de la apoptosis sólo sería válido utilizado en combinación con
tratamientos dirigidos hacia la causa principal. Sin embargo, podría conseguir que las células ganglionares se
recuperaran de un período de stress inicial, permitiéndoles una recuperación completa si la causa primitiva
(PIO elevada) es reducida y controlada. Por tanto, en el futuro la combinación de terapias neuroprotectoras y
reductoras de la PIO podría convertirse en el tratamiento de elección del glaucoma.
Apoptosis en carcinoma ductal infiltrante de mama
El estudio de la apoptosis ha posibilitado el conocimiento de nuevos genes que regulan, modifican o sirven
como efectores para este tipo de muerte celular aportando un nuevo enfoque en el diagnóstico y terapia
tumoral.
Recientemente se ha observado la expresión de una determinada oncoproteína en procesos malignos de
próstata, neuroblastomas, endometrio, mama y otros. La expresión aumentada de esta oncoproteina tiene lugar
como consecuencia de la traslocación t{14;18}{q32;q21} que sitúa al proto−oncogen bcl−2 en la vecindad de
un potente gen promotor (cadena pesada de la Ig). En los linfomas de bajo grado la expresión de bcl−2 ha
relacionado el acúmulo de células con la inhibición de la apoptosis ejercida por el gen. Existen, sin embargo,
diferentes caminos que conducen a la apoptosis y no todos, lógicamente, están controlados por el gen bcl−2.
El gen Bcl−2 forma parte de una amplia familia en la que se incluyen otros genes cuyo denominador común
es el control de la apoptosis. Los genes constituyentes de esta familia se dividen funcionalmente en dos grupos
antagónicos: genes supresores de la apoptosis como es el Bcl−2 y genes promotores como Bax. La proteína
Bax dimeriza consigo misma o con Bcl−2, de tal forma que los heterodímeros Bcl−2/Bax bloquean la
apoptosis, mientras que los homodímeros Bax/ Bax la inducen. La relación Bcl−2/ Bax determina si la célula
sobrevive o sufre apoptosis como consecuencia de un estímulo apoptótico. Cuando Bax predomina se activa la
muerte programada suprimiéndose el efecto supresor de Bcl−2.
.
39
Figura 16
Las oncoproteínas Bcl−2 y Bax puede detectarse por métodos inmunohistoquímicos en material incluido en
parafina, lo que permite estudios retrospectivos en diferentes tumores con objeto de valorar su utilidad como
marcador biológico predictivo.
En el carcinoma de mama la expresión de Bcl−2 se ha asociado con características clínico patológicas
favorables. Sin embargo, han sido menos los estudios que han relacionado la expresión de Bcl−2 y Bax.
Para conocer el posible valor predictivo y la dependencia hormonal del oncogén bcl−2 y Bax y establecer su
correlación con otros factores pronósticos clásicos y biológicos, se han realizado estudios de CDI con ganglios
linfáticos negativos, relacionando la expresión de bcl−2 y Bax con diferentes características clínico
patológicas, receptores hormonales, antígeno de proliferación MIB1 y la expresión del oncogén supresor p53,
así como con la supervivencia y el periodo libre de enfermedad.
El bcl−2, es uno de los genes que influye en ella, bloqueándola. Al interrumpirse este mecanismo, uno de
cuyos fines es el control de la masa celular, las células afectadas adquieren una ventaja proliferativa, que las
40
puede dotar de un fenotipo neoplásico, presentando resistencia a la apoptosis.
La traslocación t{14;18} produce niveles altos inadecuados de la oncoproteina producto de este gen, también
denominada Bcl−2; ésta se acumula en los tejidos y es susceptible de ser cuantificada. Sin embargo, bcl−2 no
es el único gen implicado en el complejo mecanismo de la apoptosis; dentro de la familia de genes
reguladores de la muerte celular, existen otros, con papeles promotores y supresores de la apoptosis, que se
mantienen en un delicado equilibrio.
