Pruebas biológicas para la evaluación ecotoxicológica de
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INFORME FINAL: “PRUEBAS BIOLÓGICAS PARA LA EVALUACIÓN ECOTOXICOLOGICA DE SUSTANCIAS QUIMICAS” elaborado por: La Universidad Autónoma Metropolitana y el Instituto Nacional de Ecología Octubre, 2005 1 I.- INTRODUCCIÓN Antecedentes Debido a la urgente necesidad de determinar el impacto que están ocasionando los contaminantes en el ambiente, actualmente en México existe un interés creciente por el desarrollo de un procedimiento estandarizado para la evaluación ecotoxicológica de las sustancias. Esto exige el desarrollo de una serie de pruebas biológicas (batería de bioensayos) para medir directamente los efectos tóxicos en los organismos y en los ecosistemas. Estos procedimientos han sido ampliamente utilizados desde hace varios años en otros países, donde forman parte de su normatividad ambiental y su uso ha significando avances importantes para la protección del ambiente. Contar con estos procedimientos traería los mismos beneficios para México; sin embargo, estas pruebas no pueden aplicarse tal cual se hace en esos países, ya que es indispensable tomar en cuenta las características propias de nuestro país, eligiendo a las especies más útiles de acuerdo a su representatividad ecológica y considerando la infraestructura existente, así como los recursos humanos y económicos que existen en México. Justificación El registro de nuevos plaguicidas, la aplicación de nuevas sustancias, la caracterización de los residuos industriales, la evaluación de la contaminación por emisiones, fugas, derrames y descargas, son ejemplos de las muchas actividades que requieren de procedimientos estandarizados para medir los impactos que ocasionan sobre los organismos y los ecosistemas. Actualmente dichas actividades se regulan únicamente con análisis fisicoquímicos, que no son capaces de medir los efectos biológicos. Por tal motivo, es importante complementar dichos análisis con bioensayos de toxicidad para determinar los efectos sobre los individuos, que puedan afectar a las poblaciones y los ecosistemas en general. Con la realización de ambos tipos de pruebas se contará 2 con una visión más completa de los efectos adversos que se ocasionan sobre los componentes bióticos y abióticos de los ecosistemas y se podrán tomar medidas integrales para proteger el ambiente. II. OBJETIVOS Objetivo general Formular una batería de pruebas biológicas de laboratorio para la evaluación ecotoxicológica de las sustancias que sea aplicable en México. Objetivos particulares 1) Llevar a cabo un censo a nivel nacional, a través de la aplicación de un cuestionario, para la identificación de profesionales y laboratorios con experiencia en el desarrollo de pruebas biológicas para la evaluación ecotoxicológica de sustancias químicas. 2) Realizar una búsqueda amplia en la regulación ambiental de varios países para identificar los bioensayos más empleados y las características que debe reunir con relación a su representatividad ecológica (especies, niveles tróficos y compartimentos ambientales considerados, sensibilidad, respuesta crítica para el ecosistema, etc.) e implementación en laboratorio (cultivo y mantenimiento de organismos, desarrollo de la prueba, análisis de resultados, control de calidad, costos, etc.). Así mismo, reunir la información de la experiencia que se tenga en México a este respecto. 3) Establecer los criterios de selección de las pruebas. Estos deben incluir: sensibilidad complementaria, evitar la redundancia entre las pruebas, tipos de sustancias que pueden detectar, aceptación entre los sectores involucrados en el cuidado del medio ambiente (gubernamental, industrial, académico, etc.), limitaciones de tipo económico y de infraestructura para su aplicación, etc. 3 4) Aplicando los criterios mencionados en el objetivo anterior, seleccionar las pruebas que formarán parte de la Batería de Pruebas. 5) Establecer los criterios de interpretación de las pruebas seleccionadas. III.- MATERIALES Y MÉTODO Para la identificación de expertos en bioensayos a nivel nacional, primero se diseñó una encuesta en la que además de los datos de contacto del investigador, se solicitó información respecto a su experiencia en la realización de bioensayos y otras técnicas asociadas a la realización de este tipo de estudios, como son la determinación de contaminantes en diversas matrices ambientales y la experiencia en el uso de biomarcadores de exposición y efecto. También se preguntó acerca de la infraestructura de la que disponen en sus respectivas instituciones, así como su disponibilidad para dar cursos de capacitación (ver Anexo 1). Esta encuesta fue distribuida a todos los socios de la Asociación Mesoamericana de Ecotoxicología y Química Ambiental, A.C., (AMEQA) y a los miembros de la lista de discusión ECOTOX. Asimismo, se les envío a los investigadores que previamente habían asistido a alguna actividad organizada por el INE o respondido a otra encuesta, de la misma institución, para expertos en COPs. Posteriormente y aprovechando algunas actividades organizadas por el INE, como el Foro Nacional de Investigación sobre Contaminantes Orgánicos Persistentes, se distribuyó la encuesta más ampliamente. Algunos expertos se incorporaron al proyecto ya en una etapa avanzada, al ser invitados por alguno de los participantes. Simultáneamente, se llevó a cabo un par de reuniones con aquellos expertos que ya se tenían identificados, por su participación en el 1er Congreso de la AMEQA. En estas reuniones se hizo una breve presentación del proyecto y los expertos hablaron de su experiencia en el área de bioensayos; asimismo se elaboró una primera lista de criterios de selección de pruebas que se distribuyó 4 por correo electrónico y que posteriormente se consideró para la propuesta de los bioensayos. Se llevó a cabo un Primer Taller de Expertos para la discusión de los criterios de selección de bioensayos, así como para estudiar propuestas de pruebas que coincidieran con estos criterios. Este taller tuvo verificativo el 30 de Junio y 1º de Julio, en las instalaciones del Centro de Capacitación del Instituto Mexicano de Tecnología del Agua (IMTA), en Jiutepec, Morelos. Los participantes discutieron en grupo, las generalidades de los protocolos así como las especies susceptibles de ser usadas; posteriormente se organizaron en tres grupos: Ambientes Terrestres (suelo), Ambientes Dulceacuícolas (agua y sedimento) y Ambientes Salobres y Marinos (agua y sedimento) y en cada uno se escogió un coordinador, quien fue el encargado de organizar el avance y trabajo que se presentaría en la siguiente reunión. Un Segundo Taller de Expertos fue organizado el 28 y 29 de septiembre, en la misma sede que el anterior, en el que se presentaron las primeras propuestas de protocolos para bioensayos. Asimismo, se discutieron las fortalezas y debilidades de lo alcanzado por el grupo hasta ese momento y se discutieron las acciones necesarias para avanzar en la estandarización de una batería de bioensayos para México. Por último, se planearon de manera general las estrategias que deberán seguirse el próximo año para avanzar en la estandarización. IV.- ANÁLISIS DE RESULTADOS Se recibieron 30 cuestionarios con información de profesionistas de distintas partes del país. De estos, dos fueron eliminados ya que se trataba de personas cuya especialidad es la química ambiental, y no tenían experiencia en el manejo de organismos en bioensayos (Anexo 2). Cabe destacar que la mayor parte de los que respondieron a la encuesta colaboraron con este proyecto, así como sus grupos de trabajo; adicionalmente colegas mexicanos y extranjeros contribuyeron en los protocolos que se detallan más adelante. 5 Se llevaron a cabo dos reuniones preparatorias (enero y mayo) a las cuales asistieron expertos en bioensayos identificados, ya sea por la información que se recabo en los cuestionarios, o por su anterior participación en eventos de la AMEQA, también asistió personal de CENICA y del INE. En estas reuniones se explicó brevemente el presente proyecto haciendo énfasis en las necesidades que tiene el sector gubernamental (SEMARNAT, INE, CNA) con respecto a información ecotoxicológica. La M. en C. Yolanda Pica expuso la experiencia del IMTA y otros laboratorios latinoamericanos en el proyecto WATERTOX, que como resultado publicó el Manual “Ensayos toxicológicos y métodos de evaluación de calidad de aguas”. Posteriormente, las discusiones que se llevaron a cabo, se centraron en tener bien claras las necesidades a las que la batería de bioensayos debería responder, al requisito de identificar un mayor número de expertos y a enlistar los Criterios de Selección de los Bioensayos (Anexo 3), los cuales fueron discutidos en el Primer Taller. Adicionalmente, se propuso recabar la información ecotoxicológica que se ha generado en México, con sus organismos y sus condiciones ambientales, haciendo particular énfasis en todo aquello que se ha publicado en la literatura gris (informes de proyecto, tesis, etc.) y que es de difícil acceso. Para ello se trabajó en la elaboración de un cuestionario (Anexo 4) pero, posteriormente se decidió dejar este punto como un proyecto futuro que generará una base de datos de acceso público que podría estar en la página de internet del INE y/o la AMEQA. En el Primer Taller, los 22 expertos que estuvieron presentes discutieron ampliamente los Criterios de Selección de los Bioensayos, lo que resultó en la lista presentada en el anexo 3 la cual refleja la experiencia del grupo con respecto a lo que hace que un bioensayo o una batería de estos sean técnicamente factibles y científicamente válidos. Estos criterios fueron consideraros en la siguiente etapa para la propuesta de todos y cada uno de los protocolos. A continuación el grupo enlisto las especies o pruebas con las que a la fecha ha trabajado de manera rutinaria y exitosa, así como aquellas que por su importancia ecológica o por ser especies estándar en otros países pudieran 6 utilizarse en México, esto dió como resultado tres listas (una por cada ambiente) de especies o pruebas candidatas. La lista de agua dulce incluyó 6 especies fitoplanctónicas, 18 especies de zooplancton, 10 especies nectónicas, 15 especies de hábitos bentónicos, 10 especies de plantas superiores y 2 especies bacterianas (Anexo 5). La de ambientes marinos y salobres comprendió 5 especies fitoplanctónicas, 8 especies de zooplancton, 4 especies nectónicas, 20 especies de hábitos bentónicos y Vibrio fischeri (Anexo 6). El listado de ambientes terrestres abarcó 5 pruebas de metabolismo microbiano, 5 especies o grupos de mesofauna, 11 especies de mono y dicotiledonias y 7 otras especies/pruebas microbianas (Anexo 7). Los listados pasaron por una segunda etapa de análisis en la que los participantes acotaron el número de especies o pruebas aplicando los criterios desarrollados con anterioridad, asimismo se acordó elaborar una guía para la elaboración de los protocolos, de tal manera que todos incluyeran los mismos puntos. Una vez elaborada, esta guía fue distribuida de manera electrónica. En el segundo taller se presentaron los avances que a la fecha se tenía en el desarrollo de los protocolos, con lo cual se pudo identificar aquellas áreas en las que no se cuenta con experiencia dentro del grupo. Para subsanar esta debilidad se sugirió que en un futuro se consiguiera la asesoría de expertos de otros países. Asimismo, se reconoció que algunas especies/pruebas presentan potencial para ser utilizadas no solamente en pruebas agudas, si no también en pruebas subletales, por lo que se incluyen en este informe algunos de estos protocolos, además se planteó que en un futuro sería adecuado invertir en el desarrollo de éstas pruebas, así como de biomarcadores de exposición y efecto para especies mexicanas. A la fecha se tienen protocolos preliminares para ensayos de toxicidad aguda con cladóceros y algas de agua dulce, así como con lombriz de tierra (Anexo 8), que han sido desarrollados por distintos grupos de expertos; estos tienen puntos en común, por lo que se plantea que será necesario trabajar en la integración de estas propuestas para obtener un protocolo unificado para cada 7 grupo de organismos. Esto requerirá de trabajo de gabinete, pero también de algunas pruebas prácticas, previo a la fase de estandarización. Otros protocolos que se presentan en el anexo 8 de este informe incluyen: • Ensayo de toxicidad aguda con Allium cepa L., mediante la evaluación de la inhibición del crecimiento promedio de raíces de cebolla. • Ensayo de toxicidad aguda (efectos letales y subletales) con Hydra attenuata. • Ensayo de toxicidad aguda con semillas de lechuga (Lactuca sativa L.) • Prueba de toxicidad aguda con Vibrio fischeri (Photobacterium phosphoreum). • Ensayo de toxicidad con el nematodo Panagrellus redivivus. • Prueba de citotoxicidad aguda con celomocitos de lombriz de tierra (Eisenia foetida) • Prueba de Germinación de semillas • Prueba de Ames por el método de microfluctuación modificado para determinar genotoxicidad en compuestos químicos puros y muestras ambientales • Bioensayo de la Actividad Deshidrogenasa • Bioensayo de Trifosfato de Adenosina (ATP) • Bioensayo de la Tasa de Mineralización del Nitrógeno • Prueba para evaluar los efectos de contaminantes en almeja Catarina Argopecten ventricosus. • Bioensayos de toxicidad en camarones Peneidos Debido a que se pretende tener como un producto final de este esfuerzo un Manual de Pruebas Biológicas, se discutió que esto requerirá no solamente de tiempo si no también de amplios recursos financieros, pues los materiales y talleres que deben ser organizados para este fin pueden resultar costosos. Asimismo, se adelantó en la definición de algunas secciones que el futuro Manual deberá contener y que son comunes para todas las pruebas, como el lavado de 8 material, extracción de muestras, etc., y se acordó un mecanismo para su desarrollo. En este informe se incluye el procedimiento para la generación de extractos orgánicos y elutriados de suelos y sedimentos para su análisis en pruebas de toxicidad (ver anexo 9). V.- Conclusiones 1. La existencia de un cepario donde se mantenga y produzca organismos de calidad conocida, es de importancia para asegurar que los laboratorios puedan obtener especimenes en cualquier momento. 2. En México existe un número importante de especialistas en bioensayos para ambientes dulceacuícolas. 3. En el caso de especies para las que se cuenta con más de un protocolo, será necesario integrar las propuestas. 4. Hace falta comparar la sensibilidad de los peces de agua dulce (Poecilidos) para los que ya se tienen protocolos con alguna(s) especie(s) de importancia económica (Cichlidos nativos). 5. Las pruebas para suelo con enzimas de la microflora requieren ser perfeccionadas. 6. Hace falta el desarrollo de protocolos con peces marinos. 7. Hace falta el desarrollo de protocolos con insectos, entre ellos los polinizadores como las abejas. 8. Algunos grupos como los nematodos, cladoceros, oligoquetos etc., presentan un gran potencial para determinaciones subletales, por lo que hace falta el desarrollo de estas pruebas (enzimas y biomarcadores). 9. La elaboración del Manual de pruebas biológicas para la evaluación ecotoxicologica de sustancias químicas y muestras ambientales, requiere de tiempo y amplios recursos financieros. 10. Debido a la limitada experiencia que se tiene en las pruebas de genotoxicidad, así como en el manejo de suelos/sedimentos artificiales es necesario conseguir la asesoría de expertos en el tema. 9 11. La información ecotoxicológica existente para México necesita ser recopilada y analizada, para posteriormente armar una base de datos de acceso público. VI.- Recomendaciones 1. Apoyar adecuadamente la siguiente etapa de este proyecto, que es la estandarización de el mayor número posible de protocolos 2. Conseguir las asesorías necesarias para subsanar las debilidades identificadas. 3. Promover la existencia de un cepario donde se mantenga y produzca organismos de calidad conocida. 4. Apoyar el desarrollo de pruebas subletales, así como de biomarcadores de exposición y efecto. 5. Generar una base de datos de acceso público con la información ecotoxicológica que se ha generado en México, con organismos estándar y del país, así como en las condiciones ambientales características del mismo. 10 ANEXO 1. Formato para el Censo de Expertos en Bioensayos 11 CUESTIONARIO DATOS GENERALES Nombre del investigador: Institución actualmente): (donde labora Dependencia de adscripción: Área o departamento: Grupo de investigación: Puesto del Investigador: Dirección de la institución: Teléfono: Fax: Dirección electrónica: FORMACIÓN PROFESIONAL Experiencia docente relacionada al tema de ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos Proyectos realizados en ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos 12 PRINCIPALES LINEAS DE INVESTIGACIÓN EN ECOTOXICOLOGÍA Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS 1. 2. 3. 4. 5. PUBLICACIONES RECIENTES EN LOS TEMAS DE ECOTOXICOLOGÍA Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS 1. 2. 3. 4. 5. CAPACIDAD ANALÍTICA Matrices ambientales que analiza: Agua dulce Agua Marina Sedimentos Suelos Otros Tipos de contaminantes que analiza: Metales: Plaguicidas: Compuestos orgánicos: Otros: Pruebas biológicas que realiza: Bioensayos con: Biomarcadores en: 13 Pruebas certificadas (Mencionar que tipo de certificación y su vigencia): Infraestructura con la que cuenta: Equipo de laboratorio Cultivo y mantenimiento de organismos y cepas (certificadas o no) Compuestos de referencia certificados Personal disponible Disposición para dar capacitación a otros usuarios en las pruebas que realiza Nota: Favor de enviar el cuestionario debidamente llenado a la Dra. Ania Mendoza Cantú Jefe del Departamento de Desarrollo de Programas para el Manejo de Riesgos Instituto Nacional de Ecología A la cuenta de correo electrónico: amendoza@ine.gob.mx 14 ANEXO 2. Cuestionarios Contestados 15 1. Alba Martínez 2. Baqueiro Cárdenas 3. Barrera Escorcia 4. Betancourt Lozano 5. Corona Vadillo 6. Cueva Diaz 7. García Rico 8. Gold Bouchot 9. Guzmán García 10. Hansen Anne 11. Heyer Rodríguez 12. Madrigal Santillan 13. Martínez Jerónimo 14. Nandini Sarma 15. Nava Vera 16. Núñez Nogueira 17. Pica Granados 18. Ramírez Romero 19. Rendón von Osten 20. Robles Mendoza 21. Rodríguez Vazquez 22. Rubio León 23. Salazar Coria 24. Sarma S. 25. Sobrino Figueroa 26. Uribe Hernández 27. Vanegas 28. Zapata Pérez 16 CUESTIONARIO DATOS GENERALES Nombre del investigador: Alejandro Federico Alva Martínez Institución (donde labora actualmente): FES-Iztacala UNAM y UAM-Xochimilco Dependencia de adscripción: Área o departamento: Zoología Acuática, UNAM Ecología Microbiana UAM-X Grupo de investigación: Puesto del Investigador: Estudiante de Doctorado Dirección de la institución: Teléfono: 56 23 11 25 UNAM Fax: 55 49 55 92 Dirección electrónica: afam99@yahoo.com afalva@ecotonica.com FORMACIÓN PROFESIONAL Licenciatura en Biología (enfoque hidrobiologico) UAM-X Maestría en Ciencias (Biología de sistemas y recursos acuáticos) UNAM Actualmente en curso Doctorado en Ciencias Biológicas (Biomanipulación acuática) UAM falta tesis Estudiante Licenciatura en Economía (2 semestre) SUA-UNAM Experiencia docente relacionada al tema de ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos En el IPN del 2000 al 2002 (Nivel vocacional) Cursos de Estrategias de solución problemática ambiental y problemática ambiental, Carrera de Técnico en Ecología En la UNAM 2003, 2004 (Nivel posgrado) Curso de limnología aplicada y Biomanipulacion aplicada, Maestría en Ciencias. Proyectos realizados en ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos 17 PRINCIPALES LINEAS DE INVESTIGACIÓN EN ECOTOXICOLOGÍA Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS 1. Biomanipulación 2.Eutroficación acuática efectos sobre la cadena trofica 3. 4. 