EVALUACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO ALTOS Y BAJOS EN NUTRIENTES PARA LA RECUPERACIÓN DE HETERÓTROFOS EDÁFICOS EN LA ECORREGIÓN CAFETERA DE LOS ANDES NELCY EDITH LATORRE BARRIOS TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial Para optar al título de MICROBIÓLOGA INDUSTRIAL PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL Bogotá, D. C. NOVIEMBRE DE 2007 1 NOTA DE ADVERTENCIA Artículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946 “La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”. 2 EVALUACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO ALTOS Y BAJOS EN NUTRIENTES PARA LA RECUPERACIÓN DE HETERÓTROFOS EDÁFICOS EN LA ECORREGIÓN CAFETERA DE LOS ANDES NELCY EDITH LATORRE BARRIOS APROBADO _________________________ Fabio Roldan , Ph D. Director ________________________ ________________________ Gerardo Moreno David Gómez Jurado Jurado 3 EVALUACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO ALTOS Y BAJOS EN NUTRIENTES PARA LA RECUPERACIÓN DE HETERÓTROFOS EDÁFICOS EN LA ECORREGIÓN CAFETERA DE LOS ANDES NELCY EDITH LATORRE BARRIOS APROBADO ________________________ Dra Ángela Umaña Decana Académico ________________________ Janeth Arias Msc Director de Carreras de Microbiología 4 A Dios y a mis padres por ser la guía de mi vida 5 AGRADECIMIENTOS Al CIEBREG-COLCIENCIAS y a la Pontificia Universidad Javeriana por su apoyo económico y logístico. Al Doctor Fabio Roldan por su paciencia y su apoyo. A todos los integrantes de la unidad de saneamiento y biotecnología ambiental (USBA) por su colaboración. A mis amigos que me acompañaron a lo largo de ese proceso. A Andrés por su comprensión, ayuda y por ser siempre incondicional. A mi familia por ser la motivación de todo y por que sin ellos nada de esto hubiera sido posible. 6 TABLA DE CONTENIDOS Pág RESUMEN ....................................................................................................................... ….1 1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................. 3 2. MARCO TEÓRICO .......................................................................................................... 5 2.1 El Suelo………………………………………………………………………………5 2.1.1 Características físicas del suelo….…………………………………...……….6 2.1.1.1 Textura y estructura del suelo……………………………………….6 2.1.1.2 Porosidad……………………………………………………………7 2.1.2 Características químicas del suelo…………………………………………….8 2.1.2.1 pH……………………………………………...……………………8 2.1.2.2 Materia orgánica…………………………………………...………..8 2.1.3 Distribución microbiana en el suelo ................................................................. 9 2.2 Diversidad microbiana. .............................................................................................. 10 2.3 Microorganismos Heterótrofos .................................................................................. 11 2.4 Determinación del número de microorganismos ....................................................... 12 2.4.1 Requerimientos nutricionales para el crecimiento microbiano……………...12 2.4.1.1 Fuente de carbono……………………………………………………...13 2.4.1.2 Factores de crecimiento…………………………...…………………...13 2.4.2 Medios de cultivo ........................................................................................... 13 2.4.2.1 Clasificación de los medios de cultivo…………………………………14 2.4.2.1.1 Según el estado ...................................................................................... 14 2.4.2.1.2 Según su composición: .......................................................................... 14 2.5 Extracción de microorganismos de la matriz de suelo ............................................. 15 2.5.1 Recuento en placa de heterótrofos totales ....................................................... 16 2.6 Microorganismo oligótrofos y copiótrofos………………………………...………17 2.7 Medios con baja concentración de nutrientes para recuento de heterótrofos ........... 18 2.7.1 Medio R2A ...................................................................................................... 18 2.7.2 Medio NWRI ................................................................................................... 18 2.8 Medios con alta concentración de nutrientes para recuento de heterótrofos ............ 19 2.8.1 Medio tripticasa soya (TSBA) ......................................................................... 19 2.8.2 Agar infusión suelo (AIS) ................................................................................ 19 7 3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA ............................................................................ 20 4. JUSTIFICACIÓN ............................................................................................................ 21 5. OBJETIVOS .................................................................................................................... 22 5. 1 Objetivo general ........................................................................................................ 22 5.2 Objetivos especificos ................................................................................................ 22 6. MATERIALES Y MÉTODOS........................................................................................ 23 6.1 Estandarización del proceso de extracción de microorganismos............................... 23 6.2 Localización del área de estudio ................................................................................ 24 6.3 Diseño experimental .................................................................................................. 26 6.4 Toma de muestras ...................................................................................................... 27 6.5 Análisis fisicoquímicos .............................................................................................. 27 6.6 Comparación de medios de cultivo. ........................................................................... 27 6.7 Análisis estadístico .................................................................................................... 28 7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN .................................................................................... 29 7.1 Estandarización del proceso de extracción de microorganismos.............................. 29 7.2 Comparación de medios de cultivo. .......................................................................... 32 7.2.1 Cuenca del río La Vieja ................................................................................... 33 7.2.2 Cuenca del Río Otún ........................................................................................ 35 7.3 Caracterización microscópica de colonias diferentes recuperadas en medio R2A .... 36 7.4 Evaluación del efecto de las coberturas vegetales sobre la densidad de microorganismos heterótrofos. ................................................................................. 38 7.4.1 Efecto de las coberturas sobre la densidad de microorganismos heterótrofos en La Vieja…………..………………………………………………………38 7.4.2 Efecto de las coberturas sobre la densidad de microorganismos heterótrofos en El Otún …………………………………………….……………………40 7.5 Abundancia de microorganismos heterótrofos en relación con la densidad de microorganismos totales (DAPI)…………………………………………………41 8. CONCLUSIONES ......................................................................................................... 45 9 . RECOMENDACIONES ............................................................................................... 45 10. BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................................... 46 11. ANEXOS ....................................................................................................................... 53 8 ÍNDICE DE TABLAS Pág Tabla 1. Características de los horizontes del suelo…………………………………...…..5 Tabla 2. Clasificación del suelo según tamaño de partícula ………………………...……6 Tabla 3. Tratamientos y soluciones utilizadas durante la extracción de microorganismos edáficos……..........................................................................................................16 Tabla 4. Tratamientos evaluados durante la extracción de microorganismos edáficos…..............................................................................................................23 Tabla 5. Coberturas y fincas seleccionadas en la ventana la Vieja…………….....…… ..25 Tabla 6. Coberturas y fincas seleccionadas en la ventana Otún………………….………..26 Tabla 7. Diferencias entre los recuentos de heterótrofos en los medios de cultivo en la cuenca del río La Vieja………………………………………………………..34 Tabla 8. Diferencias entre los medios de cultivo en la cuenca del río El Otún………….36 Tabla 9. Abundancia relativa de heterótrofos con relación a la densidad total de de microorganismos del suelo (DAPI)……………………………………......42 9 ÍNDICE DE FIGURAS Pág Figura 1. Dilución inicial de la muestra de suelo en solución de extracción ……………..24 Figura 2. Tratamientos evaluados para la extracción de microorganismos del suelo……..29 Figura 3. Dispersión de los datos en los tratamientos de extracción de microorganismos..30 Figura 5. Interacción entre soluciones y agitaciones evaluadas para extracción de microorganismos del suelo…………………………………………..…………..31 Figura 6. Morfologías y reacción de Gram observadas en las cuencas ………….………..37 Figura 7. Recuentos de heterótrofos edáficos por cobertura en La Vieja……..………....39 Figura 8. Recuentos de heterótrofos edáficos por coberturas en El Otún…………..…….41 10 RESUMEN El objetivo del presente estudio fue evaluar medios de cultivo bajos y altos en nutrientes para la recuperación de heterótrofos del suelo en diferentes coberturas vegetales en la Ecoregión Cafetera (cuencas de los ríos la Vieja y Otún). Inicialmente, se estandarizó el proceso de extracción de microorganismos del suelo evaluando diferentes tiempos, velocidades y soluciones de extracción. Se realizó la comparación de los medios de cultivo bajos (R2A y NWRI) y altos en nutrientes (TSBA y AIS), para seleccionar el medio que presentará la mayor recuperación de microorganismos heterótrofos del suelo y poder evaluar el efecto de las coberturas vegetales sobre las densidades de estos microorganismos. Finalmente, se determinó la abundancia relativa de los heterótrofos en relación con los conteos de microorganismos totales obtenidos por 4'-6-Diamidino-2fenilindol diclorhidrato (DAPI). El uso de solución salina (0.85% p/v) a 160 rpm por 15 min presentó los mayores recuentos de microorganismos. Se estableció que los medios bajos en nutrientes (R2A y NWRI) presentaron los recuentos significativamente mayores y específicamente el R2A, que fue seleccionado y utilizado para estimar la densidad de los heterótrofos edáficos en las diferentes coberturas. Las densidades de heterótrofos obtenidas presentaron una alta variabilidad y no se observaron diferencias significativas entre las diferentes coberturas vegetales evaluadas. Los mayores recuentos se presentaron guaduales de La Vieja y en el segundo evento de muestreo en el Otún, esto puede ser posiblemente atribuido al aumento en las precipitaciones durante este evento. Por otro lado, no se observaron diferencias significativas en la abundancia relativa de las coberturas evaluadas, lo que puede mostrar que este grupo microbiano posiblemente no un buen indicador de los cambios en el uso del suelo. Palabras claves: abundancia relativa, recuento heterótrofos, densidad microorganismos, uso del suelo 11 ABSTRACT The main goal of this study was to evaluate different media with low and high nutrient concentrations for its ability to recover edaphic heterotrophic microorganisms from different vegetal covers in the Coffee Eco region (river basins of the rivers Vieja and Otún). Initially, the process of extraction of microorganisms from soil was standardized evaluating different times, speeds and extraction solutions. To select the growth media with the highest microbial recovery, low (R2A and NWRI) and high (TSBA and AIS) media were compared. The selected media was used to estimate the heterotrophic density in the vegetal covers. Finally, the abundance of the heterotrophic was determined in relation with the total microorganisms’ counts that were obtained by using the 4'-6-Diamidino-2-fenilindo diclorhidratol (DAPI). The use of saline solution (0,85% p/v) to 160 rpm by 15 min presented the greater counts of soil microorganisms. It was determined that the growth media with low nutrients presented significant higher counts and specifically the R2A media, that was selected and use to estimate the edaphic heterotrophic microorganisms during the study. The heterotrophic densities observed presented a high variability and there were not significant differences between the different vegetation covers. The highest counts were observed in guaduales of La Vieja and in the second sampling event in the Otún. It could be attributed to the precipitation increase during this sampling event. On the other hand, significant differences in the relative abundance of the evaluated covers were not observed, which could possibly indicate that this microbial group is not a good indicator of the health and use changes of the soil. Key words: microbial density, relative abundance, heterotrophic counts, soil use 12 1. INTRODUCCIÓN El suelo es considerado un sistema heterogéneo, dinámico y discontinuo, con presencia de microorganismos que viven en numerosos microhábitats que difieren temporal y espacialmente. Factores como la fuente de carbono (FC) y energía (FE), macronutrientes, micronutrientes, factores de crecimiento, agua disponible, temperatura, presión, aceptores terminales de electrones (ATEs), pH y potencial de oxido-reducción pueden afectar la ecología, actividad y densidad de los microorganismos en el suelo. El conocimiento de la diversidad microbiana del suelo es bastante limitado, principalmente por la incapacidad de proveer las condiciones de cultivo óptimas para el crecimiento de los microorganismos. Actualmente, las investigaciones existentes sobre biodiversidad en diferentes tipos de ecosistemas en Colombia, hacen énfasis en el estudio de la variedad de flora y fauna, siendo la diversidad microbiana un componente poco conocido. Para ampliar el entendimiento de la diversidad microbiana es importante el estudio de los microorganismos cultivables del suelo, debido a que pueden brindar una aproximación al conocimiento del efecto de los cambios ambientales sobre la densidad de las comunidades microbianas. Para esto se debe tener en cuenta el proceso de extracción de los microorganismos, el aporte de condiciones nutricionales adecuadas, y la aplicación de temperaturas y tiempos de incubación indicados que favorezcan la mayor recuperación de los microorganismos de la matriz del suelo. Este trabajo se enmarcó en el programa del Centro de Investigaciones y Estudios en Biodiversidad y Recursos Genéticos (CIEBREG) que busca caracterizar, evaluar y monitorear la biodiversidad de paisajes naturales asociados a sistemas productivos para el mantenimiento de la funcionalidad ecológica. Esta investigación se llevó a cabo en la Unidad de Saneamiento y Biotecnología Ambiental (USBA) con el fin de servir de soporte para los trabajos de USBA-CIEBREG en el estudio de microorganismos degradadores de hidrocarburos, microorganismos del ciclo del nitrógeno y en la evaluación del efecto de las coberturas vegetales sobre las comunidades microbianas en las cuencas del río La Vieja y El Otún. Para cumplir con este objetivo fue necesario evaluar los microorganismos heterótrofos cultivables del suelo, para lo cual se estandarizó el proceso de extracción de 13 microorganismos, se estimó la densidad de microorganismos heterótrofos, se realizó la caracterización de morfotipos en las diferentes coberturas vegetales en las cuenca de los ríos La Vieja y el Otún, y se determinó la relación entre conteo directo con el conteo en placa por medio del índice de abundancia relativa. 14 2. MARCO TEÓRICO 2.1 El Suelo El término suelo puede definirse como la capa superior de la Tierra que se distingue de la roca sólida. Los suelos son formaciones geológicas naturales, agregados de minerales no consolidados y de partículas orgánicas producidas por la acción combinada del viento, el agua y los procesos de desintegración orgánica, lo cual justifica su continua evolución y, en consecuencia, su gran variedad (Lederberg, 2000; Navarro, 2000). La composición química y la estructura física del suelo están determinadas principalmente por: el tipo de material geológico del que se origina, la cubierta vegetal, la topografía y los cambios artificiales resultantes de las actividades humanas (Lederberg, 2000). El perfil del suelo se considera como la exposición vertical de una porción superficial de la corteza terrestre, constituido por una serie de capas u horizontes, que se diferencian estructuralmente en su textura, color y consistencia, además de poseer diferencias fisicoquímicas y microbiológicas (Tabla 1) (Navarro, 2000). Tabla 1. Características de los horizontes del suelo. Horizonte Características O Capas superficiales en las que dominan el detritus orgánico. Horizonte mineral formado en la superficie del suelo o justo A debajo del horizonte O. Contiene una acumulación de materia orgánica descompuesta (humus). Horizonte mineral que ha perdido arcillas, hierro y aluminio, E dejando fundamentalmente partículas de arena y limo. Horizonte dominado por la destrucción de la estructura rocosa B original que contiene materiales iluviados de los horizontes superiores. Horizonte (excluyendo el lecho de roca) escasamente afectado por C la génesis del suelo. Lecho de roca, principalmente basalto, granito, la piedra arenisca o R la piedra caliza. Fuente: Coyne, 2000. El suelo presenta una gran diversidad de comunidades microbianas que contribuyen en gran manera en el ciclaje de los nutrientes, su salud y estructura, y por ende su fertilidad, 15 contribuyendo al sostenimiento el crecimiento vegetal (Kennedy, 1999). A su vez, las plantas ejercen gran influencia en el crecimiento microbiano, principalmente por los exudados de las raíces y las partes senescentes de las plantas que son una fuente esencial de nutrientes para los microorganismos (Atlas y Bartha, 2001). 2.1.1 Características físicas del suelo El suelo esta constituido por materia mineral, materia orgánica, agua y aire, siendo un medio ideal para ser el soporte del crecimiento de plantas y diferentes comunidades microbianas (Navarro, 2000). Según la relación de estos componentes en la matriz del suelo, este puede presentar diferentes características físicas y químicas que determinan las particulares del suelo como lo son la textura, la estructura y la porosidad. 2.1.1.1 Textura y estructura del suelo La textura del suelo constituye una propiedad física muy importante para la ecología de los microorganismos, ya que determina el área de superficie disponible como hábitat para el crecimiento de los microorganismos (Atlas y Bartha, 2001). La textura del suelo es establecida por la distribución de tamaño de las partículas individuales del suelo (Sylvia et al., 2005). Teniendo en cuenta la influencia del tamaño de estas partículas sobre las propiedades físicas, químicas y biológicas del suelo, se han clasificado por medio del análisis granulométrico (Tabla 2). Tabla 2. Clasificación del suelo según tamaño de partícula Denominaciones Arena gruesa Arena fina Limo Arcilla Fuente: Navarro, 2000 Diámetro de partícula (μm) 200- 2000 20 -200 20 <2 16 La arena, la arcilla y el limo se adhieren entre si formando agregados (terrones naturales del suelo) que se mantienen unidos por minerales inorgánicos precipitados o sustancias húmicas (fracciones muy resistentes de materia orgánica del suelo) (Coyne, 2000). De igual forma los microorganismos favorecen la formación de estos agregados, principalmente por la producción de polisacáridos, los cuales contribuyen en la estructura y formación del suelo (Sylvia et al., 2005). Dependiendo de su forma, los agregados definen la estructura del suelo, por ejemplo, los agregados de forma esférica poseen mayor espacio entre si, haciendo que el suelo presente una mayor permeabilidad, a diferencia de los agregados en forma de bloque o prisma (Sylvia et al., 2005). 2.1.1.2 Porosidad Entre los agregados y partículas del suelo existen espacios abiertos denominados poros, cuyo tamaño regula la entrada y colonización de los microorganismos. De igual forma, el tamaño de los poros influye en la difusión del agua, los gases y los nutrientes a través del suelo, generando diversas condiciones para el desarrollo microbiano (Coyne, 2000). La porosidad puede ser de gran tamaño, haciendo referencia al suelo con poros de diámetro entre 25 y 100 mm, lo que permite un rápido movimiento de gases y el agua del suelo (Sylvia et al., 2005). Por otro lado, la microporosidad hace referencia a suelos con poros de diámetros entre 0,2 a 2,5 mm, estos poros se encuentran principalmente en los suelos ricos en elementos finos y arcilla, presentando una microfauna numerosa y activa (Lederberg, 2000). Por lo general los suelos arcillosos presentan un drenaje lento del agua debido a que los microporos restringen el flujo de esta, generando zonas de anaerobiosis que favorecen el crecimiento de microorganismos que sean afines a estas condiciones (Madigan et al., 2001; Sylvia et al., 2005). 17 2.1.2 Características químicas del suelo 2.1.2.1 pH El pH del suelo es un factor de gran importancia porque afecta directamente la disponibilidad de los nutrientes y cambia las características químicas del ambiente. Los microorganismos tienen rangos de pH óptimos para su crecimiento, que al ser alterados en el ambiente, modifican significantemente la densidad microbiana (Sylvia et al. 2005). La mayoría de los microorganismos crecen mejor en suelos minerales con valores de pH neutros, reduciendo notablemente su actividad cuando el pH es inferior a 5.5 o superior a 9.0 (Navarro, 2000). 2.1.2.2 Materia orgánica La materia orgánica del suelo está constituida por organismos vivos (microorganismos, animales y raíces de plantas), materia orgánica en descomposición y la fracción húmica del suelo (Eweis et al., 1999; Maier et al., 2001). La materia orgánica del suelo sufre procesos de oxidación que llevarán a la producción de CO2 y H2O. Sin embargo, una parte de la materia orgánica escapa a este proceso de oxidación y se transforma en grandes macromoléculas que no son solubles y constituyen la fracción denominada húmica (o humus (Atlas y Bartha, 2001). El humus se caracteriza por su color negruzco, debido a la gran cantidad de carbono que contiene y se encuentra principalmente en los primeros horizontes del suelo. Este se compone de tres fracciones separables por su solubilidad en ácidos y bases (ácido fúlvico), en ácidos pero no en álcalis (ácido húmico) o insolubilidad en ambos (húmica) (Bitton, 2002). En el proceso de degradación de la materia orgánica, el metabolismo de los microorganismos heterótrofos se encuentra regulado por factores como aireación, humedad, pH y disponibilidad de nutrientes en el suelo. Algunas condiciones favorecen este proceso de degradación, entre estos se encuentran: bajo contenido de lignina en los residuos vegetales, cantidad adecuada de nitrógeno disponible o bajas relaciones C:N, pH cercanos a 18 la neutralidad, adecuada aireación y humedad y temperaturas de suelo entre 30 a 40 °C. Como resultado de la combinación de diferentes factores en el proceso de descomposición de los residuos vegetales, una fracción del carbono presente en el suelo es convertido a CO2 y otra es incorporada a la biomasa microbiana interviniendo en gran medida en el reciclaje del carbono en el ambiente (Navarro, 2000; Sylvia et al., 2005). La materia orgánica es un indicador clave de la calidad del suelo debido a que la diversidad y la actividad de la mesofauna y los microorganismos están directamente relacionadas con la materia orgánica. El aumento de la materia orgánica genera una mayor agregación y estabilidad de la estructura, incrementando la tasa de infiltración y la retención de agua así como la resistencia contra la erosión hídrica y eólica (Atlas y Bartha, 2001). En ciertos suelos a pesar de el bajo contenido proteico se puede detectar una alta actividad enzimática, esto es frecuente en suelos con alta presencia de arcilla, debido principalmente a su carga eléctrica neta, actuando como un intercambiador iónico, reteniendo enzimas procedentes de la descomposición de tejidos y células (Coyne, 2000). 2.1.3 Distribución microbiana en el suelo Los patrones de distribución espacial de los microorganismos se relacionan con factores ambientales como temperatura del suelo, pH, salinidad, disponibilidad de agua y nutrientes. Estos factores influencian la actividad microbiana y desempeñan un papel muy importante en la determinación de la dinámica espacial y temporal de los microorganismos en ambientes naturales. Las características que influyen en la distribución microbiana en el suelo pueden ser extrínsecas e intrínsecas. Las características extrínsecas proceden del suelo (estructura, gases disponibles, agua, potencial de oxidorreducción) y del amiente (radiación solar, precipitaciones, viento y humedad relativa). Las características intrínsecas incluyen los mecanismos de persistencia y resistencia de los microorganismos (esporas), su tamaño, tasa de mortalidad y procesos metabólicos (Coyne, 2000). Estas características se relacionan con la función que desempeñan los 19 microorganismos en el ambiente, ya que estos constituyen un papel fundamental en el ciclaje continúo de nutrientes como el carbono, nitrógeno, fósforo, hierro y azufre (Kirk et al., 2004; Liu et al., 2006). 2.2 Diversidad microbiana. La biodiversidad se define como la variabilidad de organismos vivos de cualquier ecosistema (terrestre, marino, aéreo o acuático) y comprende la diversidad dentro de cada especie, así como entre las especies y ecosistemas de los que forman parte (Hawksworth, 1996; Minambiente, 1997) Al ser la diversidad una expresión de la estructura de un sistema, la forma en que se expresa esta propiedad corresponde a un número simple y sin unidades generalmente calculado con una ecuación matemática (Margalef, 1974). La diversidad se fundamenta en la riqueza (número de especies o tipos de organismos en una comunidad), la uniformidad, la abundancia relativa y la distribución de individuos entre las especies (Franklin et al., 2001). Sin embargo, la definición tradicional de la diversidad se ha basado principalmente en el estudio de plantas y animales y no se aplica fácilmente a los microorganismos. La diversidad microbiana es, en general, un término que incluye la diversidad genética (cantidad y distribución de la información genética dentro de las especies), la diversidad de las comunidades microbianas y la diversidad ecológica. Estas varían según la estructura del suelo, la complejidad de las interacciones y los niveles tróficos presentes en este ambiente. (Nannipieri et al., 2003). La perdida de la biodiversidad en el mundo es causada principalmente por la destrucción de los hábitats naturales. Las zonas tropicales representan los principales almacenes de biodiversidad del planeta, estas zonas se pierden rápidamente debido al incremento de campos de cultivo, expansión de la frontera agrícola, cultivos ilícitos, la transformación del paisaje, la sobreexplotación y el cambio climático (Pereira et al., 2006). Debido al desconocimiento de la influencia de las actividades antropogénicas sobre los ecosistemas subterráneos y sobre las comunidades edáficas, es necesario entender la diversidad microbiana como una herramienta fundamental para mantener la salud del ambiente y del suelo (Kirk et al., 2004; Liu, 2006). 20 La gran diversidad de comunidades microbianas no permite que su estudio sea sencillo y menos aun establecer un eslabón entre la estructura y la distribución de características fisiológicas de las comunidades microbianas (Calbrix et al., 2005). Sin embargo, en los últimos años se ha incrementado el interés en esta área, realizándose diversos estudios que dan una aproximación al conocimiento de la diversidad microbiana, no obstante estas investigaciones aun son escasas en nuestro país. 2.3 Microorganismos Heterótrofos Los microorganismos heterótrofos obtienen energía por medio de la oxidación de la materia orgánica presente en el suelo (Coyne, 2000). Estos microorganismos poseen un papel muy importante en el ciclo de carbono, reciclando el material orgánico en CO2 y H2O (Atlas y Bartha, 2001). Debido a su distribución ubicua, gran abundancia y capacidades metabólicas diversas, los heterótrofos microbianos son los principales responsables de las actividades de descomposición de la materia orgánica (Lederberg, 2000). Los microorganismos heterótrofos presentan gran diversidad en cuanto a exigencias en sustratos carbonados, variando desde los que pueden utilizar hidratos de carbono, alcoholes y ácidos orgánicos sencillos hasta los que son capaces de descomponer compuestos polimerizados, como la celulosa y la lignina (Julca-Otiniano et al., 2006). La mayoría de estos microorganismos heterótrofos son saprofitos comunes en el suelo que pueden ser eficaces transformadores de sustratos edáficos en biomasa (Julca-Otiniano et al., 2006). 2.4 Determinación de la densidad de microorganismos Debido a la necesidad de estudiar las relaciones existentes entre los microorganismos y el ecosistema, es necesario determinar la biomasa y la actividad microbiana en su hábitat natural (Atlas y Bartha, 2001). En los métodos de conteo de los microorganismos se utilizan procedimientos para facilitar su detección, siendo los mas empleados los sistemas de enumeración directa, como siembra en placa, microscopia por epifluorecencia y determinación del número más probable (Grant, 1989; Yu et al., 1995). 21 La ventaja de este tipo de metodologías clásicas para el recuento de la biomasa en muestras ambientales, como la siembra en placa, radica en que se obtiene una alta variedad de morfotipos que pueden ser posteriormente estudiados. Además, por medio de la optimización de los medios de cultivo, se puede obtener una recuperación microorganismos de lento crecimiento o que poseen condiciones específicas para su desarrollo y multiplicación (Balestra y Misaghi, 1997). Para un mejor entendimiento de los microorganismos cultivables se deben desarrollar métodos de cultivo simples para obtener colonias de bacterias del suelo en el laboratorio. Aunque que por medio del uso de técnicas como las moleculares, se pueden obtener resultados satisfactorios, estas técnicas son bastaste costosas y dispendiosas, siendo necesario el uso de metodologías mas simples y económicas, por lo que aun se utilizan medios de cultivo en el estudio de los microorganismos (Janssen et al., 2002; Joseph et al., 2003). 2.4.1 Requerimientos nutricionales para el crecimiento microbiano Los microorganismos requieren una serie nutrientes para su desarrollo, crecimiento y formación de nueva biomasa. Estos nutrientes pueden ser los macronutrinetes, que son requeridos en grandes cantidades, como C, N y P; y micronutrientes que se requieren en pequeñas cantidades como el K, Cu, Ni y Mo (Atlas y Bartha, 2001) Para el cultivo de los microorganismos es importante proveer una fuente de nitrógeno, como el amonio, el nitrato o aminoácidos. El nitrógeno es utilizado por las bacterias para formar aminoácidos y bases nitrogenadas, entre otros moléculas (Sylvia et al., 2005). De igual forma, elementos como P, S, K y Mg, son requeridos por los microorganismos para la síntesis de moléculas, como ácidos nucleídos, vitaminas, coenzimas, entre otras. Además desempeñan funciones importantes como cofactores enzimáticos, como es el caso del Mg (Coyne, 2000; Madigan et al., 2001). Elementos como el Cu, Ni, Cr, Mn, Mo, Se y Zn se conocen como micronutrientes o elementos traza, que son requeridos en bajas concentraciones y desempeñan un rol estructural en las enzimas; por ejemplo, el Mo6+ se necesita en la nitrogenasa que es el enzima que cataliza la conversión del nitrógeno atmosférico en amoníaco en la fijación biológica de nitrógeno (Atlas, 1995). 22 2.4.1.1 Fuente de carbono El carbono interviene en la composición de los seres vivos y forma parte de la atmósfera, hidrosfera y litosfera. En la atmósfera se encuentra mayoritariamente en forma de anhídrido carbónico (CO2), que constituye el 0,03 % de la misma. En la hidrosfera, el carbono se encuentra en forma de ion bicarbonato (HC −O3 ) y de ion carbonato (C 2−3 O ). En la litosfera se puede en tres maneras diferentes: formando rocas carbonatadas, silicatos cálcicos o en forma de combustibles fósiles (Navarro, 2000). El carbono se transfiere por el CO2 de la atmosfera mediante el proceso de la fotosíntesis y vuelve a ella a través de la respiración de los animales (Madigan et al., 2001). El carbono es requerido en la formación de moléculas y como fuente de energía, en el caso de muchos heterótrofos, difiriendo en la concentración y tipo de compuestos orgánicos que necesitan como fuente de carbono de acuerdo a su metabolismo (Merck, 2004). Compuestos como los aminoácidos, ácidos grasos y compuestos aromáticos pueden ser usados por los microorganismos como fuentes de carbono (Coyne, 2000) 2.4.1.2 Factores de crecimiento. Son compuestos orgánicos requeridos en muy pequeñas cantidades y solo por algunas células. Los factores de crecimiento incluyen vitaminas, aminoácidos y bases nitrogenadas. Aunque la mayoría de los microorganismos son capaces de sintetizar estos compuestos, otros requieren tomarlos del medio ambiente (Sylvia et al., 2005). 2.4.2 Medios de cultivo Los medios de cultivo constituyen un aspecto importante en el estudio de los microorganismos porque proporcionan los nutrientes necesarios para su crecimiento en el laboratorio. En la preparación y diseño de un medio de cultivo, se busca proporcionar una mezcla adecuada de nutrientes requeridos por los microorganismos a una concentración que optimice su crecimiento. Muchos nutrientes pueden ser inhibitorios o tóxicos cuando su concentración es demasiado alta, por ello se busca mantener un balance de nutrientes, para 23 evitar los excesos que puedan llegar a subestimar o inhibir el crecimiento de los microorganismos (Merck, 2004). 