En la mama, al igual que en otros tejidos, Bcl−2 se relaciona con el desarrollo y la diferenciación epitelial,
expresándose intensamente en la mama en desarrollo, de forma que en este estadio su presencia no implica un
fenotipo tumoral .
No ha sido aclarada la posible implicación de bcl−2 en la patogénesis del carcinoma de mama. En otros
tejidos se ha confirmado que se trata de un evento temprano, como lo demuestra el hecho de su aparición en
lesiones preneoplásicas y preinvasivos. La adquisición del fenotipo tumoral que originaría el carcinoma
mamario, podría depender de varios factores, entre los que destaca la desregulación de la apoptosis, en forma
de desequilibrio entre genes anti−apoptosis (por ejemplo, bcl−2) y genes pro−apoptosis (por ejemplo bax).
Así mismo, las relaciones de bcl−2 con otros oncogenes, como cerbB−2 , c−myc, y p53, plantea la posibilidad
de que bcl−2 estuviera implicado en un mecanismo progresivo (incluso podría ser el primer paso) de
adquisición de mutaciones acumulativas por las células con positividad para bcl−2, que va transformando el
fenotipo celular hasta hacerlo tumoral. Por último, el simple hecho de que bcl−2 confiera longevidad a las
células podría aumentar el tiempo de que disponen para sufrir alteraciones mutagénicas de cualquier tipo.
Sin embargo, el fenotipo tumoral en el que estaría implicado Bcl−2 sería menos agresivo que los inducidos
por otros mecanismos. Trabajos recientes han encontrado resultados similares señalando una estrecha
correlación entre la expresión de Bcl−2 y la positividad para receptores de estrógenos y progesterona y
negatividad para la expresión de p53, y una correlación significativa con una supervivencia general más
prolongada. Para algunos autores, la mejor supervivencia asociada con la expresión de Bcl−2 únicamente se
observaría en tumores con ganglios linfáticos positivos e incluso otros trabajos relacionan la expresión de bcl−
2 con la presencia de metástasis ganglionares axilares. Resulta asimismo significativa la relación que
encontramos entre la expresión de Bcl−2 y el alto índice de proliferación con Mib−1, considerado de mal
pronóstico así mismo por otros. La negatividad para bcl−2 observada en tumores RE negativos y alta
proliferación celular, caracterizaría un grupo de tumores que no requeriría bcl−2 para inhibir la apoptosis y
prolongar de esta forma la vida celular, respondiendo a otros factores de crecimiento independientes del
control hormonal. Un especial interés tiene asimismo la relación inversa observada entre la oncoproteina
Bcl−2 y la expresión del oncogén supresor p53. El p53 no sólo inhibe la proliferación celular, sino que
también está involucrado en la inducción de la apoptosis en determinadas células tumorales.
En los estudios de supervivencia, el significado pronóstico de Bcl−2 no se mantiene como marcador
independiente en el análisis multivariante en relación con los RE, p53, grado nuclear e histológico y Mib−1,
aunque sí es independiente del tamaño tumoral, lo que limita su uso clínico como marcador pronóstico en el
cáncer de mama.
Otra de las posibles aplicaciones futuras de bcl−2 en la valoración de mujeres con CDI, con ganglios axilares
negativos, podría ser la de identificar grupos de pacientes con mal pronóstico, susceptibles de ser tratadas con
ciclos de quimioterapia profiláctica, tras la cirugía.
Hasta un 30% de enfermas con CDI, ganglios negativos y receptores hormonales positivos, presentan
recidivas en los primeros 10 años. Estas enfermas parecen beneficiarse de la administración de
quimioterápicos, para lo cual es necesario identificar a esta grupo; la estrecha relación de Bcl−2 con otros
factores de buen pronóstico, podría ser utilizada, de forma que las enfermas de estas condiciones que tuviesen
ausencia de Bcl−2, serían las candidatas a la profilaxis, ya que como hemos visto, estos tumores tienden a la
41
desdiferenciación.