5. PUBLICACIONES RECIENTES EN LOS TEMAS DE ECOTOXICOLOGÍA Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS 1. Alejandro Federico Alva-Martínez, S.S.S. Sarma & S. Nandini. Population dynamics of rotifers (Rotifera) on mixed diets: a case study using Microcystis aeruginosa Hidrobiologica. en prensa 2. Alejandro Federico Alva-Martínez, S.S.S. Sarma & S. Nandini. 2004. Population Growth of Daphnia Pulex (Cladocera) on a Mixed Diet (Microcystis Aeruginosa with Chlorella or Scenedesmus). Crustaceana 77(8): 973-988 3. Alejandro Federico Alva-Martínez, S.S.S. Sarma & S. Nandini. 2001. Comparative population dynamics of three species of cladocera in relation to different levels of chlorella vulgaris and microcystis aeruginosa Crustaceana 74(8): 749-764 4. 5. CAPACIDAD ANALÍTICA Matrices ambientales que analiza: Agua dulce Agua Marina Sedimentos Suelos Otros Tipos de contaminantes que analiza: Metales: Plaguicidas: Compuestos orgánicos: Microcystis spp Otros: Pruebas biológicas que realiza: 18 Bioensayos con: rotíferos Cladóceros Algas Anélidos Biomarcadores en: Pruebas certificadas (Mencionar que tipo de certificación y su vigencia): Infraestructura con la que cuenta: Equipo de laboratorio Se cuenta con todo lo necesario para realizar ecotoxicologia Cultivo y mantenimiento de organismos y cepas (certificadas o no) Algas Scenedesmus acutus certificada Chlorella vulgaris certificada Cladóceros 6 especies Rotíferos 5 especies Anélidos 1 especie Compuestos de referencia certificados Personal disponible Servidores sociales Disposición para dar capacitación a otros usuarios en las pruebas que realiza Se puede capacitar siempre dependiendo de los tiempos disponibles de nuestra parte 19 CUESTIONARIO DATOS GENERALES Nombre del investigador: Dr. Erick Raúl Baqueiro Cárdenas Institución (donde labora actualmente): CICATA-IPN, Altamira Dependencia de adscripción: Instituto Politécnico Nacional Área o departamento: Recursos Bióticos sustentable y Desarrollo Grupo de investigación: Puesto del Investigador: Titular Dirección de la institución: Teléfono: Km 14.5 Carr. Tampico Industrial Altamira 833 264 9302 Fax: 833 260 0124 Dirección electrónica: Ebaqueiro@ipn.mx – Pto. FORMACIÓN PROFESIONAL Licenciatura, en Biología Fac. Ciencias UNAM Maestría Biología Fac. Ciencias UNAM Doctorado Oceanografía Biológica Pesquera ICML, UNAM (No graduado) Doctorado Ciencias Marinas CINVESTAV, Unidad Mérida (Graduado) Experiencia docente relacionada al tema de ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos Laboratorio de Ecología experimental del CRIP, La Paz, Baja California, 1976 – 1986 Laboratorio de estudios básicos para Acuacultura CRIP, Lerma, Campeche, 1986 – 1999 CICATA-IPN, Altamira, tutor de tesis Maestria: Metales pesados en sedimentos de las laguna costeras de Tamaulipas”, “Metales pesados en organismos de las lagunas costeras de tamaulipas” y Doctorado “Bioacumulación y biomagnificación de organoclorados persistentes en el Ostión Crassostrea virginica” Proyectos realizados en ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos Participación en el programa internacional de calibración de Artemia salina 1979. Bioensayos sobre tolerancia a diferente factores ambientales en moluscos diversos de Baja California.y Península de Yucatán. 20 PRINCIPALES LINEAS DE INVESTIGACIÓN EN ECOTOXICOLOGÍA Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS 1.Bioacumulación y biomagnificación de organoclorados en el ostión Crassostrea virginica 2.Metales pesados en organismos acuaticos y su biomagnificación en la cadena trófica 3. 4. 5. PUBLICACIONES RECIENTES EN LOS TEMAS DE ECOTOXICOLOGÍA Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS 1. 2. 3. 4. 5. CAPACIDAD ANALÍTICA Matrices ambientales que analiza: Agua dulce Agua Marina Pesticidas, orgánicos persistentes, metales pesados Sedimentos Pesticidas, orgánicos persistentes, metales pesados Suelos Organismos Pesticidas, orgánicos persistentes, metales pesados Tipos de contaminantes que analiza: Metales: Plomo, Cadmio, Níquel, Mercurio y Plata Plaguicidas: Aldrin, dieldrin, endrin, clordano, DDT, Heptacloro toxafeno Acrilonitrilo, benceno Compuestos orgánicos: Otros: Pruebas biológicas que realiza: Bioensayos con: Daños histológicos en organismos marinos e impacto en el desarrollo gonádico Biomarcadores en: 21 Pruebas certificadas (Mencionar que tipo de certificación y su vigencia): Infraestructura con la que cuenta: Equipo de laboratorio Cromatografo de Gases Perkin Elmer con Detector de Captura de Elelectrones (ECD) y Ionización de Flama (FID) Cromatografo de Gases Hullet Packard (CG-HP) Cromatografo de liquidos (CL-PE) Espectometro de Emisión de Plansma (ICP-AES) Analizador de Carbon orgánico total Espectro fotómetro de luz infrarroja (Ir-sp) Espectro fotómetro de luz ultra violeta (UV-sp) Especrtro fotómetro de absorción atómica (AA-Hp) Calorímetro diferencial Campana Bacteriológica Cultivo y mantenimiento de organismos y cepas (certificadas o no) Compuestos de referencia certificados Personal disponible Estudiantes de posgrado Disposición para dar capacitación a otros usuarios en las pruebas que realiza Pueden implementarse cursos, seminarios y prácticas según necesidades. 22 CUESTIONARIO DATOS GENERALES Nombre del investigador: Guadalupe Barrera Escorcia Institución (donde labora actualmente): Universidad Autónoma Metropolitana Dependencia de adscripción: Iztapalapa Área o departamento: Grupo de investigación: Área Producción Acuática, Departamento Hidrobiología, División CBS. Ecotoxicología Puesto del Investigador: Profesor Titular C de tiempo completo Dirección de la institución: Teléfono: Av. San rafael Atlixco 186, Col. Vicentina, C.P. 09340, Iztapalapa, D.F. 58 04 64 74 Fax: 58 04 47 38 Dirección electrónica: gube@xanum.uam.mx FORMACIÓN PROFESIONAL Biología, Fac. de Ciencias, UNAM. Maestría en Ciencias Biológicas, Fac. de Ciencias, UNAM, con enfoque en contaminación, tesis sobre calidad sanitaria en la Laguna de Tamiahua, Ver. Actualmente terminando estudios de Doctorado en Ciencias Biológicas, UAM-I, con tesis sobre efectos de metales (Cd y Cr) en ostión. Experiencia docente relacionada al tema de ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos Profesora titular de la asignatura Alteración de Ecosistemas en la carrera de Hidrobiología, anteriormente vinculada a cursos de Impacto Ambiental. Actualmente involucrada en cursos de Biología General y Evolución. Proyectos realizados en ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos Responsable en el proyecto: Toxicidad de cromo y cadmio en ostión Crassostrea virginica de la laguna de Mandinga, Veracruz. Proyecto con apoyo CONACYT de 1996 a 1999. Apoyo UAM de 1996 a 2002. Actualmente colaboradora en el proyecto “Biomarcadores en organismos acuáticos mexicanos para el monitoreo ambiental” y colaboradora en el proyecto “Determinación del riesgo ecológico de un ambiente acuático.” Proyecto Recientemente aprobado a través del programa PROMEP 23 PRINCIPALES LINEAS DE INVESTIGACIÓN EN ECOTOXICOLOGÍA Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS 1. Metales tóxicos, cadmio y cromo en ostión. 2. Efectos fisiológicos en ostión. 3. Biomarcadores (metalotioneinas y lipoperoxidación). 4. Bacterias con actividad toxigénica de importancia epidemiológica (Vibrio cholerae). 5. Calidad sanitaria (coliformes, estreptococos, patógenos). PUBLICACIONES RECIENTES EN LOS TEMAS DE ECOTOXICOLOGÍA Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS 1. Barrera-Escorcia, G. e I. Wong-Chang. Mean lethal body concentration of Cadmiun in Crassostrea virginica from a Mexican Tropical Coastal Lagoon. Revista Internacional de Contaminación Ambiental. 21 (2) En prensa 2. Otras publicaciones anteriores están vinculadas a investigación sobre calidad sanitaria y Vibrio cholerae Barrera-Escorcia, G. y P. E. Namihira-Santillán. Contaminación microbiológica en la zona costera de Akumal, Q. Roo, México. Hidrobiologica 14 (1): 27-35 3. Capítulos del libro: “Golfo de México: Contaminación e Impacto Ambiental. Diagnóstico y tendencias.” Serie Científica 5. Universidad Autónoma de Campeche, Centro EPOMEX: 1. Barrera, E.G. y CH.I. Wong. Contaminación por microorganismos en zonas costeras. 2. Wong, CH,I. y E.G. Barrera. Implicaciones ecológicas de la contaminación microbiológica en la zona costero marina. 3. Wong, CH.I. y E.G. Barrera. Niveles de contaminación microbiológica en el Golfo de México. 4. Barrera E.G. y CH.I. Wong. Contaminación microbiológica en el Golfo de México: Diagnóstico. 5. Guzmán G.X., E.G., Barrera y Ch.I. Wong. Efecto del almacenamiento en la calidad sanitaria del ostión Crassostrea virginica (Gmelin) de la laguna de Tamiahua, Veracruz. 4. Barrera-Escorcia, G. e I. Wong-Chang. Eutrofización y calidad del agua. En: Arredondo-Figueroa J.L.: Limnología de Presas Mexicanas, en prensa a editarse por la UAM-I. 5. CAPACIDAD ANALÍTICA Matrices ambientales que analiza: Agua dulce Agua Marina Parámetros fisicoquímicos, contaminantes, organismos indicadores de referencia (cladóceros, bacterias). Parámetros fisicoquímicos, contaminantes, organismos indicadores de referencia y del ambiente natural (moluscos, bacterias). Sedimentos 24 Suelos Otros Tipos de contaminantes que analiza: Metales: Cd Cr Plaguicidas: Compuestos orgánicos: Otros: Pruebas biológicas que realiza: Bioensayos con: Daphina magna, Crassostrea virginica Biomarcadores en: Crassostrea virginica de tipo bioquímico: metalotioneinas, proteinas, lipoperoxidación. Respuestas de tipo fisiológico: integraciones simples: tasa de filtración, tasa metabólica, radio O:N, asimilación, eficiencia de asimilación; respuestas simples (consumo de alimento, exceción fecal, nitrogenada, respiración, morfometría) e integraciones complejas (campo de crecimiento). Pruebas certificadas (Mencionar que tipo de certificación y su vigencia): Infraestructura con la que cuenta: Equipo de laboratorio Acuarios para mantenimiento de organismos en laboratorio en condiciones controladas. Horno de microondas para digestión de muestras diversas, procesador de tejidos desde inclusión hasta teñido, equipo diverso que incluye autoclaves, campana de flujo laminar, campanas de extracción, centrífuga, microcentrífuga, centrífuga refrigerada, homogenizador de tejidos, microscopios, analizador de oxígeno, salinómetro, laboratorio de campo Hach, cámara de electroforesis, balanzas, y otros equipos menores. Cultivo y mantenimiento de organismos y cepas (certificadas o no) Durante algunos años se mantuvo la cepa toxigénica de Vibrio cholerae O1 peruana, ya que el proyecto entonces vigente evaluó la presencia de esta cepa, tanto toxigénica como no toxigénica a través de métodos de cultivo tradicionales y por anticuerpos fluorescentes. Compuestos de referencia certificados Personal disponible 25 El laboratorio cuenta actualmente con un ayudante cuya plaza tendrá solo duración de un año. Solo puede obtenerse apoyo a través de proyectos que involucren estudiantes que desarrollen tesis a nivel licenciatura y posgrado. Disposición para dar capacitación a otros usuarios en las pruebas que realiza 26 CUESTIONARIO DATOS GENERALES Nombre del investigador: Institución (donde actualmente): Dr. Miguel Betancourt Lozano labora Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo Dependencia de adscripción: Área o departamento: Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental Manejo Ambiental Grupo de investigación: Ecotoxicología Puesto del Investigador: Investigador Titular Dirección de la institución: Teléfono: Av. Sábalo Cerritos, Estero del Yugo 82010, Mazatlán, Sinaloa, México 669-9898700 ext.240 Fax: 669-9898701 Dirección electrónica: mbl@victoria.ciad.mx FORMACIÓN PROFESIONAL 1988 – Licenciatura en Biología Marina – UABCS 1992 – Maestría en Ecología – CICIMAR, IPN 2000 – Doctor en Filosofía (ecotoxicología) – University of Stirling, Escocia, GB Experiencia docente relacionada al tema de ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos Organización y participación de cursos-talleres: 2001 – Field methods in water and sediment ecotoxicology – theory and practice. 2001 – Molecular tools in ecotoxicological research and environmental impact assessment. 2003 – Numerical methods in ecotoxicology. Proyectos realizados en ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos 1996-1998: Interactive effects between malathion and propiconazole in the marine shrimp Penaeus vannamei, and its sublethal responses. International Foundation for Science (IFS), Estocolmo, Suecia. 1998-2000: Susceptibilidad de Penaeus vannamei al efecto interactivo 27 entre plaguicidas e infecciones bacterianas y su relación con componentes del sistema de defensa. CONACyT. 2001-2004: Efecto de la exposición a plaguicidas organofosforados en la susceptibilidad de Litopenaeus vannamei a la infección experimental con Vibrio parahaemolyticus. Una extrapolación al campo. CONACyT. 2001-2004: Evaluación ecotoxicológica de la contaminación por plaguicidas y metales pesados en lagunas costeras de Sinaloa. CONACyT PRINCIPALES LINEAS DE INVESTIGACIÓN EN ECOTOXICOLOGÍA Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS 1. Diseño e implementación de bioensayos para evaluar toxicidad de efluentes y sedimentos estuarinos y marinos. 2. Utilización de biomarcadores fisiológicos y conductuales para evaluar efectos de contaminantes en organismos estuarinos y marinos. 3. En colaboración con otros investigadores, utilización de biomarcadores moleculares y bioquímicos para evaluar efectos de contaminantes en organismos estuarinos y marinos. 4. Efecto interactivo entre procesos infecciosos patogénicos y contaminantes ambientales en organismos cultivados. 5. PUBLICACIONES RECIENTES EN LOS TEMAS DE ECOTOXICOLOGÍA Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS 1. Roque A., D.J. S. Abad, M. Betancourt-Lozano, C. Chavez, B. Gomez-Gil, A.L. Guerra-Flores, y F. Vargas-Albores. 2002. Evaluation of the susceptibility of the shrimp Litopenaeus vannamei to vibriosis when exposed to agricultural pesticides. Diseases in Asian Aquaculture IV 2. En prensa: Chemosphere: Roque A., Abad S., Garcia de la Parra L.M., Baird D., Guerra-Flores AL, Gomez-Gil B., Betancourt-Lozano M. Evaluation of the susceptibility of the cultured shrimp Litopenaeus vannamei to vibriosis when orally exposed to methyl parathion . 3. Aceptada: Ecotoxicology and Environmental Safety: Comoglio, L., O. Amin, A. Roque, M. Betancourt-Lozano, D. Anguas, and M. Haro. Evaluation of sublethal biomarkers in Litopenaeus vannamei on foodborne exposure to methyl parathion. 4. Enviada: Vitellogenin transcription and reproductive cycle in the white mullet (Mugil curema) from two estuaries in Northwest Mexico. García-Gasca, A., J. Ríos, R. Hernández, P. Estañol, H. Plascencia, L.M. García de la Parra, and M. Betancourt-Lozano. 5. Enviada: Induction of morphological deformities in Litopenaeus vannamei juveniles exposed to a triazole-derivative fungicide. Betancourt-Lozano M., D.J. Baird, R. Sangha and F. González-Farias. CAPACIDAD ANALÍTICA Matrices ambientales que analiza: 28 Agua dulce Plaguicidas y compuestos clorados Agua Marina Plaguicidas y compuestos clorados Sedimentos Plaguicidas y compuestos clorados Suelos Otros: Organismos Plaguicidas y compuestos clorados Tipos de contaminantes que analiza: Metales: Plaguicidas: Organofosforados y organoclorados Compuestos orgánicos: PCBs Otros: Pruebas biológicas que realiza: Bioensayos con: Crustáceos: Tisbe sp., Uca princeps y Litopenaeus vannamei Moluscos: Mytella strigata y Crassostrea palmula Biomarcadores en: Genotoxicidad, GST, AChE, proteínas de estrés, vitelogenina, alteraciones histológicas y morfológicas, crecimiento, tasa de alimentación y respuestas conductuales Pruebas certificadas (Mencionar que tipo de certificación y su vigencia): Infraestructura con la que cuenta: Equipo de laboratorio Liofilizadora, cromatógrafos (ECD, FID, NPD), RapidVap, Soxhlet, bomba peristáltica, cuarto refrigerado, refrigeradores, ultracongeladores, centrífugas, lector de placas, microscopios y equipo de video. Cultivo y mantenimiento de organismos y cepas (certificadas o no) 2 cuartos experimentales con agua de mar y dulce, aireación, fotoperiodo y temperatura controlada. Compuestos de referencia certificados 29 Personal disponible 1 técnico de cromatografía Disposición para dar capacitación a otros usuarios en las pruebas que realiza Si hay disposición, aunque, como se puede apreciar, el apoyo técnico es muy limitado, por lo cual el desarrollo de los bioensayos normalmente se acopla a trabajos de tesis de estudiantes. 30 CUESTIONARIO DATOS GENERALES Diana Corona Vadillo Universidad Nacional Autónoma de México Institución (donde labora actualmente): (UNAM) Dependencia de adscripción: Instituto de Geografía Laboratorio de Análisis Físicos y Químicos Área o departamento: del Ambiente Cromatografía y Ecotoxicología terrestre. Grupo de investigación: ---Puesto del Investigador: 2ª Circuito Exterior, Ciudad Universitaria, A.P. 20-850 Coyoacán, México, D.F. C.P. Dirección de la institución: 04510 56-22-30-22; 56-22-43-36 Teléfono: 56-22-43-52 Fax: dianacov@att.net.mx; dcorona@estudiantes.ciad.mx Dirección electrónica: Nombre del investigador: FORMACIÓN PROFESIONAL - Licenciatura en Bióloga, Fac. de Ciencias, UNAM. Maestría en Ciencias en Manejo Ambiental con especialidad en Ecotoxicología marina, Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C.-Unidad Mazatlán. Experiencia docente relacionada al tema de ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos -Estudio de biomarcadores a nivel molecular, bioquímico y nivel de organismo en cangrejo violinista Uca princeps (Smith 1870) expuestos a sedimentos contaminados en Mazatlán , Sinaloa. - Estudio de genotoxicidad en células sanguíneas de lombriz Eisenia fetida expuestas a suelos contaminados con hidrocarburos provenientes de Tabasco. Proyectos realizados en ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos -Estudio de biomarcadores a nivel molecular, bioquímico y nivel de organismo en cangrejo violinista Uca princeps (Smith 1870) expuestos a sedimentos contaminados en Mazatlán , Sinaloa. - Estudio de genotoxicidad en células sanguíneas de lombriz Eisenia fetida expuestas a suelos contaminados con hidrocarburos provenientes de Tabasco. PRINCIPALES LINEAS DE INVESTIGACIÓN EN ECOTOXICOLOGÍA Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS 1. Estudio de biomarcadores en cangrejo violinista Uca princeps y realización 31 de bioensayos con ellos. 2. Estudio de genotoxicidad (Ensayo cometa) en células sanguíneas de lombriz compostera Eisenia fetida expuestas a suelos contaminados con hidrocarburos y realización de bioensayos. 3. 4. 5. PUBLICACIONES RECIENTES EN LOS TEMAS DE ECOTOXICOLOGÍA Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS 1. ---2. 3. 4. 5. CAPACIDAD ANALÍTICA Matrices ambientales que analiza: Agua dulce Agua Marina Sedimentos Suelos Otros X X Tipos de contaminantes que analiza: Metales: Plaguicidas: Compuestos orgánicos: Otros: - Pruebas biológicas que realiza: Bioensayos con: - Cangrejo violinista (Uca princeps).. - Lombriz compostera (Eisenia fetida) Biomarcadores en: - A nivel molecular: Ensayo cometa (genotoxicidad) 32 A nivel bioquímico: activación de la enzima Glutatión-S-Tansferasa. A nivel de organismo: Factor de condición múltiple; Índice Hepatosomático y Gonadosomático y mortalidad. Pruebas certificadas (Mencionar que tipo de certificación y su vigencia): ------- Infraestructura con la que cuenta: Equipo de laboratorio Mismo material del que dispone la Dra. Silke Cram en el Laboratorio de Análisis Físicos y Químicos del Ambiente en el Instituto de Geografía, UNAM. Dado que me encuentro temporalmente trabajando con ella, esta parte corresponde al material del que ella dispone. Cultivo y mantenimiento de organismos y cepas (certificadas o no) - Mantenimiento de cangrejo violinista Uca princeps. - Mantenimiento de lombriz compostera. Eisenia fetida. Compuestos de referencia certificados ------Personal disponible ---Disposición para dar capacitación a otros usuarios en las pruebas que realiza - Buena. 