2.4.2.1 Clasificación de los medios de cultivo. Debido a que las necesidades nutricionales de las bacterias son muy amplias, y algunas de estas son exigentes, existe una variedad de medios de cultivo con composición y características diferentes. Los medios de cultivo se pueden clasificar según su composición química y el estado (sólido o liquido) del medio (Escobar de Rico, 2002; Merck, 2004). 2.4.2.1.1 Según el estado 1. Medios líquidos: son medios que no poseen un agente solidificante, se usan principalmente como caldos de cultivo. 2. Medios sólidos: llevan un agente solidificante (agar) que es un polisacárido acido producido por ciertas algas que gelifica por debajo de 45° C y se usa a una concentración de 1,5% p/v. 3. Medios semisólidos: agar a una concentración del 0,7% p/v (Merck, 2004). 2.4.2.1.2 Según su composición: 1. Medios sintéticos o químicamente definidos. Llevan fuente de carbono, fuente de nitrógeno, sales que proporcionen iones (P, K, Mg, Fe, Ca, entre otros), y nutrientes estimuladores del crecimiento a concentraciones conocidas. 2. Medios complejos o de composición indefinida. Estos medios tiene adición de nutrientes como extracto de levadura, peptona, infusión de cerebro, extracto de carne, etc, con ellos se obtiene un medio rico nutricionalmente, aunque indefinido químicamente p.e., Mac Conkey, VRBG, Plate Count. 3. Medios de enriquecimiento. Son medios complejos (normalmente) con nutrientes que favorecen el crecimiento de determinados microorganismos (particularmente heterótrofos exigentes). Ejemplo: adición de sangre, suero o extractos de tejidos de animales y plantas p.e., Agar Mosel, Agar Sangre. 4. Medios selectivos. Son aquellos que por sus componentes favorecen el crecimiento específico de un microorganismo o grupo de microorganismos. Son de gran utilidad 24 para el aislamiento de microorganismos a partir de una población microbiana mixta p.e., LMX, SPS. 5. Medios diferenciales. Son medios que facilitan la exclusión de microorganismos de una mezcla por sus propiedades diferenciales de crecimiento en dichos medios. p.e., Caldo tetrationato. 2.5 Extracción de microorganismos de la matriz de suelo Los polisacáridos producidos por algunas bacterias intervienen en formación de agregados del suelo estableciendo fuertes uniones entre las bacterias y las partículas del suelo (Coyne, 2000; Sylvia et al. 2005), estos polisacáridos extracelulares presentan una asociación con las partículas de arcilla, promoviendo la estabilidad y estructura de los agregados del suelo (Lindahl, 1996). Para una mayor recuperación de microorganismos presentes en muestras de suelo es necesario utilizar una técnica adecuada para la ruptura los agregados del suelo, garantizando que la mayoría de microorganismos sean liberados (Lindahl, 1996). La disrupción de estas partículas se puede llevar a cabo por diferentes procesos y uso de soluciones de extracción (Tabla 3). Muchos procesos de extracción son usados, pero poco se ha comparado el efecto de estos sobre los resultados obtenidos (Clabrix et al., 2005). Es de gran importancia evaluar esto debido a que algunos tratamientos pueden causar daño celular, además de interferir en el pH de la muestra, alterando directamente la población nativa de microorganismos (Lindahl, 1996). 25 Tabla 3. Tratamientos y soluciones utilizadas durante la extracción de microorganismos edáficos Tratamientos Soluciones Agitación orbital Tratamiento ultrasónico Stomacher Sonicación Oxidación química Disrupción enzimática Centrifugación Vortex Agua destilada o desionizada Buffer fosfato NaCl 0.85% (p/v) Pirofosfato de sódio Solución Ringer Fuente: Lindahl, 1996; Calbrix et al., 2005. 2.5.1 Recuento en placa de heterótrofos totales El método de recuento en placa es muy utilizado para la enumeración de microorganismos viables, especialmente para bacterias y hongos. Las técnicas de recuento en placa emplean con mayor frecuencia el agar como agente solidificante ya que la mayoría de las bacterias carecen de las enzimas necesarias para despolimerizarlo (Atlas y Bartha, 2001). Para la enumeración de heterótrofos aerobios en muestras ambientales los métodos de recuento en superficie son la mejor alternativa. Los recuentos en profundidad, no se consideran adecuados porque pueden causar la muerte de las células debido a la baja concentración de oxigeno y la exposición a la temperatura de los medios fundidos (45 a 50 ºC). (Kaper et al., 1977; Reasoner, 2004). Las colonias que crecen sobre los medios de cultivo dan un estimado de la cantidad de microorganismos presentes en una muestra (Escobar de Rico, 2002), esto se realiza por medio del recuento de las unidades formadoras de colonia (UFC). Una UFC es el término que debe utilizarse para reportar el número de colonias en placa; cada microorganismo en un medio de cultivo adecuado da origen a una colonia, estas colonias pueden surgir en pares, cadenas o grupos (American Public Health Association, 2005). Para el recuento de microorganismos heterótrofos se han empleado temperaturas de incubación de 22-28ºC, con tiempos de 3 a 7 días (Reasoner, 2004) 26 La principal ventaja de la siembra en placa es que a partir de esta se logran obtener cultivos puros, es decir microorganismos viables, que pueden usarse para análisis posteriores, como análisis taxonómicos o genéticos (Elliott y Des Jardin, 1999). Sin embargó, una de las limitaciones en esta técnica, es el desconocimiento de todos los requisitos y condiciones de cultivo de los microorganismos y la incapacidad para recuperar células de crecimiento lento y células viables no cultivables (McCaing et al., 2001). Esto se puede contrarrestar por medio de la selección de diferentes medios de cultivo para suplir las necesidades nutricionales de los microorganismos en cultivo (Balestra y Misaghi, 1997). 2.6 Microorganismo oligótrofos y copiótrofos Los microorganismos heterótrofos además de utilizar una variedad de fuentes de carbono, dependen para su desarrollo de la concentración en que se encuentran los nutrientes en el ambiente, según esto se pueden clasificar en oligotrófos por su habilidad de crecer en ambientes bajos en nutrientes y presentar bajas tasas metabólicas, y en copiótrofos por su afinidad hacia ambientes altos en nutrientes y por presentar altas tasas de crecimiento (Staley, 2000; Sylvia et al., 2005) Algunos estudios sugieren que los microorganismos oligótrofos crecen mejor a concentraciones de sustratos menores a 10 mg (Riis et al., 1998; Phung et al., 2004). De igual manera se ha demostrado que los microorganismos oligotrófos se aíslan de ambientes bajos en nutrientes como agua y estuarios (Van der Kooji and Hijen ,1983). Sin embargo, Saito y col. (1998) afirman que estos microorganismos se encuentran ampliamente en el suelo. Los microorganismos oligótrofos desempeñan un rol importante en la descomposición de la materia orgánica y la dinámica de nutrientes, siendo aislados en diferentes tipos de suelos (Hattori, 1976; Hashimoto et al., 2006). Por otro lado, los microorganismos copiótrofos tienen la capacidad de dividirse en menos de 15 minutos, además de presentar una baja afinidad por el trasporte de nutrientes dentro de la célula. Los microorganismos copiótrofos pueden sobrecrecer en ambientes altos en nutrientes debido a que sus sistemas de trasporte de nutrientes generan un aumento rápido de biomasa (Staley, 2000). 27 2.7 Medios con baja concentración de nutrientes para recuento de heterótrofos 2.7.1 Medio R2A Reasoner y Geldreich (1985) modificaron el medio Henrici (McTernan et al., 1974) disminuyendo a la mitad la concentración de nutrientes, creando así el medio R2A (Anexo A). Este medio debido a su baja concentración de fuente de carbono y energía, se implemento en la enumeración de microorganismos heterótrofos en lagos oligotróficos (Reasoner y Geldreich, 1985). Aunque inicialmente se uso en muestras de agua, varios estudios mostraron la misma efectividad en muestras de suelo, principalmente por la buena recuperación de microorganismos (Mikell, et al., 1995; Margesin y Schinner, 2001; Franklin et al., 2001; Ellis et al., 2003 y Calbrix et al., 2005) La ventaja que posee el uso de este medio radica en que su baja concentración de nutrientes permite el crecimiento, multiplicación y mantenimiento de una serie de microorganismos del suelo que pueden ser inhibidos por concentraciones altas de algunos nutrientes. Por esto se establece que son de mayor utilidad los medios “bajos en nutrientes” básicamente para una mayor recuperación de microorganismos oligotróficos debido a su inhabilidad de crecer en medios con altas concentraciones de nutrientes (Olsen y Bakken, 1987). 2.7.2 Medio NWRI El medio NWRI es un medio bajo en nutrientes alternativo al agar R2A para la detección de las bacterias heterótrofas (American Public Health Association, 2005) (Anexo A). Varios estudios han empleado este medio para la recuperación de microorganismos heterótrofos en muestras de agua (Reasoner, 2004). Sin embargo, su uso en suelos no se ha sido reportado. En un estudio realizado por Parrington & Sharpe (1998) el medio NWRI se comparó con medios altos en nutrientes (tripicasa soya y plate count) demostrando que se obtenían mayores recuentos de heterótrofos con el NWRI, además se obtenían colonias mas definidas y una buena recuperación de microorganismos filamentosos (Lillis y Bissonnette, 2001). 28 2.8 Medios con alta concentración de nutrientes para recuento de heterótrofos 2.8.1 Medio tripticasa soya (TSBA) El TSBA es un medio con alta concentración de nutrientes utilizado ampliamente en el procesamiento de muestras de suelo (Ellis et al., 2003) (Anexo A). McCaig y col. (2001) y Balestra y col. (1997) usaron este medio para la caracterización de las especies bacterianas del suelo y en la estimación de la diversidad microbiana, por ser un buen soporte para el crecimiento bacteriano. Martin (1975) y Elliot y col. (1999) usaron el medio TSBA para el recuento de bacterias presentes en el suelo, estableciendo que este medio proporciona condiciones nutricionales a los microorganismos edáficos para el aumentó de biomasa. 2.8.2 Agar infusión suelo (AIS) El agar infusión suelo es usado ampliamente en los recuentos para muestras de suelo, debido principalmente a que este medio suministra condiciones presentes en el ambiente natural los microorganismos (Anexo A). Su principal ventaja para recuperar microorganismos edáficos es que posee factores promotores de crecimiento que se encuentran en el suelo como vitaminas y aminoácidos, que son requeridos por estos (García, 1973). Olsen y Bakken (1987) realizaron el recuento de UFC de microorganismos heterótrofos presentes en muestras de suelo, determinando que para obtener una mayor recuperación de microorganismos a partir de muestras de suelo, los medios más indicados son aquellos que tienen en su formulación la infusión de suelo. El AIS ha sido ampliamente reportado (ASM, 1999) y se ha utilizado en la Unidad de saneamiento y biotecnología ambiental (USBA) de la Pontificia Univerisidad Javeriana para la recuperación de microorganismos heterótrofos en suelos contaminados con hidrocarburos y en estudios de biorremediación (Cleves y Sandoval, 2003; Maldonado, 2004; Vallejo, 2004) 29 3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA La perdida de la diversidad microbiana se ha incrementado en el país, principalmente por las perturbaciones que ejerce el hombre sobre el ambiente, modificando y fragmentando el paisaje y estableciendo sistemas productivos p.e, ganadería de leche, ganadería de carne, cultivos mixtos. Estos sistemas productivos incentivan el uso de agroquímicos (fertilizantes y plaguicidas), la implementación de sistemas de riego, el cultivo intensivo y el aprovechamiento extensivo de la tierra, causando un desequilibrio en la funcionalidad y el mantenimiento de las actividades en que intervienen los microorganismos. Entre estas actividades se encuentran la fijación de nitrógeno, ciclaje de nutrientes, degradación de compuestos contaminantes, control de plagas, entre otros. Para evaluar el efecto antopogénico sobre la densidad de las comunidades microbianas del suelo, se deben establecer metodologías que permitan el estudio de la ecología microbiana. En la evaluación de la parte cultivable de los microorganismos del suelo, se han usado medios de cultivo que no proporcionan las condiciones necesarias para el desarrollo de diferentes microorganismos. Por tal motivo, en el presente estudio se estandarizó el proceso de extracción de microorganismos del suelo y se realizó una comparación entre medios de cultivo altos y bajos en nutrientes, determinando que medio proporciona los requerimientos nutricionales necesarios para obtener una mayor recuperación de microorganismos heterótrofos como herramienta para las investigaciones realizadas por USBA-CIEBREG en el estudio de las comunidades microbianas. 30 4. JUSTIFICACIÓN Los microorganismos del suelo comprenden la mayor diversidad del planeta cumpliendo un papel fundamental en la descomposición de la materia orgánica y en el ciclaje de nutrientes, interviniendo en la disponibilidad de los nutrientes, las características físicas y químicas de suelo. Actualmente en Colombia, son pocos los estudios sobre diversidad de microorganismos edáficos cultivables debido a que se desconocen las condiciones adecuadas de cultivo. Los métodos convencionales de recuperación de microorganismos heterótrofos edáficos, basados en el uso de un solo tipo de medio de cultivo ayudan a la recuperación de unos pocos microorganismos, principalmente porque en la mayoría de los casos las condiciones de cultivo no imitan el ambiente natural de los microorganismos, y consecuentemente no se aportan los componentes apropiados para el óptimo crecimiento y desarrollo de los microorganismos. Para realizar una valoración de la diversidad en la ecorregión cafetera, el CIEBREG en uno de sus objetivos buscó caracterizar, evaluar y monitorear la biodiversidad de sistemas productivos asociados a paisajes naturales, para el mantenimiento de la funcionalidad ecológica. A nivel edáfico, fue necesario evaluar diferentes medios de cultivo para obtener una mayor recuperación de microorganismos heterótrofos por medio de la técnica de recuento en placa, como soporte en el estudio de microorganismos degradadores de hidrocarburos y microorganismos del ciclo del nitrógeno en trabajos realizados en USBA. 31 5. OBJETIVOS 5. 1 OBJETIVO GENERAL Evaluar medios de cultivo altos y bajos nutrientes para la recuperación de heterótrofos en diferentes coberturas vegetales en la Ecoregión Cafetera (Cuencas de los ríos La Vieja y Otún). 5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS • Estandarizar el proceso de extracción de microorganismos en muestras de suelo para la recuperación de microorganismos heterótrofos. • Comparar medios de cultivo altos y bajos en nutrientes para la recuperación de microorganismos heterótrofos en muestras de suelo. • Estimar la densidad de los microorganismos heterótrofos totales por recuento en placa en las coberturas vegetales seleccionadas. • Estimar la densidad de microorganismos heterótrofos en términos de abundancia relativa y realizar la caracterización de morfotipos en las diferentes coberturas. 32 6. MATERIALES Y MÉTODOS Durante el presente estudio se estandarizó el proceso de extracción de microorganismos de suelo evaluando diferentes tiempos, velocidades y soluciones de extracción. Adicionalmente, se realizó una comparación de diferentes medios de cultivo altos y bajos en nutrientes para obtener una mayor recuperación de microorganismos heterótrofos y así poder evaluar el efecto de las coberturas sobre las densidades de estos microorganismos. Finalmente, se determinó la abundancia de los heterótrofos en relación con el conteo de microorganismos totales obtenido por Vela (2007) utilizando 4'-6-Diamidino-2-fenilindol diclorhidrato (DAPI). 