Uso del pez cebra como animal modelo para estudios de
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Uso del pez cebra como animal modelo para estudios de nanotoxicidad Sandra Rainieri srainieri@azti.es JORNADA “NANOTECNOLOGÍA Y ALIMENTACIÓN” 1 Junio 2015 ©AZTI 6/2/2015 1 Toxicidad NP metálicas In vitro Estrés oxidativo Inflamación Apoptosis … Mecanismo de acción no siempre claro Faltan protocolos estandarizados y resultados uniformes Pocos estudios in vivo y a largo plazo ©AZTI 6/2/2015 2 Modelos animales para estudios de toxicidad • Los ensayos de toxicidad son obligatorios para cada aditivo / nuevo ingrediente • Los procedimiento estándar incluyen ensayo in vitro e in vivo • Los estudios con animales son caro, complicados, low-throughput y éticamente problemáticos Solución: utilizar sistemas alternativos para llevar a cabo ensayos iniciales. Invertebrados Embriones ©AZTI 6/2/2015 3 Pez cebra (Danio rerio) • • • • • Fácil y económico de mantener Reproducción externa Embriones transparente Herramientas genética Test alternativos MODELO RECONOCIDO • • • • • • Biología del desarrollo Enfermedades humanas Desarrollo de medicamentos Eco-toxicología Investigación alimentaria Acuicultura Zebrafish 5 hpf 48 hpf 5 hpf 120 hpf Alimentación espontanea (ANIMAL) ©AZTI 6/2/2015 © AZTI-Tecnalia. Todos los derechos reservados.© AZTI-Tecnalia. Todos los derechos reservados. 4 Estudios in vivo alternativos al uso de animales Inflamación- cepa transgénica expresa mieloperoxidasa (mpx). que Estrés oxidativo – tinción con fluoróforo que detecta producción de ROS. Además, estimación daño oxidativo (peroxidación lipidica, daño proteinas, ADN….). Apoptosis – tinción con fluoróforo que detecta muerte celular programada. ©AZTI 6/2/2015 5 Estudios in vivo alternativos al uso de animales Absorción / Bioacumulación Olasagasti et al., J. Appl. Toxicol., 2014 López-Serrano et al., Nanotoxicology., 2014 Espresión genica – genes individuales o mediante array. ©AZTI 6/2/2015 6 Fases de un estudio de nanotoxicidad • Caracterización físico – química de las NPs con diferentes técnicas (a T0 y durante el experimento). • Definición de un protocolo de exposición adecuado. • Evaluación del absorción y distribución en el sistema biológico utilizado (durante el experimento). • Evaluación de end-points de toxicidad específicos. ©AZTI 6/2/2015 7 Estudio sobre la toxicidad de AgNPs comerciales Objetivos del trabajo: 1) Definir un protocolo adecuado para la evaluación de la toxicidad de NPs metálicas con embriones de pez cebra. 2) Clarificar si la toxicidad se debe a NPs o a liberación de Ag+. 3) Verificar si existen biomarcadores de toxicidad comunes entre diferentes tipos de AgNPs. ©AZTI 6/2/2015 8 Fase 1: definición protocolo exposición 96h OECD 236 (FET test) Protocolo 1 4hpf-48hpf Protocolo 2 72hpf-120hpf 48h 48h Protocolo 3 96hpf-120hpf nAg coloidal 24h Absorción y distribución Olasagasti et al., J. Appl. Toxicol., 2014 ©AZTI 6/2/2015 9 Fase 2: NPs vs Ag+ Embryo water nAg coloidal Polytech & Net y AgNO3 Agua desionizada • Toxicidad aguda • Expresión génica Ag+ (complejos con aniones) = NO efecto Ag+ (NO complejos) = efecto 100 % Mortality 