33 CUESTIONARIO DATOS GENERALES Nombre del investigador: María del Carmen Cuevas Díaz Institución (donde labora actualmente): Universidad Veracruzana Dependencia de adscripción: Área o departamento: Fac. Ciencias Coatzacoalcos Ärea Técnica Grupo de investigación: Energia y medio ambiente Puesto del Investigador: Dirección de la institución: Mtro de Tiempo Completo. Coordinador de Laboratorio Av. Universidad Km 7.5 Coatzacoalcos, Ver. Teléfono: 01(921)21-1-57-00 ext 2 Fax: 01(921)21-1-57-00 ext 2 Dirección electrónica: ccuevas@uv.mx marycarm81@hotmail.com Químicas Campus FORMACIÓN PROFESIONAL Licenciatura: Químico Farmacéutico Biólogo Maestría: Ingeniería Ambiental Estudios de doctorado en Biotecnología Ambiental 7° cuatrimestre CINVESTAV-IPN Experiencia docente relacionada al tema de ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos Toxicología ambiental a nivel medio superior Proyectos realizados en ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos Actualmente como parte de la tesis doctoral PRINCIPALES LINEAS DE INVESTIGACIÓN EN ECOTOXICOLOGÍA Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS 1.Medio ambiente: suelo. Ecotoxicología de suelo 2. Medio ambiente: suelo. Suelos contaminados con hidrocarburos 3. 4. 34 5. PUBLICACIONES RECIENTES EN LOS TEMAS DE ECOTOXICOLOGÍA Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS 1. 2. 3. 4. 5. CAPACIDAD ANALÍTICA Matrices ambientales que analiza: Agua dulce Agua Marina Sedimentos Suelos Contaminados con hidrocarburos Otros Tipos de contaminantes que analiza: Metales: Plaguicidas: Compuestos orgánicos: TPH, HAP´s Otros: Pruebas biológicas que realiza: Bioensayos con: Lombrices, plantas y se está por iniciar con enzimas para suelo así como con Pseudomona putida Biomarcadores en: Pruebas certificadas (Mencionar que tipo de certificación y su vigencia): 35 Infraestructura con la que cuenta: Equipo de laboratorio Vortex, espectrofotómetro, refrigerador, estufa, balanza analítica, potenciómetro, centrífuga, bomba de vacío, cromatógrafo de gases Cultivo y mantenimiento de organismos y cepas (certificadas o no) Eisenia andrei, semillas de Lactuca sativa, Triticum aestivum Compuestos de referencia certificados Personal disponible Disposición para dar capacitación a otros usuarios en las pruebas que realiza Bioensayo con Eisenia andrei para suelo 36 CUESTIONARIO DATOS GENERALES Nombre del investigador: M.C. Leticia García Rico Institución (donde labora actualmente): Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A.C Dependencia de adscripción: Área o departamento: Ciencia de los Alimentos Grupo de investigación: Toxicología Puesto del Investigador: Investigador Titular Dirección de la institución: Teléfono: Km 0.5 Carretera a la Victoria, Hermosillo, Sonora (662)2892400 Fax: (662) 2800058 Dirección electrónica: lgarciar@cascabel.ciad.mx FORMACIÓN PROFESIONAL Profesional: Licenciatura en Química, Universidad Autónoma de Baja California Escuela de Ciencias Químicas (Julio 1977-Junio 1982). Posgrado: Maestro en Ciencias con Especialidad en Nutrición y Alimentos, CIAD, A.C. (Septiembre 1983-Septiembre de 1985). Experiencia docente relacionada al tema de ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos Impartición de los cursos: Tópicos de toxicología de los alimentos, Técnicas de detección de residuos tóxicos en el programa de posgrado del CIAD, A.C. Proyectos realizados en ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos • Detección de metales pesados en áreas de cultivos ostrícolas (sedimento, agua y ostión Crassostrea gigas) localizados en el estado de Sonora. 1998. SIMAC. • Biodisponibilidad de metales pesados en sedimentos marinos superficiales de los centros ostrícolas del estado de Sonora. 2000-2002. SIMAC. • Caracterización de las fracciones de metales potencialmente biodisponibles en sedimento marino y su bioacumulación en ostión de la zona ostrícola de Bacochibampo, Sonora. CIAD-UNISON. 2004. • Evaluación de los niveles de concentración de metales pesados (disueltos y 37 suspendidos) en agua superficial, su bioacumulación y potencial tóxico en ostión (Crassostrea gigas). Sagarpa-conacyt 2004. PRINCIPALES LINEAS DE INVESTIGACIÓN EN ECOTOXICOLOGÍA Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS 1. Química Ambiental 2.Ecotoxicología de sedimentos 3. Concentración, destino, transporte de contaminantes metálicos 4. 5. PUBLICACIONES RECIENTES EN LOS TEMAS DE ECOTOXICOLOGÍA Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS 1. Leticia García-Rico, María Sonia Soto-Cruz, Martín E. Jara-Marini, Agustín Gómez- Álvarez. (2004) Fracciones geoquímicas de Cd, Cu y Pb en sedimentos marinos superficiales de zonas ostrícolas del estado de Sonora, México. Rev. Int. Contam. Amb. 3(20). 2. Jaqueline García-Hernández, Leticia García-Rico, Martin E. Jara-Marini, Ramón Barraza-Guardado, Amy Hudson Weaver. (2004) Concentrations of trace metals during a harmful algal bloom (hab) in the KUN KAAK BAY, SONORA, MEXICO 3. L. García-Rico, Mercedes Valenzuela Rodríguez, Jara-Marini M (enviado 2004). Mercury distribution in sediments from the Sonoran Coast, Mexico. Environmental Pollution 4. L. García-Rico and M.E. Jara-Marini (enviado 2005). Distribution of arsenic in three geochemical fractions of surface sediments from coastal areas of Sonora, Mexico (Gulf of California). . Bull. Environ. Contam. 5. L. García-Rico, S. Wilson-Cruz, M.C. Frasquillo-Félix, M.E. Jara-Marini. (enviado 2003). Total Metals in Intertidal Surface Sediment of oyster culture areas in Sonora, Mexico. Bull. Environ. Contam. 70(6):1235-1241 CAPACIDAD ANALÍTICA Matrices ambientales que analiza: Agua dulce Agua Marina √ Sedimentos √ Suelos Otros Organismos Tipos de contaminantes que analiza: Metales: Cadmio, cobre, plomo, zinc, cromo, mercurio, arsénico 38 Plaguicidas: Compuestos orgánicos: Otros: parámetros fisicoquímicos Pruebas biológicas que realiza: Bioensayos con: Biomarcadores en: sistemas marinos Pruebas certificadas (Mencionar que tipo de certificación y su vigencia): Detección de metales en alimentos- EMA (3 años) Infraestructura con la que cuenta: Laboratorio equipado para llevar a cabo la determinación de parámetros fisicoquímicos y la detección de metales pesados en sistemas marinos. Equipo mayor: espectrofotómetro de absorción atómica (flama, horno de grafito, generador de vapor e hidruros), horno de microondas, balanza analítica, congelador, refrigerador, sistema de computo, etc. Cultivo y mantenimiento de organismos y cepas (certificadas o no) Compuestos de referencia certificados Soluciones estándar de metales certificadas Material de referencia certificado (NIST, CNRC) Personal disponible 2 investigadores 2 técnicos Disposición para dar capacitación a otros usuarios en las pruebas que realiza Se pueden organizar cursos de capacitación 39 CUESTIONARIO DATOS GENERALES Nombre del investigador: Gerardo Gold Bouchot Institución (donde labora actualmente): CINVESTAV Dependencia de adscripción: Unidad Mérida Área o departamento: Departamento de Recursos del Mar Grupo de investigación: Impacto y salud Ambiental Puesto del Investigador: Investigador Titular Dirección de la institución: Teléfono: Km 6 Antigua Carretera a Progreso Mérida, Yucatán 97310 (999) 981 2960 Ext. 523 Fax: (999) 981 2334 Dirección electrónica: ggold@mda.cinvestav.mx FORMACIÓN PROFESIONAL Oceanólogo químico por la UABC. 1979. Maestría en Química, University of the Paciific. 1985. Doctorado en Ciencias, en Ciencias Marinas. Cinvestav, 1991. Experiencia docente relacionada al tema de ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos Profesor del curso de “Contaminación Marina”, Cinvestav Mérida, por 20 años. Profesor del diplomado “Contaminación e Impacto Ambiental”, Universidad Autónoma de Campeche. Durante cuatro años. Proyectos realizados en ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos Caracterización ambiental del sistema lacustre San Miguel, municipio de Reforma, Chiapas. Diagnóstico del recurso camarón en el sur del Golfo de México. Diagnóstico de la mortalidad de ostiones (Crassostrea virginica) en Tabasco. Contaminación y biomarcadores en el Bagre Maya Ariopsis assimilis de la Bahía de Chetumal. PRINCIPALES LINEAS DE INVESTIGACIÓN EN ECOTOXICOLOGÍA Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS 1. Determinación analítica de sustancias tóxicas en muestras acuáticas. 2. Desarrollo y validación de biomarcadores en organismos acuáticos. 40 3. Relación, mediante técnicas estadísticas multivariadas, entre las concentraciones de sustancias tóxicas en organismos y los niveles de biomarcadores en los mismos organismos. PUBLICACIONES RECIENTES EN LOS TEMAS DE ECOTOXICOLOGÍA Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS 1. Gold-Bouchot G., Zapata-Perez O., Rodriguez-Fuentes G., Ceja-Moreno V., del RíoGarcia M. In Press. Biomarkers and Pollutants in the Nile Tilapia, Oreochromis niloticus, in Four Lakes from San Miguel, Chiapas, Mexico. International Journal of Environment and Pollution. 2. Zapata-Pérez O., Del-Río M., Domínguez J., Chan R., Ceja V. and Gold-Bouchot G. In Press. Preliminary studies of biochemical changes (ethoxycoumarin O-deethylase activities and vitellogenin induction) in two species of shrimp (Farfantapeneaus duorarum and Litopenaeus setiferus) from the Gulf of Mexico. Ecotoxicology and Environmental Safety. 3. Rodríguez-Fuentes G. and Gold-Bouchot G. 2004. Characterization of Cholinesterase Activity from Different Tissues of Nile Tilapia (Oreochromis niloticus). Marine Environmental Research 58: 505-509. 4. Leaños-Castañeda O., Gold-Bouchot G., Van der Kraak G., Lister A., Ceja-Moreno V., and Simá-Álvarez R. 2004. An Aromatase Inhibitor and Tamoxifen Decrease Plasma Levels of o,p’-DDT and its Metabolites in Nile Tilapia (Oreochromis niloticus). Marine Environmental Research 58: 337-342. 5. Noreña-Barroso E., Simá-Alvarez R., Gold-Bouchot G. and Zapata-Perez O. 2004. Persistent Organic Pollutants and Histological Lesions in Mayan Catfish Ariopsis assimilis from the Bay of Chetumal, Mexico. Marine Pollution Bulletin 48: 263-269. CAPACIDAD ANALÍTICA Matrices ambientales que analiza: Agua dulce Agua, organismos. Agua Marina Agua, organismos. Sedimentos Sedimentos, material extraíble, fases sedimentológicas. Suelos Sedimentos, material extraíble, fases sedimentológicas. Otros Tipos de contaminantes que analiza: Metales: Cd, Cu, Zn, Hg, Cr, Pb, V, Ni, Plaguicidas: Aldrín, Endrín, Dieldrín, DDT, Endosulfán I y II, Metoxicloro, Triclorobenceno, Pentaclorobenceno, Hexaclorobenceno, hexaclorociclohexanos, Mirex, Pentacloroanisol. 41 Compuestos orgánicos: Hidrocarburos policíclicos aromáticos (PAHs). Otros: Bifenilos policlorados (PCBs). Pruebas biológicas que realiza: Bioensayos con: Tilapia nilótica (Oreochromis niloticus) Bagres (Ariopsis assimilis y A. felis) Camarón (Farfantapenaeus spp.) Biomarcadores en: Peces, crustáceos, moluscos. Microalgas Pastos Marinos Pruebas certificadas (Mencionar que tipo de certificación y su vigencia): Ninguna. Solo hemos participado en ejercicios internacionales de intercalibración, organizados por el laboratorio de Mónaco de la AIEA. Infraestructura con la que cuenta: Equipo de laboratorio Dos cromatógrafos de gases. Dos HPLC. Un equipo de absorción atómica. Centrífuga. Espetrofluorómetro. Espectrofotómetro. Cultivo y mantenimiento de organismos y cepas (certificadas o no) Cultivos de microalgas. Cultivos de microalgas Tilapia nilótica Langostinos Compuestos de referencia certificados Materiales certificados de referencia para distintas matrices y analitos. Personal disponible De planta un auxiliar de laboratorio en mi laboratorio. 42 Varios técnicos en cultivos, en distintos laboratorios. Técnicos en histología, en otros laboratorios. Disposición para dar capacitación a otros usuarios en las pruebas que realiza Tenemos disposición absoluta para capacitar a otros usuarios. Hemos capacitado a personal de la Armada de México, a participantes del Proyecto del Sistema Arrecifal Mesoamericano de México, Belice, Honduras y Guatemala. 43 CUESTIONARIO DATOS GENERALES Nombre del investigador: Institución (donde actualmente): Xochitl Guzmán García labora UAM-I. Universidad Autónoma Metropolitana Dependencia de adscripción: División de Ciencias de la Salud Área o departamento: Hidrobiología Grupo de investigación: Ecotoxicología Puesto del Investigador: Profesor Titular Dirección de la institución: Teléfono: Av. San Rafael Atlixco No.186 col Vicentina. Delegación Iztapalapa 58 04 64 74 Fax: 58 04 47 38 Dirección electrónica: Xgg@xanum.uam.mx FORMACIÓN PROFESIONAL Licenciatura en Biología; Maestría en Biología Experimental; Doctorado en Biología Experimental (Estudiante) Experiencia docente relacionada al tema de ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos Análisis bacteriológico en agua, sedimento y ostión de lagunas costeras. Curso de Ecotoxicología Seminarios de investigación determinación de metales, histopatología, cinéticas de acumulación y eliminación de substancias tóxicas. Proyectos realizados en ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos Determinación de la calidad de agua, sedimentos y especies de interes comercial. Determinación de especies patógenas y vibrio Cholera en ostión, agua y plancton. Efectos de Cadmio y Cromo en Ostión Crassostrea virginica. Biomarcadores en organismos acuáticos para monitoreo ambiental Histopatología en especies indicadoras de Contaminación 44 PRINCIPALES LINEAS DE INVESTIGACIÓN EN ECOTOXICOLOGÍA Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS 1. Biomonitoreo con Ostión Crassostrea virginica. 2. Efectos histopatológicos en organismos acuáticos 3. Determinación y efecto de metales tóxicos 4. Bioensayos subletales y letales con organismos acuáticos 5. Aplicación de biomarcadores en especies acuaticas PUBLICACIONES RECIENTES EN LOS TEMAS DE ECOTOXICOLOGÍA Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS 1. Calidad Sanitaria del ostión de la laguna de Tamiahua, Ver. 2. 3. 4. 5. CAPACIDAD ANALÍTICA Matrices ambientales que analiza: Agua dulce X Agua Marina x Sedimentos x Suelos Otros Organismos acuáticos Tipos de contaminantes que analiza: Metales: x Plaguicidas: Compuestos orgánicos: Otros: Efectos en los organismos con biomarcadores Pruebas biológicas que realiza: Bioensayos con: Bivalvos Biomarcadores en: 45 Bivalvos Peces Invertebrados Pruebas certificadas (Mencionar que tipo de certificación y su vigencia): Infraestructura con la que cuenta: Equipo de laboratorio Procesador de tejidos, microtomo, sistema de transferencia de tejidos, Centro de inclusión de tejidos, tren de Tinción, afiladora de cuchillas, Horno de Digestión CEM, Centrifugas, Homogenizador de tejidos Ultraturrax, Microscopios, equipo de cristaleria, campana de extracción y flujo laminar, incubadoras, quipo para la determinación de la calidad de agua, sistema de maduración de agua marina. Cultivo y mantenimiento de organismos y cepas (certificadas o no) Compuestos de referencia certificados Personal disponible Disposición para dar capacitación a otros usuarios en las pruebas que realiza si 46 CUESTIONARIO DE INVESTIGACIÓN EN ECOTOXICOLOGÍA Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS DATOS GENERALES Nombre del investigador: Institución (donde labora actualmente): Dependencia de adscripción: Área o departamento: Grupo de investigación: Puesto del Investigador: Dirección de la institución: Teléfono: Fax: Dirección electrónica: FORMACIÓN PROFESIONAL Anne Hansen Instituto Mexicano de Tecnología del Agua Coordinación de Tecnología Hidrológica Hidrogeoquímica Especialista Titular “B” Paseo Cuanhnáhuac # Jiutepec, Morelos (777) 32-93-600 Ext. 610 (777) 32-93-682 anisen@tlaloc.imta.mx 8532, 62530, Licenciatura en química Maestría y doctorado en Ciencias del Mar (Oceanografía química) Experiencia docente relacionada al tema de ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos Modelación ambiental Proyectos realizados en ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos Biorreactor para la producción de cepas biodegradadoras Experimentos de biodegradación mediante dilución isotópica PRINCIPALES LINEAS DE INVESTIGACIÓN EN ECOTOXICOLOGÍA Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS 1. Biodegradación de COP’s 2. Bioacumulación de COP’s 3. Producción de cepas en biorreactor 4. 5. PUBLICACIONES RECIENTES EN LOS TEMAS DE ECOTOXICOLOGÍA Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS 1. 47 2. 3. 4. 5. CAPACIDAD ANALÍTICA Matrices ambientales que analiza: Agua dulce Agua Marina Sedimentos Suelos Otros X X X Tipos de contaminantes que analiza: Metales: Plaguicidas: Compuestos orgánicos: Otros: X X X Pruebas biológicas que realiza: Bioensayos con: Crecimiento de cepas Biodegradacipon de COP’s Bioacumulación de metales Biomarcadores en: Pruebas certificadas (Mencionar que tipo de certificación y su vigencia): Infraestructura con la que cuenta: Equipo de laboratorio Laboratorio para investigación con fuentes radioactivas abiertas Contador gamma Contador de centelleo líquido Cultivo y mantenimiento de organismos y cepas (certificadas o no) 48 Cultivo de hongos y bacterias (no certificados) Compuestos de referencia certificados Isótopos radioactivos 210Pb, 14C, 134Cs, 109Cd, Zn, 2,4-D, atrazina Personal disponible 2 Investigadores titulares 4 Investigadores asociados 1 Estudiante de doctorado, 2 de maestría y 1 de licenciatura Disposición para dar capacitación a otros usuarios en las pruebas que realiza Sí, pero se requiere usar seguridad radiológica para trabajar con fuentes abiertas de radiación. 49 CUESTIONARIO DATOS GENERALES Nombre del investigador: Institución (donde labora actualmente): Dependencia de adscripción: Área o departamento: Grupo de investigación: Puesto del Investigador: Dirección de la institución: Teléfono: Fax: Dirección electrónica: FORMACIÓN PROFESIONAL Lorenzo Heyer Rodríguez Universidad Autónoma de Tamaulipas UAM Agronomía y Ciencias Laboratorio de Toxicología Acuática Química y Toxicología Ambiental Titular Centro Universitario Victoria, Ciudad Victoria, Tamaulipas (834) 31-81-718 (834) 31-81-718 lheyer@uat.edu.mx Químico Clínico Biólogo. Doctorado en Ciencias. Especialidad en Salud Ambiental Experiencia docente relacionada al tema de ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos Proyectos realizados en ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos Estudios ecotoxicológicos de HCB y HCBD en pantanos de Lousiana, EUA. Estudios biogeoquímicos de COP (SAGARPA-CONACyT) PRINCIPALES LINEAS DE INVESTIGACIÓN EN ECOTOXICOLOGÍA Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS 1. Biomarcadores de Contaminación 2. Toxicología de plaguicidas 3. 4. 5. PUBLICACIONES RECIENTES EN LOS TEMAS DE ECOTOXICOLOGÍA Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS 1. 2. 3. 4. 5. 50 CAPACIDAD ANALÍTICA Matrices ambientales que analiza: Agua dulce Agua Marina Sedimentos Suelos Otros X X X Tipos de contaminantes que analiza: Metales: Plaguicidas: Compuestos orgánicos: X X Otros: Pruebas biológicas que realiza: Bioensayos con: Brachidanio danio, dosis letales y bioacumulación Biomarcadores en: Peces y organismos bénticos Pruebas certificadas (Mencionar que tipo de certificación y su vigencia): Infraestructura con la que cuenta: Equipo de laboratorio Cromatografía de gases con detectores de ECD, FID, NPD Cultivo y mantenimiento de organismos y cepas (certificadas o no) Compuestos de referencia certificados Personal disponible 2 Investigadores 2 Becarios de pregrado Disposición para dar capacitación a otros usuarios en las pruebas que realiza Si 51 52 CUESTIONARIO DATOS GENERALES Nombre del investigador: Eduardo Osiris Madrigal Santillán Institución (donde labora actualmente): Instituto de Ciencias de la Salud. Universidad Autónoma del Estado de Hidalgo. Escuela Nacional de Ciencias Biológicas IPN Dependencia de adscripción: Escuela de Medicina ICSA-UAEH Área o departamento: Grupo de investigación: Puesto del Investigador: Dirección de la institución: Laboratorio de Farmacología y Toxicología ICSA-UAEH. Laboratorio de Genética ENCB-IPN Actualmente soy el líder del cuerpo académico de toxicología clínica en la UAE Jefe del Laboratorio de Farmacología Teléfono: Abasolo 600 cp 42000 Col. Pachuca Hgo. 01 771 71 720 00 ext 5107 0 5117 Fax: Mismo telefono ext 5111 Dirección electrónica: eomsmx@yahoo.com.mx madrigal@uaeh.reduaeh.mx Centro FORMACIÓN PROFESIONAL Licenciatura en Químico Bacteriólogo Parasitólogo Maestría en Ciencias Químicobiologicas con especialidad en Genética Toxicológica Doctorado en Ciencias Químicobiologicas con especialidad en Genética Toxicológica Experiencia docente relacionada al tema de ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos Desde 1999 estoy adscrito al área académica de Medicina en la UAE en donde participo activamente en el curso teórico y práctico de Farmacología y Toxicología. Además, participo continuamente en la Maestría de Ciencias Químicobiologicas de la ENCB-IPN. Y mi s actividades de docente iniciaron en el año de 1992. Actualmente soy asesor de tesis de licenciatura y posgrado. Proyectos realizados en ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos Estos son los proyectos en los que he participado: 1.