6.1 Estandarización del proceso de extracción de microorganismos en muestras de suelo para la recuperación de microorganismos heterótrofos. Para estandarizar el proceso de extracción de los microorganismos del suelo se evaluaron cuatro tratamientos comparando diferentes tiempos, velocidades y soluciones de extracción (Tabla 4). Estos tratamientos se seleccionaron por ser reportados en la literatura (Yu et al., 1995; Lindahl, 1996; Riis et al., 1998; Calbrix et al., 2005) y por ser utilizados en el laboratorio de la Unidad de Saneamiento y Biotecnología Ambiental (USBA). Para la estandarización, se tomaron 5.0 g de suelo de la reserva forestal Bremen (municipios Filandia y Circasia, Quindío), y se adicionaron a 45 ml de cada una de las soluciones de extracción evaluadas y se agitaron de acuerdo a cada tratamiento (Figura 1). Tabla 4. Tratamientos evaluados durante la extracción de microorganismos de suelo Tratamiento 1 2 3 4 Solución de extracción Buffer fosfato (Anexo B) Buffer fosfato Solución salina 0.85% (p/v) Solución salina 0.85% (p/v) Agitación orbital (rpm) 160 200 160 200 Tiempo (min) 15 20 15 20 Después del proceso de extracción, se realizaron diluciones de la suspensión de suelo con base 10 (10-1 a 10-6). Se sembró 0.1mL en superficie a partir de la dilución 10-3 en el medio 33 agar infusión suelo (AIS) (Anexo A). Este medio se venia usando para el recuento de heterótrofos en el laboratorio USBA. Las placas sembradas se incubaron a temperatura ambiente (22-25ºC) y se realizó el recuento de unidades formadoras de colonias (UFC) al quinto día de incubación. Figura 1. Preparación de dilución inicial de la muestra de suelo en solución de extracción 6.2 Localización del área de estudio El presente estudio se llevó a cabo en la ecorregión cafetera, específicamente en los departamentos de Risaralda y Quindío. Se seleccionaron dos ventanas como unidades macro del esquema de muestreo, correspondientes a las cuencas hidrográficas de los ríos La Vieja y El Otún. Estas ventanas fueron elegidas con base en criterios de heterogeneidad espacial, gradiente altitudinal, estructuras de paisaje y por presentar diferentes coberturas y múltiples categorías de manejo (Camargo, 2006). Ventana La Vieja El río La Vieja es uno de los principales tributarios del río Cauca, y es considerado un gran eje fluvial. Su cuenca hidrográfica está ubicada en el centro-occidente de Colombia en los departamentos del Quindío, Risaralda y Valle, con un área aproximada 2,925 km2 y se encuentra ubicada al sur occidente de la ecorregión cafetera. Geográficamente esta cuenca, está enmarcada dentro de las siguientes coordenadas: 4°04´ y 4°49´ de latitud norte y 75°24´ y 75°57´ de longitud oeste y presenta una gran 34 heterogeneidad ambiental evidenciada en sus diferencias climáticas y topográficas (Díaz et al., 1996). Esta cuenca, debido a la formación geológica de los Andes centrales colombianos, de origen terciario y cuaternario, presenta suelos de formación reciente, de origen volcánico y sedimentario por areniscas, arcillositas y conglomerados, que se caracterizan por ser de disposición superficial, texturas finas y pH moderadamente ácidos (Díaz et al., 1996). En esta ventana se seleccionaron cuatro coberturas predominantes que correspondían a los tipos de paisajes mas sobresalientes (Roldan, 2006) (Tablas 5). Tabla 5. Coberturas y fincas seleccionadas en la ventana la Vieja. Ventana Cobertura Finca La Ramada Guadual La Comarca La Granja Bosque Bremen La Vieja La Ramada Pastizal Villa Ximena El Bolsillo Cafetal sin sombrío La Alegría Ventana Otún En la cuenca del Río Otún, ubicada en el departamento de Risaralda, se encuentran bosques premontanos de alta humedad con vegetación arbórea, pastizales naturales y mejorados, y cultivos mixtos (cebolla y aromáticas), terrenos de alta fertilidad que son utilizados para la explotación maderera y algunos cultivos de subsistencia. Estas tierras son óptimas para el cultivo de cebolla, aromáticas, plátano, maíz, yuca, fríjol, los cuales pueden ser tecnificados o de nivel artesanal. Los suelos del Otún se caracterizan por ser drenados, profundos, con alto contenido de arcillas y materia orgánica y presentar un pH acido (Beltran et al., 1988). En Otún se seleccionaron cuatro coberturas representativas de esta 35 cuenca para determinar su efecto sobre la densidad de microorganismos heterótrofos (Tabla 6). Tabla 6. Coberturas y fincas selecionadas en la ventana Otún. Ventana Cobertura Finca Santa Helena Bosque La Pastora La Playa Guadual Mandalay El Otún Bella Vista Cebolla Macarena Playa Rica Forestales Lisbrán 6.3 Diseño experimental El estudio se llevó a cabo en dos eventos de muestreo en épocas diferentes del año, el primer evento se realizó del 23 al 30 de Junio y el segundo del 22 al 30 de Septiembre de 2006. Para cada una de las ventanas (La Vieja y Otún) se seleccionaron las cuatro coberturas más representativas (Tablas 5 y 6) y dentro de cada una de las coberturas se eligieron dos fincas donde se seleccionaron aleatoriamente tres puntos a muestrear. Finalmente se obtuvieron 48 muestras en cada evento de muestreo (EM) para la comparación de medios bajos (R2A y NWRI) y altos en nutrientes (AIS y TSBA) con el fin de realizar el recuento de microorganismos heterótrofos en la ecorregión cafetera. 36 6.4 Toma de muestras Para la toma de las muestras de suelo en cada una de las coberturas, se delimitaron tres cuadrantes de 2.5 x 2.5 m, ubicados al menos a 30 m de los bordes. Dentro de cada cuadrante se tomaron muestras de cada uno de los vértices y del centro usando un barreno de 20 cm de largo por 5 cm de diámetro. Se obtuvo una muestra compuesta por cuadrante después de mezclar vigorosamente las muestras obtenidas de todos los puntos del cuadrante. De esta mezcla, se tomaron aproximadamente 500 g. Este procedimiento se repitió en cada cuadrante. La muestra compuesta se colocó en bolsas de cierre hermético Whirlpack®, y se conservaron en refrigeración (4-6 °C) hasta su procesamiento en USBA. 6.5 Análisis fisicoquímicos Se midió la temperatura in situ con un termómetro de suelo a 20 cm de profundidad y la altura de la hojarasca. En el laboratorio de USBA se evaluaron el pH y el porcentaje de humedad. El pH se determinó de acuerdo al protocolo de la Agencia Ambiental de Estados Unidos (EPA, 9045c) y el porcentaje de humedad se midió de acuerdo al protocolo del Instituto Geográfico Agustín Codazzi (Olarte, 1979). 6.6 Comparación de medios de cultivo altos (TSBA y AIS) y bajos en nutrientes (R2A y NWRI) para la recuperación de microorganismos heterótrofos en muestras de suelo. Para la comparación de medios de cultivo se utilizaron las muestras de suelo recolectadas en la ecorregión cafetera y se procesaron teniendo en cuenta los resultados obtenidos en la estandarización del proceso de extracción de microorganismos edáficos (ver numeral 6.1) (n=96). De esta manera, se agregaron 5.0 g de la muestra de suelo (AJ150:Mettler) en 45 ml de solución salina 0.85% p/v (J.T Baker: grado reactivo) filtrada en membranas de celulosa (0.22μm) y estérilizada (121°C x 15 psi) y se agitó durante 15 min a 160 rpm en un agitador orbital (New science: 12100). Bajo condiciones de esterilidad se realizaron diluciones seriadas con base 10 hasta 106 en solución salina, agitando con vortex antes de tomar una alícuota de cada dilución. Se colocaron 100 μl de las diluciones de la muestra sobre placas con los diferentes medios a evaluar (ver numeral 2.6): bajos en nutrientes 37 (R2A (Difco) y NWRI) y altos en nutrientes (TSBA (Oxoid) y AIS) (Anexo A). El procedimiento se realizó por duplicado en cada dilución. Finalmente las cajas se incubaron aproximadamente de 22 a 25 °C por 5 d, se realizó el recuento de las unidades formadoras de colonias de heterótrofos totales y los datos se convirtieron a gramos peso seco (UFC/gps)(n=384). Se realizó tinción de Gram a las colonias que presentaron características macroscópicas diferentes en las placas donde se hizo el recuento, para determinar las características microscópicas: reacción Gram positiva o Gram negativas y morfología (bacilos, cocos, cocobacilos). 6.7 Análisis estadístico Para la comparación de medios de cultivo se usó la prueba de ANOVA y el test TukeyKramer (p<0.05) debido a que los datos presentaban una distribución normal. Posteriormente se compararon lo resultados obtenidos en el medio R2A, los cuales no presentaron una distribución normal, por lo que se usó la prueba de Kruskal Wallis (p<0.05) para evaluar el efecto de las coberturas sobre la densidad de microorganismo heterótrofos. Se compararon los recuentos entre eventos de muestreo para cada una de las ventanas usando la prueba de Wilcoxon (p<0.05). Finalmente para establecer si las variables fisicoquímicas presentaban correlación con el recuento de heterótrofos se realizó el análisis no paramétrico de Spearman. 38 7. RESUL LTADOS Y DISCUSIÓN 7.1 Estandariz de microorrganismos en muestraas de E zación del proceso p de extracción e sueloo para la reecuperación n de microorganismos heterótroofos. Se observó o un efecto sign nificativo de d los trataamientos evvaluados soobre el recu uento de heterrótrofos dell suelo (AN NOVA y Tu ukey-Krameer; p< 0.05; n = 40) (A Anexo C y D). Los mayoores recuenntos se presentaron cuaando se utillizó la soluución salinaa 0.85% (p//v) a 160 rpm por 15 min y bufferr fosfato a 200 rpm por 20 min, m sin obsservarse diferencias miento con buffer b fosfaato a 160 rpm m por 15 signiificativas enntre los dos tratamientoos. El tratam min presentó reecuentos siggnificativam mente menoores a los demás trataamientos (F Figura 2) Log UFC/gps (Aneexo C). 8,00 7,80 7,60 7,40 7,20 7,00 6,80 6,60 6,40 6,20 6,00 16 60 rpm X 15 min n 200 rp pm X 20 min 160 rpm X 15 min 200 rpm X 20 min Buffer fosfato Bufffer fosfato Solución salina 0.85% S Solución salina 0.85% 0 1 2 3 4 Tratamiento Fig gura 2. Trattamientos evvaluados paara la extraccción de miccroorganism mos del suello. Las barras de error muesstran una desviación esttándar (n=10) r o obtenidos, see pudo obseervar una mayor m disperrsión de los datos en A paartir de los resultados los tratamientos t s con buffeer fosfato (Tratamient ( tos 1 y 2) (Figura 3). Por otro lado los tratam mientos conn solución salina (3 y 4) presenntaron una menor m disppersión en los l datos indiccando una mayor m preciisión (Figurra 3). La dispersión enn los tratam mientos 1 y 2, 2 podía indiccar dos cosaas, un errorr experimenntal o que eel tamaño de d la muesttra no fue suficiente s para representarr la variabiliidad de los datos. d 39 Para verificar si el tamaño de la muestra era el parámetro relacionado con la dispersión se tuvo en cuenta que los promedios (Log UFC/gps) solo se diferenciaban en un máximo de 1.5 unidades, que trasladado a la potencia de 10 son aproximadamente 31.6 UFC, valor que no era significativo en el contexto que se evaluó este estudio. 1 2 3 4 Tratamiento Figura 3. Dispersión de los datos en los tratamientos de extracción de microorganismos. Las flechas indican los valores con mayor dispersión El logaritmo de los datos presentó homogeneidad de varianzas y una distribución normal, por esta razón se compararon los tratamientos utilizando una ANOVA y el test de TukeyKramer (Anexo D). Durante el análisis de varianzas se observó que 0.3% de la variación total podría ser atribuida a los tratamientos lo que indico que todos lo tratamientos eran buenos. Sin embargo, se busco establecer con cual de estos tratamientos se podía obtener mayores recuentos y para ello se observó la interacción entre las soluciones y agitaciones evaluadas. Se observó un efecto conjunto de las dos variables, indicando que la solución salina presentaba mayores recuentos independiente a la agitación (Figura 5). 40 Al no presentarse diferencias significativas en el uso de solución salina con agitación a 160 rpm por 15 min y el buffer fosfato con agitación a 200 rpm por 20 min, se seleccionó el primer tratamiento por presentar recuentos mayores, menor dispersión en los datos y por ser la solución salina mas económica y de fácil preparación. Resultados similares fueron obtenidos por Calbrix y col. (2005) quienes analizaron la eficiencia de diferentes tratamientos para la extracción de microorganismos del suelo, los autores no encontraron diferencias significativas entre los tratamientos y seleccionaron la solución salina al 0.85% por su fácil preparación y manejo. Por otro lado, Yu y col. (1995) así como Riis y col. (1998) determinaron que el uso de la solución salina al 0.85% combinada con agitaciones menores a 200 rpm era el método optimo para la separación de los microorganismos de las partículas de suelo. Agitación (rpm) Figura 5. Interacción entre soluciones y agitaciones evaluadas para extracción de microorganismos del suelo (BF: buffer fosfato. SS: Solucion salina). Con base en los resultados obtenidos en el presente estudio, el proceso de extracción se estableció de la siguiente manera: adición de 5.0 g de suelo (Mettler: AJ150) a 45 ml de solución salina (0.85% p/v) (J.T Baker; grado reactivo) estéril (121°C x 15 psi) y filtrada en membranas de celulosa de 0.22μm (GSWP09050: Millipore) con agitación orbital a 160 41 rpm por 15 min (12100: New science). Esta selección se realizó porque se obtuvieron mayores recuentos con este tratamiento y una mayor precisión. Una vez terminado el proceso de agitación, se dejo decantar el sedimento durante 5 min con el fin de tomar la solución de suelo donde deberían estar en suspensión los microorganismos. 7.2 Comparación de medios de cultivo altos (TSBA y AIS) y bajos en nutrientes (R2A y NWRI) para la recuperación de microorganismos heterótrofos en muestras de suelo. Para la comparación de los medios de cultivo con altos y bajos nutrientes, se utilizó el recuento en placa (ASM, 1999; American Public Health Association, 2005) y se implemento la técnica estandarizada para la extracción de microorganismos edáficos. Posteriormente, se evaluó cual de los medios mencionados en la literatura como altos y bajos en nutrientes presentaban mayores recuentos de microorganismos heterótrofos en las diferentes coberturas vegetales evaluadas, con el fin de determinar que medio se debería usar el segundo año del estudio. En términos generales, de las 96 muestras evaluadas en los dos eventos de muestreo, se presentaron recuentos significativamente mayores en R2A en el 31% de los resultados, 22% en NWRI, 6.25% en TSBA y 3.75% en AIS (Tukey-Kramer; p < 0.05; n=384) (Anexo E y F); indicando, que los medios con bajos nutrientes permitían una mayor recuperación de los microorganismos heterótrofos presentes en las diferentes coberturas vegetales, debido a que permiten el crecimiento y mantenimiento de una serie de microorganismos del suelo que pueden ser inhibidos por altas concentraciones de algunos nutrientes (Chand et al., 1992). Aunque se considera al suelo como un ambiente rico en nutrientes, es difícil generalizar y por el contrario es altamente heterogéneo, presentando microambientes con bajas concentraciones de nutrientes. Según Ferrari y col. (2005), el suelo es un sustrato complejo que contiene una variedad de compuestos orgánicos e inorgánicos que suministran condiciones óptimas para el desarrollo de diferentes grupos de microorganismos. Uno de los grupos predominantes en este ambiente son los microorganismos oligótrofos (Hattori, 42 1976), quienes desempeñan un papel importante en la descomposición de la materia orgánica y en la dinámica de nutrientes (Hashimoto et al., 2006). Olsen y Bakken (1987) evaluaron diferentes medios de cultivo para la optimización del recuento en placa de microorganismos edáficos, obteniendo mayores recuentos en medios bajos en nutrientes debido a que se obtiene una mayor recuperación de microorganismos oligotróficos por su inhabilidad para crecer en medios con altas concentraciones de nutrientes (Riis et al., 1998; Phung et al., 2004). De igual manera Chand y col. (1992) concluyeron que los medios con altas concentraciones de nutrientes son inapropiados para el recuento de microorganismos del suelo, principalmente por que en estos se presenta sobrecrecimieto de microorganismos con altas tasas metabólicas, inhibiendo el desarrollo de microorganismos de lento crecimiento. Así mismo, Elliott y Des Jardin (1999) comentan el efecto negativo de las altas concentraciones de nutrientes en la recuperación de microorganismos por la inhibición causada por algunos componentes de los medios. En el presente estudio se observó una mejor recuperación de microorganismos heterótrofos en los medios considerados bajos en nutrientes (R2A y NWRI) (Parrington y Sharpe, 1998; Reasoner, 2004), indicando que estos medios permiten el crecimiento de colonias microbianas diferenciadas debido a que no crecen superpuestas, ni se presenta crecimiento acelerado de algunos microorganismos, lo que puede favorece el posterior aislamiento y estudio de los heterótrofos presentes en el suelo. Resultados similares fueron obtenidos por Whang y Hattori (1988) al comparar dos medios de cultivo: agar nutritivo (AN) y agar nutritivo diluido (AND), para la recuperación de microorganismos del suelo. Los autores observaron que en el medio bajo en nutrientes se presentaron mayores recuentos, indicando que estos proporcionaban mejores condiciones para el desarrollo de microorganismos oligotrófos. Teniendo en cuenta que este tipo de microorganismos es sensible a los nutrientes orgánicos y presenta bajas tasas de crecimiento (Saito et al., 1998). 