80 60 nAg deionized water 40 nAg embryo water 20 0 0.01 ppm 1 ppm 5 ppm nAg concentration Olasagasti et al., J. Appl. Toxicol., 2014 ©AZTI 6/2/2015 10 NP vs Ag+ AgNPs vs AgNO3 (agua desionizada) Análisis transcriptómico Genes inducidos/ reprimidos !! NO genes comunes!! Mecanismo diferente Procesos biológicos 1 proceso común: “cellular macromolecule metabolic process” Mecanismo diferente Rutas metabólicas 1 en común Metabolismo lipídico Mecanismo diferente ©AZTI 6/2/2015 11 NP vs Ag+ • Toxicidad de las AgNPs debida al tamaño nano y a la liberación de iones. • El mecanismo de acción de las AgNPs depende del medio y de la concentración. ©AZTI 6/2/2015 12 Fase 3: Comparación efectos diferentes AgNPs Nanoplata coloidal Polytech & Net 100 LC50 6.24 ppm 80 % Mortality 19.05nm 60 40 20 0 0.01 ppm AgNPs SIGMA + citrato 1 ppm 5 ppm 7 ppm 11 ppm 15 ppm 120 % Mortality 100 80 60 40 LC50 1.07 ppm 20 10.82 nm 0 0,093 ppm 0,1875 ppm 0,375 ppm 0,75 ppm Suplemento alimentario 1,5 ppm 3 ppm 100 Mortality % 80 5.9 nm LC50 0.076 ppm 60 40 20 0 Más toxico! ©AZTI 6/2/2015 0,05625 ppm 0,1125 ppm 0,225 ppm 0,45 ppm 13 0,9 ppm Comparación efectos diferentes AgNPs Expresión diferencial de genes seleccionados Products NPs Ag mt il1β slc16a9a opn1mw2 ucp3 nAg colloidal Polytech & Net NPs Ag Sigma Supplement nAg up-regulated (p<0.01) down-regulated ©AZTI 6/2/2015 14 Comparación efectos diferentes AgNPs • El nivel de toxicidad y las rutas metabólicas afectadas dependen del tipo de AgNPs ©AZTI 6/2/2015 15 Conclusiones • En estudios de nanotoxicidad es fundamental definir un protocolo de exposición adecuado. • El medio de disolución influye en la toxicidad de las AgNPs. • La toxicidad de las AgNPs es debida en parte al tamaño nano y en parte a la liberación de Ag+. • No se han detectado biomarcadores específicos para la detección de toxicidad de los tres tipos de las AgNPs estudiadas. ©AZTI 6/2/2015 16 Equipo toxicidad y pez cebra AZTI Alex Barranco Nagore Egurrola Nadia Conlledo M. Jose Sierra Monica Martinez Santos Amaia Mendizabal Maider Olasagasti Sandra Rainieri Miguel Ángel Pardo ©AZTI 6/2/2015 17 Gracias!! Colaboradores Financiación Departamento de química analítica Universidad Complutense de Madrid 2011-2014 Analítica, transcriptómica y proteómica para la evaluación de la toxicidad mecanismos y bioacumilacion de contaminantes alimentarios y ambientales (ATP-ToxBio). CTQ2011-28328-C02-02 2015-2017 Evaluación de los efectos tóxicos de la presencia de nanopartículas, medicamentos y compuestos orgánicos persistentes en alimentos (SAFEFOOD) 2009-2011- DaReTest-El pez cebra como modelo animal en investigación alimentaria: evaluación de la seguridad y de la efectividad de ingredientes y modelo de acuicultura. 2012-2015- SEGURFISH: Nuevas metodologías para garantizar la seguridad alimentaria de productos pesqueros ©AZTI 6/2/2015 18 www.azti.es | www.alimentatec.com | www.itsasnet.com T. +34 94 657 40 00 | info@azti.es Txatxarramendi ugartea z/g Herrera Kaia, Portualdea z/g Astondo Bidea, Edificio 609 48395 Sukarrieta, Bizkaia (SPAIN) 20110 Pasaia, Gipuzkoa (SPAIN) Parque Tecnológico de Bizkaia 48160 Derio, Bizkaia (SPAIN) ©AZTI 6/2/2015 19