- Estudio histopatológico en hígado de ratas expuestas al metil terbutil éter y plomo. 53 2.- Efecto genotóxico del maíz contaminado con AFB1 y su inhibición mediante la adición de Saccharomyces cerevisiae. 3.- Evaluación subcrónica de la capacidad de la imipramina y desipramina para inducir micronúcleos in vivo. 4.- Antigenotoxicidad del jugo de toronja y la naringina contra la ifosfamida y el metil metano sulfonato. 5.- Efecto genotóxico producido por Cadmio y zinc en Daphnia pulex 6.- Capacidad antigenotóxica y antioxidante del aceite esencial de manzanilla. 7.- Antigenotoxicidad del manano, glucano y glucomanano contra el daño producido por la AFB1. 8.- Efecto de sedimentos en hígado de ratas y metalotionenina sobre la genotoxicidad del zinc en Dugesia dorotocephala. PRINCIPALES LINEAS DE INVESTIGACIÓN EN ECOTOXICOLOGÍA Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS 1. Genética Toxicológica en mamíferos (Intercambios de Cromátides Hermanas, Micronúcleos, Lipoperoxidación y Ensayo Cometa) 2. Genética Toxicológica en peces (Intercambios de Cromátides Hermanas, Micronúcleos, Lipoperoxidación y Ensayo Cometa) 3. Toxicología preclínica (Ensayos agudos, subcrónicos y crónicos, evaluación toxicológica y farmacológica) 4. 5. PUBLICACIONES RECIENTES EN LOS TEMAS DE ECOTOXICOLOGÍA Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS 1. Madrigal BE, Madrigal SE, Cassani M, Leyva S. (2004) Efecto genotóxico del asbesto comercial en cultivo de linfocitos humanos. Revista Mexicana de Ciencias Farmacéuticas. 35: 20-24 2. Madrigal S,E Madrigal BE, Cassani M, Leyva S, Piña A. (2002) Efecto genotóxico de la crocidolita en cultivo de linfocitos humanos. Bioquimia. 27: 7-11 3. Madrigal-Bujaidar E, Márquez-Márquez R, Reyes A, Madrigal-Santillán E. (2005) Antigenotoxic effect of Saccharomyces cerevisiae on the damage produced in mice fed with aflatoxin B1contaminated corn. International Journal of Food Sciences and Nutrition. En prensa 4. Madrigal-Bujaidar E, Madrigal-Santillán E, Pages N, Grigorij K, Chamorro G. (2002) Etude de L´antigénotoxicité de diferentes substances pour réduire la toxicité de´l aflatoxine B1 chez la souris. Toxines et recherches biomedicales. France Elsevier. 123-132 5. Madrigal-Bujaidar E, Madrigal-Santillán E, Vera CA (2004) Antigenotoxic effect of glucan against the damage produced by aflatoxin B1 in mouse hepatocytes.Toxicology and applied Pharmacology 197 (3):261 54 CAPACIDAD ANALÍTICA Matrices ambientales que analiza: Agua dulce Agua Marina Sedimentos Suelos Otros Tejidos Tipos de contaminantes que analiza: Metales: Plaguicidas: Malation, paration Compuestos orgánicos: Otros: Compuestos carcinogénicos y genotóxicos Pruebas biológicas que realiza: Bioensayos con: 1.- Roedores (ICH, MN, Lipoperoxidación, Ensayo Cometa) 2.- Peces (MN, Ensayo Cometa) 3.- Prueba de Ames Biomarcadores en: Pruebas certificadas (Mencionar que tipo de certificación y su vigencia): Infraestructura con la que cuenta: Equipo de laboratorio Se cuenta con el material y equipo indispensable para realizar las pruebas antes mencionadas. Cultivo y mantenimiento de organismos y cepas (certificadas o no) Compuestos de referencia certificados Personal disponible 55 Disposición para dar capacitación a otros usuarios en las pruebas que realiza Estamos en toda la disposición. Estaremos muy contentos de recibir nuevos colegas y participar con otras instituciones. 56 CUESTIONARIO DATOS GENERALES Nombre del investigador: Dr. Fernando Martínez Jerónimo Institución (donde labora actualmente): Instituto Politécnico Nacional Dependencia de adscripción: Escuela Nacional de Ciencias Biológicas Área o departamento: Departamento de Zoología Grupo de investigación: Lab. de Hidrobiología Experimental y Ecotoxicología Presidente de Academia Puesto del Investigador: Dirección de la institución: Teléfono: Carpio esq. Plan de Aayala S/N, Col. Sto. Tomás. Del. Miguel Hidalgo. México D. F. 11340. (55) 5729-6000 ext. 62424 y 62517 Fax: (55) 5396-3503 Dirección electrónica: fjeroni@ipn.mx FORMACIÓN PROFESIONAL Licenciatura en Biología Maestría en Ciencias con Especialidad en Ecología Doctorado en Ciencias con Especialidad en Ecología Experiencia docente relacionada al tema de ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos Ecología y Contaminación Ambiental (Licenciatura, carrera de Ingeniero en Sistemas Ambientales Contaminación Acuática y Toxicología (Licenciatura, Carrera de Biólogo) Ecotoxicología Acuática y Contaminación (Posgrado, Maestría y Doctorado en Ecología) Proyectos realizados en ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos Aprox. 10 Proyectos Institucionales 2 proyectos Vinculados I Proyecto Conacyt PRINCIPALES LINEAS DE INVESTIGACIÓN EN ECOTOXICOLOGÍA Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS 1. Ecotoxicología con Cladóceros dulceacuícolas 2.Ecotoxicología con microalgas y otras especies de invertebrados y vertebrados 57 dulceacuícolas 3.Hidrobiología Experimental de especies de agua dulce 4.Toxinas y sustancias bioactivas de Cianobacterias 5. PUBLICACIONES RECIENTES EN LOS TEMAS DE ECOTOXICOLOGÍA Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS 1. Ver anexo. 2. 3. 4. 5. CAPACIDAD ANALÍTICA Matrices ambientales que analiza: Agua dulce Principalmente sistemas dulceacuícolas Agua Marina Sedimentos Suelos Otros Tipos de contaminantes que analiza: Metales: Metales Pesados Plaguicidas: Compuestos orgánicos: Petróleo e hidrocarburos Otros: Pruebas biológicas que realiza: Bioensayos con: Daphnia magna, Selenastrum capricornutum (Raphidocelis subcapitata), Pomacea patula, Cyprinus carpio, Onchorhynchus mikis Biomarcadores en: Pomacea patula y P. flagelata 58 Pruebas certificadas (Mencionar que tipo de certificación y su vigencia): Daphnia magna, Selenastrum capricornutum y Poecilia reticulata (en proceso de certificación) Infraestructura con la que cuenta: Equipo de laboratorio Cámaras bioclimáticas, equipo e infraestructura para trabajo en condiciones de esterilidad, bombas de vacío, centrífugas, equipos digitales para cuantificación de oxígeno disuelto, salinidad, conductividad, pH. Equipo Hach poara determinaciones químicas, equipo óptico, etc. Cultivo y mantenimiento de organismos y cepas (certificadas o no) Cepario de microalgas y cianobacterias Cepario de Cladoceros Compuestos de referencia certificados Cromo hexavalente Personal disponible 2 Profesores de tiempo completo 2 Profesores de ¾ de iempo I Técnico Docente Disposición para dar capacitación a otros usuarios en las pruebas que realiza Constante, principalmente por vía institucional Relación de publicaciones a) REVISTAS NACIONALES CON JURADO 1. Martínez-Jerónimo, F, 1986. Aislamiento y cultivo preliminar de dos especies de rotíferos eurihalinos. Zoología Informa, 6:22-27. 2. Martínez-Jerónimo, F., R. Ramírez G., R. Villaseñor C., G. Rios B. y F.Espinosa Ch., 1988. Cultivos de apoyo para acuacultura: producción de alimento vivo. Acuavisión, 14: 18-24. 3. Martínez-Jerónimo, F., 1990. Contaminación acuática y toxicología. Parte I. Zoología Informa, 17-18: 32-49. 4. Martínez-Jerónimo, F., 1990. Contaminación acuática y toxicología. Parte II. Zoología Informa, 19-20: 3-20. 5. Martínez-Jerónimo, F., 1991. Contaminación acuática y toxicología. Parte III. Zoología Informa, 21: 1-17. 59 6. Martínez-Jerónimo, F., 1991. La importancia de los bioensayos en la evaluación de la toxicidad acuática. Universidad: Ciencia y Tecnología, 1(4):3744. 7. Espinosa-Chávez, F., F. Martínez-Jerónimo y R. Ramírez-Granados, 1992. Tasa de filtración y cultivo de Moina macrocopa (Crustacea: Cladocera) alimentada con Scenedesmus incrassatulus (Chlorophyceae) y estiércol vacuno digerido. An. Inst. Cienc. del Mar y Limnol. Univ. Nal. Autón. México, 19(2):137-142. 8. Espinosa.Chávez, F. y F. Martínez-Jerónimo, 1993. El cultivo de protozoarios de vida libre como una forma de apoyo a la docencia. Zoología Informa, 25: 4548. 9. Martínez-Jerónimo, F. 1993. Piscicultura: La biotecnología para la producción de peces. Caminos Abiertos, Universidad Pedagógica Nacional, 27: 26-28. 10. Martínez-Jerónimo, F., R. Villaseñor, F. Espinosa & G. Rios, (1997). Metodología para la producción de neonatos de Daphnia magna (Anomopoda: Daphnidae), como organismo de prueba en toxicología acuática. Zoología Informa, 36-37: 59-81. 11. Villaseñor Córdova, R., G. Rios, F. Martínez-Jerónimo, y R. Ramírez G., (1997). Desarrollo de un cultivo de Chironomus plumosus (Diptera: Chironomidae), a escala de laboratorio. Zoología Informa, 36-37: 45-58. 12. Espinosa-Chávez, F., F. Martínez-Jerónimo y R. Ramírez-Granados, (1997). Cultivo intensivo de Moina macrocopa (Anomopoda: Moinidae). Zoología Informa, 36-37: 27-43. 13. Martínez-Jerónimo, F., (2003). Effect of photoperiod and temperature on the somatic growth of Daphnia magna (Branchiopoda: Anomopoda). Scientia Naturae, 6(1): 15-22. 14. Ruiz-Ramírez R., F. Espinosa-Chávez & F. Martínez-Jerónimo (en prensa). El género Pomacea (Caenogastropoda: Ampullaridae). Importancia social, económica, biológica y pesquera. Zoología Informa. b) REVISTAS INTERNACIONALES Y PADRÓN CONACYT 1. Martínez-Jerónimo, F. y F. Espinosa-Chávez, 1991. Efecto de la salinidad, cantidad de inóculo y volúmen de cosecha en el crecimiento poblacional de Dunaliella tertiolecta (Chlorophyceae: Volvocales). Rev. Lat-amer. Microbiol., 33: 181-189. 2. Martínez-Jerónimo, F. & A. Gutierrez Valdivia. 1991. Fecundity, reproduction, and growth of Moina macrocopa fed different algae. Hydrobiologia, 222: 49-55. 3. Espinosa-Chávez, F., F. Martínez-Jerónimo y T. Gutiérrez-Castrejón, 1992. Eficiencia comparativa de la capacidad nitrificante de filtros biológicos 60 construidos con grava de sílice o tezontle. Rev. Lat-amer. Microbiol., 34:333337. 4. Martínez-Jerónimo, F., R. Villaseñor, F. Espinosa y G. Ríos, 1993. The use of life-tables and application factors for evaluating the chronic toxicity of Kraft mill wastes to Daphnia magna. Bull. Environ. Contam. Toxicol., 50:377-384. 5. Martínez-Jerónimo, F., R. Villaseñor, G. Rios & F. Espinosa, 1994. Effect of food type and concentration on the survival, longevity, and reproduction of Daphnia magna. Hydrobiologia. 287: 207-214. 6. Martínez-Jerónimo. F. y F. Espinosa-Chávez, 1994. A laboratory-scale system for mass culture of freshwater microalgae in polyethylene bags: J Appl. Phycol. 6: 423-425. 7. Martínez-Jerónimo. F. y R. García-González, (1994/1995). Effect of food concentration on the chronic toxicity of Sodium Dodecyl Sulfate to Daphnia magna. J. Aquatic Ecosystem Health 3: 247-253. 8. Martínez-Jerónimo, F., F. Espinosa, R. Villaseñor & G. Rios, (1997). Primer registro de Moina hutchinsoni (Daphniiformes: Moinidae) en México. Revista de Biología Tropical, 45(3): 1268-1269. 9. Ramírez-Olvera, R., M. Coria-Cedillo, R. O. Cañizares-Villanueva, F. Martínez-Jerónimo, T. Ponce-Noyola & E. Rios-Leal, (2000). Growth evaluation and bioproducts characterization of Calothrix sp. Bioresource Technology, 72: 121-124. 10. Cañizares-Villanueva, R. O., F. Martínez-Jerónimo & F. Espinosa-Chávez, (2000). Acute Toxicity to Daphnia magna of effluents containing Cd, Zn, and a mixture Cd-Zn, after metal removal by Chlorella vulgaris. Environmental Toxicology, 15(3): 160-164. 11. Martínez-Jerónimo, F., F. Espinosa-Chávez & R. Villaseñor-Córdova, (2000). Effect of culture volume and adult density on the neonate production of Daphnia magna, as test organisms for aquatic toxicity tests. Environmental Toxicology, 15(3): 155-159. 12. Rodríguez-Estrada, J., R. Villaseñor-Córdova & F. Martínez-Jerónimo (2003). Efecto de la temperatura y tipo de alimento en el cultivo de Moina micrura (Kurz, 1874) (Anomopoda: Moinidae) en condiciones de laboratorio. Hidrobiológica, 13: 239-245. 13. Carreón-Palau L., E. Uria-Galicia, F. Espinosa-Chávez & F. MartínezJerónimo (2003). Desarrollo morfológico e histológico del sistema reproductor de Pomacea patula catemacensis (Baker, 1922) (Mollusca, Caenogastropoda: Ampullariidae. Revista Chilena de Historia Natural, 76:665-680. 14. Domínguez-Bocanegra, A. R., Guerrero Legarreta, I., F. Martinez Jerónimo, & A. Tomasini Campocosio, (2004). Influence of environmental and nutritional factors in the production of astaxanthin from Haematococcus pluvialis. Bioresource Technology, 92:209-214. 61 15. Peña-Castro, J. M., F. Martínez-Jerónimo, F. Esparza-García & R. O. Cañizares-Villanueva, (2004). Heavy metals removal by the microalga Scenedesmus incrassatulus in continuous cultures. Bioresource Technology, 94(2): 219-222. 16. Martínez-Jerónimo, F., M. Elías-Gutiérrez & E. Suárez-Morales, (2004) A redescription of Moina hutchinsoni Brehm, a rare cladoceran (Branchiopoda: Anomopoda) found in remnants of a Mexican saline lake, with notes on its life history. Journal of Crustacean Biology, 24: 232-245. 17. Olvera-Hernández, E., L. Martínez-Tabche & F. Martínez-Jerónimo, (2004). Bioavailability and Effects of Malathion in Artificial Sediments on Simocephalus vetulus (Cladocera: Daphniidae). Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology. 73: 197-204. 18. Peña-Castro J. M., F. Martínez-Jerónimo, F. Esparza-García & R. O. Cañizares-Villanueva, (2004). Phenotypic plasticity in Scenedesmus incrassatulus (Chlorophyceae) in response to heavy metals stress. Chemosphere, 57: 1629-1636. 19. Espinosa-Chávez F. & F. Martínez-Jerónimo, (2004). Growth and fecundity of Pomacea patula (Caenogastropoda: Ampullariidae) when fed on gel diets of Scenedesmus incrassatulus (Chlorophyceae). The Veliger (en prensa). 20. Martínez-Jerónimo, F. & F. Espinosa-Chávez, (2004). Notes on the reproduction and survival of Moina hutchinsoni Brehm, 1937 (Moinidae: Anomopoda) grown in media of varying salinity. Aquatic Ecology. (in press). 21. Martínez-Jerónimo, F., F. Espinosa, R. Villaseñor & G. Ríos. Chronic toxicity of crude oil to Daphnia magna (Crustacea: Anomopoda). Archives of Environmental Contamination and Toxicology (In press). 22. Ruiz-Ramírez R., F. Espinosa-Chávez & F. Martínez-Jerónimo. Growth and reproduction of Pomacea patula catemacensis Baker, 1922 (Gastropoda: Ampullariidae) when fed Calothrix sp. (Cyanobacteria). Journal of the World Aquaculture Society (Aceptado) Manuscritos enviados. Un total de 3 manuscritos enviados y actualmente en la etapa de revisión en diferentes revistas internacionales. Martínez-Jerónimo, F. Demographic study of maximum salinity tolerance of Daphnia magna (Cladocera). Sometido a Journal of Plankton Research (enviado) Martínez-Jerónimo F., L. Martínez-Jerónimo & F. Espinosa-Chávez. Efecto de las condiciones de cultivo y edad de los reproductores sobre la toxicidad del Cromo en neonatos de Daphnia magna Straus 1820 (Cladocera). Sometido a Hidrobiológica (enviado). 62 Espinosa-Chávez, F., L. Victoria-Ramírez & F. Martínez-Jerónimo. Toxicidad de muestras de petróleo crudo sobre Dunaliella tertiolecta Butcher, 1959 (Chlorophyceae). Sometido a Hidrobiológica (enviado). 63 CUESTIONARIO DATOS GENERALES Nombre del investigador: Dra.Nandini Sarma Institución (donde labora actualmente): UNAM Dependencia de adscripción: Iztacala Área o departamento: Posgrado Grupo de investigación: Ecologia y Ecotoxicologia de Zooplancton Puesto del Investigador: Prof. Tit. “A”, TC. Def. Dirección de la institución: Teléfono: Av. Los Barrios, FES Iztacala, AP 314, CP 54090, Los Reyes, Iztacala, Tlalnepantla, Edo. de Mexico 56231125 Fax: 5231256 Dirección electrónica: nandini@servidor.unam.mx FORMACIÓN PROFESIONAL Doctor en Ciencias Zoológicas (Desde 1995); Sistema Nacional de Investigadores (SNI) Nivel - I Experiencia docente relacionada al tema de ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos Tutor principal de Maestría y Doctorado (UNAM) Proyectos realizados en ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos CONACyT y PAPIIT (UNAM): proyectos relacionados de ecotoxicologia de zooplancton 64 PRINCIPALES LINEAS DE INVESTIGACIÓN EN ECOTOXICOLOGÍA Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS 1. Cultivo y uso de rotiferos como organismos de bioensayo 2. Cultivo y uso de cladoceros como organismos de bioensayo 3. Cultivo y uso de ostracodos como organismos de bioensayo 4. Cultivo y uso Chlorella como organismos de bioensayo 5. Cultivo y uso de Scenedesmus como organismos de bioensayo PUBLICACIONES RECIENTES EN LOS TEMAS DE ECOTOXICOLOGÍA Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS 1. Nandini S, Mayeli SM & Sarma SSS 2004 Effect of stress on the life table demography of Moina macrocopa. Hydrobiologia 526: 245-254 2. García-García G, Nandini S & Sarma SSS 2004 The effect of cadmium on the population dynamics of Moina macrocopa and Macrothrix triserialis (Cladocera). Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology 72(4): 717-724 (SpringerVerlag, USA). 3. Sarma SSS, Núñez-Cruz HF & Nandini S 2005 Effects on the population dynamics of Brachionus rubens (Rotifera) caused by mercury and cadmium administered through medium and algal food (Chlorella vulgaris). Acta Zoologica Sinica 51(1): 46-52 4. Ramírez-Pérez T, Sarma SSS & Nandini S 2004. Effects of mercury on the life table demography of the rotifer Brachionus calyciflorus Pallas (Rotifera). Ecotoxicology 13: 535-544 5. Gama-Flores JL, Sarma SSS & Nandini S 2004 Acute and chronic toxicity of the pesticide methyl parathion to the rotifer Brachionus angularis (Rotifera) at different algal (Chlorella vulgaris) food densities. Aquatic Ecology 38: 27-36 CAPACIDAD ANALÍTICA Matrices ambientales que analiza: Agua dulce X Agua Marina Sedimentos Suelos Otros Tipos de contaminantes que analiza: Metales: X Plaguicidas: X Compuestos orgánicos: X 65 Otros: Microcystis Pruebas biológicas que realiza: Bioensayos con: Alga, Zooplancton, Larva de Pez Biomarcadores en: Pruebas certificadas (Mencionar que tipo de certificación y su vigencia): Infraestructura con la que cuenta: Varios Equipos de laboratorio Cultivo y mantenimiento de organismos y cepas (certificadas o no) Cepas de varias especies de alga y zooplancton Compuestos de referencia certificados Personal disponible Dra Nandini Sarma Dr. SSS Sarma Disposición para dar capacitación a otros usuarios en las pruebas que realiza 66 CUESTIONARIO DATOS GENERALES Nombre del investigador: Dra. Ing. Carmen Zenia Nava Vera Institución (donde labora actualmente): Universidad Autónoma de Tamaulipas Dependencia de adscripción: Fac. de Ing. Arturo Narro Siller Área o departamento: Centro de Transferencia de tecnología Grupo de investigación: Puesto del Investigador: CAEF Medio Ambiente y Desarrollo sustentable Líder de CA Dirección de la institución: Centro Universitario Tampico-Madero Teléfono: 833 2 41 2042 Fax: 833 241 2042 Dirección electrónica: Cnavave@uat.edu.mx FORMACIÓN PROFESIONAL Dra por la Universidad de Sevilla. En Formación e investigación en medio ambiente. Experiencia docente relacionada al tema de ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos Ninguna Proyectos realizados en ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos Propuesta para aplicar bioensayos en la caracterización ambiental de lixiviados de residuos de construcción y demolición de obras. En proceso 67 PRINCIPALES LINEAS DE INVESTIGACIÓN EN ECOTOXICOLOGÍA Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS 1. Caracterización ambiental de residuos de construcción 2. 