7.2.1 Cuenca del río La Vieja Los resultados observados en La Vieja mostraron que en todas las coberturas los medios con bajas concentraciones de nutrientes (R2A y NWRI) permitieron una mayor recuperación de microorganismos heterótrofos (Anexo E). En bosque, guadual y cafetal sin sombrío se presentaron recuentos significativamente mayores en los medios con bajas 43 concentraciones de nutrientes (Tabla 7). Teniendo en cuenta el alto contenido de materia orgánica reportado en la literatura para los suelos de guaduales (11.21%), bosques (22.0%) y cafetales (9.5%) (Giraldo y Sabogal, 1999; Sadeghian et al., 1999), se esperaba obtener una mayor recuperación de microorganismos heterótrofos en medios altos en nutrientes. Sin embargo, se debe tener en cuenta que la materia orgánica disponible en el suelo es utilizada rápidamente y de igual forma se encuentra asociada con materiales del suelo, como las arcillas, haciéndola recalcitrante e inaccesible para los microorganismos (Morita, 2000). Estas condiciones pueden permitir el desarrollo de microorganismos con la capacidad de crecer a bajas concentraciones de nutrientes, lo que pudo verse en una mayor recuperación en medios R2A y NWRI. Por otro lado en la cobertura pastizal, no se presentaron diferencias significativas en los recuentos obtenidos los diferentes medios de cultivo, indicando que este tipo de cobertura posiblemente puede presentar microorganismos con requerimientos nutricionales mayores (Tabla 7). Tabla 7. Diferencias entre los recuentos de heterótrofos en los medios de cultivo en la cuenca del río La Vieja Cobertura Medio de cultivo R2A Bosque Pastizal Guadual CSS NWRI TSBA AIS R2A b TSBA b NWRI b AIS a a a a NWRI R2A TSBA AIS a a R2A NWRI a b TSBA b AIS a a a b Las letras diferentes indican diferencias significativas p< 0.05 Los medios con mayores recuentos se presentan a la izquierda. CSS: Cafetal sin sombrío b 44 7.2.2 Cuenca del Río Otún En Otún en las coberturas de cebolla y guadual se presentaron recuentos significativamente mayores en medios bajos en nutrientes (Tabla 8). Según Mantilla y col. (2000) los altos contenidos de materia orgánica del suelo se relacionan con la baja tasa de mineralización, esto se puede atribuir a la capacidad los aluminosilicatos amorfos (arcillas, feldespato, cloritas, granito) para adsorber los productos húmicos, convirtiendo la materia orgánica en un sustrato poco disponible para los microorganismos, generando ambientes bajos en nutrientes. Estas condicionen pueden favorece el desarrollo de microorganismos oligotrófos y microorganismos con bajas tasas metabólicas, lo que pudo generar a una recuperación mayor en medios bajos en nutrientes (R2A y NWRI). Por otro lado, en bosques y forestales no se observaron diferencias significativas en la recuperación de microorganismos heterótrofos en los diferentes medios de cultivo. Sin embargo, se presentaron recuentos mayores en los medios bajos en nutrientes, principalmente en el medio R2A. Teniendo en cuenta que el contenido, la clase y la composición la materia orgánica del suelo depende también de factores ambientales (clima, posición geográfica, temperatura, uso del suelos, entre otros, factores edáficos (humedad, temperatura, pH y aireación) (Mantilla et al., 2000), se puede asumir que la variabilidad del suelo puede proveer diversas condiciones para el desarrollo de diferentes tipos de microorganismos, lo que se vio reflejado en una buena recuperación con medios bajos y altos en nutrientes. Según Massa y col. (1998) después de comparar varios medios para la recuperación de heterótrofos en muestras de agua, obtuvieron mayores recuentos en el medio R2A y por su alta eficiencia recomiendan este medio para el recuento en placa de microorganismos heterótrofos. Aunque el medio R2A se uso inicialmente en la enumeración de microorganismos heterótrofos en lagos oligotróficos, debido a sus bajas concentraciones de diferentes fuentes carbono y fuentes de energía (Reasoner y Geldreich, 1985), varios estudios indican la misma efectividad en muestras de suelo principalmente por la buena recuperación de microorganismos heterótrofos (Mikell et al., 1995; Franklin et al., 2001; Margesin y Schinner, 2001; Ellis et al., 2003 y Calbrix et al., 2005). 45 Tabla 8. Diferencias entre los medios de cultivo en la cuenca del río El Otún Cobertura Medios de cultivo NWRI R2A AIS TSBA a R2A a b NWRI a b TSBA b AIS a a a a NWRI R2A AIS TSBA R2A b NWRI b TSBA b AIS a a a a Cebolla Bosque Guadual a Forestales Las letras diferentes indican diferencias significativas p< 0.05 Los medios con mayores recuentos se presentan a la izquierda. Los recuentos obtenido con el medio R2A (bajo en nutrientes) se seleccionaron para evaluar el efecto de las coberturas vegetales sobre la densidad de microorganismos heterótrofos (Anexo I y K), debido a que este medio permitió el desarrollo los microorganismos heterótrofos sin que se presentaran antagonismos por diferencias en las tasas de crecimiento lo que permitió obtener mayores recuentos de heterótrofos en las coberturas evaluadas. 7.3 Caracterización microscópica de colonias diferentes recuperadas en medio R2A Se realizó tinción de Gram a las colonias de la dilución donde se hizo el recuento de heterótrofos, observándose una mayor prevalencia de bacilos, en las dos cuencas. De igual forma se observó una mayor proporción de Gram positivos (Figuras 6) (Anexo J). Según Aguilera y Vélez (2001) los principales géneros aislados e identificados independientemente de la procedencia del suelo, son Bacillus y Clostridium, estos además de ser bacilos Gram positivos tienen la capacidad de formar endosporas. Muchas bacterias en respuesta a la disminución de nutrientes y cambios en el ambiente generan estas estructuras que no son células reproductoras sino formas de resistencia, estas estructuras hacen a los microorganismos mas resistentes a condiciones ambientales y por ende predominantes en el suelo (Sylvia et al., 2005). 46 La Vieja 80 Coco bacilo Coco morfologas (%) 100 Bacilo 60 40 20 La Vieja 80 Gram negativo 60 40 20 0 0 Bosque CF SS Guadual Pastizal Bosque Cobertura Bacilo 80 Coco bacilo Coco 60 Gram negativo 40 20 0 0 Cebolla Forestales Guadual Cobertura Gram positivo 80 20 Bosque Pastizal 100 colonias (%) 100 40 Guadual Otún Otún 60 CF SS Coberuta B colonias (%) Gram positivo 100 morfologías (%) A Bosque Cebolla Forestales Guadual Cobertura Figura 6. Morfologías y tinción de Gram observadas en las cuencas de los ríos A) La Vieja y B) El Otún 47 7.4 Evaluación del efecto de las coberturas vegetales sobre la densidad de microorganismos heterótrofos. Para la evaluación del efecto de las coberturas sobre la densidad de heterótrofos se tuvieron en cuenta las variables fisicoquímicas de las muestras, se realizó la prueba de Spearman con el fin de determinar la correlación de las variables fisicoquímicas (temperatura, pH, humedad y altura de hojarasca) con la densidad de microorganismos heterótrofos, el análisis indicó que no existía ninguna influencia de estas variables sobre los recuentos en cada una de las coberturas vegetales (Anexo G y H). Teniendo en cuenta que la cantidad, tipo y disponibilidad de materia orgánica determina la densidad de la comunidad heterotrófica del suelo, se debe asumir que las comunidades microbianas variaran según las condiciones ambientales y la disponibilidad de sustratos asociados a la materia vegetal haciendo ciertos grupos más predominantes que otros (Aguilera y Vélez, 2001). Sin embargo, en el presente estudio después de comparar los recuentos obtenidos en cada una de las coberturas vegetales usando la prueba de Kruskal Wallis (p < 0.05; n=96) no se encontraron diferencias significativas en el recuento de heterótrofos entre las diferentes coberturas en ninguno de los dos eventos de muestreo (Figuras 7 y 8) (Anexo K). 7.4.1 Efecto de las coberturas sobre la densidad de microorganismos heterótrofos en La Vieja En términos generales no se observaron diferencias significativas en los recuentos de heterótrofos obtenidos en las diferentes coberturas vegetales en esta cuenca (Kruskal Wallis; p < 0.05; n=96) (Anexo K). Sin embargo, en los guaduales se presentaron mayores recuentos y menor dispersión en los dos eventos de muestreo (Figura 7). 48 Figurra 7. Reccuentos heteerótrofos edáficos porr coberturaa en La Viieja. Se preesenta el prom medio y una desviación estándar (nn=12) c (1999) quienes reeportaron Resuultados simiilares fueroon obtenidoos por Saddeghian y col. mayoor actividadd microbianna - CO2 en e la coberrtura de guaadual (evalluación de CO2 por respiirometria), al caracteerizar sueloos en sisteemas agroppecuarios y forestalees en el depaartamento deel Quindío (Colombia)). Teniendo en cuenta que q el rápiddo crecimieento de la guaddua le apoorta al sueelo un aum mento conssiderable de d hojas en e descomp posición, enriqqueciendo y mejorandoo la texturaa y estructurra del sueloo (Giraldo y Sabogal, 1999), y que los l microorrganismos están e en mayyor abundanncia en las primeras ettapas del prroceso de descoomposiciónn de las hojaas (hojarasca) (Feria, 19998); se poddría asumir que las con ndiciones preseentes en la ccobertura dee guadual inncrementan los niveles de materia orgánica diisponible para los microorrganismos heterótrofos h s. Según Paaz y col. (20006) la relaación directaa entre la mateeria orgánica del suelo y la dinám mica de la biomasa b miccrobiana se presenta po or que el mateerial orgániico que ing gresa al suuelo es utiilizado com mo fuente de energía por las poblaaciones miccrobianas, lo l que pudoo influir enn mayores recuentos r de heterótroffos en la cobertura de guaadual. Por otro o lado, sabiendo que existe unaa relación directament d e proporcioonal entre laa materia orgánnica y la bbiomasa microbiana m (Giraldo y Sabogal, 1999; Man ntilla, 20000; JulcaOtin niano et all., 2006; Paz et al., 2006) y qu ue la desccomposición de la hojarasca contribuye al cciclaje de nu utrientes haciéndolos h s mas dispoonibles paraa microorgganismos 49 y plantas (Varela et al., 2002; Cleveland et al., 2004), se esperaba que existiera un efecto mayor de aquellas coberturas con presencia de hojarasca (bosques y cafetales) sobre los recuentos de microorganismos heterótrofos, sin embargo en este estudio no se evidenció ningún efecto de esta variable sobre la densidad de heterótrofos (Spearman; p < 0.05; n=96) (Anexo H). De acuerdo a Varela y colaboradores (2004), algunos componentes de la hojarasca activan la vida microbiana, ejerciendo una acción positiva sobre la descomposición de la materia orgánica, por el contrario otros tienen efecto negativo. Según Mantilla y col. (2000) se debe tener en cuenta la relación del contenido de alta materia orgánica del suelo con la presencia de algunos aluminosilicatos amorfos, debido a que absorben diferentes productos húmicos, convirtiendo la materia orgánica en un sustrato poco disponible para los microorganismos. Esto podría justificar por que la presencia de hojarasca no presento correlación con la densidad de heterótrofos. 7.4.2 Efecto de las coberturas sobre la densidad de microorganismos heterótrofos en El Otún En la cuenca del río El Otún no se observaron diferencias significativas en los recuentos entre las coberturas en los dos eventos de muestreo (Kruskal Wallis; p < 0.05; n=96) (Anexo K). Sin embargo los recuentos en el segundo evento de muestreo fueron significativamente mayores (Wilcoxon; p<0.05; n=96) (Figura 8) (Anexo M). Según el Centro Nacional de Investigación de Café (CENICAFE) la distribución promedio mensual de lluvias para la cuenca del río El Otún fue 190 mm en junio y 277 mm en Octubre. Teniendo en cuenta el aumento en las precipitaciones en el segundo evento de muestreo y la influencia de esta variable en el aumento de los niveles de materia orgánica por el mal drenaje de los suelos (Mantilla et al., 2000), se podría asumir que el nivel de precipitaciones presentó una influencia sobre la densidad heterótrofos en el segundo evento de muestreo, debido a que se obtiene un mayor número de microorganismos cuando se aumenta la cantidad de sustratos en el suelo (Aguilera y Vélez, 2001). 50 Figura 8. Recuentos de heterótrofos edáficos por coberturas en El Otún. Se presenta el promedio y la desviación estándar (n=12) Por otro lado, se observaron mayores recuentos y menor dispersión de los datos en la cobertura de forestales en el segundo evento muestreo, contrario a lo reportado por Sadeghian y col. (1999), quienes obtuvieron baja actividad microbiana - CO2 en las plantaciones forestales (pinos) (evaluación de CO2 por respirometria), relacionándolo principalmente con el menor contenido de la materia orgánica que caracterizó a esta cobertura en su investigación. Teniendo en cuenta que las variables fisicoquímicas (humedad, temperatura, pH) no presentaron influencia sobre la densidad de heterótrofos (Anexo H), no se puede establecer a que corresponden los mayores recuentos de heterótrofos en los forestales con respecto a las demás coberturas vegetales. Según Aguilera y Vélez (2001) factores como el porcentaje de materia orgánica, concentración de nitrógeno y fosforo, que no fueron medidos en este estudio, pueden determinar la densidad de microorganismos en el suelo, debido a su importancia en el metabolismo de los heterótrofos. 7.5 Abundancia de microorganismos heterótrofos en relación con la densidad de microorganismos totales (DAPI) Al comparar los recuentos en placa de heterótrofos cultivables con los conteos de totales por DAPI (Vela, 2007), se observó que las condiciones de cultivo dadas recuperaron 51 microorganismos heterótrofos cultivables, aerobios y mesófilos, mientras que la técnica de conteo de microorganismos totales por DAPI determinó la densidad de aerobios, anaerobios, cultivables y no cultivables, viables y no viables. Por tal razón la mejor manera de relacionar estos resultados es calculando la abundancia relativa, donde se mide la densidad de una población (densidad de heterótrofos edáficos) con respecto a un grupo mayor (densidad de microorganismos totales por DAPI). Para determinar la abundancia relativa (Ar) de microorganismos heterótrofos se utilizó la 100 (Magurran, 1989) (Tabla 9). Los valores observados no formula presentaron diferencias significativas (Tukey-Kramer; p<0.05; n=192) (Anexo L),lo que puede indicar que posiblemente los microorganismos heterótrofos no se ven afectados por los cambios en el manejo del suelo, dados por los múltiples usos productivos en las diferentes coberturas vegetales. Tabla 9. Abundancia relativa de heterótrofos con relación a la densidad total de microorganismos del suelo (DAPI) en las coberturas vegetales seleccionadas. Cobertura Heterótrofos DAPI Ar Bosque 7,05 11,23 62,75 Pastizal 7,11 11,18 63,53 Guadual 7,30 CFSS Cobertura Heterótrofos DAPI Ar Cebolla 6,87 11,15 61,62 Bosque 7,02 11,12 63,11 11,26 64,85 Guadual 6,78 11,07 61,20 7,12 11,37 62,56 Forestales 6,66 11,46 58,06 Bosque 7,26 11,51 63,03 Cebolla 7,12 11,39 62,45 Pastizal 7,05 11,30 62,37 Bosque 6,98 11,57 60,31 EM 1 EM2 EM 1 EM2 Guadual 7,16 11,39 62,84 Guadual 7,11 11,57 61,39 CFSS 7,13 11,22 63,51 Forestales 7,24 11,58 62,51 CFSS: Cafetal sin sombrío EM: Evento de muestreo 52 Según Paz y col. (2006) la actividad biológica puede estimarse a través de indicadores que generan información sobre la dinámica de la materia orgánica en el suelo, como lo es la determinación de biomasa microbiana. Esta propiedad permite estimar la calidad biológica del suelo, por ser de rápida respuesta a los cambios en el manejo agronómico y sufrir cambios frente al estrés ambiental. Sin embargo, según los resultados obtenidos en este estudio, la densidad de microorganismos heterótrofos no se vio afectada por los diferentes manejos de cultivo, mostrando que este grupo funcional no se debe considerar como un indicador biológico de la calidad y salud del suelo. Debido a la falta de estudios que relacionen los microorganismos heterótrofos con coberturas vegetales, no se puede analizar si la proporción de este grupo microbiano es mayor o menor a lo esperado en la ecorregión cafetera. Sin embargo, al comparar los resultados obtenidos entre las coberturas vegetales se pudo observar que en general se presentó una alta variabilidad en los recuentos de heterótrofos impidiendo observar cambios en la población de estos microorganismos, de igual forma se observó que el grupo funcional de heterótrofos es muy heterogéneo, presentando afinidad por diferentes sustratos del suelo. Teniendo en cuenta que un buen indicador de la calidad del suelo debe ser sensible a los cambios ambientales (Acuña et al., 2006) y que la densidad de microorganismos heterótrofos no se vio afectada por los diferentes manejos de cultivo, se puede asumir que posiblemente este grupo funcional no se debe considerar como un indicador biológico de la calidad y salud del suelo. 53 8. CONCLUSIONES 1. El uso de solución salina (0.85% p/v) con agitación de 160 rpm por 15 min presento menor dispersión de los datos y la mayor recuperación de microorganismos heterótrofos de la matriz del suelo 2. En las diferentes coberturas vegetales de las cuencas del río La Vieja y Otún los medios de cultivo bajos en nutrientes presentaron la mayor recuperación de heterótrofos, específicamente el medio R2A que fue seleccionado y utilizado para estimar la densidad de los heterótrofos edáficos. 3. No se observaron diferencias en las densidades de los microorganismos heterótrofos en las coberturas vegetales evaluadas indicando que posiblemente no se puede evaluar la calidad y salud del suelo por medio de este grupo microbiano. 54 9. RECOMENDACIONES 1. Es necesario la medición la materia orgánica en estudios posteriores de los microorganismos heterótrofos. 