Un campo de investigación abierto es el valor de la expresión de Bcl−2 como factor predictivo de respuesta
hormonal y quimioterápica, así como su relación e interacciones con estos agentes terapéuticos que frenan el
estímulo hormonal y/o inducen apoptosis, como el tamoxifeno.
La mayor parte de los estudios que han valorado la expresión de Bax en carcinomas de mama han asociado la
expresión aumentada de esta proteína con una peor diferenciación tumoral. Binder et al. asocian la expresión
de Bax con características negativas histopatológicas especialmente cuando la expresión de Bcl−2 está
desregulada concomitantemente. Otros estudios que has valorado la expresión conjunta de ambas proteínas,
encuentran , sin embargo, que es la pérdida de expresión de ambas proteínas lo que confiere un
comportamiento mas agresivo a los tumores. Por último, otros autores, que también han estudiado el efecto
conjunto de ambas proteínas, no encuentran significado pronóstico en su relación como tampoco en la
expresión aislada de Bax en relación con la supervivencia.
Algunos autores que han investigado la expresión de ambas proteínas tanto en carcinomas intraductales (CI)
como en carcinomas ductales infiltrantes (CDI), encuentran una clara expresión antagónica únicamente en CI,
con un predominio de Bcl−2 en tumores bien diferenciados y de Bax en carcinomas de alto grado . A medida
que el tumor progresa se pierde la expresión de ambas proteínas a la vez que ésta se hace mas coordinada. El
balance entre Bcl−2 y Bax y su papel en el control de la apoptosis son factores importantes en la
carcinogénesis y en la progresión tumoral, sin embargo, los mecanismos íntimos que controlan su
interdependencia son poco conocidos.
En conclusión, la expresión aumentada del oncogén regulador de la muerte programada bcl−2 se observó más
frecuentemente en tumores con marcadores biológicos favorables asociándose con una supervivencia global y
un periodo libre de enfermedad más largo por lo que podría incluirse como un marcador favorable no
independiente en pacientes con ganglios linfáticos negativos. Sólo los casos con intensa positividad para Bax
se observaron en tumores mas agresivos y con una supervivencia mas corta.
Apoptosis en carcinoma urotelial de vías altas
La incidencia de tumores del tracto urinario superior está aumentando en los países desarrollados. Los factores
clásicos (grado, extensión local, metástasis ganglionares o a distancia) se han usado para predecir la evolución
clínica, pero tumores de características similares pueden tener diferente evolución clínica. Se necesitan nuevos
factores pronósticos para aumentar la precisión en cuanto a la predicción de supervivencia y para elegir
esquemas terapéuticos individualizados .
La ploidía del ADN y la proliferación tumoral medida por el Ki67 han probado ser importantes factores
pronósticos de supervivencia, en este tipo de tumores. Hay pocos datos acerca del papel de la apoptosis como
predictor de la progresión tumoral en el tracto urotelial superior. Los resultados de tres estudios en el urotelio
de cáncer de vejiga son controvertidos en cuanto a la relación de apoptosis con otras características tumorales
y la supervivencia.
Es sabido el papel primordial en la regulación de la proliferación y la apoptosis que desempeña el p53.
Concretamente, en tumores del tracto urotelial superior, Rey et al. encontraron que alteraciones del p53
resultaban en un aumento de la proliferación celular y progresión tumoral.
El tratamiento estándar para los tumores uroteliales del tracto superior es la cirugía radical. El tratamiento
conservador queda restringido, en la actualidad, a los estadios bajos pero, si se dispusiese de nuevos factores
pronósticos predictores de supervivencia y progresión tumoral, podría realizarse una selección más precisa de
los pacientes que necesitan tratamiento conservador o de los candidatos a esquemas terapéuticos más
agresivos. Es decir, el tratamiento adyuvante con radioterapia o quimioterapia podría indicarse solo a aquellos
42
pacientes con alto riesgo de recaídas y/ o con tumores sensibles a tales tratamientos (alto índice apoptótico
pretratamiento).