3. 4. 5. PUBLICACIONES RECIENTES EN LOS TEMAS DE ECOTOXICOLOGÍA Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS 1. En revisión. Caracterización ambiental de residuos de construcción 2. 3. 4. 5. CAPACIDAD ANALÍTICA Matrices ambientales que analiza: Agua dulce xxx Agua Marina xxx Sedimentos Suelos xxx Otros Tipos de contaminantes que analiza: Metales: xxx Plaguicidas: 68 Compuestos orgánicos: xxx Otros: Compuestos inorgánicos de contaminación básica Pruebas biológicas que realiza: Bioensayos con: Están en proceso de definirse cuales serían las más adecuadas. Es un proyecto que Inicia en septiembre 2004. Biomarcadores en: No Pruebas certificadas (Mencionar que tipo de certificación y su vigencia): Infraestructura con la que cuenta: Equipo de laboratorio En instalación laboratorio. El proyecto se apoya con el equipo e instalaciones del IMTA Cultivo y mantenimiento de organismos y cepas (certificadas o no) Compuestos de referencia certificados Personal disponible 69 Disposición para dar capacitación a otros usuarios en las pruebas que realiza 70 CUESTIONARIO DATOS GENERALES Nombre del investigador: Institución (donde labora actualmente): Dependencia de adscripción: Área o departamento: Grupo de investigación: Gabriel Nuñez Nogueira Instituto de Ciencias del Mar y LimnologíaUNAM UNAM-CU Laboratorio de Contaminación Marina Contaminantes Inorgánicos (metales) y orgánicos metálicos Puesto del Investigador: Dirección de la institución: Teléfono: Fax: Dirección electrónica: FORMACIÓN PROFESIONAL Ciudad Universitaria. Circuito Exterior S/N. C.P. 04510 56-22-57-65 gnunez@icmyl.unam.mx Licenciatura en Biología (Facultad de Ciencias-UNAM) Doctorado en Biología (Queen Mary Collage, Universidad de Londres, GB) Experiencia docente relacionada al tema de ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos Cursos de contaminación por metales pesados y traza Curso sobre AAS. Experiencia en uso de marcadores radiactivos Microanálisis de rayos X y polarogarfía de pulso diferencial Proyectos realizados en ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos Cinética y acumulación de Cd y Zn en camarones Regulación de metales en camarones Compartamentalización de metales en células de hepatopancreas y branquias PRINCIPALES LINEAS DE INVESTIGACIÓN EN ECOTOXICOLOGÍA Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS 1. Acumulación y regulación 2. Mecanismos de destoxificación 3. Eficiencia de asimilación 4. 71 5. PUBLICACIONES RECIENTES EN LOS TEMAS DE ECOTOXICOLOGÍA Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS 1. Nunez-Nogueira & Rainbow. (2005). Marine Biology. (On line) 2. Nunez-Nogueira & Rainbow (2005). Mar. Environ. Res. 60 3. Nunez-Noguiera (2005). EPOMEX. En impresión. 4. 5. CAPACIDAD ANALÍTICA Matrices ambientales que analiza: Agua dulce Agua Marina Sedimentos Suelos Otros X X X Organismos Tipos de contaminantes que analiza: Cd, Cu, Cr, Fe, Zn, V, Ni Metales: Plaguicidas: Compuestos orgánicos: Otros: Pruebas biológicas que realiza: Bioensayos con: Radioisótopos, metaloproteínas (MT’s) Biomarcadores en: Metalotioninas o proteínas tipo metalotioneínas Pruebas certificadas (Mencionar que tipo de certificación y su vigencia): Se ha participado con IAEA para metales en sedimentos (aún no se certifica) Infraestructura con la que cuenta: Equipo de laboratorio 72 AAS Cultivo y mantenimiento de organismos y cepas (certificadas o no) Mantenimiento para postlarva-juveniles de camarón Compuestos de referencia certificados Ninguno Personal disponible Biol. Susana Villanueva M. en C. Guadalupe Ponce Disposición para dar capacitación a otros usuarios en las pruebas que realiza Medio tiempo 73 CUESTIONARIO DATOS GENERALES Nombre del investigador: M.C YOLANDA PICA GRANADOS Institución (donde labora actualmente): Instituto Mexicano de Tecnología del Agua. IMTA Dependencia de adscripción: Coordinación de Tratamiento y Calidad del Agua Área o departamento: Subcoordinación de Hidrobiología y Evaluación Ambiental Grupo de investigación: Toxicología Acuática Puesto del Investigador: Investigador Titular A Dirección de la institución: Teléfono: Paseo Cuauhnahuac 8532 Col .Progreso, Jiutepec, Mor. México C.P. 62550 017773293665 Fax: 017773293665 Dirección electrónica: ypica@tlaloc.imta.mx FORMACIÓN PROFESIONAL ACADÉMICA Licenciatura: Maestría: Biología . Facultad de Ciencias (FC), Universidad Nacional Autónoma de México UNAM. 1988. En Ciencias (Biología) F.C., UNAM. 1994. EXPERIENCIA Técnico Académico por contrato . ICMyL, UNAM Jefe del laboratorio. Instituto Mexicano del Petróleo. Investigador Numerario I. Instituto Mexicano del Petróleo Investigador Numerario II. Instituto Mexicano del Petróleo Especialista en Hidráulica IV-A (III). IMTA. Especialista en Hidráulica Titular A (IV). IMTA. Consultor para el International Development Research Center, Canadá. México D.F. 1985-1993 México D.F. 1990-1995 México D.F. 1992-1994 México D.F. 1994-1995 Jiutepec. Mor. 1995-2001 Jiutepec. Mor. 2001-a la fecha Jiutepec. Mor. 2000-a la fecha Experiencia docente relacionada al tema de ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos Cursos especializados rInternacionales Instructor y Docente: del Taller de Transferencia de Tecnología de Bioensayos a Municipalidades de América Latina. IDRC-CIMA-UNLP, Por invitación del Interntional Development Research Centre (Otawa, Canadá- Uruguay) Lugar: Centro de Investigaciones de Medio Ambiente (CIMA), Universidad Nacional de La Plata (UNLP), Buenos Aires, Argentina. 74 Fecha: 14-20 de mayo del 2000 (60 h). Nacionales Instructor y Docente: del “Taller de Transferencia Tecnológica “Métodos biológicos para la detección de toxicidad por contaminantes químicos en aguas residuales y naturales” (14-18 de agosto 2000). Patrocinado por la CNA Lugar: Instituto Mexicano de Tecnología del Agua, Jiutepec, Morelos,. Fecha: 14-18 de mayo del 2000 (50h). Instructor del “Tercer Modulo “Restauración de acuíferos contaminados por hidrocarburos” del Diplomado Restauración de suelos y aguas subterráneas contaminadas por hidrocarburos de la Universidad Autónoma del Estado de Morelos. Lugar: Instituto Mexicano de Tecnología del Agua, Jiutepec, Morelos,. Fecha: 11-15 de noviembre de 2002. Personal formado. Tesis dirigidas. “Evaluación toxicológica del herbicida Glifosato” para obtener el grado de Licenciado en Biología (Hidrobiología) en la Universidad Autónoma de Morelos. Septiembre del 2000. “Instrumentación de la metodología de evaluación e identificación de la toxicidad en aguas residuales y naturales a través de pruebas biológicas”. Para obtener el grado de Maestría en Ingeniería Ambiental. Facultad de Ingeniería. DEPFI, Campus Morelos. Tutorías o asesorías a estudiantes Internacionales Asesoría de 12 especialistas, personal de las Municipalidades del Cono Sur, de los países de Colombia, Chile, Brasil, Uruguay y Argentina, en el uso de una batería de biensayos de toxicidad para evaluación de la calidad del agua intercalibrada por los laboratorios participantes en la Red Internacional Watertox. Proyecto de transferencia tecnológica del International Development Research Centre (IDRC) OtawaUruguay. Fecha: de mayo del 2000 a la fecha Nacionales Asesoría de 14 especialistas, personal de siete laboratorios regionales de la CNA provenientes de los estados de Coahuila, Sonora, Monterrey, Tamaulipas, Morelos, D.F. y Chiapas y de la Universidad Autónoma de Querétaro, en el uso de una batería de biensayos de toxicidad para evaluación de la calidad del agua. Proyecto de transferencia tecnológica para la Comisión Nacional del Agua. Fecha: de agosto del 2000 agosto 2002 Proyectos realizados en ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos 1."CONTROL INTEGRAL DEL LIRIO ACUATICO E IMPLICACIONES TOXICOLÓGICAS EN EL LAGO DE CHAPALA" . Proyecto CONACyT Fecha: marzo de 1996 a mayo 1998. Instrumentación y de los protocolos de evaluación relacionados a pruebas de toxicidad, para el desarrollo del Método de Evaluación e Identificación de Tóxicos (TIE, EPA, 1989). 2."SEGUIMIENTO TOXICOLOGICO DE UN POCESO EXPERIMENTAL DE BIOREMEDIACION DE SUSTRATOS CONTAMINADOS POR PETROLEO, CON ENFASIS EN EL MONITOREO DE METABOLITOS GENOTOXICOS". En colaboración con el Instituto de Biotecnología de la UNAM. Campus Morelos. Fecha: 1996-1997 Investigación encaminada a evaluar la utilidad y alcances del uso de la prueba de toxicidad aguda con Vibrio fischeri y la prueba de AMES para la detección de mutágenos, como dos métodos de biomonitoreo de hidrocarburos aromáticos policíclicos, HAP y sus metabolitos encontrados en substratos afectados por derrame de petróleo. 3. "INDICADORES BIOLOGICOS. ESTABLECIMIENTO E INTERCALIBRACION DE UNA BATERIA DE PRUEBAS DE TOXICIDAD”Fecha: 1997 Instrumentación y estandarización de una batería de siete pruebas de toxicidad, de aplicación en evaluaciones 75 ambientales de riesgo y de calidad del agua. Pruebas: Daphnia magna, Selenastrum capricornutum, Lactuca sativa,. Panagrellus redivivus, Hydra attenuata, Allium sp., pruebas de genotoxicidad y daño cromosómico con la bacteria Salmonella typhimurium y Allium sp, 4. “INTEGRATED APPROACHES TO SAFE DRINKING WATER (GLOBAL) ” Proyecto: International Development Research Centre Fecha: septiembre de 1997 a noviembre 1998. Desarrollo del programa de intercalibración de la batería de seis pruebas de toxicidad 5. “EVALUACION DE LA SENSIBILIDAD DE ORGANISMOS PARA PRUEBAS DE TOXICIDAD A TRAVÉZ DE UN PROGRAMA DE INTERCALIBRACIÓN INTERNACIONAL” Fecha: 1998. IMTA Variación de la respuesta de los organismos de prueba a los distintos grupos de compuestos para definir sus ámbitos de sensibilidad. 6. “EVALUACION DE LAS DESCARGAS DE LA REFINERIA ANTONIO DOVALI JAIME Y DE LA ZONA LITORAL DE LA BAHIA LA VENTOSA, ASOCIADA AL AREA DE IMPACTO DE LOS EMISORES SUBMARINOS” Proyecto Contratado PEMEX-Refinación. echa: 1998 Estudio de caracterización de las aguas residuales de la Refinería y su comparación con resultados de modelos biológicos a través de pruebas biológicas de toxicidad crónica (desarrollo larvario de erizos, crecimiento de anfípodos marinos, Vibrio fischeri y Artemia sp). 7.“ANÁISIS DE LA SENSIBILIDAD DE LA MICROALGA Selenastrum capricornutum. Fecha: 1999 Determinar los ámbitos de su sensibilidad para tóxicos específicos que afectan principalmente metabolismos vegetales 8. “COMMUNITY AND ECOSYSTEM STRATEGIES FOR WATER QUALITY MONITORING IN MUNICIPALITIES OF LATIN AMERICA” Proyecto de colaboración internacional, México-Canadá-Uruguay. International Development Research Center (IDRC) Fecha: julio de 1999 a octubre 2001. Desarrollo del programa de intercalibración del método de concentración de muestras ambientales para el análisis de toxicidad con la batería de pruebas intercalibradas, Se experimentó su aplicación en el manejo de muestras ambientales provenientes. 9. “MÉTODOS BIOLÓGICOS PARA EL MONITOREO DE LA CALIDAD DEL AGUA EN LAB. REGIONALES DE LA CNA. Capacitación e Intercalibración. Proyecto:, CNA Fecha: 2000 Proyecto de capacitación e intercalibración dirigido a los laboratorios regionales de la CNA para el manejo de métodos de evaluación biológica considerando el apoyo y asesoría para seguimiento a las actividades de establecimiento de cultivos, calibración interna de los métodos y apoyo para circunscribir dichos métodos dentro de un marco de aseguramiento y garantía de calidad. 10. “ECOTOXICIDAD DE AGUAS Y SEDIMENTOS DEL RÍO CUAUTLA, Y DESCARGAS ASOCIADAS, EMPLEANDO UNA BATERÍA MULTITRÓFICA DE BIOENSAYOS” Fecha: 2002 Determinar el potencial tóxico del sistema Río Cuautla y de las descargas asociadas a través de la detección in vitro de efectos a nivel multitrófico. (toxicidad aguda y crónica) en agua y sedimentos y la detección de actividad estrogénica empleando el ensayo con levaduras recombinantes (Saccharomyces cereviciae). 11. “ESTUDIO DE PRETRATABILIDAD DE LAS AGUAS RESIDUALES DE PETROQUÍMIA PAJARITOS S.A. DE C.V. EN LOS COMPLEJOS PETROQUÍMICOS DE CANGREJERA Y MORELOS”Proyecto PEMEX Petroquímica. Fecha: 2002 Determinar las eficiencias de los sistemas experimentales para la remoción de carga tóxica a través del empleo de tres organismos de prueba Daphnia magna, P. subcapitata (Selenastrum capricornutum) y Vibrio fischeri. Se efectuaron comparaciones de tendencias de respuesta y se aplicaron principios de la metodología de Identificación y Evaluación de Tóxicos (TIE) para determinar los principales grupos funcionales responsables de la toxicidad registrada. 12. “EVALUACIÓN TOXICOLÓGICA DE AGUAS DE CINCO EMBALSES DE LA REGION BALSAS”. Proyecto CNA. Fecha: 2002 Análisis de la calidad del agua y caracterización toxicológica de cinco embalses de la Región Balsas. Aplicación de batería de pruebas e identificación de contaminantes orgánicos , metálicos y ficotoxinas. 13. “CARACTERIZACIÓN DE LOS EEFLUENTES ACUOSOS DE LA PETROQUÍMICA PAJARITOS , S. A DE C. V. E INGENIERÍA CONCEPTUAL DE SU TRATAMIENTO”. Proyecto PEMEX Petroquímica. Fecha: 2003-2004 Determinar las eficiencias de los sistemas experimentales para la remoción de carga tóxica a través del empleo de tres organismos de prueba Daphnia magna, P. subcapitata (Selenastrum capricornutum) y Vibrio fischeri. Se efectuaron comparaciones de tendencias de respuesta y se aplicaron principios de la metodología de Identificación y Evaluación de Tóxicos (TIE) para determinar los principales grupos funcionales responsables de la toxicidad registrada. 14. “ESTIMACION TOXICOLOGICA DEL POSIBLE EFECTO DE LA DESCARGA DE LA EMPRESA BASF MEXICANA EN EL AREA COSTERA DEL ESTADO DE TAMAULIPAS”.Proyecto BASF MEXICANA, S.A. Fecha: 2003 - 2004 Análisis de la calidad del agua de la descarga de la empresa Basf Mexicana, con base en los esquemas normativos vigentes, a evaluación química de contaminantes y el desarrollo de pruebas biológicas de toxicidad aguda y crónica (D. magna, P. subcapitata, Artemia sp, V. fischeri y Litopenaeus psetiferus) y aplicación de modelos de dispersión de contaminantes. 76 PRINCIPALES LINEAS DE INVESTIGACIÓN EN ECOTOXICOLOGÍA Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Ecotoxicología acuática (ambientes epicontinentales y/o costeros), Desarrollo de bioensayos en agua y sedimentos, para detección de efectos, agudos, crónicos y mutagénicos.. Uso de biosensores para determinación de optimización y evaluación de funcionamiento de plantas de tratamiento. Aplicación de bioensayos para determinación de fracciones tóxicas en muestras ambientales o aguas residuales (Identificación y Evaluación de Tóxicos , TIE por sus siglas en ingles) Detección química de contaminantes en agua, sedimento y organismos (con énfasis en HAP, BPC y Plaguicidas Organoclorados) Control de calidad de pruebas biológicas. Aplicación de modelos de dispersión para determinar dirección y transporte de agentes tóxicos PUBLICACIONES RECIENTES EN LOS TEMAS DE ECOTOXICOLOGÍA Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS LIBROS Nacionales 1. Pica-Granados Y. 2002. Serie Autodidáctica de Medición de la Calidad del Agua, Segunda Parte. Análisis de Toxicidad en el Agua. Ed. Comisión Nacional del Agua- Instituto Mexicano de Tecnología del Agua.. ISBN 968-55-36-21-X. P. 41 Intenacionales 2. Pica-Granados Y. y Díaz Báez C. 2000. “MANUAL DE PROCEDIMIENTOS PARA LA EJECUCIÓN DE BIOENSAYOS DE TOXICIDAD AGUDA. International Developent Research Center (IDRC). Documento para publicación en hoja web http://www.idrc.ca/lacro/bioensayos. Para el proyecto “ ESTRATÉGIAS COMUNITARIAS Y ECOSISTÉMICAS DE EVALUACIÓN DE LA CALIDAD DEL AGUA, EN MUNICIPIOS DE AMÉRICA LATINA. 3. Castillo, G., Díaz–Báez M.C., Pica-Granados Y.., Ronco, A ., Sánchez-Bain, A, 2001.. ..Red Watertox: Toxicidad en Aguas Ambientales de Argentina, Chile, Colombia y México. Society of Environmental Toxicology and Chemistry (SETAC)”, Capítulo Latinoamérica. Buenos Aires, Argentina. Distribución Internacional 4. Ensayos toxicológicos y métodos de evaluación de calidad de aguas. Estandarización, Intercalibración,2004.. Internacional Development Research Centre (IDRC) -IMTA. Ed. G.Castillo, 1ª Ed. pp 198. ISBN-968 5536. ARTICULOS Internacionales 5. - F. J. Marquez-Rocha, Y. Pica-Granados, A. M. Sandoval-Villasana,R. Vázquez-Duhalt. 1998. Determination of Genotoxicity Using a Choloperoxidase-Mediated Model of PAH-CNA Adduc Formation. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 59:788-795. 6. .- Y Pica-Granados, D.G. Trujillo & Hernández S. H. 2000. Bioassay standarization for water quality minitoring in Mexico.. In: Special Issue: Publication for Watertox Network, John Wiley & Sons, Environm. Toxicol. 15: 322-330. 7. .- G. Forget, A. Sanchez-Bain, V. Arkhipchuk, T. Beaurregard, C. Blaise, G. Castillo, L.E. Castillo, M.C. 77 Díaz-Baez, Y Pica-Granados, A. Ronco, R.C. Sirvastava & Dutka B.J. 2000. Preliminary data of a single-blind multicountry trial of six bioassays for water toxicity monitoring. In: Special Issue 9th Internatonal Symposium on Toxicity Assessment., John Wiley & Sons, Environm. Toxicol. 15: 362-369. 8. .- M.C. Diaz-Baez, W.A. Sánchez, B.J. Dutka, A. Ronco, G. Castillo Y. Pica-Granados, L.E. Castillo, J.Ridal, V. Arkhipchuk, and R.C. Srivastava. INTERNATIONAL ECOTOXICOLOGICAL EVALUATION OF DRINKING WATER SUPPLIES USING A BATTERY OF BIOASSAYS . In: Special Issue 10th Internatonal Symposium on Toxicity Assessment., John Wiley & Sons, Environm. Toxicol. Vol.17 (3): 232-240 9. .- Ronco, Gagnon P., M.C. Diaz-Baez, V. Arkhipchuk, G. Castillo, L.E. Castillo, B.J. Dutka, Y. PicaGranados, J. Ridal, R.C. Srivastava, A. Sánchez. OVERVIEW OF STATISTICAL RESULTS FROM THE WATERTOX INTERCALIBRATION AND ENVIRONMENTAL TESTING PHASE II PROGRAM In: Special Issue 10th Internatonal Symposium on Toxicity Assessment., John Wiley & Sons, Environm. Toxicol Vol.17 (3): 241-249 10. Morales R , Pica-Granados Y., Rodríguez C., Goméz E., Escalante M., Izurieta J. 2004. Modelación de la dispersión de la descarga de un emisor submarino en la zona costera del Golfo de México . Mem. XXI Congreso Latinoamericano de Hidráulica Nacionales 11. Pica-Granados, Y. Botello, A. V. Y Villanueva, F.S. 1998.Contaminación por hidrocaburos aromáticos policíclicos en sedimentos y organismos del Puerto de Salina Cuz, Oaxaca, México. Rev. Internal. de Contam. Amb. 11(1).21-30. 12. Pica – Granados Y, y Huerto-Delgadillo R. 2004. Evidencias de Agentes de disfunción endocrina en sistemas acuáticos de México, un problema que demanda atención . Mem. XVIII Congreso Nacional de Hidráulica . 1027-1034.pag Artículos en revistas No arbitradas Internacionales 13. .- Pica-Granados Y., Huerto D. R. I., Gutiérrez L. E y Bandala E. 1998. “ Sediment testing. rd Toxicological characterization of Lake Chapala. In: Proceedings of the 23 . Annual Aquatic Toxicity Workshop. Canadian Technical Report of Fisheries and Aquatic Sciences No.2144. Alberta, Canada. Nacionales 14. .Pica-Granados Y., Trujillo, D.G., Hernández S.H. y R Huerto-Delgadillo. 