2. Para estudios posteriores es necesario enfocar el estudio de los heterótrofos a un grupo especifico sean hongos, bacterias o bacterias filamentosos debido a que al analizar estos en un solo estudio se pueden presentar inhibiciones. 3. Para el recuento de bacterias heterótrofas con el medio de cultivo R2A es necesario adicionar un inhibidor para evitar el crecimiento de las bacterias filamentosas con el fin de evitar inhibición por metabólicos de crecimiento. 55 9. BIBLIOGRAFÍA • Acuña, O., Peña, W., Serrano, E., Pocasangre, L., Rosales, F., Delgano, E., Trejos, J. y Segura. A. 2006. La importancia de los microorganismos en la calidad y salud de los suelos. XVII Reunião Internacional da Associação para a Cooperação Santa Catalina (Brasil). p.p. 222-233. • Aguilera, M. y Vélez, B. 2001. Aproximación al estudio del efecto de la cobertura vegetal sobre los grupos bacterianos proteolíticos y celulolíticos en el departamento del Quindío. Trabajo de grado. de Microbiología Industrial. Facultad de Ciencias. Pontificia Universidad Javeriana. Facultad de Ciencias. • American Public Health Association. 2005. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. 21st Edition (Greenberg, A., Clesceri, L. & Eaton, A.), American Water Works Association. Water Environment Federation, Maryland, USA. • ASM. 1999. Manual of microbiology and biotechnology. Departament of Nutrition and Food Science. Massachusetts Institute of Technology, Cambridge. Washington D.C. • Atlas, R. 1995. Media for environmental microbiology. University of Louisville. Pag: 119. • Atlas, M. y Bartha, R. 2002. Ecología microbiana y microbiología ambiental. Cuarta edición. Addison Wesley. Nueva York, USA. pp. 217-262. • Balestra, G. y Misaghi, I. 1997. Increasing the efficiency of the plate counting method for estimating bacterial diversity. Journal Microbiological Methods. 30(2):111-117. • Beltran, E., Molina, R. y Jiménez, L. 1988. Estudio general de suelos del departamento de Risaralda. Instituto Geográfico Agustín Codazzi. Bogotá, Colombia. pp 72-74, 94, 112, 178, 181, 201, 206. • Bitton, G. 2002. Encyclopedia of environmental microbiology. Vol 3. Tercera Edición. Ed. Wiley, New York, USA. pp 1654-1670. • Calbrix, R., Laval, K. y Barray, S. 2005. Analisys of the potential functional diversity of the bacteria community in soil: a reproducible procedure using solecarbon-source utilization profiles. Europan Journal of Soil Biology. 41:11-20. • Camargo, J. 2006. Informe de la dirección científica del CIEBREG. Informe electrónico. Quindio, Colombia. 56 ciebreg.utp.edu.co/Plone/Ciebreg/direccion/direccion_cientifica/talleres/talleres/Info rme.pdf • Chand, T., Harris, R. y Andrews, J. 1992. Enumeration and characterization of bacterial colonists of a submersed aquatic plant, Eurasia watermilfoil (Myriphyllum spicatum L). Applied and Environmental Microbiology. 58(10): 3374-3379. • Cleveland,C., Alan, T., y Briana, C. 2004. Soil Microbial Dynamics in Costa Rica: Seasonal and Biogeochemical Constraints. Biotropica 36(2): 184-195 • Cleves, I. y Sandoval, C. 2003. Evaluación de la biodegradación de hidrocarburos presentes en suelos contaminados con lodos aceitosos de la industria petrolera de Campo Dina (Huila- Colombia) Trabajo de grado. Carrera de Microbiología Industrial. Facultad de Ciencias. Pontificia Universidad Javeriana. • Coyne, M. 2000. Microbiología del suelo: Un enfoque exploratorio. Primera edición. Editorial Parainfo S.A. Madrid, España. pp. 128-152. • Díaz, P., Pedro, A., Alvarado, M., Pedro, D. y Useche, C. 1996. Suelos del departamento del Quindío. Corporación Autónoma Regional del Quindío (CRQ). Grupo editores S.A. Armenia - Colombia. pp. 110, 112, 118, 120 • Elliott, M. y Des Jardin, E. 1999. Comparison of media and diluents for enumeration of aerobic bacteria from bermuda grass golf course putting greens. Journal Microbiological Methods. 34(3):194-202. • Ellis, R., Morgan, P., Weightman, A. y Fry, J. 2003. Cultivation-dependent and independent approaches for determining bacterial diversity in hevy-metalcontaminated soil. Applied and Environmental Microbiology. 69:3223-3230. • Escobar de Rico, M. 2002. Fundamentos de Microbiología. Bogotá. Tercera edición. Colombia. Ed. CEJA. pp 121-136. • Eweis, J. y Ergas, S. 1999. Principios de Biorecuperación. Primera edición. Editorial McGraw Hill. Madrid, España. pp 27-39. • Feria, L. 1998. Comparación de la actividad microbiana en hojarasca entre un área continua y un fragmento de bosque andino. Trabajo de grado. Facultad de Ciencias. Carrera de Microbiología Industrial. Pontificia Universidad Javeriana. • Ferrari, B., Binnerup, S. and Gillings, M. 2005. Microcolony cultivation on a soil substrate membrane system selects for previously uncultured soil bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 72(12):8714-8720. • Franklin, J., Garland, C., Bolster, C. y Mills, A. 2001. Impact of dilution on microbial community structure and functional potential: comparison of numerical 57 simulations and batch culture microbiology. 67(2):702–712 experiments. Applied and environmental • Garcia, M.M. 1973. Evaluation of Various Media and the Use of Soil Infusion in the Production of Brucella abortus Antigen. Canadian Journal of Veterinary Research. 37(1): 33–42. • Giraldo. H y Sabogal. O. 1999. Una alternativa sostenible: La guadua. Técnicas de cultivo y manejo. Ed. Corporación Autónoma Regional del Quindío C.R.Q. Colombia. p 192. • Grant, W. 1989. Microbiología Ambiental. Primera edición Ed. Acribia. Zaragoza, España. pp. 98-100. • Hashimoto, T., Whang, K. and Nagaoka, K. 2006. A quantitative evaluation and phylogenetic characterization of oligotrophic denitrifying bacteria harbored in subsurface upland soil using improved culturability. Biology Fertility Soils. 42(3): 179–185. • Hattori, T. 1976. Plate count of bacteria in soil on a diluted nutrient broth as a culture medium. Reports of the Institute for Agricultural Research, Tohoku University. Pp 27:23–30 • Hawksworth, D. 1996. Biodiversity measurement and estimation. First edition. Ed. Chapman & Hall, Londres (Inglaterra). p.p. 10-11. • Janssen,P.H., Yales, P., Grinton, P., Taylor, P. and Sait, M. (2002). Improved culturability of soil bacteria and isolation in pure culture of novel members of the divisions Acidobacteria, Actinobacteria, Proteobacteria, and Verrucomicrobia. Applied and Environmental Microbiology. 68: 2391-2396. • Joseph, S., Hugenholtz, P., Sangwan, C. and Janssen, P. 2003. Laboratory cultivation of widespread and previously unculturable soil bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 69:7210-7215. • Julca-Otiniano A., Meneses-Florián L., Blas-Sevillano, R., y Bello-Amez, S. 2006. La materia orgánica, importancia y experiencia de su uso en la agricultura. Idesia 24: 49-51. • Kaper, J., Mills, A., and Colwell, R. 1977. Evaluation of the Accuracy and Precision of Enumerating Aerobic Heterotrophs in Water Samples by the Spread Plate Method. Applied and Environmental Microbiology. 35(4): 756-761. • Kennedy, A. 1999. Bacterial diversity in agroecosystems. Agriculture, Ecosystems and Environment. 74: 65–76. 58 • Kirk, J., Beaudette, L., Hart, M., Moutoglis, P., Klironomos, J., Lee, H., Trevor, J. 2004. Methods of studying soil microbial diversity. Journal of Microbiological Methods. 58: 169– 188. • Lederberg, J. 2000. Enciclopedia of microbiology. Second edition. Ed Academic Press. California, USA. p.p. 86-88, 651-662. • Lindahl, V. 1996. Improved soil dispersion procedures for total bacterial counts, extraction of indigenous bacteria and cell survival. Journal of Microbiology Methods. 25(3):279-286. • Lillis, T.O y Bissonnette, G.K. 2001. Detection and characterization of filterable heterotrophic bacteria form rural groundwater supplies. Letter in Applied Microbiology. 32: 268-272. • Liu, B., Jia, G., Chen, J. y Wang, G. 2006. A review of methods for studying microbial diversity in soils. Pedosphere. 1: 18-24. • Madigan, M., Martinko, J. and Parker, J. 2001 Biología de los microorganismos. Octava edición. Ed. Prentice Hall. Madrid , España. Pág: 15-16, 25-26, 110, 112, 116-117, 113-114, 561-563, 872-75. • Magurran, A. 1989. Diversidad Ecológica y su medición. Primera edición. Ediciones Vedrá, Barcelona (España). pp. 9-125 • Maier, R., Pepper, I., and Gerba C. 2001. Environmental Microbiology. First edition. Academic Press. Tucson, USA. p.p. 66-71. • Maldonado, C. 2004. Evaluación de la atenuación natural de hidrocarburos de petróleo utilizados como supresores de polvo en carreteras sin pavimentar. Trabajo de Grado. Programa de Biología y Microbiología. Facultad de Ciencias. Universidad de los Andes. • Mantilla, G., de Latorre S., Gómez, C., Ordóñez, N., Ceballos, J., Euscategui, C., Péres, P., Pérez, S. Martínez, N., Sánchez, R., Maldonado, N., Gaitán, J. Chávez, L., Chamorro, C. y Flórez A. 2000. El medio ambiente en Colombia. Cap 6. Los suelos: estabilidad, productividad y degradación. Publicación del Instituto de Hidrología, Meteorología y Estudios Ambientales (IDEAM). Pág 228-273. • Margalef, R. 1974. Ecología. Segunda edición. Ed. Omega. Barcelona, España. p 951. • Margesin. R. and Schinner. F. 2001. Biodegradation and bioremediation of hydrocarbons in extremes environments. Applied and Environmental Microbiology. 53: 650-663 59 • Martin, J. 1975. Comparision of agar media for counts of viable soil bacteria. Short communication. Soil Biology & Biochemistry. 7: 401-402. • Massa, S., Caruso, M., Trovatelli, F. y Tosques, M. 1998. Comparison of plate count agar and R2A medium for enumeration of heterotrophic bacteria in natural mineral water. Word Journal of Microbiology and Biotechnology. 14(5): 15731972. • McCaing, A., Grayston, S., Proser, J. and Glover. 2001. Impact of cultivation on characterization of species composition of soil bacterial communities. Microbiological Ecology. 35:37-48. • Mcternan, W., Adams, J. y Rechard, P. 1974. Comparison of methods for enumerating fluorescent bacteria. Applied Microbiology. 1: 290-291. • Merck, 2004. Manual de Medios de Cultivo. Darmstadt, Alemania • Method EPA-9045C. (1995); Soil and Waste pH; Revision 3, Enero 1995. • Mikell, A., Smith, C. y Richardson, J. 1995. Evaluation of media and techniques to enumeration heterotrophic microbes from karst and sand aquifer springs. Microbial Ecology. 31:115-124. • Minambiente. 1997. Ley de biodiversidad. República de Colombia. www.minambiente.gov.co • Morita, R. 2000. Low nutrient environments. Encyclopedia of Microbiology. Volume 3. Segunda edición. Oregon State University USA. p.p. 86-88. • Nannipieri, P., Ascher, J., Ceccherini, T., Landi, L., Pietramellara, G. and Renella, G. 2003. Microbial diversity and soil functions. European Journal of Soil Science. (54):655-670. • Navarro, G. 2000. Química agrícola. El suelo y los elementos químicos esenciales para la vida vegetal. Segunda edición Ed. Mundi Prensa. España. p.p. 78-82. • Olarte R. 1979. Métodos analíticos del laboratorio de suelos. Instituto Geográfico Agustín Codazzi (IGAC). Subdirección agrológica. Ministerio de Hacienda y Crédito Público. 4ta edicion. Bogotá. pp. 90 y 136 • Olsen, R. y Bakken, L. 1987. Viability of soil bacteria: optimization of platecounting technique and comparison between total counts and plate counts within different size groups. Microbiological Ecology. 13: 59-74. 60 • Parrington, L. y Sharpe. A. 1998. Factors affecting aerobic colony counts for bottled water. Food Microbiology. 15(1): 79–90. • Paz, E., Sanchez, M. y Sadeghian, S. 2006. Relación entre dos sistemas de sombrío de café y algunas propiedades del suelo en la meseta de Popayán, Colombia. Acta Agronómica de Colombia. 55:1-5. • Pereira, R., Silveira, E., Scaquitto, D., Nascimbem, E., Val-Moraes, S., Wickert, E., Carareto-Alves, L. y Macedo, E. 2006. Molecular characterization of bacterial populations of different soils. Brazilian Journal of Microbiology. 37:439-447. • Phung, N., Lee, J., Hyun, K., Chang, I., Gadd, G., Hong, B. 2004. Analysis of microbial diversity in oligotrophic microbial fuel cells using 16S rDNA sequences. Microbiology Letters. 233: 77–82. • Reasoner, D. 2004. Heterotrophic plate count methodology in the United States. International Journal of Food Microbiology. 92: 307-315. • Reasoner, D. y Geldreich, E. 1985. A new medium for the enumeration and subculture of bacteria from potable water. Applied and Environmental Microbiology. 49: 1-7. • Riis, V., Lorbeer, H. y Babel, W. 1998. Extraction of microorganisms from soil: Evaluation of the efficiency by counting methods and activity measurements. Soil Biology Biochemistry. 30(12):1573-1581. • Roldan, F. 2006. Planeación de muestreo de suelo en la ecorregión cafeteria para el CIEBREG (Comunicación personal). • Sadeghian, S., Murgueitio, E. y Rivera, J. 1999. Características de suelos en sistemas agropecuarios y forestales para el ordenamiento territorial en el departamento del Quindío (Colombia). Fundación Centro para la Investigación en Sistemas Sostenibles de Producción Agropecuaria (CIPAV). www.cipav.org.co/redagrofor/memorias99/Siavosh.htm • Saito, A., Mitsui, H., Hattori, R., Minamisawa, K. y Hattori, T. 1998. Slow-growing and oligotrophic soil bacteria phylogenetically close to Bradyrhizobium japonicum. Microbiology Ecology. 25(3):277-286. • Staley, J. 2000. Heterotrophic microorganisms. University of Washington. Encyclopedia of Microbiology. Academic Press. California, USA. Segunda edición. pp. 651-662. • Sylvia, D., Fuhrmann, J., Hartel, P. y Zuberer, D. 2005. Priciples and aplications of soil microbiology. Prentice Hall. New Jersey, USA. pp. 53, 218-256. 61 • Vallejo, V. 2004. Efecto de la Adición de Nutrientes (nitrógeno y Fósforo) en la degradación de TPH en suelos contaminados con Hidrocarburos del petróleo. Tesis de Maestría. Carrera de Microbiología. Facultad de Ciencias. Pontificia Universidad Javeriana. • Van der Kooij, D. y Hijnen, W. 1983. Nutritional Versatility of a Starch-Utilizing Flavobacterium at Low Substrate Concentrations. Applied and Environmental Microbiology. 45: 804-810 • Varela, A., Barriga, P. y Ahumada, J. 2002. Comparación de factores abióticos relacionados con la descomposición de hojarasca entre fragmentos y no fragmentos de bosque altoandino nublado. Ecotropicos 15(2):185-193 • Vela, A. 2007. Evaluación del efecto de los sistemas productivos sobre la densidad de los microorganismos edáficos en suelos del eje cafetero en las cuencas de los ríos La Vieja y El Otún. Trabajo de Grado. Programa de Microbiología Industrial. Facultad de Ciencias. Pontificia Universidad Javeriana. • Whang, K y Hattori, T. 1988. Oligotrophic bacteria from rendzina forest soil. Antonie van Leeuwenhoek 54:19-36 • Xu, J. 2006. Microbial ecology in the age of genomics and metagenomics: concepts, tools, and recent advances. Molecular Ecology 15: 1713 –1731 • Yu, W., Dodds, W., Banks, M. and Skalsky, J. 1995. Optimal staining and sample storage time for direct microscopic enumeration of total and active bacteria in soil with two fluorescent dyes. Applied and Environmental Microbiology. 61(9):33673372. 62 10. ANEXOS ANEXO A. COMPOSICIÓN MEDIOS DE CULTIVO 1. MEDIO R2A Glucosa Peptona de proteasa Extracto de levadura Almidón soluble Piruvato de sodio KHPO4 MgSO4 Casaminoacidos (g/L) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.3 0.3 0.05 0.5 2. MEDIO NWRI Peptona Caseina soluble K2HPO4 MgSO4 FeCl3 (g/L) 3.0 0.5 0.2 0.05 0.001 3. MEDIO TSBA Tripticasa Dextrosa Peptona NaCl K2HPO4 (g/L) 17.0 2.5 3.0 5.0 2.5 4. MEDIO AIS Glucosa Extracto de levadura K2HPO4 KH2PO4 MgSO4 .7H2O Infusión suelo* Agua destilada (g/L) 7.5 3.0 0.5 0.5 0.5 400ml 600ml *Infusión suelo Suelo del sitio de muestro Agua destilada 250 g 750ml 63 ANEXO B. PREPARACIÓN BUFFER FOSFATO (American Public Health Association, 2005) Solución 1: 34 g de H2PO4 en 1 L de agua destilada. El pH se ajustó a 7.2. Solución 2: 50 g de MgSO4.7H2O en 1 L de agua destilada Solución de trabajo: se tomaron 1.25 ml de la solución 1 y 5.0 ml de la solución 2, y se completó a 1 L con agua destilada 64 ANEXO C. RECUENTO DE HETERÓTROFOS PARA LOS TRATAMIENTOS EVALUADOS % Humedad Media(%H) 35,20 37,77 ds P.S Solución diluyente Tratamiento Heterotrofos (AIS) 1' Replica (AIS) 1'' 1'/PS 1´´/PS Media Log Media 0,60 Buffer fosfato 160rpm*15min 1,71E+06 1,98E+06 2,83E+06 3,28E+06 3,05E+06 6,5 0,58 Buffer fosfato 160rpm*15min 1,83E+06 1,29E+06 3,16E+06 2,23E+06 2,70E+06 6,4 3,08 0,60 Buffer fosfato 160rpm*15min 1,23E+06 1,38E+06 2,05E+06 2,30E+06 2,18E+06 6,3 35,19 0,62 Buffer fosfato 160rpm*15min 1,62E+06 1,86E+06 2,62E+06 3,01E+06 2,81E+06 6,4 31,82 0,59 Buffer fosfato 160rpm*15min 3,80E+06 5,70E+06 6,49E+06 9,74E+06 8,12E+06 6,9 35,20 0,60 Buffer fosfato 200rpm*15min 1,67E+07 1,30E+07 2,76E+07 2,15E+07 2,46E+07 7,4 40,00 36,00 37,77 0,58 Buffer fosfato 200rpm*15min 9,50E+06 1,44E+07 1,64E+07 2,49E+07 2,06E+07 7,3 3,08 0,60 Buffer fosfato 200rpm*15min 1,25E+07 1,22E+07 2,09E+07 2,04E+07 2,06E+07 7,3 35,19 0,62 Buffer fosfato 200rpm*15min 1,03E+07 1,38E+07 1,66E+07 2,23E+07 1,95E+07 7,3 31,82 0,59 Buffer fosfato 200rpm*15min 5,20E+06 6,80E+06 8,89E+06 1,16E+07 1,03E+07 7,0 35,20 0,60 NaCl 160rpm*15min 1,93E+07 1,07E+07 3,20E+07 1,77E+07 2,48E+07 7,4 40,00 36,00 37,77 0,58 NaCl 160rpm*15min 1,20E+07 1,72E+07 2,07E+07 2,97E+07 2,52E+07 7,4 3,08 0,60 NaCl 160rpm*15min 9,70E+06 8,10E+06 1,62E+07 1,35E+07 1,49E+07 7,2 35,19 0,62 NaCl 160rpm*15min 1,38E+07 1,83E+07 2,23E+07 2,96E+07 2,59E+07 7,4 31,82 0,59 NaCl 160rpm*15min 8,30E+06 9,30E+06 1,42E+07 1,59E+07 1,50E+07 7,2 35,20 0,60 NaCl 200rpm*15min 8,00E+06 9,30E+06 1,32E+07 1,54E+07 1,43E+07 7,2 40,00 36,00 37,77 0,58 NaCl 200rpm*15min 6,80E+06 8,00E+05 1,17E+07 1,38E+06 6,57E+06 6,8 3,08 0,60 NaCl 200rpm*15min 5,80E+06 6,70E+06 9,69E+06 1,12E+07 1,04E+07 7,0 35,19 0,62 NaCl 200rpm*15min 6,70E+06 5,50E+06 1,08E+07 8,89E+06 9,86E+06 7,0 31,82 0,59 NaCl 200rpm*15min 1,14E+07 9,60E+06 1,95E+07 1,64E+07 1,79E+07 7,3 40,00 36,00 ds 6,5 0,22 7,3 0,15 7,3 0,13 7,0 0,17 PS: peso seco 65 ANEXO D. Distribución de los tratamientos, ANOVA y comparación de medias utilizando Tukey-Kramer para la estandarización del proceso de extracción 7,5 7 Log UFC/gps 6,5 6 1 2 3 All Pairs Tukey-Kramer 0,05 4 Tratamiento Análisis de una vía Anova Análisis de Varianza Source DF Sum of Squares Mean Square F Ratio Prob > F Tratamiento 3 3,9054275 1,30181 0,04801 Error 36 1,7284700 C. Total 39 5,6338975 27,1136 <.0001 Comparación de medias usando Tukey-Kramer HSD q* 2,69323 Abs(Dif)-LSD 3 2 4 1 3 -0,26392 -0,21992 0,03708 0,52208 2 -0,21992 -0,26392 -0,00692 0,47808 4 0,03708 -0,00692 -0,26392 0,22108 1 0,52208 0,47808 0,22108 -0,26392 Los valores positivos muestran diferencias significativas entre las medias. 