El proceso apoptótico parece ser importante en el desarrollo y progresión de los tumores de tal forma que la
falta de apoptosis de células dotadas de ADN aberrante conduciría no solo a la perpetuación en su
descendencia de estas anomalías, sino a la mayor supervivencia del clon anómalo. Alteraciones en el p53
podrían conducir a una menor inducción de la apoptosis y aumento de la proliferación. En este escenario, los
tumores agresivos podrían mostrar un menor número de apoptosis, aumento de la proliferación y aumento de
la expresión del p53 mutado.
El proceso de la apoptosis en los tumores uroteliales del tracto urinario alto no había sido estudiado hasta el
trabajo de Masuda et al., donde alto índice apoptótico se relacionaba con estadios y grados avanzados, y peor
supervivencia en 64 pacientes con tumores de la pelvis renal y uréter, en los que existía una fuerte correlación
con el índice mitótico. Tres estudios publicados en tumores uroteliales de la vejiga mostraron resultados
controvertidos. En el estudio de Lipponen et al., altos niveles de apoptosis se relacionaron con características
de progresión tumoral (mayor grado, estadio avanzado) incluyendo sobreexpresión de p53 y alto índice
mitótico. Un bajo IA fue predictivo de mejor supervivencia en el análisis univariante pero no fue predictivo de
supervivencia en el análisis multivariante.
En el estudio de King et al., se encontró una relación entre apoptosis y grado tumoral (una tendencia
estadísticamente no significativa) e invasión ganglionar pero no con otras características clínico patológicas
del tumor ni con la supervivencia del paciente. Finalmente los resultados del grupo de Chyle et al.,
demostraron que el IA pretratamiento estaba relacionado con el grado, estadio y el índice mitótico. Aunque el
alto índice apoptótico pretratamiento estaba relacionado con una mejor respuesta a la radiación preoperatoria,
no se encontraron diferencias en la supervivencia.
Se ha observado que la agresividad tumoral, incluyendo la alta proliferación, estaban relacionados con niveles
elevados de apoptosis. Si mencionábamos previamente que en el perfil de tumores agresivos debía incluirse la
poca apoptosis, nos encontramos, en los tumores uroteliales de tracto superior, que los tumores con alta
apoptosis llevaban aparejada alta proliferación y peor supervivencia. El p53 es uno de los genes envueltos en
la regulación de la apoptosis y proliferación tumoral. La expresión de p53 mutado, hipotéticamente se
relaciona con menor tasa de apoptosis dentro del tumor. Sin embargo, en el estudio de Lipponen, el índice
apoptótico en los tumores uroteliales de vejiga que mostraban alteraciones del p53 era alto. Nuevamente la
íntima relación entre apoptosis y proliferación podría ayudarnos a explicar este resultado pues p53 mutado no
solo induce menor apoptosis sino también mayor proliferación. En el presente estudio no se encontró relación
entre la expresión del p53 y el IA tumoral; la detección de p53 alterado no siempre está relacionado con
mutaciones génicas resultantes en diferentes tipos de alteración funcional de la proteína. Además,
probablemente no todos los anticuerpos usados para medir el p53 acumulado detecten la misma proporción de
proteína p53 salvaje y mutada. El papel de éste y otros genes envueltos en la regulación de la apoptosis, en los
carcinomas uroteliales, queda aún por definir. Masuda et al. no encontraron correlación entre la expresión de
bcl−2 e índice apoptótico. Posiblemente arroje más información pronostica la determinación simultánea, en la
preparación tumoral, de la expresión de diferentes genes reguladores de apoptosis.
En conclusión, el índice apoptótico tumoral (IA) parece estar relacionado con características tumorales
desfavorables y con la proliferación. Altos niveles de apoptosis tumoral se relacionaron con reducción en la
probabilidad de supervivencia, en un gran grupo de pacientes con un largo seguimiento. No está claro si este
papel predictor es debido a la apoptosis por sí misma o guarda relación con la proliferación tumoral.
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