2001. PRUEBAS DE TOXICIDAD: Biotecnologías para el análisis integral de la calidad del agua, al alcance de países en vías de desarrollo. Anuario del Instituto Mexicano de Tecnología del Agua. CAPACIDAD ANALÍTICA Matrices ambientales que analiza: Agua dulce Agua y sedimento, acumulación en tejidos. Desarrollo de (pruebas de toxicidad y genotoxicidad diversas, caracterización fisicoquímica, análisis químico de contaminantes orgánicos e inorgánicos (AA-HG, GI, CG-Masas, HPLC, polarográfía) microbiológía y virología, entre otros Agua Marina Agua y sedimento, acumulación en tejidos. Desarrollo de pruebas de toxicidad y genotoxicidad diversas, caracterización fisicoquímica, análisis químico de contaminantes tanto orgánicos como inorgánicos (AA-HG, GI, CG-Masas, HPLC, polarografía) microbiología y 78 virología , entre otros Sedimentos Suelos Otros Ambientes de agua dulce y costeros. Desarrollo de pruebas de toxicidad y genotoxicidad diversas, caracterización fisicoquímica, análisis químico de contaminantes orgánicos e inorgánicos (AA-HG, GI, CG-Masas, HPLC, polarografía), Microbiología y Virología, entre otros Caracterización física, pruebas de toxicidad diversas enfocadas a mejoramiento de suelos, biorrememdiación y disposición de lodos residuales, análisis químico de contaminantes orgánicos e inorgánicos (AA-HG, GI, CG-Masas, HPLC, polarografía), entre otros, biorremediación y seguimiento de procesos de mejoramiento. EL IMTA cuenta con diversos laboratorios acreditados ante EMA para los diversos métodos que comprenden la capacidad analítica de la institución, además cuenta con muy diversas líneas de investigación asociadas a diversas áreas como son :tratamiento de aguas residuales, lodos residuales, biorremediación, hidrobiología y evaluación ambiental, hidrología , hidráulica, riego y drenaje, entre muchos otros, y de cada una de ellas pueden hacerse mención a una larga lista adicional de capacidades analíticas. Por el momento solo se han puesto algunas que se asocian al tema y objetivo de este cuestionario. Tipos de contaminantes que analiza: Metales: Plaguicidas: Por AA, Horno de Grafito y Generador de Hidruros (Cd, Cu, Co, Cr, Pb As, Hg, Zn, Ni, V, Se, , Fe, Mn, Mg, entre otros) Organoclorados, Organofosforados Compuestos orgánicos: HAP, Nonilfenoles, ftalatos, COV, BTEX, BPC, Trihalometanos, Heroicidad (GLifosato, 2,4 D), Microcistina o Ácido domóico, Bases y Neutros ,, Carbarilos, Atrazina, Fenoles, Otros: Barridos de identificación de metabolitos y tóxicos diversos no enmarcados en los grupos enlistados a través de barridos cromatográficos e identificación por CG- Masas Pruebas biológicas que realiza: Bioensayos con: Daphnia magna (aguda y crónica), Vibrio fischeri, Selenastrum capricornutum, Hydra attenuata (Prueba aguda y teratogenicidad) , L. sativa, Penagrelles redivivus, Allium sp (prueba aguda y genotoxicidad), Hyalella azteca , Chironomus riparius. AMES, SOS, Cromotest, Microfluctuación. Biomarcadores en: NO 79 Pruebas certificadas (Mencionar que tipo de certificación y su vigencia): Algunas de ellas se encuentran acreditadas por la Entidad Mexicana de acreditación Certificado No . AG-177-032/04. Las pruebas acreditadas son toxicidad aguda con Daphjnia magna y Vibrio fischeri, y de genotoxicicdad AMES. El resto de las pruebas se realiza en apego a los procedimientos de control descritos en los procedimientos del sistema de Aseguramiento de la Calidad del laboratorio de pruebas. Infraestructura con la que cuenta: Equipo de laboratorio. Todo el equipo se encuentra dentro de un programa de mantenimiento, calibrado o verificado, según sea, con estándares o materiales de referencia certificados , validados o valorados (también según sea el caso) Con fines de pruebas biológicas se cuenta con: Balanza analítica de doble escala, centrifuga, liofilizador, controladores de temperatura, microscopios ópticos y estereoscópicos, invertido, sistema s de extracción soxhlet, microondas, baños ultrasónicos, campanas de flujo laminar, lector de microplacas, mufla, hornos, incubadoras con luz y temperatura controlada, refrigeradores, ultracongeladores, cámaras frías, sistema de purificación de agua Milli-Q, Microtox (2), Microtomo, Epectrómetro, Fluorómetro, oxímetros, potenciómetros de campo y laboratorio, conductímetros, censores de amonio, Redox, planchas de agitación y calentamiento, bombas peristálticas, pantallas de iluminación, entre otros y equipo diverso de monitoreo en campo. El laboratorio de toxicología cuenta con alrededor de 220 m2 con espacios climatizados de acuerdo a las necesidades de los cultivos y de las pruebas. En estas áreas se cuenta con control automático de (timers) de horas de luz y oscuridad,. En esta área también se cuenta con corriente continua de energía eléctrica para los sistemas que así lo requieran. El área se distribuye en dos cuartos de cultivo de organismos para microensayos (algas, cladóceros, nematodos, hydra entre otros etc), un espacio de observación y medición que cuenta con equipos acordes a esta función como son microscopios, espectrómetros, lectores de muicroplaca (colorimetros y espectrómetro), Microtox, incubadoras, cámaras de iluminación incubación para pruebas agudas. Cuenta con un cuarto de lavado y de preparación de medios, una área para ensayos y cultivos de peces, una áreas de cuarentena y un cuarto para pruebas crónicas y de flujo continuo donde también se mantienen especies para análisis de sedimento (Hyalella azteca y C riparius). Esta habitación cuenta con instalación de sistemas hidráulico para flujo en continuo y dosificación. También se cuenta con un cuarto refrigerado y una área húmeda donde se produce agua de calidad Milli-Q para las distintas necesidades de abasto. 80 En un área adicional, aislada de laboratorio de pruebas biológicas, se cuenta con 30 m2 más para procesamiento y manejo de muestras, donde se efectúa filtración, preparación de soluciones, extracción orgánica y demás procesos de manejo químicos de las muestras, cuando así es necesario. Las pruebas de Ames, se realizan en otro espacio adicional de 30 m2 cuadrados mas donde se cuenta con un cuarto de aislamiento con campana de flujo laminar, contadores de colonia, incubadoras, y un equipo de Bioscreen para fines de la técnica de microfluctuación Infraestructura en General El laboratorio de calidad del agua, cuenta con áreas aisladas para análisis fisicoquímico, Química analítica que comprende Absorción atómica con la AA, plasma y polarografía además de áreas de digestión de muestras, Cromatografía de Gases con equipos acoplados a Masas, a Purga y trampa y Head Space con detectores diversos, en esta áreas también se incluye un apartado para extracción y manejo de muestras. Anexo se encuentra el área s de Cromatografía de líquidos y espectrometría así como de balanzas. El IMTA cuenta con un área de análisis de microbiología y virología de 250 m cuadrado donde se cuenta con microscopía de epifluorescencia, microscopía electrónica, lector de PCR, sistemas de electroforesis, autoclaves, campañas y equipo de aislamiento y proliferación de microorganismos, entre otros. El laboratorio de análisis de suelos donde se realizan pruebas físico-químicas generales así como análisis de isotopía para determinación migración de contaminantes, se emplean también técnicas de espectroscopia de fluorescencia y espectrómetro de radiación beta por centelleo líquido. Se cuenta con un área de invernadero con estanques secos para el cultivo de Eisenia faetida para tratamiento de lodos de plantas de tratamiento y composteo Cultivo y mantenimiento de organismos y cepas (certificadas o no) Áreas y especies antes mencionadas. Las cepas carecen de certificado, solo se cuenta con la carta de donación y el aval de la identificación con base a claves taxonómicas Respecto a C ripariun en este momento no se cuenta con la cepa Compuestos de referencia certificados Para fines de pruebas biológicas se emplean controles positivos elaborados con sales grado reactivo analítico de l 99% de pureza que presente certificado del productor como es el caso de Fulka, sin embargo este certificado no basta para el 81 CENAM (Centro Nacional de Metrología), quienes finalmente deberán proveer a los laboratorios acreditados de los materiales y sustancias de referencia, sin embargo en este momento el CENAM no esta en capacidad de abastecer las sales de Cr, Cu y cristales de Fenol que se emplean como referencia de estas pruebas así que extendió su autorización al IMTA para el uso del certificado de la compañía productora Este será el procedimiento que se tendrá que seguir en caso de una acreditación de pruebas biológicas y de no existir la sustancia en los catálogos de CENAM. Para el caso de las determinaciones químicas del área fisicoquímica, analítica y microbiología CENAM ha abastecido algunos materiales de referencia. Personal disponible Para el manejo de pruebas biológicas se cuenta con Un responsable de área de prueba de toxicidad y otro mas de prueba de AMES,. En cuanto a las primeras se cuenta con dos técnicos especializados con 8 años de experiencia y dos estudiantes. En genotoxicidad se cuenta con un técnico con 3 años de experiencia y tres estudiantes. Los técnicos no forman parte del personal contratado por la institución sus servicios se mantienen por pago de honorarios por proyecto. Disposición para dar capacitación a otros usuarios en las pruebas que realiza Se tiene no solo la disposición sino la experiencia de impartir cursos teóricoprácticos para la transferencia tecnológica para el manejo de bioensayos. Los talleres de entrenamiento fueron llevados a cabo en México, para capacitar personal de los laboratorios Regionales de la Comisión Nacional del Agua y en Argentina (La Plata), para Laboratorios pertenecientes a las municipalidades de países del Cono Sur (Argentina, Uruguay, Colombia, Chile y Brasil). El IMTA cuenta con un centro de capacitación con espacios de alojamiento y aulas dentro de su infraestructura, la cual es muy adecuada para cualquier clase de evento o taller. 82 CUESTIONARIO DATOS GENERALES Nombre del investigador: PATRICIA RAMÍREZ ROMERO Institución (donde labora actualmente): UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA Dependencia de adscripción: Área o departamento: DEPTO. DE HIDROBIOLOGÍA Grupo de investigación: ECOTOXICOLOGÍA Puesto del Investigador: TITULAR “C” DE T.C. Dirección de la institución: Teléfono: AV. SAN RAFAEL ATLIXCO # 186, COL. VICENTINA, MÉXICO, D. F. 09340 55-5804-6493 Fax: 55-5804-4738 Dirección electrónica: patt@xanum.uam.mx FORMACIÓN PROFESIONAL Licenciatura: Hidrobiología, (1988) Universidad Autónoma Metropolitana-Iztapalapa Maestría : Biología Experimental, Universidad Autónoma MetropolitanaIztapalapa (1992) Doctorado: Philosophy Doctor (Toxicología acuática), Miami University, USA, (1997) Experiencia docente relacionada al tema de ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos He trabajado en el desarrollo de proyectos de investigación relacionados con los efectos de los contaminantes (metales, HAPs) en los organismos acuáticos (crustáceos) desde 1988 A partir de 1990 comencé a asesorar alumnos de licenciatura en sus proyectos terminales y de servicio social. Actualmente también asesoro estudiantes a nivel de maestría y doctorado, en diversas instituciones de educación superior. Proyectos realizados en ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos Biomarcadores en organismos acuáticos mexicanos para monitoreo ambiental. Comparación de la toxicidad del cadmio, cromo y zinc en poblaciones silvestres mexicanas de Hyalella azteca. 83 Evaluation of the acute and chronic toxcicity of fluoranthene-spiked sediments in the presence of UV light using the amphipod Hyalella azteca. Efectos de concentraciones subletales de cadmio sobre algunos parámetros fisiológicos de Machrobrachium rosenbergii Comportamiento de algunos contaminantes en la laguna de Tamiahua y capacidad de autodepuración del sistema. Evaluación de la calidad sanitaria del agua, sedimento y algunas especies de interés comercial en la zona sur de la laguna de Tamiahua, Ver. Efectos del cadmio y cromo en la sobrevivencia y respiración de Callinectes similis. PRINCIPALES LINEAS DE INVESTIGACIÓN EN ECOTOXICOLOGÍA Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS 1. Fotoquímica y toxicidad de hidrocarburos policíclicos aromáticos 2. Toxicidad aguda y crónica de metales en invertebrados acuáticos. 3. Bioenergética como indicador del estrés causado por contaminación 4. Papel de la toxicología acuática en los estudios de Impacto Ambiental y en la Evaluación del Riesgo Ambiental. 5. Calidad del agua y Educación Ambiental en áreas turísticas. PUBLICACIONES RECIENTES EN LOS TEMAS DE ECOTOXICOLOGÍA Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS 1. Evans, J., Fernández-Bremauntz F., Gavilán-García A., Ize-Lema I., Martínez-Cordero M.A., Ramírez-Romero P. y Zuk M. 2003. Introducción al Análisis de Riesgos Ambientales. SEMARNAT-INE. México. 123 pp. 2. Ramírez-Romero, P., Ducoing-Chahó,E. y M. Castillo-González. 2003. Calidad Ambiental de las Playas de la Rivera Maya, Municipio de Solidaridad, Q. Roo, México. Estrategia para la Certificación de las Playas Limpias. Memorias en extenso. MarCuba 2003, VI Congreso de Ciencias del Mar.La Habana, Cuba. 1-5 diciembre. 3. Ramírez-Romero, P. Bioacumulación, biodisponibilidad y efectos de los contaminantes sobre los organismos acuáticos. En: Arredondo Figueroa, J.L. (ed.) Limnología de presas mexicanas.UAM, UAEM. 605-617 (774p) 4. A. John Bailer, Bahjat Qaqish, James T. Oris and P. Ramírez-Romero. Accounting for possible chamber effects via correlated binary data analysis methods. Env. Toxicol. Chem. (en prensa) 5. Ramírez, P., and J.T. Oris. Acute phototoxicty of sediments spiked with fluoranthene to the amphipod Hyalella azteca. Environ. Contam. Toxicol. (en prensa) 6. Ramírez, P., and J.T. Oris. Chronic toxicity of fluoranthene spiked sediments in the presence of ultraviolet radiation. Implications for the present SQC. Aquat. Toxicol. (en prensa) CAPACIDAD ANALÍTICA Matrices ambientales que analiza: Agua dulce X 84 Agua Marina X Sedimentos X Suelos Otros Organismos Tipos de contaminantes que analiza: Metales: X Plaguicidas: Compuestos orgánicos: HAPs Otros: Pruebas biológicas que realiza: Bioensayos con: Callinectes sapidus Machrobrachium rosenbergii Hyalella azteca Artemia salina Strombus gigas Biomarcadores en: Hyalella azteca (lipoperoxidación) Artemia salina (ensayo cometa, lipoperoxidación) Pruebas certificadas (Mencionar que tipo de certificación y su vigencia): Infraestructura con la que cuenta: Equipo de laboratorio Acuarios para mantenimiento de organismos en laboratorio en condiciones controladas. Horno de microondas para digestión de muestras diversas, procesador de tejidos desde inclusión hasta teñido, equipo diverso que incluye autoclaves, campana de flujo laminar, campanas de extracción, centrífuga, microcentrífuga, centrífuga refrigerada, homogenizador de tejidos, microscopios, analizador de oxígeno, salinómetro, laboratorio de campo Hach, cámara de electroforesis, balanzas, y otros equipos menores. 85 Compuestos de referencia certificados Personal disponible En el laboratorio trabajamos 5 profesores de tiempo completo y un ayudante de profesor de medio tiempo. También contamos con el apoyo de estudiantes que realizan estancias profesionales, servicio social, tesis de licenciatura y posgrado. Disposición para dar capacitación a otros usuarios en las pruebas que realiza Si 86 CUESTIONARIO DATOS GENERALES Nombre del investigador: Institución actualmente): (donde Dependencia de adscripción: Jaime Rendón von Osten labora Universidad Autónoma de Campeche Área o departamento: Centro de Ecología, Pesquerías y Oceanografía del Golfo de México (EPOMEX) Contaminación e Impacto Ambiental Grupo de investigación: Laboratorio de Ecotoxicología Puesto del Investigador: Profesor Investigador Tiempo Completo Dirección de la institución: Teléfono: Av. Agustín Melgar entre Juan de la Barrera y Calle 20 Colonia Buenavista 01 981 8119800 Ext 62305 Fax: 01 981 8119800 Ext 62399 Dirección electrónica: jarendon@uacam.mx FORMACIÓN PROFESIONAL Doctor en Ciencias, Biología. Universidad de Aveiro, Portugal. Maestría en Ciencias en Manejo de Recursos Naturales. El Colegio de la Frontera Sur. Químico Farmacéutico Biólogo. Universidad Veracruzana Experiencia docente relacionada al tema de ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos Catedrático de la Asignatura de “Ecotoxicología” en el séptimo semestre de la Carrera de Ingeniería Bioquímica Ambiental, Universidad Autónoma de Campeche, desde 2000 a la fecha. Proyectos realizados en ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos 1. Tropical and subtropical cost effective tools for an integrated risk assessment of wetlands. Financiado por la Comunidad Europea. 2. Impactos antropogénicos sobre el recurso camarón en la Sonda de Campeche. Financiado por RMNE-GSIPA-PEMEX. 87 3. Evaluación económica ambiental del impacto a la salud humana del uso de agroquímicos en el sureste de México. Financiado por CONACYT-Sisierra PRINCIPALES LINEAS DE INVESTIGACIÓN EN ECOTOXICOLOGÍA Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS 1. Evaluación de efectos adversos de plaguicidas en organismos acuáticos utilizando biomarcadores 2. Efectos adversos en trabajadores agrícolas expuestos a plaguicidas 3. Residuos de compuestos orgánicos persistentes en substratos ambientales 4. 5. PUBLICACIONES RECIENTES EN LOS TEMAS DE ECOTOXICOLOGÍA Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS 1. J. Rendón-von Osten, A. Ortiz-Arana, L. Guilhermino and A.M.V.M. Soares. 2005. In vivo evaluation of three biomarkers in the mosquitofish (Gambusia yucatana) exposed to pesticides. Chemosphere 58(5):627-636. 2. J. Rendón-von Osten, A. Soares and L. Guilhermino. 2005. Black-bellied whistling duck (Dendrocygna autumnalis) brain cholinesterase characterization and diagnosis of anticholinesterase pesticide exposure in wild populations from the Palizada river basin, Mexico. Environmental Toxicology and Chemistry 24(2):313-317. 3. J. Rendón-von Osten, R. Tinoco-Ojanguren, A.M.V.M. Soares and L. Guilhermino. Exposure to Pesticides and Acetylcholinesterase in Campesinos from Campeche, Mexico. Archives of Environmental Health (En prensa). 4. M. Moreira-Santos, A.L. Fonseca, S.M. Moreira, J. Rendón-von Osten, E.M. Da Silva, A.M.V.M. Soares, L. Guilhermino and R. Ribeiro. Short-term sublethal (sediment and aquatic roots of floating macrophytes) assays with a tropical chironomid based on postexposure feeding and biomarkers. Environmental Toxicology and Chemistry (En prensa) 5. Rendón-von Osten J, Memije-Canepa M, Ortíz-Arana A y F. González. 2004. Residuos de plaguicidas en suelos de la zona agrícola de Chiná, Campeche y evaluación de su toxicidad mediante biomarcadores. 1er Congreso Asociación Mesoamericana de Ecotoxicología y Química Ambiental A. C. CAPACIDAD ANALÍTICA Matrices ambientales que analiza: Agua dulce Contaminantes orgánicos persistentes Agua Marina Contaminantes orgánicos persistentes Sedimentos Contaminantes orgánicos persistentes y metales pesados 88 Suelos Evaluación toxicológica y contaminantes orgánicos persistentes Otros Biomarcadores y contaminantes orgánicos persistentes en tejidos (músculo y sangre), leche materna. Tipos de contaminantes que analiza: Metales: Plomo, cadmio, zinc, cromo y cobre Plaguicidas: Organoclorados: DDTs (DDT, DDE y DDD), aldrín, endrin, clordano, mirex, metoxicloro Organofosforados: clorpirifos, malation, paration Congeneros de Policlorobifenilos (PCBs) Compuestos orgánicos: Otros: Pruebas biológicas que realiza: Bioensayos con: Gambusia (Gambusia yucatana) Biomarcadores en: Determinación de los biomarcadores: Acetilcolinesterasa (AChE) En músculo, cerebro y sangre Glutation S-transferasa (GST) En hígado y branquias Lactato Deshidrogenasa (LDH) En músculo Pruebas certificadas (Mencionar que tipo de certificación y su vigencia): Infraestructura con la que cuenta: Cromatógrafo Varian 3800, con detectores de Ionizacion de Flama (FID) y Captura de Electrones (ECD) Cromatografo Fisson 8000, con detectores de Ionizacion de Flama (FID) y Nitrógeno-Fósforo (NPD) Lector de Microplaca EX LabSystem Fluoroskan FL LabSystem 89 Absorción Atómica GBC 932AA Equipo básico de laboratorio Cultivo y mantenimiento de organismos y cepas (certificadas o no) Cultivo de gambusias (Gambusia yucatana) Compuestos de referencia certificados Personal disponible Dos técnicos con licenciatura en Químico Farmacéutico Biólogo. Disposición para dar capacitación a otros usuarios en las pruebas que realiza Existe la disposición. 