66 ANEXO E. RECUENTO DE HETERÓTROFOS EN LOS DIFERENTES MEDIOS DE CULTIVO EVALUADOS Muestreo Ventana 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 Fincas La Granja La Granja La Granja La Granja La Granja La Granja La Granja La Granja La Granja La Granja La Granja La Granja La Granja La Granja La Granja La Granja La Granja La Granja La Granja La Granja La Granja La Granja La Granja La Granja La Granja La Granja La Granja La Granja La Granja Coberturas Medio Replica Bosque a Bosque b Bosque a AIS Bosque b Bosque a Bosque b Bosque a Bosque b Bosque a NWRI Bosque b Bosque a Bosque b Bosque a Bosque b Bosque a R2A Bosque b Bosque a Bosque b Bosque a Bosque b Bosque a TSBA Bosque b Bosque a Bosque b Bosque a Bosque b AIS Bosque a Bosque b Bosque a Recuento 6,43E+06 3,03E+06 7,87E+06 5,42E+06 3,56E+06 2,80E+06 2,61E+07 1,83E+07 1,33E+07 1,61E+07 6,62E+05 5,85E+05 2,03E+07 2,54E+07 1,74E+07 1,26E+07 1,43E+06 1,29E+06 8,13E+06 6,31E+06 1,24E+07 8,90E+06 1,59E+06 1,17E+06 1,17E+07 9,70E+06 7,99E+06 1,07E+07 1,06E+07 Log Recuento 6,81 6,48 6,90 6,73 6,55 6,45 7,42 7,26 7,12 7,21 5,82 5,77 7,31 7,40 7,24 7,10 6,15 6,11 6,91 6,80 7,09 6,95 6,20 6,07 7,07 6,99 6,90 7,03 7,02 Media DS 6,65 0,19 6,77 0,76 6,89 0,59 6,67 0,43 6,83 0,44 67 Muestreo Ventana 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Fincas La Granja La Granja La Granja La Granja La Granja La Granja La Granja La Granja La Granja La Granja La Granja La Granja La Granja La Granja La Granja La Granja La Granja La Granja La Granja La Ramada La Ramada La Ramada La Ramada La Ramada La Ramada La Ramada La Ramada La Ramada La Ramada La Ramada La Ramada La Ramada Coberturas Bosque Bosque Bosque Bosque Bosque Bosque Bosque Bosque Bosque Bosque Bosque Bosque Bosque Bosque Bosque Bosque Bosque Bosque Bosque Pastizal Pastizal Pastizal Pastizal Pastizal Pastizal Pastizal Pastizal Pastizal Pastizal Pastizal Pastizal Pastizal Medio Replica b a b a NWRI b a b a b a R2A b a b a b a TSBA b a b a b a AIS b a b a b a NWRI b a b R2A a Recuento 8,80E+05 1,32E+07 1,74E+07 1,87E+07 1,66E+07 1,25E+07 1,86E+07 1,95E+07 1,58E+07 2,02E+07 2,56E+07 2,17E+07 1,81E+07 1,23E+07 1,11E+07 1,10E+07 8,53E+06 1,10E+07 1,39E+07 7,53E+06 9,11E+06 1,01E+07 9,44E+06 4,62E+06 5,49E+06 9,51E+06 1,32E+07 1,21E+07 1,20E+07 4,49E+06 5,74E+06 1,02E+07 Log Recuento 5,94 7,12 7,24 7,27 7,22 7,10 7,27 7,29 7,20 7,30 7,41 7,34 7,26 7,09 7,05 7,04 6,93 7,04 7,14 6,88 6,96 7,00 6,98 6,66 6,74 6,98 7,12 7,08 7,08 6,65 6,76 7,01 Media DS 7,20 0,08 7,30 0,07 7,05 0,07 6,87 0,14 6,95 0,19 7,40 0,39 68 Muestreo Ventana 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 Fincas La Ramada La Ramada La Ramada La Ramada La Ramada La Ramada La Ramada La Ramada La Ramada La Ramada La Ramada La Ramada La Ramada La Ramada La Ramada La Ramada La Ramada La Ramada La Ramada La Ramada La Ramada La Ramada La Ramada La Ramada La Ramada La Ramada La Ramada La Ramada La Ramada La Ramada La Ramada Coberturas Pastizal Pastizal Pastizal Pastizal Pastizal Pastizal Pastizal Pastizal Pastizal Pastizal Pastizal Pastizal Pastizal Pastizal Pastizal Pastizal Pastizal Pastizal Pastizal Pastizal Pastizal Pastizal Pastizal Pastizal Pastizal Pastizal Pastizal Pastizal Pastizal Pastizal Pastizal Medio Replica b a R2A b a b a b a TSBA b a b a b a AIS b a b a b a NWRI b a b a b a R2A b a b a TSBA b Recuento 1,28E+07 1,86E+07 1,61E+07 7,24E+07 8,36E+07 1,03E+07 1,00E+07 5,85E+06 6,12E+06 1,96E+07 1,63E+07 7,45E+06 5,96E+06 6,28E+06 6,88E+06 7,94E+06 8,42E+06 1,01E+07 1,19E+07 1,16E+07 1,33E+07 9,96E+06 1,26E+07 3,51E+07 3,27E+07 2,02E+06 2,29E+07 1,19E+07 1,24E+07 1,04E+07 1,18E+07 Log Recuento 7,11 7,27 7,21 7,86 7,92 7,01 7,00 6,77 6,79 7,29 7,21 6,87 6,78 6,80 6,84 6,90 6,93 7,00 7,08 7,07 7,12 7,00 7,10 7,55 7,51 6,30 7,36 7,07 7,10 7,02 7,07 Media DS 7,01 0,21 6,85 0,06 7,06 0,05 7,15 0,46 7,06 0,05 69 Muestreo Ventana 2 1 2 1 2 1 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 1 2 1 2 1 2 1 Fincas La Ramada La Ramada La Ramada La Ramada La Ramada La Ramada La Ramada La Ramada La Ramada La Ramada La Ramada La Ramada La Ramada La Ramada La Ramada La Ramada La Ramada La Ramada La Ramada La Ramada La Ramada La Ramada La Ramada La Ramada La Ramada La Ramada La Ramada La Ramada La Ramada La Ramada La Ramada La Ramada Coberturas Pastizal Pastizal Pastizal Pastizal Guadual Guadual Guadual Guadual Guadual Guadual Guadual Guadual Guadual Guadual Guadual Guadual Guadual Guadual Guadual Guadual Guadual Guadual Guadual Guadual Guadual Guadual Guadual Guadual Guadual Guadual Guadual Guadual Medio Replica a b TSBA a b a b a AIS b a b a b a NWRI b a b a b a R2A b a b a b a TSBA b a b a b AIS a b Recuento 1,14E+07 1,04E+07 1,42E+07 1,07E+07 1,88E+07 1,22E+07 5,60E+06 5,33E+06 7,78E+06 1,04E+07 1,86E+07 2,24E+07 1,57E+07 1,97E+07 2,11E+07 1,75E+07 1,75E+07 1,92E+07 3,13E+07 2,71E+07 1,77E+07 1,64E+07 1,61E+07 1,48E+07 2,01E+07 1,90E+07 1,34E+07 1,54E+07 9,93E+06 8,83E+06 8,44E+06 6,70E+06 Log Recuento 7,06 7,02 7,15 7,03 7,27 7,09 6,75 6,73 6,89 7,02 7,27 7,35 7,20 7,29 7,33 7,24 7,24 7,28 7,50 7,43 7,25 7,21 7,21 7,17 7,30 7,28 7,13 7,19 7,00 6,95 6,93 6,83 Media DS 6,96 0,21 7,28 0,06 7,32 0,12 7,21 0,07 6,97 0,09 70 Muestreo Ventana 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Fincas La Ramada La Ramada La Ramada La Ramada La Ramada La Ramada La Ramada La Ramada La Ramada La Ramada La Ramada La Ramada La Ramada La Ramada La Ramada La Ramada La Ramada La Ramada La Ramada La Ramada La Comarca La Comarca La Comarca La Comarca La Comarca La Comarca La Comarca La Comarca La Comarca La Comarca La Comarca La Comarca Coberturas Guadual Guadual Guadual Guadual Guadual Guadual Guadual Guadual Guadual Guadual Guadual Guadual Guadual Guadual Guadual Guadual Guadual Guadual Guadual Guadual Guadual Guadual Guadual Guadual Guadual Guadual Guadual Guadual Guadual Guadual Guadual Guadual Medio Replica a AIS b a b a NWRI b a b a b a R2A b a b a b a TSBA b a b a b a AIS b a b a b a NWRI b a b Recuento 1,23E+07 1,06E+07 1,52E+07 1,47E+07 2,02E+07 1,84E+07 1,24E+07 1,51E+07 2,29E+07 2,37E+07 1,29E+07 1,65E+07 1,98E+07 3,55E+07 1,10E+07 1,70E+07 1,49E+07 1,33E+07 1,74E+07 1,13E+07 5,30E+07 6,81E+07 1,47E+07 1,38E+07 1,86E+07 2,11E+07 1,41E+07 1,94E+07 1,80E+07 2,91E+07 2,88E+07 4,38E+07 Log Recuento 7,09 7,03 7,18 7,17 7,31 7,26 7,09 7,18 7,36 7,37 7,11 7,22 7,30 7,55 7,04 7,23 7,17 7,12 7,24 7,05 7,72 7,83 7,17 7,14 7,27 7,32 7,15 7,29 7,25 7,46 7,46 7,64 Media DS 7,20 0,08 7,32 0,15 7,14 0,09 7,41 0,30 7,38 0,18 71 Muestreo Ventana 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 Fincas La Comarca La Comarca La Comarca La Comarca La Comarca La Comarca La Comarca La Comarca La Comarca La Comarca La Comarca La Comarca La Comarca La Comarca La Comarca La Comarca La Comarca La Comarca La Comarca La Comarca La Comarca La Comarca La Comarca La Comarca La Comarca La Comarca La Comarca La Comarca La Comarca La Comarca La Comarca La Comarca Coberturas Guadual Guadual Guadual Guadual Guadual Guadual Guadual Guadual Guadual Guadual Guadual Guadual Guadual Guadual Guadual Guadual Guadual Guadual Guadual Guadual Guadual Guadual Guadual Guadual Guadual Guadual Guadual Guadual Guadual Guadual Guadual Guadual Medio Replica a b a R2A b a b a b a TSBA b a b a b a AIS b a b a b a NWRI b a b a b a R2A b a b a TSBA b Recuento 3,48E+07 2,06E+07 1,61E+07 2,05E+07 1,49E+07 1,33E+07 1,63E+07 1,79E+07 1,34E+07 1,09E+07 1,85E+07 1,78E+07 9,20E+06 5,09E+06 7,48E+06 3,93E+06 1,68E+07 1,85E+07 1,11E+07 9,20E+06 1,24E+07 1,48E+07 1,47E+07 1,37E+07 9,45E+06 7,14E+06 1,14E+07 1,04E+07 9,66E+06 1,20E+07 1,71E+07 1,65E+07 Log Recuento 7,54 7,31 7,21 7,31 7,17 7,12 7,21 7,25 7,13 7,04 7,27 7,25 6,96 6,71 6,87 6,59 7,23 7,27 7,05 6,96 7,09 7,17 7,17 7,14 6,98 6,85 7,06 7,02 6,99 7,08 7,23 7,22 Media DS 7,28 0,15 7,19 0,09 6,94 0,27 7,10 0,08 6,99 0,08 7,22 0,06 72 Muestreo Ventana 2 1 2 1 2 1 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 1 2 1 2 1 2 1 Fincas La Comarca La Comarca La Comarca La Comarca El Bolsillo El Bolsillo El Bolsillo El Bolsillo El Bolsillo El Bolsillo El Bolsillo El Bolsillo El Bolsillo El Bolsillo El Bolsillo El Bolsillo El Bolsillo El Bolsillo El Bolsillo El Bolsillo El Bolsillo El Bolsillo El Bolsillo El Bolsillo El Bolsillo El Bolsillo El Bolsillo El Bolsillo El Bolsillo El Bolsillo El Bolsillo El Bolsillo Coberturas Guadual Guadual Guadual Guadual CF SS CF SS CF SS CF SS CF SS CF SS CF SS CF SS CF SS CF SS CF SS CF SS CF SS CF SS CF SS CF SS CF SS CF SS CF SS CF SS CF SS CF SS CF SS CF SS CF SS CF SS CF SS CF SS Medio Replica a b TSBA a b a b a AIS b a b a b a NWRI b a b a b a R2A b a b a b a TSBA b a b a b AIS a b Recuento 1,32E+07 1,48E+07 1,83E+07 2,00E+07 1,66E+06 2,01E+06 5,97E+06 8,37E+06 3,69E+06 4,13E+06 7,04E+06 6,84E+06 8,30E+06 1,15E+07 1,31E+06 1,06E+06 8,78E+06 7,15E+06 1,38E+07 9,90E+06 1,09E+07 1,20E+07 7,35E+06 6,64E+06 1,21E+07 1,11E+08 6,79E+06 8,85E+05 1,01E+07 1,29E+07 9,82E+06 6,89E+06 Log Recuento 7,12 7,17 7,26 7,30 6,22 6,30 6,78 6,92 6,57 6,62 6,85 6,84 6,92 7,06 6,12 6,03 6,94 6,85 7,14 7,00 7,04 7,08 6,87 6,82 7,08 8,04 6,83 5,95 7,00 7,11 6,99 6,84 Media DS 6,57 0,27 6,63 0,44 7,01 0,10 6,93 0,67 6,93 0,15 73 Muestreo Ventana 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Fincas El Bolsillo El Bolsillo El Bolsillo El Bolsillo El Bolsillo El Bolsillo El Bolsillo El Bolsillo El Bolsillo El Bolsillo El Bolsillo El Bolsillo El Bolsillo El Bolsillo El Bolsillo El Bolsillo El Bolsillo El Bolsillo El Bolsillo El Bolsillo Alegria Alegria Alegria Alegria Alegria Alegria Alegria Alegria Alegria Alegria Alegria Alegria Coberturas CF SS CF SS CF SS CF SS CF SS CF SS CF SS CF SS CF SS CF SS CF SS CF SS CF SS CF SS CF SS CF SS CF SS CF SS CF SS CF SS CF SS CF SS CF SS CF SS CF SS CF SS CF SS CF SS CF SS CF SS CF SS CF SS Medio Replica a AIS b a b a NWRI b a b a b a R2A b a b a b a TSBA b a b a b a AIS b a b a b a NWRI b a b Recuento 4,82E+06 8,46E+06 2,10E+07 2,39E+07 2,73E+07 3,00E+07 3,19E+07 2,94E+07 1,65E+07 1,47E+07 1,38E+07 1,26E+07 1,51E+07 1,08E+07 1,20E+07 1,01E+07 9,82E+06 8,64E+06 1,13E+07 8,98E+06 2,40E+06 2,73E+06 6,87E+05 3,84E+06 1,88E+07 2,31E+07 6,30E+06 8,32E+06 2,70E+07 1,59E+07 8,71E+06 1,01E+07 Log Recuento 6,68 6,93 7,32 7,38 7,44 7,48 7,50 7,47 7,22 7,17 7,14 7,10 7,18 7,03 7,08 7,00 6,99 6,94 7,05 6,95 6,38 6,44 5,84 6,58 7,27 7,36 6,80 6,92 7,43 7,20 6,94 7,00 Media DS 7,43 0,07 7,14 0,06 7,00 0,06 6,65 0,58 7,05 0,23 74 Muestreo Ventana 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 Fincas Alegria Alegria Alegria Alegria Alegria Alegria Alegria Alegria Alegria Alegria Alegria Alegria Alegria Alegria Alegria Alegria Alegria Alegria Alegria Alegria Alegria Alegria Alegria Alegria Alegria Alegria Alegria Alegria Alegria Alegria Alegria Alegria Coberturas CF SS CF SS CF SS CF SS CF SS CF SS CF SS CF SS CF SS CF SS CF SS CF SS CF SS CF SS CF SS CF SS CF SS CF SS CF SS CF SS CF SS CF SS CF SS CF SS CF SS CF SS CF SS CF SS CF SS CF SS CF SS CF SS Medio Replica a b a R2A b a b a b a TSBA b a b a b a AIS b a b a b a NWRI b a b a b a R2A b a b a TSBA b Recuento 1,87E+06 1,65E+07 3,90E+07 2,09E+07 3,07E+07 2,70E+07 1,72E+07 1,38E+06 7,79E+05 6,21E+05 1,44E+06 1,09E+06 5,15E+06 3,83E+06 4,87E+06 7,24E+05 6,69E+06 1,39E+07 2,53E+07 2,71E+07 1,54E+07 1,80E+07 2,13E+07 2,34E+07 1,13E+07 1,03E+07 1,44E+07 1,64E+07 1,40E+07 1,20E+07 7,55E+06 6,83E+06 Log Recuento 6,27 7,22 7,59 7,32 7,49 7,43 7,24 6,14 5,89 5,79 6,16 6,04 6,71 6,58 6,69 5,86 6,83 7,14 7,40 7,43 7,19 7,26 7,33 7,37 7,05 7,01 7,16 7,21 7,15 7,08 6,88 6,83 Media DS 7,22 0,48 6,21 0,52 6,63 0,43 7,33 0,09 7,11 0,08 6,95 0,08 75 Muestreo Ventana 2 1 2 1 2 1 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 1 2 1 Fincas Alegria Alegria Alegria Alegria Bremen Bremen Bremen Bremen Bremen Bremen Bremen Bremen Bremen Bremen Bremen Bremen Bremen Bremen Bremen Bremen Bremen Bremen Bremen Bremen Bremen Bremen Bremen Bremen Bremen Bremen Coberturas CF SS CF SS CF SS CF SS Bosque Bosque Bosque Bosque Bosque Bosque Bosque Bosque Bosque Bosque Bosque Bosque Bosque Bosque Bosque Bosque Bosque Bosque Bosque Bosque Bosque Bosque Bosque Bosque Bosque Bosque Medio Replica a b TSBA a b a b a AIS b a b a b a NWRI b a b a b a R2A b a b a b a TSBA b a b a AIS b Recuento 1,06E+07 1,09E+07 8,67E+06 9,78E+06 1,25E+06 1,28E+06 1,14E+06 1,43E+06 1,82E+06 1,75E+06 1,78E+06 2,08E+06 1,43E+06 1,65E+06 2,96E+06 3,81E+06 2,26E+07 6,52E+06 1,90E+07 1,97E+07 1,72E+07 1,99E+07 1,23E+06 9,60E+05 1,92E+06 1,56E+06 1,39E+06 1,22E+06 1,27E+07 7,94E+06 Log Recuento 7,02 7,04 6,94 6,99 6,10 6,11 6,06 6,16 6,26 6,24 6,25 6,32 6,16 6,22 6,47 6,58 7,36 6,81 7,28 7,30 7,24 7,30 6,09 5,98 6,28 6,19 6,14 6,09 7,10 6,90 Media DS 6,15 0,08 6,33 0,16 7,21 0,20 6,13 0,10 7,04 0,12 76 Muestreo Ventana 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Fincas Bremen Bremen Bremen Bremen Bremen Bremen Bremen Bremen Bremen Bremen Bremen Bremen Bremen Bremen Bremen Bremen Bremen Bremen Bremen Bremen Bremen Bremen Villa Ximena Villa Ximena Villa Ximena Villa Ximena Villa Ximena Villa Ximena Villa Ximena Villa Ximena Villa Ximena Coberturas Bosque Bosque Bosque Bosque Bosque Bosque Bosque Bosque Bosque Bosque Bosque Bosque Bosque Bosque Bosque Bosque Bosque Bosque Bosque Bosque Bosque Bosque Pastizal Pastizal Pastizal Pastizal Pastizal Pastizal Pastizal Pastizal Pastizal Medio Replica a b AIS a b a b a NWRI b a b a b a R2A b a b a b a TSBA b a b a b a AIS b a b a NWRI b a Recuento 1,29E+07 1,60E+07 7,84E+06 1,12E+07 1,75E+07 1,46E+07 2,34E+07 2,52E+07 1,68E+07 1,79E+07 1,64E+07 1,32E+07 1,51E+07 1,34E+07 2,24E+07 1,94E+07 1,71E+07 1,34E+07 1,65E+07 1,11E+07 1,98E+07 1,21E+07 3,48E+06 4,74E+06 1,44E+07 1,16E+07 9,21E+06 1,07E+07 1,41E+06 1,47E+06 6,66E+06 Log Recuento 7,11 7,20 6,89 7,05 7,24 7,17 7,37 7,40 7,23 7,25 7,22 7,12 7,18 7,13 7,35 7,29 7,23 7,13 7,22 7,04 7,30 7,08 6,54 6,68 7,16 7,06 6,96 7,03 6,15 6,17 6,82 Media DS 7,28 0,09 7,21 0,09 7,17 0,10 6,91 0,24 6,80 0,53 77 Muestreo Ventana 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 Fincas Villa Ximena Villa Ximena Villa Ximena Villa Ximena Villa Ximena Villa Ximena Villa Ximena Villa Ximena Villa Ximena Villa Ximena Villa Ximena Villa Ximena Villa Ximena Villa Ximena Villa Ximena Villa Ximena Villa Ximena Villa Ximena Villa Ximena Villa Ximena Villa Ximena Villa Ximena Villa Ximena Villa Ximena Villa Ximena Villa Ximena Villa Ximena Villa Ximena Villa Ximena Villa Ximena Villa Ximena Villa Ximena Coberturas Pastizal Pastizal Pastizal Pastizal Pastizal Pastizal Pastizal Pastizal Pastizal Pastizal Pastizal Pastizal Pastizal Pastizal Pastizal Pastizal Pastizal Pastizal Pastizal Pastizal Pastizal Pastizal Pastizal Pastizal Pastizal Pastizal Pastizal Pastizal Pastizal Pastizal Pastizal Pastizal Medio Replica b NWRI a b a b a R2A b a b a b a TSBA b a b a b a AIS b a b a b a NWRI b a b a b R2A a b a Recuento 9,18E+06 1,84E+07 2,53E+07 1,44E+07 1,25E+06 1,01E+07 1,33E+07 1,82E+06 1,59E+07 1,25E+07 1,15E+07 8,28E+06 7,02E+06 3,61E+06 5,42E+06 8,37E+06 7,54E+06 1,24E+07 1,21E+07 1,16E+07 1,05E+07 7,96E+06 7,82E+06 8,96E+06 1,02E+07 8,43E+06 9,20E+06 7,82E+06 7,96E+06 1,02E+07 8,96E+06 9,20E+06 Log Recuento 6,96 7,27 7,40 7,16 6,10 7,00 7,12 6,26 7,20 7,10 7,06 6,92 6,85 6,56 6,73 6,92 6,88 7,09 7,08 7,07 7,02 6,90 6,89 6,95 7,01 6,93 6,96 6,89 6,90 7,01 6,95 6,96 Media DS 6,81 0,49 6,87 0,20 7,01 0,09 6,94 0,04 6,94 0,04 78 Muestreo Ventana 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 Fincas Villa Ximena Villa Ximena Villa Ximena Villa Ximena Villa Ximena Villa Ximena Villa Ximena Coberturas Medio Replica R2A Pastizal b Pastizal a Pastizal b Pastizal a TSBA Pastizal b Pastizal a Pastizal b Recuento 8,43E+06 5,08E+06 3,98E+06 7,32E+06 7,47E+06 7,54E+06 9,96E+06 Log Recuento 6,93 6,71 6,60 6,86 6,87 6,88 7,00 Media DS 6,82 0,14 79 ANEXO F. Distribución de los recuentos en medios de cultivo. Comparación de medias utilizando Tukey-Kramer. Cuenca del río La Vieja BOSQUE 7 Log UFC/gps 6 AIS NWRI R2A TSBA Medio de cultivo All Pairs Tukey-Kramer 0.05 Comparación de medias usando Tukey-Kramer HSD q* 2.61824 Abs(Dif)-LSD R2A R2A NWRI TSBA AIS -0.33651 0.04680 0.18846 0.27305 NWRI 0.04680 -0.31477 -0.17311 -0.08852 TSBA 0.18846 -0.17311 -0.31477 -0.23019 AIS 0.27305 -0.08852 -0.23019 -0.31477 Los valores positivos muestran diferencias significativas entre las medias. 