Expresión Génica GENOMA Transcripción •Acceso al genoma •Ensamblado del complejo de iniciación de la transcripción •Síntesis de ARN •Procesamiento del ARN •Estabilidad del ARN (degradación, localización) TRANSCRIPTOMA Traducción Colección de moléculas de ARN cuya información genética es requerida por la célula en un determinado momento •Ensamblado del complejo de iniciación •Síntesis de proteínas •Plegamiento y Procesamiento de proteínas •Degradación del Proteínas PROTEOMA Repertorio de proteínas celulares 1 Transcripción • 1) Reconocimiento del Promotor • 2) Iniciación: Ensamblado del complejo de iniciación – Unión de RNA pol sola o con proteínas accesorias a su promotor – Conversión de Complejo de iniciación cerradoÆ Complejo de iniciación abierto (ruptura de la unión H entre algunas bases en el sitio de iniciación) – Síntesis de los primeros nt y “clearance” del promotor • 3) Elongación: Complejo estable de transcripción • 4) Terminación: Involucra desestabilización de apareamiento RNA- molde de DNA Unidad de Transcripción: desde Promotor hasta Terminador 2 Eventos en la iniciación de la transcripción Elongación: 40nt/seg (bacteria) 3 4 RNA polimerasa 5 6 RNA polimerasas •Bacteriófagos T3 y T7: Un único polipéptido. Reconoce solo unos pocos promotores del fago • Bacteria: E.coli – 5 subunidades α2ββ’ σ Core catalítico • Eucariotas: – Múltiples subunidades : 8-12 – 3 RNA polimerasas: • RNA polimerasa I : rRNA (28s, 18s y 5,8s) • RNA polimerasa II : mRNA y RNA peq (snuRNA) • RNA polimerasa III : RNA peq (5s rRNA, tRNA, etc) 7 Transcripción en Procariotas Reconocimiento de la secuencia Promotora Promotor : Sitio de unión de la RNA pol E.Coli Æ - 2 secuencias de 6pb (ADN doble cadena) - Distancia entre las 2 secuencias - Startpoint (purina) TTGACA TATAAT UP -35 -10 +1 CAT 8 Secuencia -35 Separación entre secuencias Secuencia -10 (Pribnow Box) 9 Iniciación en E.coli • Contacto directo RNA pol-Promotor Core catalíticoÆ Contactos inespecíficos débiles Subunidad σ Æ Especificidad de secuencias Sec. -35Æ capacidad de unión de RNA pol Sec. -10Æ Conversión de complejo cerrado en complejo abierto (apertura de cadenas) 10 Transcripción en bacterias Factor σ : requerido para unión de RNA pol al Promotor Liberación de σ luego de iniciación de transcripción 11 Elongación: Complejo de transcripción (core catalítico de la RNA pol) RNA polimerasa cubre 30pb Burbuja de transcripción 12-14nt Apareamiento RNA- DNA 8 pb 12 Terminación en Bacterias Determinada por la estructura secundaria del ARN transcripto • Terminadores Intrínsecos – Palíndrome invertida seguida de corrida de U en el RNA transcripto •Formación de estructura de “hairpin” estable en el RNA desfavorece la unión RNA al molde de DNA Modos de acción •Debilitamiento mayor en la región transcripta con corrida de U (A-U unión débil) •Interacción del “hairpin” de RNA con subunidad β 13 Terminadores intrínsecos 14 Terminación Rho dependiente – RNA polimerasa pausa en la señal de terminación – Señal con “hairpin” menos estable – No hay corrida de U – Requiere actividad de proteína Rho –Rho: actividad helicasa Î rompe activamente la unión entre RNA y DNA molde 15 Transcripción en Eucariotas Reconocimiento de la secuencia Promotora • RNA pol eucariotas no reconocen directamente su secuencia promotora Æ Factores Generales de Transcripción • Promotor core – Sitio de ensamblado del Complejo de iniciación de la transcripción (Responsable de la Transcripción basal) • Elementos upstream del promotor – Unión de proteínas activadoras de la transcripción 16 Cada RNA polimerasa reconoce secuencias promotoras distintas •RNA pol I •core -45 y +20 (rico en GC + corta sec rica AT +1) •Elementos control upstream (UCE) RNA pol II •core -25 TATA Box •Inr (secuencia iniciadora) YYCARR •Elementos upstream •RNA pol III •Promotor dentro del gen •3 tipos de promotores •Usualmente 2 secuencias (50-100pb ) 17 18 Promotores de RNA pol III 19 Iniciación –RNA pol II • Reconocimiento del Promotor: Factor general de transcripción (GTF) TFIID •TBP: Unión a DNA secuencia específica (TATA Box) TFIID •Factores asociados a TBP (TAF): ayudan en la unión de TBP a TATA Box 20 Ensamblado del complejo de preiniciación 21 TBP participa del inicio de la transcripción de las 3 RNA pol eucariotas 22 • Eventos en la iniciación: – 1) Unión de TBPÆ torción del DNA en la región de TATA Box – 2) Torción Æ estructura de reconocimiento para TFIIB que asegura posicionamiento correcto de RNA pol II – 3) Ruptura de uniones H PIC cerradoÆ PIC abierto (TFII H) Etapa Final de iniciación: Fosforilación de CTD de la subunidad mayor de RNA pol II (TFIIH)Æ liberación del promotor y establecimiento de complejo de transcripción estable (Elongación) CTD: repeticiones de 7 aa (mamíferos 52 repeticiones) ricas en Ser 23 24 Transcripción y Reparación Procariotas: reclutamiento de Mfd por frenado de RNA pol. Liberación de RNA pol Reclutamiento de sistema UvrABC Eucariotas: reclutamiento de TFIIH por frenado de RNA pol. Degradación de RNA pol TFIIH + Complejo de reparación 25 Síntesis y procesamiento del RNA en eucariotas • Diferencia con Bacterias: – Traducción diferida de transcripción – Procesamiento del RNA durante la transcripción •CAP •Corte y empalme de exones: Splicing •Poly A 26 27 Enzimas unidas al CTDÆ componentes de RNA pol II 28 Capping Escape exitoso (30 nt sintetizados)Æ Capping Adición de G al extremo 5’ del RNAÆ Unión 5’-5’ (Guanidil Transferasa) Unión de un grupo metiloÆ 7 metil Guanosina (Metil Transferasa) 29 Elongación • Transcriptos eucariotas más largos que bacterias (distrofina 2400kb) Î Importancia en estabilidad del complejo de transcripción • RNA pol sola: – velocidad de síntesis baja – pausa frecuente • Factores de elongación Proteínas asociadas con la RNA pol II después del escape del promotor 30 TERMINACIÓN RNA polimerasa I •Involucra el reconocimiento de una secuencia de 18pb por un factor auxiliar •Extremo 3’ ARN maduro difiere del 3’ generado por terminación Î procesamiento del ARNr RNA polimerasa III •Señal: Corrida de U dentro de una región rica en GC •Terminación dentro de una corrida de U •Clivaje y poliadenilación del ARN. Señal en el ARN transcripto RNA polimerasa II •Terminación de la transcripción downstream del sitio de clivaje (sitio no definido). El clivaje dispara la terminación. 31 Terminación y poliadenilación • CPSF y CstF : Componente de especificidad y factor estimulatorio. – Reconocimiento de secuencias. • Endonucleasa : CFI y CFII – Clivaje para generar nuevo 3’ • Poly A polimerasa (PAP) : RNA polimerasa independiente de molde – Cola de polyA (~250 A) – Actúa en un sitio interno del transcripto Señal de poliadenilación 5’ AAUAAA 3’ 10-30 nt upstream del sitio de poliadenilación (CPSF) Sitio de poliadenilación posterior a CA Región rica en GU 10-20nt downstream (CstF) 32 ¾ Contacto de CPSF y CstF con secuencias de poliadenilación cambia las propiedades del complejo de elongación Æ Terminación de transcripción CPSF y CstF reclutadas por RNA pol II (CTD) 33 34 “Splicing” • Distintos tipos de Intrones: – 7 tipos en eucariotas – Otros distintos en archaea En mRNA 2 tipos de intrones: GU-AG Æ mayoritarios AU-AC 35 36 •sitio 5’ : AG GUAAGU (dador) GU-AG •sitio 3’ : PyPyPyPyPyPyPNCAG (aceptor) •A: punto de ramificación 37 •Splicing: reacciones de trans-esterificación 1) Clivaje en el sitio 5’ promovido por -OH 2’ de nt A localizado dentro de la secuencia del intrón (punto de ramificación) – Ataque del sitio 5’ Æ clivaje de la unión fosfodiester – Formación de nueva unión 5’-2’ (lariat) 2) Clivaje del sitio 3’ y unión de exones promovido por –OH 3’ del extremo del exón – Clivaje en el sitio 3’ – Liberación del intrón (lariat) – Unión de exones 38 • Aparato de splicing: Spliceosoma •SnRNP Spliceosoma •Sn RNA : U1, U2, U4, U5 y U6 •Proteínas •Proteínas asociadas Importante por: - Distancia entre sitios de splicing - Selección de sitios de splicing 39 40 41 42 Selección de sitios de splicing correctos Factores reguladores de splicing Proteínas SR : Dominio RS + RRM ¾ Interacción entre U1-sn RNP y U2-snRNP ¾ Interacción con ESE (enhancer en exon) ¾ Interacción con ESS (silenciadores en exon) ¾ SCAF (SR like factores asociados a CTD): conexión física entre spliceosoma y CTD de RNA pol II 43 “Splicing” Alternativo: Mecanismo para generar múltiples isoformas de proteínas Procesamiento diferencial del ARN de algunos genes: de modo tejido específico, en distintas etapas del desarrollo o como respuesta a alguna señal. Mecanismo adicional de regulación de la expresión. 44 Variación de concentración relativa de factores generales de splicing y ribonucleoproteínas de unión al ARN (hnRNP) Ej: - ASF/SF2 en bajas cantidades: selección de sitio de splicing 5’ más fuerte. En altas cantidades: sitio 5’ más cercano al 3’. - hnRNPA1: selección del sitio 5’ más distante. Unión a ESS: bloquea utilización de sitio 3’ adyacente Represión o activación de sitios de splicing por factores de splicing específicos de tejidos o etapas del desarrollo 45 46