90 CUESTIONARIO DATOS GENERALES Nombre del investigador: Dra. Cecilia Robles Mendoza Institución (donde labora actualmente): UNAM Dependencia de adscripción: Facultad de Ciencias Área o departamento: Dep. Ecología y Recursos Naturales Grupo de investigación: Ecofisiología Puesto del Investigador: Posdoctorado Dirección de la institución: Teléfono: Circuito Exterior, 04510 Coyoacán D. F. 56224829 Fax: 56224828 Dirección electrónica: rmc@correo.unam.mx Ciudad Universitaria FORMACIÓN PROFESIONAL Licenciatura: En Biología, Facultad de Ciencias, UNAM. Promedio: 9.23. Tesis: “Alteraciones ambientales de postlarvas y juveniles del camarón blanco Penaeus setiferus (Crustacea: Decapoda) por efecto del amoniaco.” Obtención del título: 27 Noviembre de 1997. Maestría: Postgrado en Biología de Sistemas y Recursos Acuáticos. Instituto de Ciencias del Mar y Limnología, UNAM. Promedio 9.55. Tesis: “Efecto subletal del amonio sobre juveniles de Litopenaeus setiferus (Crustacea: Decapoda)”. Obtención del grado: 5 Junio de 2001. Mención honorífica por ser una de las Mejores Tesis de Maestría en el Postgrado del ICMyL-UNAM, año 2002. Doctorado: Escuela de Doctorado en Ciencia y Tecnología Aplicada al Ambiente. Universidad de Siena, Italia. Departamento de Ciencias Ambientales, Unidad Ecotoxicología. Inicio Octubre 2001. Tesis: “Efecto de xantatos en organismos de agua dulce: evaluación de riesgo y modo de acción tóxica”. Obtención del grado: 14 Marzo de 2005. Experiencia docente relacionada al tema de ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos 1. Tutor de Servicios Sociales. Estudiante: Susana Alejandre Grimaldo Programa: “Ecotoxicología de Crustáceos Acuáticos” Periodo: Octubre 1999 - Marzo 2000. 2. Actividad Docente. Profesor de Asignatura, Categoría: A. “Ecofisiología Animal”: Materia Optativa de la Licenciatura de Biología. Facultad de Ciencias, UNAM. Donde se realizaron biensayos de toxicidad aguda. Período de 3 semestres: 3 Abril 2000 – 18 91 Julio 2001. 3. Sínodal en exámenes profesionales. a) “Evaluación del contenido de metales pesados en Tilapia (Oreohromis nilocutis”) de la presa hidroeléctrica Zimapan”. Presentado por Jorge Alberto Valdiviezo Rodríguez. 14 Agosto 1998. b) “Efecto del amonio en la osmoregulación de juveniles de Litopenaeus setiferus (Crustacea, Decapoda)”. Presentado por Héctor Eduardo Ríos Torres. 27 Febrero 2001. Proyectos realizados en ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos Participación en Proyectos de Investigación. a) “Evaluación del efecto de compuestos nitrogenados y niveles limitantes de oxígeno disuelto en la producción de postlarvas de camarones peneidos”. PAPIIT, IN 204295. Agosto 1995 – Julio 1998. b) “Efectos subletales del amonio en juveniles de Penaeus setiferus (Crustacea, Decapoda)”. PAPIIT, IN 221998. Agosto 1998 – Julio 1999. c) “Efectos subletales del amonio en juveniles de Litopenaeus setiferus (Crustacea, Decapoda): metabolismo y actividad”. PAPIIT, IN 217999. Agosto 1999 – Julio 2001. d) “Diagnosis del efecto biológico en el ambiente marino por la actividad de la industria pretrolera en la Sonda de Campeche, México”. IMP-PEMEX No. IMP F.37062. Marzo – Septiembre 2001. e) “Ecotoxicología de xantatos”. Realizado con el grupo de trabajo de Ecotoxicología del Departamento de Ciencias Ambientales, Universidad de Siena, Italia. Octubre 2001-Marzo 2005. f) “Efecto del chlorpyrifos en el desarrollo de la rana Xenopus leavis”. Realizado con el grupo de trabajo de Ecotoxicología y Biología del Desarrollo del Departamento de Ciencias del Ambiente y del Territorio, Universidad de Milán-Bicocca, Italia. EneroMarzo 2005. g) “Riesgo ecológico de la zona lacustre de Xochimilco por el uso de agroquímicos: vulnerabilidad de la población del ajolote Ambystoma mexicanum” Laboratorio de Ecofisiología de la Facultad de Ciencias, UNAM. Proceso de inicio. PRINCIPALES LINEAS DE INVESTIGACIÓN EN ECOTOXICOLOGÍA Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS 1. Ecotoxicología de Compuestos nitrogenados. Aplicación de bioensayos: a) Toxicidad aguda de amonio y nitrito y con la acción conjunta de niveles limitantes de oxígeno disuelto. Endpoint: sobrevivencia. b) Toxicidad crónica de amonio. Endpoint: crecimiento, campo de crecimiento y sobreviviencia. 2. Ecotoxicología de xantatos. Aplicación de biensayos: a) Toxicidad aguda sobre Vibrio fishery (endpoint: bioluminiscencia), Selenastrum capricornutum (endpoint: reproducción), Lemna minor (endpoint: crecimiento), Daphnia magna (endpoint: movilidad), renacuajo del sapo Bufo bufo (endpoint: sobrevivencia), huevo, larva y juvenil (endpoint: sobrevivencia) de la trucha Oncorrynchus mykiss. b) Toxicidad crónica sobre Daphnia magna (endpoint: eficiencia reproductiva) y juveniles de O. mykiss (endpoint: histopatología de tejido branquial). 3. Ecotoxicología de Plaguicidas. Aplicación de bioensayos. 92 a) Toxicidad crónica sobre la rana Xenopus leavis. Endpoint: sobrevivencia y teratogénesis. b) Toxicidad aguda de agroquímicos sobre el ajolote A. mexicanum. Endpoint: teratogénesis y sobrevivenvia. c) Toxicidad crónica de agroquímicos sobre el ajolote A. mexicanum. Endpoint: regeneración caudal. PUBLICACIONES RECIENTES EN LOS TEMAS DE ECOTOXICOLOGÍA Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS 1. Robles Cecilia and Vanegas Cecilia. Short-term effect of ammonia to Litopenaeus setiferus juveniles: oxygen consumption, nitrogen excretion and ammonia and urea accumulation. En preparación. 2. Robles Cecilia and Vanegas Cecilia. Chronic toxicity of ammonia to juveniles Litopenaeus setiferus: scope for growth. En preparación. 3. Rios Eduardo, Vanegas Cecilia and Robles Cecilia. Osmoregulatory behavior of Litopenaeus setiferus juveniles exposed to subletal levels of ammonia. En preparación. 4. Robles, C. e C. Gaggi. Valutazione Preliminare del Pericolo Potenziale degli Xantati su Ecosistemi di Acqua Dolce. Atti del XIII Congresso Nazionale della Società Italiana di Ecologia. Como, Italia. 5. Robles, C. and C. Gaggi. “Risk assessment of xanthates on freshwater ecosystems”. En preparación. 6. Robles, C., C. Sensini, S. Focardi and C. Gaggi. “Histopathological action of xanthates on gill tissue of Oncorhynchus mykis”. (Enviado: Chemosphere). 7. Robles, C., C. Gaggi, V. Croce and S. Galassi. “Chronic effect of xanthates: Reproductive efficiency of Daphnia magna”. (Enviado, Aquatic Toxicology). CAPACIDAD ANALÍTICA Matrices ambientales que analiza: Agua dulce Si Agua Marina Si Sedimentos Monitoreo de niveles de metales pesados Suelos No Otros Tejido animal Tipos de contaminantes que analiza: Metales: Mercurio Plaguicidas: Clorphyrifos Se iniciará con el análisis de Organoclorados Compuestos orgánicos: Otros: Amonio, nitrito y xantatos Pruebas biológicas que realiza: Bioensayos con: 93 Microalga (S. capricornutum), planta acuática (L. minor), crustáceos (D. magna, Litopenaeus setiferus) anfibios (sapos y A. mexicanum) y peces (Brachydanio rerio, Xiphophorus helleri, O. mykiss). Biomarcadores en: Crecimiento y campo de crecimiento (camarones peneidos) Histopatología (peces) Pruebas certificadas (Mencionar que tipo de certificación y su vigencia): Infraestructura con la que cuenta: Equipo de laboratorio: 1. Sistema respirométrico para camarones, peces y anfibios. 2. Oxímetros YSI 3. Espectrofotómetro de luz visible 4. Balanza Analítica Sartorious 5. Multianalizador de pH y conductividad Corning 6. Refractómetro Atago para medición de salinidad 7. Estufa BlumeM 8. Mufla para la combustión de muestras Thermolyne 1500 9. Microscopio estereoscópico Olympus 10. Microcentrífuga Eppendorf 11. Multianalizador de iones (Na+, Cl- y K+) Easy Lyte Plus 12. Sistema digestor de tejido 13. Multilector de placas Bio-Rad 14. Micro-osmómetro The Advanced 3300 15. Sistema para la determinación de la capacidad de nado de peces 16. Sistema para la preparación de muestras en laboratorio y su posterior evaluación de metales pesados 17. Espectro de absorción atómica de flama y horno de grafito Cultivo y mantenimiento de organismos y cepas (certificadas o no) 1. Área de mantenimiento de organismos acuáticos (camarones, peces y anfibios) 2. Área de ensayos toxicológicos con sistemas controlados de aireación y fotoperíodo 3. Acuarios para mantenimiento de organismos de agua dulce y salada 4. Sistemas de filtración mecánica, UV y biológica Los organismos de prueba son mantenidos previamente en el laboratorio (bajo los parámetros fisicoquímicos del ambiente y régimen de alimentación adecuados para cada especie), el tiempo suficiente para garantizar su adecuado estado fisiológico al inicio de los bioensayos de toxicidad. Compuestos de referencia certificados 94 Personal disponible Disposición para dar capacitación a otros usuarios en las pruebas que realiza Si de acuerdo a la disposición de tiempo. 95 CUESTIONARIO DATOS GENERALES Nombre del investigador: Institución (donde labora actualmente): Dependencia de adscripción: Área o departamento: Grupo de investigación: Puesto del Investigador: Dirección de la institución: Teléfono: Fax: Dirección electrónica: FORMACIÓN PROFESIONAL LUCIA SALAZAR CORIA INSTITUTO MEXICANO DEL PETROLEO DIRECCION EJECUTIVA DE MEDIO AMBIENTE Y SEGURIDAD PROTECCION AMBIENTAL EVALUACION INTEGRAL AMBIENTAL ESPECIALISTA D EJE CENTRAL LAZARO CARDENAS NO. 152. COL SAN BARATOLO ATEPEHUACAN. CP. 07730 9175-8500 9175-8484 lsalazar@imp.mx Licenciatura en Biología. FESC-Iztacala. UNAM Maestría en Toxicología. ENCB-IPN Experiencia docente relacionada al tema de ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos Proyectos realizados en ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos 1993-1995. Evaluación del efecto de la temperatura de la descarga 2 refinería “General Lázaro Cárdenas Minatitlán, Ver. 1995. EOE-8017. Diagnóstico ambiental de la Laguna Lagarto y el medio circundante a la estación 2 de rebombeo Loma Bonita, Oax 1996. DOC-8081. Evaluación del impacto del río Pánuco , debido a la influencia de la refinería y terminal marítima de Cd. Madero, Tamps. Informe Técnico integral de la temporada de lluvias (segunda etapa). 1996.DOC-8084. Evaluación del Impacto del río Coatzacoalcos, debido a la influencia de la refinería de Minatitlán, Ver”. Informe Técnico Integral de la temporada de lluvias (segunda etapa). Agosto, 1996 1996. DOC-8151. Caracterización fisicoquímica y biológica de la bahía y estero la Ventosa y las lagunas superior e inferior, Salina Cruz, Oax. Diagnóstico ambiental del estero La ventosa. (Dictamen Final). 1996. .EOE-8084 Evaluación del impacto del río Coatzacoalcos debido a la influencia de la refinería de Minatitlán, Ver. Informe Técnico Integral Final (Ciclo Anual) 1997. EOE-8085. Evaluación del impacto del río Pánuco debido a la influencia de la refinería y terminal marítima de Cd. Madero, Tamps. Informe Técnico Integral Final 1996. DOC-0002. Descripción del escenario ambiental de la región de mayor incidencia 96 de la especie Penaeus setiferus. Cruceros oceanográficos Perfotox I-II 1997. DOC-8059. Bioacumulación y seguimiento de contaminantes en el río Pánuco y sus principales influentes (Canal de Chijol y Varadero). 1997. DOC-8060. Bioacumulación y seguimiento de contaminantes en la Cuenca Baja del río Coatzacoalcos y sus principales influentes (Calzadas Arroyo Teapa) 1997. DOC-6200. Evaluación del grado de afectación por las emisiones de dibenzodioxinas y dibenzofuranos en el ambiente circundante al CPQ Pajaritos. 1997. DOC-8062. Creación de marcos de referencia ambientales para los dragados de mantenimiento en terminales marítimas de Pemex Refinación (terminal marítima de Madero) junio 1997 1997. DOC-8063. Creación de marcos de referencia ambientales para los dragados de mantenimiento en terminales marítimas de Pemex Refinación (terminal marítima de Pajaritos) 1998. DOC-8075. Caracterización del grado de toxicidad de las descargas en las refinerías “Gral. Lázaro Cárdenas del río de Minatitlán, Ver. Y “Francisco I. Madero de Cd. Madero, Tamps. 1998. Diagnóstico ambiental del arroyo San Francisco 1998. Diagnóstico ambiental de la Laguna Limón, pantano y arroyo los monos en relación al complejo procesador de gas de Ciudad Pemex. 1998. Evaluación ambiental del pantano Santa Alejandrina y Arroyo San Francisco. 1998. DOC-8106. Identificación de posibles compuestos tóxicos en las aguas residuales vertidas al río de los remedios en la zona de San Juan Ixhuatepec. 1998. P.00644. Circulación y transporte en la cuenca baja del río Panuco como base para evaluar la sensibilidad y riesgo ecológico del sistema. 1998. DOC-8106. Monitoreo de aguas residuales en Sn. Juan Ixhuatepec" 1999. DOC-8041. Creación de marcos de referencia ambientales para los dragados de mantenimiento en terminales marítimas de PEMEX-Refinación" 1999. DOC-7217. Evaluación del sistema acuático superficial y subterráneo del CPG Cd. de PEMEX" 1999. DOC-7205. Estudio ambiental integral de la región de Salina Cruz, Oax. 1999. DOC-7221. Estudio y evaluación de las aguas residuales de instalaciones de distribución de PEMEX-Refinación" 1999. P.00473. Investigación sobre el origen y dispersión de las emisiones naturales y antropogénicas de las actividades costa afuera de petróleos mexicanos. 1999. P.011 96F-48-VI. Biodegradación de compuestos recalcitrantes 1999. P.01350. Evaluación ambiental del derrame provocado por la toma clandestina del poliducto Minatitlán-Salina Cruz, Oax. en el arroyo Igú y Laguna Superior, Oax. 2000. F.00291. Evaluación del efluente de la refinería e Cadereyta y el cuerpo receptor asociado. 2000. F.00244. "Diagnóstico de la contaminación por hidrocarburos en el subsuelo de la terminal de almacenamiento y distribución de Pachuca, Hgo." 2000. F.00009. Desarrollo y evaluación de prueba de campo para la biorremediación del pantano Santa Alejandrina, Minatitlán, Ver. 2001 F.27035. Análisis de efluentes en Pajaritos, Ver. 2001. F.00291. Evaluación del efluente de la refinería de Cadereyta 2001 F.01421. Estudio para e control de corrosión interior en ductos para el transporte de hidrocarburos de la región marina noreste. 2001. D.00888. Desarrollo de combustibles de bajo impacto ambiental. 2001 D.00017. Investigación sobre evaluación ambiental de procesos de refinación del petróleo. 2001 D.00015. Evaluación de las actividades costa afuera e instalaciones costeras 97 asociadas en el ambiente marino de la Sonda de Campeche. 2002 F.21016. Estudio de seguimiento del proyecto ambiental integral de la región de Salina Cruz, Oax. 2002. F.20764. Evaluación ambiental del derrame provocado por la toma clandestina del poliducto minatitlán-salina Cruz, Oax. en el arroyo Sn. Pedro, estero Xadani y laguna superior 2002 K.00513. Implantación de modelos biológicos para la evaluación ecotóxica de sistemas acuáticos influidos por actividades de la industria petrolera. 2002 F.00009. Desarrollo y evaluación de prueba de campo para la biorremediación del pantano Santa Alejandrina, Minatitlán, Ver. 2002. F.37062. Evaluación de los efectos de las actividades petroleras Costa afuera e instalaciones costeras asociadas en el ambiente marino de la sonda de Campeche". Fase I. 2002. F.20700. Programa de Seguimiento del proyecto ambiental de Salina Cruz, Oax. (recursos acuáticos). 2003. F.20713. Restauración del Pantano Santa Alejandrina, Minatitlán, Ver. 2003. F. 52678. Evaluación de los efectos de las actividades petroleras costa afuera e instalaciones costeras asociadas en el ambiente marino de la Sonda de Campeche. Fase II. Evaluación prospectiva. 2004. F.21176. Diagnóstico de la contaminación en el DDV Villahermosa-Minatitlán 2004. F.30348. Estudios para la evaluación de corrosión 2005. F.52678 Evaluación de los efectos de las actividades petroleras costa afuera e instalaciones costeras asociadas en el ambiente marino de la Sonda de Campeche. Fase II. Evaluación final. PRINCIPALES LINEAS DE INVESTIGACIÓN EN ECOTOXICOLOGÍA Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS 1. Evaluación de efectos tóxicos en sistemas acuáticos marinos y continentales por contaminación con productos del petróleo. 2. Evaluación de toxicidad de agua y sedimentos. 2. Evaluación de toxicidad de inhibidores de corrosión y lodos y recortes de perforación y productos químicos. 3. Evaluación de toxicidad de emisiones vehiculares 5. Monitoreo de bioacumulación/biodisponibilidad de contaminantes en sistemas acuáticos PUBLICACIONES RECIENTES EN LOS TEMAS DE ECOTOXICOLOGÍA Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS 1. 2004. Ecotoxicología de la Sonda de Campeche. Capitulo del libro PEMEX y la salud ambiental en la Sonda de Campeche. 2. 2005. Sediment acute toxicity and its relation with nickel and vanadium levels. Articulo en revista Bull. Environ. & Toxicol. En prensa. 98 CAPACIDAD ANALÍTICA Matrices ambientales que analiza: Agua dulce Agua Marina Sedimentos Suelos Otros X x x x Lodos y recortes de perforación, inhibidores de corrosión, descargas, emisiones vehiculares (gases y particulas totales), petroleo crudo, productos químicos Tipos de contaminantes que analiza: Metales: Plaguicidas: Compuestos orgánicos: Ni, V, Ba, Cu, Zn, Hg, Pb, Cd, As, Fe. Hidrocarburos poliaromáticos, Hidrocarburos totales del petróleo, hidrocarburos aromáticos totales. Otros: Pruebas biológicas que realiza: Bioensayos con: Vibrio fischerii (Photobacterium phosphoreum) Artemia franciscana Daphnia magna Panagrellus redivivus Cyrpidpsis vidua Hyalella azteca Limnodrillus hoffmeisteri Ankistrodesmus falcatus Selenastrum capricornutum Biomarcadores en: EROD en higado, branquias y gónadas de peces Acetil colinesterasa en peces, crustáceos y oligoquetos Proteinas totales Pruebas certificadas (Mencionar que tipo de certificación y su vigencia): Infraestructura con la que cuenta: Equipo de laboratorio Cámara ambiental, microscopios óptico y estereoscopico, centrifuga, microcentrifuga de refrigeración, macerador de tejidos, estufas, incubadora, refrigerador, congelador, espectrofotometro de UV, espectrofotómetro de fluorescencia, balanza analítica, balanza semianalítica, medidor de parámetros de agua (pH, OD, salinidad, Redox), turbidímetro, destiladora, desionizador, sistema de acuarios, laboratorio móvil de 99 monitoreo de aguas. Cultivo y mantenimiento de organismos y cepas (certificadas o no) Artemia franciscana Daphnia magna Panagrellus redivivus Cyrpidpsis vidua Hyalella azteca Limnodrillus hoffmeisteri Ankistrodesmus falcatus Selenastrum capricornutum Chlorella vulgaris Dunaliella sp. Compuestos de referencia certificados Personal disponible 3 técnicos Disposición para dar capacitación a otros usuarios en las pruebas que realiza 100 CUESTIONARIO DATOS GENERALES Nombre del investigador: Dr. S.S.S. Sarma Institución (donde labora actualmente): UNAM Dependencia de adscripción: Iztacala Área o departamento: Posgrado Grupo de investigación: Ecologia y Ecotoxicologia de Zooplancton Puesto del Investigador: Prof. Tit. “C”, TC. Def. Dirección de la institución: Teléfono: Av. Los Barrios, FES Iztacala, AP 314, CP 54090, Los Reyes, Iztacala, Tlalnepantla, Edo. de Mexico 56231125 Fax: 5231256 Dirección electrónica: sarma@servidor.unam.mx FORMACIÓN PROFESIONAL Doctor en Ciencias Zoologicas (Desde 1988); Sistema Nacional de Investigadores (SNI) Nivel II Experiencia docente relacionada al tema de ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos Tutor principal de Maestria y Doctorado (UAM, UNAM y IPN) Proyectos realizados en ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos CONACyT y PAPIIT (UNAM): proyectos relacionados de ecotoxicologia de zooplancton PRINCIPALES LINEAS DE INVESTIGACIÓN EN ECOTOXICOLOGÍA Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS 1.Cultivo y uso de rotiferos como organismos de bioensayo 2.Cultivo y uso de cladoceros como organismos de bioensayo 3.Cultivo y uso de ostracodos como organismos de bioensayo 4.Cultivo y uso Chlorella como organismos de bioensayo 5.Cultivo y uso de Scenedesmus como organismos de bioensayo 101 PUBLICACIONES RECIENTES EN LOS TEMAS DE ECOTOXICOLOGÍA Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS 1. Sarma SSS, Núñez-Cruz HF & Nandini S 2005 Effects on the population dynamics of Brachionus rubens (Rotifera) caused by mercury and cadmium administered through medium and algal food (Chlorella vulgaris). Acta Zoologica Sinica 51(1): 46-52 2. Ramírez-Pérez T, Sarma SSS & Nandini S 2004. Effects of mercury on the life table demography of the rotifer Brachionus calyciflorus Pallas (Rotifera). Ecotoxicology 13: 535-544 3. García-García G, Nandini S & Sarma SSS 2004 The effect of cadmium on the population dynamics of Moina macrocopa and Macrothrix triserialis (Cladocera). Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology 72(4): 717-724 (SpringerVerlag, USA). 