80 PASTIZAL 8 Log UFC/gps 7 6 AIS NWRI R2A TSBA Medio de cultivo All Pairs Tukey-Kramer 0.05 Comparación de medias usando Tukey-Kramer HSD q* 2.61662 Abs(Dif)-LSD R2A R2A TSBA NWRI AIS -0.21448 -0.08156 -0.07698 -0.05114 TSBA -0.08156 -0.21448 -0.20989 -0.18406 NWRI -0.07698 -0.20989 -0.21448 -0.18864 AIS -0.05114 -0.18406 -0.18864 -0.21448 Los valores positivos muestran diferencias significativas entre las medias. 81 GUADUAL 7.9 7.7 7.5 Log UFC/gps 7.3 7.1 6.9 6.7 6.5 AIS NWRI R2A TSBA Medio de cultivo All Pairs Tukey-Kramer 0.05 Comparación de medias usando Tukey-Kramer HSD q* 2.61662 Abs(Dif)-LSD NWRI R2A TSBA AIS NWRI -0.14471 -0.13471 -0.09804 0.02362 R2A -0.13471 -0.14471 -0.10804 0.01362 TSBA -0.09804 -0.10804 -0.14471 -0.02304 AIS 0.02362 0.01362 -0.02304 -0.14471 Los valores positivos muestran diferencias significativas entre las medias. 82 CAFETAL SIN SOMBRÍO 8 Log UFC/gps 7 6 AIS NWRI R2A TSBA Medio de cultivo All Pairs Tukey-Kramer 0.05 Comparación de medias usando Tukey-Kramer HSD q* 2.61662 Abs(Dif)-LSD R2A NWRI TSBA AIS R2A -0.30206 -0.29414 0.04419 0.12419 NWRI -0.29414 -0.30206 0.03628 0.11628 TSBA 0.04419 0.03628 -0.30206 -0.22206 AIS 0.12419 0.11628 -0.22206 -0.30206 Los valores positivos muestran diferencias significativas entre las medias. 83 Cuenca del río El Otún CEBOLLA 7 Log UFC/gps 6 AIS NWRI R2A TSBA Medio de cultivo All Pairs Tukey-Kramer 0.05 Comparación de medias usando Tukey-Kramer HSD q* 2.61662 Abs(Dif)-LSD NWRI R2A AIS TSBA NWRI -0.27017 -0.15142 -0.08058 0.04275 R2A -0.15142 -0.27017 -0.19933 -0.07600 AIS -0.08058 -0.19933 -0.27017 -0.14683 TSBA 0.04275 -0.07600 -0.14683 -0.27017 Los valores positivos muestran diferencias significativas entre las medias. 84 BOSQUE Log UFC/gps 7 AIS NWRI R2A TSBA Medio de cultivo All Pairs Tukey-Kramer 0.05 Comparación de medias usando Tukey-Kramer HSD q* 2.61662 Abs(Dif)-LSD R2A R2A NWRI TSBA AIS -0.28263 -0.23554 -0.10846 -0.04971 NWRI -0.23554 -0.28263 -0.15554 -0.09679 TSBA -0.10846 -0.15554 -0.28263 -0.22388 AIS -0.04971 -0.09679 -0.22388 -0.28263 Los valores positivos muestran diferencias significativas entre las medias. 85 GUADUAL 8 Log UFC/gps 7 6 AIS NWRI R2A TSBA Medio de cultivo All Pairs Tukey-Kramer 0.05 Comparación de medias usando Tukey-Kramer HSD q* 2.61662 Abs(Dif)-LSD NWRI AIS R2A TSBA NWRI -0.28600 0.00942 0.03525 0.17734 AIS 0.00942 -0.28600 -0.26016 -0.11808 R2A 0.03525 -0.26016 -0.28600 -0.14391 TSBA 0.17734 -0.11808 -0.14391 -0.28600 Los valores positivos muestran diferencias significativas entre las medias. 86 FORESTALES 7 Log UFC/gps 6 AIS NWRI R2A TSBA Medio de cultivo All Pairs Tukey-Kramer 0.05 Comparación de medias usando Tukey-Kramer HSD q* 2.61662 Abs(Dif)-LSD R2A TSBA NWRI AIS R2A -0.39740 -0.18906 -0.13073 -0.04406 TSBA -0.18906 -0.39740 -0.33906 -0.25240 NWRI -0.13073 -0.33906 -0.39740 -0.31073 AIS -0.04406 -0.25240 -0.31073 -0.39740 Los valores positivos muestran diferencias significativas entre las medias. 87 ANEXO G. Libreta de campo Características sitios de muestreo Cuenca del río La Vieja Finca La Ilusión (Bosque) Presencia de árboles de gran altura con raíces tubulares, con un diámetro de altura del pecho superior a los 2m. Los tres cuadrantes del muestreo se ubicaron en la falda occidental del parche del bosque. La ramada (Pastizal) El pastizal tiene una antigüedad cercana a los 20 años. Se aprovecha para ganado Cebú de leche. La ramada (Guadual) Fragmento de guadual asociado al curso de agua, cuyo cause esta en la parte baja de un barranco empinado. La mayoría del guadual esta al costado occidental. La cobertura corresponde a grupos de pocas guaduas en la orilla de la quebrada La comarca (Guadual) Finca con amplios jardines, sectores de guadual y un lago con lodos. El guadual del muestreo se localiza a lado y lado de una quebrada de aproximadamente 10 m de ancho. La extensión del guadual es de más de 50 m de ancho con una leve pendiente. El bolsillo (Cafetal sin sombrío) Esta finca tiene sectores de cafetal antiguo, donde se encuentra cafetal sin sombrío por lo menos desde hace 25 años. Una parte de la finca presentó cafetal con plátano en un sector con una pendiente considerable (30º) y en otro cultivos de plátano y yuca. Además presenta ganado lanar de subsistencia. El cafetal con sombrío donde se tomaron las primeras muestras tubo predominio de gusanos en el dosel laxo; el sotobosque presenta algunas moráceas y el piso estaba tapizado conbalsaminaceas, conmelinas, verbenaceas y gesneriaceas adhesivas. El terreno era plano. Se le aplican agroquímicos y existe la presencia de broca. 88 La alegría (Cafetal sin sombrío) Presente un cafetal con plátano y una densa y gruesa capa de hojarasca con grandes aportes de plátano. Tiene una antigüedad de 35 años. El terreno es más o menos pendiente cerca del río. Se aplican agroquímicos de la variedad caturro. Bremen (Bosque) El sector del muestreo esta en la horilla del sendero didactivo en un terreno poco inclinado (4º) con un sotobosque denso. El diámetro a la altura de pecho de la mayoría de los individuos es menor a los 10 cm y los individuos mayores tienen un diámetro de hasta 70 cm. Existe un reclutamiento importante de moráceas. Existen helechos con un diámetro de 10 cm de una altura de 3,5 m. Helechos con vernación húmeda y viscosa de 50 a 70 cm de alto. Villa Ximena (Pastizal) Producción de leche tecnificada. En un terreno mas o menos plano con pasto alto. Algunos árboles de sombra ubicados a la orilla del camino. Cuadrantes descubiertos. Ventana El Otún Santa Helena (Bosque) Relicto de bosque suscesional, reconocido localmente como un rastrojo. Ubicado en la parte alta del valle en este sector de la cuenca, al borde de la carretera. Mandalay (Guadual) Guadual en la vega del río. Cobertura uniforme con abunante presencia hojas de guadua en el suelo. Yemas espinosas. Las cepas de los individuos conforman un dosel largo y discontinuo de aproximadamente 7 metros de altura. Los tres cuadrantes distan entre si por 100 m. Playa rica (Forestal) Plantación forestal de ciprés a lo largo de varias colinas a 2106 msnm. Sotobosque completamente despejado. Árboles jóvenes de ciprés con diámetro a la altura del pecho de 20 a 50 cm. El piso tiene un tapete continuo de hojas de ciprés y varios montones de ramas. El segundo cuadrante se tomó de un valle a un estado sucecional avanzado. 89 Lisbrán (Forestal) Plantación de pinos de más o menos 15 m de alto con un diámetro a la altura al pecho de 20 a 60 cm Variables fisicoquímicas Primer evento de muestreo Finca La Granja (Bosque) La Ramada (Pastizal) La Ramada (Guadual) La Comarca (Guadual) El Bolsillo (Cafetal sin sombrío) La Alegría (Cafetal sin sombrío) Bremen (Bosque) Villa Ximena (Pastizal) Macarena (Cebolla) Santa Helena (Bosque) Punto P1 P2 P3 P1 P2 P3 P1 P2 P3 P1 P2 P3 P1 P2 P3 P1 P2 P3 P1 P2 P3 P1 P2 P3 P1 P2 P3 P1 P2 P3 Densidad Temperatura cobertura °C vegetal 21,8 96,38 22,1 94,288 21,8 91,56 27,8 1,61 24,6 0,784 27,9 0,368 22,4 22,3 22,1 22,3 22 22,2 22,2 23,8 23 22,2 22,9 23,4 17,7 18,1 17,9 22,6 22,7 22,9 22,1 22,1 22,7 18,7 18,9 18,9 90,796 90,952 94,332 92,096 96,412 91,888 96,204 37,704 83,1 94,956 94,228 92,096 95,528 96,464 97,4 85,752 83,34 82,164 85,752 83,34 82,164 95,788 86,584 97,92 Hojarasca o altura de pasto (cm) pH* 0,9 1 3,1 20,4 23,4 8,6 5,1 5,2 5,9 4,8 10,3 5,7 3 2 3,6 22,2 4 0,7 5,76 10,9 3 11,56 38,2 24,6 11,56 38,2 24,6 2,1 4,8 3,9 5,8 6,16 6,18 5,46 5,62 3,55 5,74 5,74 5,71 5,51 5,56 5,11 5,42 5,46 5,14 5,47 5,84 5,01 4,66 3,74 4,15 5,52 5,1 5,89 5,84 6,2 6,09 4,78 4,86 4,86 90 Bella Vista (Cebolla) Mandalay (Cebolla) La Playa (Guadual) Playa Rica (Forestales) Lisbrán (Forestales) La Pastora (Bosque) P1 P2 P3 P1 P2 P3 P1 P2 P3 P1 P2 P3 P1 P2 P3 P1 P2 P3 24,6 23,5 23,56 19,3 19,3 19,1 18,7 19,1 18 21,2 20,9 22,4 20 20,54 19,7 15,8 16,2 16,3 2,24 0,628 1.2 96,256 84,66 92,98 92,616 88,456 92,98 76,704 69,788 61,884 75,248 82,424 82,892 95,06 93,708 91,212 41,8 48,4 52,2 4,1 5 2,4 0,6 2,4 1,2 0,4 0,58 0,6 9 5,6 5 2,2 3,3 2,1 6,56 6,14 5,93 5,56 5,78 5,71 5,16 5,24 5,45 5,2 4,65 5,1 4,22 4,41 3,85 5,85 5,95 5,88 * Variable determinada en USBA Segundo evento de muestreo Finca La Granja (Bosque) La Ramada (Pastizal) La Ramada (Guadual) La Comarca (Guadual) El Bolsillo (Cafetal sin sombrío) Punto P1 P2 P3 P1 P2 P3 P1 P2 P3 P1 P2 P3 P1 P2 P3 Temperatura °C 21,3 18,3 22 26,2 26 26 23,4 22,8 23 23 22,6 22,6 21,8 21,8 22 Densidad cobertura vegetal 96 98,7 95,94 0,32 0,21 0,21 96,88 96,57 95,94 99,32 97,71 96,98 93,5 87,88 74,05 Hojarasca o altura de pasto (cm) 1,4 3,1 1,9 26,8 21,8 30,8 5 6,2 4,6 11 11,4 6 3,2 3,7 2,2 pH * 5,85 5,88 5 6,43 6,35 6,21 6,37 6,46 6,4 6,25 6,2 6,17 5,95 5,59 6,12 91 La Alegría (Cafetal sin sombrío) Bremen (Bosque) Villa Ximena (Pastizal) Macarena (Cebolla) Santa Helena (Bosque) Bella Vista (Cebolla) Mandalay (Cebolla) La Playa (Guadual) Playa Rica (forestales) Lisbrán (forestales) La Pastora (Bosque) P1 P2 P3 P1 P2 P3 P1 P2 P3 P1 P2 P3 P1 P2 P3 P1 P2 P3 P1 P2 P3 P1 P2 P3 P1 P2 P3 P1 P2 P3 P1 P2 P3 23,4 23 23 95,06 97,3 97,76 20,4 21,6 20,8 18,7 19,6 23,8 16,3 18,5 15,1 23,7 20,9 20,8 ND 16,2 17 95,11 ND 95,11 16,3 19,4 19,7 17,9 18,9 19,6 11,9 11,8 11,6 91,11 96,67 90,17 5,6 7,2 4,5 80,03 61,52 69,01 ND ND ND ND ND ND 82,53 0,16 28,03 ND 98,7 98,13 16 ND 16 72,23 81,18 87,52 86,95 90,64 74,94 ND ND ND 5,6 3,4 2,8 18,1 18 18 29 13,8 20 43,28 34,8 42,3 9,3 4,9 5,2 50,9 54,2 56,4 ND 98,7 98,13 5,3 ND 8,2 6,2 0,8 0,7 4 6,3 4,3 5,2 2,8 4,1 5,66 6,6 6,55 5,28 5,06 5,01 4,4 5,1 5,68 5,92 6,12 6,03 6,07 5,63 5,57 5,63 5,82 5,83 6,03 6,06 6,01 5,67 5,72 5,8 5,56 5,52 5,84 5,12 5,52 4,98 5,88 5,81 5,84 ND: No determinado * Variable determinada en USBA 92 ANEXO H. Correlación de variables fisicoquímicas con el recuento de heterótrofos Análisis no paramétrico: Test de Spearman Variable by Variable Prob>|Rho| Temperatura pH pH Hojarasca Hojarasca Hojarasca Heterótrofos Heterótrofos Heterótrofos Heterótrofos %H %H Temperatura %H Temperatura pH %H Temperatura pH Hojarasca 0,0028 <.0001 0,0088 0,8669 0,3905 0,6314 0,3140 0,2963 0,6332 0,0938 Índice Rho menor a 0.05 indica correlación entre las variables 93 ANEXO I. RECUENTOS MEDIO R2A Muestreo 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 Ventana La Vieja La Vieja La Vieja La Vieja La Vieja La Vieja La Vieja La Vieja El Otún El Otún El Otún El Otún El Otún El Otún El Otún El Otún La Vieja La Vieja La Vieja La Vieja La Vieja La Vieja La Vieja La Vieja El Otún El Otún El Otún El Otún El Otún El Otún El Otún El Otún Sistema productivo Cultivos mixtos Cultivos mixtos Cultivos mixtos Ganadería de carne Ganadería de carne Ganadería de carne Ganadería de leche Ganadería de leche Áreas protegidas Cultivos mixtos Cultivos mixtos Cultivos mixtos Cultivos mixtos Cultivos mixtos Plantaciones forestales Plantaciones forestales Cultivos mixtos Cultivos mixtos Cultivos mixtos Ganadería de carne Ganadería de carne Ganadería de carne Ganadería de leche Ganadería de leche Áreas protegidas Cultivos mixtos Cultivos mixtos Cultivos mixtos Cultivos mixtos Cultivos mixtos Plantaciones forestales Plantaciones forestales Cobertura CFSSb CFSS Guadual Guadual Bosque Bosque Pastizal Pastizal Bosque Bosque Cebolla Cebolla Guadual Guadual Forestales Forestales CF SS CF SS Guadual Guadual Bosque Bosque Pastizal Pastizal Bosque Bosque Cebolla Cebolla Guadual Guadual Forestales Forestales Finca El Bolsillo Alegría La Comarca La Ramada Bremen La Granja La Ramada Villa Ximena La Pastora Santa Helena Macarena Bella Vista Mandalay La Playa Playa Rica Lisbrán El Bolsillo Alegría La Comarca La Ramada Bremen La Granja La Ramada Villa Ximena La Pastora Santa Helena Macarena Bella Vista Mandalay La Playa Playa Rica Lisbrán Log UFCc/gps 7.01 ± 0.10 7.22 ± 0.48 7.28 ± 0.15 7.32 ± 0.12 7.21 ± 0.20 6.89 ± 0.59 7.40 ± 0.39 6.81 ± 0.49 6.46 ± 0.08 7.58 ± 0.08 6.87 ± 0.11 6.87 ± 0.47 6.87 ± 0.46 6.68 ± 0.42 6.37 ± 0.38 6.94 ± 0.26 7.14 ± 0.06 7.11 ± 0.08 6.99 ± 0.88 7.32 ± 0.15 7.21 ± 0.09 7.30 ± 0.07 7.15 ± 0.46 6.94 ± 0.04 6.72 ± 0.28 7.23 ± 0.07 7.04 ± 0.12 7.19 ± 0.14 7.24 ± 0.45 6.97 ± 0.37 7.23 ± 0.03 7.25 ± 0.12 94 ANEXO J. CARACTERIZACIÓN MICROSCÓPICA DE COLONIAS EN MEDIO R2A La Vieja Evento de muestreo 1 Bosque 23 3 9 29 CF SS 27 8 6 41 Guadual 25 0 5 30 Pastizal 19 11 15 45 Total general 94 22 35 151 Coloración de c Bosque Gram negativo 16 Gram positivo 19 Total general 35 CF SS 21 20 41 Guadual 19 11 30 Pastizal 18 27 45 Total general 74 77 151 Morfología Bacilo Coco Coco bacilo Total general La Vieja Evento de muestreo 2 Morfología Bacilo Coco Coco bacilo Total general Bosque 27 5 8 40 Coloración de Gram Gram negativo Gram positivo Total general Bosque 14 26 40 CF SS 23 5 6 34 CF SS 16 18 34 Guadual 19 3 12 34 Guadual 20 14 34 Pastizal 33 4 14 51 Pastizal 20 31 51 Total general 102 17 40 159 Total general 70 89 159 El Otún Evento de muestreo 1 Morfologia Bacilo Coco Coco bacilo Total general Bosque 16 5 5 26 Cebolla 21 3 9 33 Forestales 19 7 3 29 Guadual 20 2 6 28 Total general 76 17 23 116 xcv Coloración de Gram Gram negativo Gram positivo Total general Bosque 7 19 26 Cebolla 14 19 33 Forestales 7 22 29 Guadual 12 16 28 Total general 40 76 116 El Otún Evento de muestreo 2 Morfología Bacilo Coco Coco bacilo Total general Bosque 16 7 5 28 Cebolla 31 5 5 42 Forestales 21 10 2 33 Guadual 23 2 7 32 Total general 91 24 19 135 Coloración de Gram Gram negativo Gram positivo Total general Bosque 8 20 28 Cebolla 13 29 42 Forestales 5 28 33 Guadual 14 18 32 Total general 40 95 135 . . . . ANEXO K. DIFERENCIAS DE LOS RECUENTOS ENTRE COBERTURAS Primer evento de muestreo xcvi ANEXO K. DIFERENCIAS DE LOS RECUENTOS ENTRE COBERTURAS Primer evento de muestreo Cuenca del río La Vieja 8 Log UFC/gps 7 6 Bosque CF SS Guadual Pastizal Cobertura Wilcoxon / Kruskal-Wallis Tests (Rank Sums) Level Count Score Sum Score Mean (Mean-Mean0)/Std0 Bosque 12 292,5 24,3750 -0,024 CF SS 12 266 22,1667 -0,655 Guadual 12 372,5 31,0417 1,858 Pastizal 12 245 20,4167 -1,155 Prueba de Chi cuadrado ChiSquare 3,9788 DF 3 Prob>ChiSq 0,2638 xcvii Segundo evento de muestreo Cuenca del río La Vieja 7,6 7,5 7,4 Log UFC/gps 7,3 7,2 7,1 7 6,9 6,8 Bosque CF SS Guadual Pastizal Cobertura Wilcoxon / Kruskal-Wallis Tests (Rank Sums) Level Count Score Sum Score Mean (Mean-Mean0)/Std0 Bosque 12 400,5 33,3750 2,525 CF SS 12 257 21,4167 -0,869 Guadual 12 281,5 23,4583 -0,286 Pastizal 12 237 19,7500 -1,346 Prueba de Chi cuadrado ChiSquare DF Prob>ChiSq 6,8578 3 0,0766 xcviii Primer evento de muestreo Cuenca del río Otún 7 Log UFC/gps 6 Bosque Cebolla Forestales Guadual Cobertura Wilcoxon / Kruskal-Wallis Tests (Rank Sums) Level Count Score Sum Score Mean (Mean-Mean0)/Std0 Bosque 12 353,5 29,4583 1,405 Cebolla 12 311,5 25,9583 0,405 Forestales 12 232 19,3333 -1,465 Guadual 12 279 23,2500 -0,345 Prueba de Chi cuadrado ChiSquare DF Prob>ChiSq 3,3676 3 0,3383 xcix Segundo evento de muestreo Cuenca del río Otún 7,6 7,4 7,2 Log UFC/gps 7 6,8 6,6 6,4 6,2 Bosque Cebolla Forestales Guadual Cobertura Wilcoxon / Kruskal-Wallis Tests (Rank Sums) Level Count Score Sum Score Mean (Mean-Mean0)/Std0 Bosque 12 240 20,0000 -1,275 Cebolla 12 238 19,8333 -1,322 Forestales 12 374,5 31,2083 1,906 Guadual 12 323,5 26,9583 0,691 Prueba de Chi cuadrado ChiSquare 5,7055 DF 3 Prob>ChiSq 0,1269 c ANEXO L. DIFERENCIAS DE LAS ABUNDANCIAS RELATIVAS ENTRE LAS COBERTURAS Cuenca del río la Vieja Análisis de una vía Anova Análisis de Varianza Source DF Sum of Squares Mean Square F Ratio Prob > F Cobertura 3 1,2005000 0,400167 0,795825 Error 4 3,1833000 C. Total 7 4,3838000 0,5028 0,7006 ci Cuenca del río El Otún Análisis de una vía Anova Análisis de Varianza Source DF Sum of Squares Mean Square F Ratio Prob > F Cobertura 3 3,469338 1,15645 3,54594 Error 4 14,183750 C. Total 7 17,653087 0,3261 0,8079 cii ANEXO M. DIFERENCIAS DE LOS RECUENTOS ENTRE EVENTOS DE MUESTREO Cuenca del río La Vieja 8 Log UFC/gps 7 6 1 2 Evento de muestreo Wilcoxon / Kruskal-Wallis Tests (Rank Sums) Level Count Score Sum Score Mean (Mean-Mean0)/Std0 1 48 2454 51,1250 0,920 2 48 2202 45,8750 -0,920 Prueba de Chi cuadrado ChiSquare DF Prob>ChiSq 0,8529 1 0,3557 ciii Cuenca del río Otún 7 Log UFC/gps 6 1 2 Evento de muestreo Wilcoxon / Kruskal-Wallis Tests (Rank Sums) Level Count Score Sum Score Mean (Mean-Mean0)/Std0 1 48 1824 38,0000 -3,690 2 48 2832 59,0000 3,690 Prueba de Chi cuadrado ChiSquare DF Prob>ChiSq 13,6448 1 0,0002 civ