4. Gama-Flores JL, Sarma SSS & Nandini S 2004 Acute and chronic toxicity of the pesticide methyl parathion to the rotifer Brachionus angularis (Rotifera) at different algal (Chlorella vulgaris) food densities. Aquatic Ecology 38: 27-36 5. Nandini S, Mayeli SM & Sarma SSS 2004 Effect of stress on the life table demography of Moina macrocopa. Hydrobiologia 526: 245-254 CAPACIDAD ANALÍTICA Matrices ambientales que analiza: Agua dulce X Agua Marina Sedimentos Suelos Otros Tipos de contaminantes que analiza: Metales: Plaguicidas: X X Compuestos orgánicos: X Otros: Microcystis Pruebas biológicas que realiza: Bioensayos con: Alga, Zooplancton, Larva de Pez Biomarcadores en: 102 Pruebas certificadas (Mencionar que tipo de certificación y su vigencia): Infraestructura con la que cuenta: Varios Equipos de laboratorio Cultivo y mantenimiento de organismos y cepas (certificadas o no) Sepas de varias especies de alga y zooplancton Compuestos de referencia certificados Personal disponible Dr SSS Sarma Dra Nandini Sarma Disposición para dar capacitación a otros usuarios en las pruebas que realiza 103 CUESTIONARIO DATOS GENERALES Nombre del investigador: REFUGIO RODRÍGUEZ VAZQUEZ Institución (donde labora actualmente): CINVESTAV-IPN Dependencia de adscripción: Área o departamento: DEPTO. DE BIOTECNOLOGÍA BIOINGENIERIA BIOTECNOLOGÍA AMBIENTAL Grupo de investigación: XENOBIOTICOS Puesto del Investigador: CINVESTAV 3C (TITULAR) Dirección de la institución: Teléfono: AV. IPN 2508, MÉXICO D.F. 50613316 Fax: 50613313 Dirección electrónica: rrodrig@mail.cinvestav.mx rerovaz@yahoo.com.mx COL. Y ZACATENCO, , FORMACIÓN PROFESIONAL ING. QUIM.IND., ESIQIE-IPN M. C. QUÍMICA ORGANICA, CINVESTAV-IPN DR. C. EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA DE LA MADERA, UNIVERSIDAD ESTATAL DE COLORADO Experiencia docente relacionada al tema de ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos -CURSO DE BIOTECNOLOGÍA AMBIENTAL (SECCION DE BIOENSAYOS), CINVESTAV-IPN - CONFERENCIAS OFRECIDAS EN FOROS NACIONALES E INTERNACIONALES POR INVITACIÓN (BIORREMEDIACION-BIOENSAYOS ECOTOXICOLOGICOS) Proyectos realizados en ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos BANCO MUNDIAL-INE PRINCIPALES LINEAS DE INVESTIGACIÓN EN ECOTOXICOLOGÍA Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS 1. BIORREMEDIACION DE SUELOS POR BIOESTIMULACION Y PRUEBAS ECOTOXICOLOGICAS 104 2. BIORREMEDIACION DE SUELOS POR BIOPILAS Y PRUEBAS ECOTOXICOLOGICAS 3. 4. 5. PUBLICACIONES RECIENTES EN LOS TEMAS DE ECOTOXICOLOGÍA Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS 1. 2. 3. 4. 5. CAPACIDAD ANALÍTICA Matrices ambientales que analiza: Agua dulce Agua Marina Sedimentos Suelos DIGESTOR PARA DETERMINACIÓN DE N; CENTRÍFUGA REFRIGERADA (DETERMINACIÓN DE COPs); MICROSPOPIOS; CAMPANAS DE FLUJO MALINAR (DETERMINACIÓN MICROBIANA); INCUBADORAS AGITADORAS E INCUBADORAS ESTATICAS (CULTIVO DE MICROORGANISMOS); EQUIPO DE EXTRACCIÓN DE COPs (SONICADOR, SOXHLET, ROTOEVAPORADOR, ETC). Otros Tipos de contaminantes que analiza: Metales: ADSORCION ATOMICA CON HORNO DE GRAFITO (DETERMINACIÓN DE METALES); ADSORCION ATOMICA (DETERMINACIÓN DE METALES); Plaguicidas: CROMATOGRAFÍA DE GASES/MS (DETERMINACIÓN DE COPs); Compuestos orgánicos: CROMATOGRAFÍA DE GASES/MS (DETERMINACIÓN DE COPs); Otros: UV-VISIBLE (DETERMINACIÓN DE ACTIVIDADES DE GASES ENZIMATICAS); CROMATOGRAFÍA (RESPIRACIÓN MICROBIANA) ; Luminómetro; electroforesis, etc. Pruebas biológicas que realiza: Bioensayos con: Pseudomonas putida Lombrices 105 Germinación de semillas Actividades enzimáticas Biomarcadores en: Pruebas certificadas (Mencionar que tipo de certificación y su vigencia): Infraestructura con la que cuenta: Equipo de laboratorio Mismo que el antes mencionado Cultivo y mantenimiento de organismos y cepas (certificadas o no) EL DEL CINVESTAV-IPN Compuestos de referencia certificados Personal disponible 1 AUXILIAR (IBQ) 1 AUXILIAR (DR. EN CIENCIAS) 1 TECNICO Disposición para dar capacitación a otros usuarios en las pruebas que realiza SI SE TIENE DISPOSICIÓN E INFRAESTRUCTURA 106 CUESTIONARIO DATOS GENERALES Nombre del investigador: Institución actualmente): (donde Alma Socorro Sobrino Figueroa labora Universidad Iztapalapa Autonoma Metropolitana- Dependencia de adscripción: División C.B.S. Área o departamento: Hidrobiología Grupo de investigación: Ecotoxicología Puesto del Investigador: Profesor Titula “C” Tiempo Completo Dirección de la institución: Av. San Rafael Atlixco # 186 C.P. 09340 Col. Vicentina Iztapalapa D.F. México Teléfono: 58-04-64-74 Fax: 58-04-47-38 Dirección electrónica: coco@xanum.uam.mx FORMACIÓN PROFESIONAL Licenciatura: Biología con área de concentración en Hidrobiología UAMI Maestria: Maestria en Ciencias (Biología) Facultad de Ciencias UNAM Doctorado: Doctorado en Ciencias Marinas. CICIMAR-IPN Experiencia docente relacionada al tema de ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos Imparto actualmente la parte práctica (laboratorio) de la UEA (Unidad de EnseñanzaAprendizaje) de “Alteración de Ecosistemas” perteneciente a la licenciatura de Hidrobiología. Se han propuesto las siguientes materias optativas: Ecotoxicología I y II Técnicas de análisis de contaminantes I y II Y se ha impartido un curso especial denominado: “Evaluación de la calidad del agua de efluentes”. Proyectos realizados en ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos 107 He participado como responsable o colaborador en los siguientes proyectos: 1. Evaluación geoquímica ambiental y diagnosis de la zona costera de Veracruz: lagunas de Tamiahua, Pueblo Viejo y Tampamachoco. Clave 3232T CONACYT 1994-1995. (Colaborador) 2. Efectos de genotoxicos detectados en agua y sedimento de la laguna de Tamiahua, Ver. Sobre larvas de Crassostrea virginica. UAMI 1996-1997, (Responsable) 3. Origen, naturaleza y evaluación de fuentes contaminantes en Bahía de la Paz, B.C.S., y su impacto en la biota. CICIMAR-IPN, 1996. (Colaborador) 4. Hidrocarburos y Metales tóxicos en cuerpos acuáticos y su bioacumulación (Evaluación de la Toxicidad de sedimentos). Laboratorio de Contaminación Marina Instituto de Ciencias del Mar y Limnologia UNAM y Gerencia de Seguridad Industrial y Protección Ambiental de PEMEX Exploración y Producción en la Región Sur. 2001 (F50003). (Colaborador) 5. Biomarcadores en organismos acuáticos mexicanos para monitoreo ambiental UAMI 2002-2005. (Responsable) 6. Monitoreo Ambiental Integral de los impactos de la actividad petrolera en la Laguna Yucateco, Tabasco, México. Laboratorio de Contaminación Marina Instituto de Ciencias del Mar y Limnología UNAM y Instituto Mexicano del Petróleo, 2003-2004. (Colaborador). 7. Determinación del riesgo ecológico de un ambiente acuático. UAMI- IIO UABCS. (Colaborador) PRINCIPALES LINEAS DE INVESTIGACIÓN EN ECOTOXICOLOGÍA Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS 1.Evaluación del efecto de metales tóxicos (cadmio, plomo y cromo) en organismos marinos (Almeja catarina, Artemia franciscana, ostión), y de agua dulce (Daphnia, ostracodos) 2.Evaluación del efecto tóxico y genotóxico de sedimentos 3.Evaluación de biomarcadores en organismos expuestos a estresores. (Lipoperoxidación, daño genético por ensayo cometa, determinación de acetilcolinesterasa, de actividad de EROD) 4.Bioacumulacion de metales en almejas (Argopectan ventricosus) 5. PUBLICACIONES RECIENTES EN LOS TEMAS DE ECOTOXICOLOGÍA Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS 1. Sobrino-Figueroa, A. 2004. Indicadores biológicos. In: Arredondo Figueroa, J.L. (Ed.). Limnología de presas mexicanas. U. A. M., México (en prensa). 2. Sobrino-Figueroa, A., Villanueva S. Y A.V. Botello. 2004. Efecto de genotóxicos en sistemas costeros de Veracruz. In: A.V. Botello, (Eds.). Golfo de México: Contaminación e Impacto Ambiental. Diagnóstico y tendencias. 2ª Ed. SEP, UAC, EPOMEX, Serie Científica, 5, (en prensa). 3. A. Sobrino-Figueroa C. Cáceres-Martínez A.V. Botello. 2005 Effects of Cadmium, Chromium, Lead and its mixtures on juveniles of the Catarina 108 Clam Argopecten ventricosus (Sowerby II, 1842). (En preparación) 4. 5. CAPACIDAD ANALÍTICA Matrices ambientales que analiza: Agua dulce Efecto tóxico por medio de bioensayos agudos con Daphnia magna y ostrácodos. Evaluación de presencia de genotóxicos por el método de Chromotest. Agua Marina Efecto tóxico por medio de bioensayos agudos con Artemia franciscana. Evaluación de presencia de genotóxicos por el método de Chromotest. Sedimentos Determinación de metales por la técnica de Absorción Atómica. Suelos Otros Tipos de contaminantes que analiza: Metales: Cadmio, plomo y cromo Plaguicidas: Compuestos orgánicos: Otros: Sustancias con efecto genotóxico Pruebas biológicas que realiza: Bioensayos con: Chlorella vulgaris, Tetraselmis sp. Daphnia magna, Artemia franciscana, ostracodos (Cypris). Larvas de ostión y almeja (Argopecten ventricosus). Adultos de ostión y almeja Peces (Atherinidos) (Se están montando las técnicas para trabajar con estos organismos). Biomarcadores en: Efecto radicales libres (Lipoperoxidación), Daño genético (Ensayo cometa, Chromotest), inhibición de acetilcolinesterasa, actividad de EROD, histología, variación en concentración de proteínas lípidos y carbohidratos de la glándula digestiva de moluscos. Pruebas certificadas (Mencionar que tipo de certificación y su vigencia): 109 Infraestructura con la que cuenta: Equipo de laboratorio Todo lo necesario para la ejecución de bioensayos. Para digestión de muestras ambientales (por microondas). Equipo para la determinación de los biomarcadores. Cultivo y mantenimiento de organismos y cepas (certificadas o no) Cepas de Clorella vulgaris, Tetraselmis sp. Daphnia magna, Quistes de Artemia franciscana, cepa de ostracodos (Cypris) Compuestos de referencia certificados Personal disponible En el laboratorio de Ecotoxicología se encuentran adscritas: M. en C. Guadalupe Barrera Escorcia, M. en C. Xochitl Guzmán Garcia Dra. Patricia Ramírez Romero y Dra. Alma S. Sobrino F. Se tiene un ayudante academico y estudiantes realizando seminarios de investigación o servicios sociales. Disposición para dar capacitación a otros usuarios en las pruebas que realiza Estoy en la mejor disposición de realizar pruebas biológicas como servicio a otras instituciones e impartir cursos sobre bioensayos y tópicos afines. 110 CUESTIONARIO DATOS GENERALES Nombre del investigador: Institución (donde labora actualmente): Dependencia de adscripción: Área o departamento: Grupo de investigación: Puesto del Investigador: Dirección de la institución: Teléfono: Fax: Dirección electrónica: FORMACIÓN PROFESIONAL M en C RAUL URIBE HERNANDEZ INSTITUTO MEXICANO DEL PETROLEO MEDIO AMBIENTE Y SEGURIDAD RESTAURACION RESTAURACION ESPECIALISTA L. Cárdenas 152, Atepehuacan 9175 8404 9175 8000 ruribe@imp.mx Col. San Bartolo Biólogo, UNAM M en C especialidad Toxicología, IPN Candidato a Dr. con especialidad Ciencias Químico- Biológicas-IPN Experiencia docente relacionada al tema de ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos Pruebas especiales en Hematología ENCB-IPN Cultivo de tejidos animales y pruebas de citotoxicidad ENCB-IPN Patología Humana ENCB-IPN Proyectos realizados en ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos Evaluación ecotoxica de suelo contaminado con hidrocarburos en Ver. Evaluación de la toxicidad emisiones de gasolina y diesel Evaluación ecotoxica de suelo bioremediado en Tabasco y Ver. Evaluación ecológica de un ecosistema tropical impactado con hidrocarburos o PRINCIPALES LINEAS DE INVESTIGACIÓN EN ECOTOXICOLOGÍA Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS 1. Pruebas de fitotoxicidad de suelos contaminados con hidrocarburos 2. Pruebas de Toxicidad con Lombriz de tierra en suelo contaminado con hidrocarburos 3. Pruebas de toxicidad in vitro de matrices ambientales contaminadas 4. 111 5. PUBLICACIONES RECIENTES EN LOS TEMAS DE ECOTOXICOLOGÍA Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS 1. PEREZ ZAPATA A.J., VEGA BARRITA M..L. Y URIBE HERNANDEZ R., 1998, ESTUDIO IN VITRO DEL EFECTO TOXICO DEL PLOMO EN LA BIOSINTESIS DE PORFIRINAS . ANALES DE LA ESC. NAC. DE CIENC. BIOL.-IPN.6:51-63. 2. URIBE HERNANDEZ R., MARTINEZ-MARTINEZ V.E. AND AVELINOZAPATA G.E., 2000. EVALUATION OF THE BIOREMEDIATION TECHNOLOGY FOR DRILLING OF OIL WASTE WELLS IN TABASCO. PROCEEDINGS OF FIRST INTERNATIONAL CONFERENCE ON PETROELUM BIOTECHNOLOGY;MEXICO CITY, 207-210 pp. 3. URIBE-HERNÁNDEZ R., AVELINO Y ZAPATA G.E., MONTES DE OCA-GARCÍA M.A., ZERMEÑO-EGUÍALIZ J.A., ORTIZ-CORNEJO N. L., SALAZAR-CORIA L., CASTRO ORTÍZ L., MARTÍNEZ–MARTÍNEZ V.E., 2004. ECOTOXICIDAD DE HIDROCARBUROS DEL PETROLEO EN RELACION A LA DESORCION Y DEGRADACION EN SUELO CONTAMINADO DEL SURESTE MEXICANO 4. ZERMEÑO E.L., URIBE H.R., SALAZAR C.L., CAMACHO R.A., ET AL, 2000. FEASIBILITY STUDIES AND TOXICITY TESTS FOR PHYTOREMEDIATION OF SOILS CONTAMINTED WITH HYDROCARBONS. PROCEEDINGS OF FIRST INTERNATIONAL CONFERENCE ON PETROELUM BIOTECHNOLOGY; MÉXICO CITY,235-239 pp. 5. URIBE H.ERNANDEZ R. , PEREZ Z.APATA A.J., 2002. GENOTOXICITY MECHANISM OF THE PAHS THROUGH OF FREE RADICAL OXYGEN IN HUMAN BLOOD CELLS. TOXICOLOGY LETTERS, 123 (SUPPL. 1):122. CAPACIDAD ANALÍTICA Matrices ambientales que analiza: Agua dulce Agua Marina Sedimentos Suelos Otros Tipos de contaminantes que analiza: Metales: Plaguicidas: Compuestos orgánicos: Otros: Pesados y de transición Petróleo y sus productos refinados Pruebas biológicas que realiza: Bioensayos con: Especies vegetales como hortalizas y pastos Lombriz de tierra 112 Líneas celulares de mamíferos y de peces Biomarcadores en: En vegetales son clorofilas y peroxidasas El lombriz son hemoglobina y cloroperoxidasa En cultivos celulares son porfirinas, ferroquelatasa, deshidratasa, radicales libres de oxígeno, fragmentos de DNA. Pruebas certificadas (Mencionar que tipo de certificación y su vigencia): Infraestructura con la que cuenta: Equipo de laboratorio Centrifugas Balanzas Campana de flujo laminar Autoclaves Incubadoras Espectro uv HPLC Cultivo y mantenimiento de organismos y cepas (certificadas o no) Lombriz de tierra (No certificados) Leucocitos humanos (No certificados) Líneas celulares (Certificadas) Compuestos de referencia certificados HAP certificados Personal disponible Técnicos, Profesionistas, Maestros Ciencias y Doctores Disposición para dar capacitación a otros usuarios en las pruebas que realiza Mediante convenio o solicitud de capacitación con estancias programadas. 113 CUESTIONARIO DATOS GENERALES Nombre del investigador: Dra. Cecilia Vanegas Institución (donde labora actualmente): Facultad de Ciencias, Universidad Nacional Autónoma de México. Dependencia de adscripción: Laboratorio de Ecofisiología, Facultad de Ciencias; Universidad Nacional Autónoma de México. Área o departamento: Departamento de Ecología y Recursos Naturales Grupo de investigación: Ecofisiología y Ecotoxicología Acuática Puesto del Investigador: Teléfono: Profesor de Carrera Titular “A”, Tiempo Completo Ciudad Universitaria; Av. Universidad 3000; Col. Copilco el Bajo. C.P. 04510 56224829 Fax: 56224828 Dirección electrónica: rcvp@hp.fciencias.unam.mx Dirección de la institución: FORMACIÓN PROFESIONAL Dra. en Ciencias (Biología). Obtención de Grado. 1996 Estancia Postdoctoral: Universidad de Plymouth, Inglaterra. 2002-2003 Area de especialidad: Ecofisiología y Ecotoxicología Acuática Experiencia docente relacionada al tema de ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos 1. Docencia 1.1.Nivel Licenciatura: 1986 a la fecha 1.1.1. Aspectos Ecotoxicológicos en Organismos Acuáticos. 1.1.2. Taller Terminal. Diagnósctico Ambiental y Evaluación de Riesgo Ecológico 1.2. Nivel Posgrado: 1995 a la fecha 1.2.1. Maestría en Ciencias (Facultad de Ciencias). Temas Selectos de Biología Acuática. Alteraciones Ambientales: un enfoque biológico. 1.2.2. Posgrado en Ciencias del Mar y Limnología. Genética Ecotoxicológica. 2. Formación de Recursos Humanos. 1993 a la fecha 2.1. Servicio Social. Ecotoxicología de Crustáceos Acuáticos: 8 2.2. Tesis de Licenciatura: Recibidos 6; En proceso 2 2.3. Tesis de Maestría: Recibidos 5; En proceso 2 2.4. Tesis de Doctorado: En proceso 1 114 Proyectos realizados en ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos 1. Estudio ecotoxicológico en los juveniles del camarón blanco Penaeus setiferus (Crustacea, Decapoda) de la Laguna de Términos: alteraciones fisiológicas y bioquímicas por efecto del cadmio, zinc y fenantreno. 1994 - 1996. 2. Efecto tóxico de compuestos nitrogenados (amonio y nitrito) y niveles limitantes de oxígeno disuelto sobre postlarvas y juveniles del camarón blanco Litopenaeus vannamei y Litopenaeus setiferus. 1996 a 2001. 3. Evaluación del efecto de fluídos de perforación en postlarvas de camarones peneidos. Instituciones participantes: 1998 a 2000. 4. Diagnóstico del efecto biológico en el ambiente marino de las actividades petroleras en la Sonda de Campeche. 2001. 5. Evaluación del efecto subletal de compuestos nitrogenados en crustáceos decápodos: estudios in situ y experimentales. Department of Biological Sciences. University of Plymouth, U.K. 2002 a 2003. 6. Evaluación del efecto biológico de la contaminación de los canales de Xochimilco en el ajolote Ambystoma mexicanum. 2003 a 2005. 7. Diagnóstico Ambiental y Evaluación de Riesgo Ecológico en la Zona Chinampera de Xochimilco, México. 2003 a 2005. 8. Evaluación del efecto biológico de la contaminación en invertebrados de sistemas lagunares-estuarinos del Estado de Sinaloa mediante la propuesta de biomarcadores múltiples. 2004-2005. 9. Hacia una enseñanza experimental de las Ciencias Ambientales en la Licenciatura de Biología. 2005-2006. PRINCIPALES LINEAS DE INVESTIGACIÓN EN ECOTOXICOLOGÍA Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS 1. Líneas de Investigación 1.1. Evaluación bajo condiciones controladas del efecto letal y subletal en organismos acuáticos de: 1.1.1. Metales pesados 1.1.2. Fluidos de Perforación 1.1.3. Compuestos Nitrogenados 1.2. Evaluación in situ del efecto adverso de contaminantes en organismos acuáticos (bivalvos, crustáceos, anfibios) en sistemas costeros y continentales 2. Aplicación de los estudios 2.1. Implementación de biomarcadores de exposición y efecto en organismos acuáticos (bivalvos, crustáceos, peces y anfibios). 2.2. Determinación de sensibilidad de diversos estadios de vida de organismos acuáticos a diversos tóxicos ambientales. 2.3. Establecimiento de relaciones de causalidad 115 PUBLICACIONES RECIENTES EN LOS TEMAS DE ECOTOXICOLOGÍA Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS 1. Alcaraz, G., C. Vanegas and X. Chiappa-Carrara. 2002. Metabolic rate of Bathygobius ramosus upon a natural daytime tidal cycle. Series, Oceanography of the Eastern Pacific. Vol II: 60-65. 2. Spanopoulos-Hernández M., C. Martínez-Palacios, C. Vanegas-Pérez, C. Rosas and L. Ross. 2005. The combined effects of salinity and temperature on the oxygen consumption of juvenile shrimps Litopenaeus stylirostris (Stimpson, 1874). Aquaculture. 244:341-348. 3. Piña L., X. Chiappa, G. Alcaraz and C. Vanegas. Tolerance to ammonia, nitrite and oxygen dissolved in Litopenaeus setiferus and Litopenaeus vannamei postlarvae and juveniles. (Enviado; Aquatic Toxicology). 4. Zúñiga S., A. Bianchini, I. Rosas and C. Vanegas. Cadmium bioaccumulation in Litopenaeus setiferus: relationship with methalothionein synthesis. (Enviado; Aquatic Toxicology). 5. Vanegas, C., M. Depledge and T. Galloway. Are the neurotoxic biomarkers in Carcinus maenas responses of specific or general toxic action? (En preparación). CAPACIDAD ANALÍTICA Matrices ambientales que analiza: Agua dulce Sí Agua Marina Sí Sedimentos Sí Suelos Sí Tipos de contaminantes que analiza: Metales: V, Cr, Mn, Fe, Ni, Cu, Zn, Cd, As, Sr, Pb Plaguicidas: Organoclorados y Organofosforados Compuestos orgánicos: Compuestos nitrogenados (amonio, nitrito, nitrato) Otros: Pruebas biológicas que realiza: Bioensayos con: Bivalvos: Mytella strigata Crustáceos: Camarón (Litopenaeus setiferus; L. vannamei; P. aztecus) Jaiba (Callinectes sapidus; C. rathbunae; C. similis) Cangrejo (Carcinus maenas; Uca princeps) Peces: Bathygobious ramosus 116 Anfibios: Ambystoma mexicanum (ajolote) Biomarcadores en: 1. Nivel Sub-organismo. Bioquímico: 1.1. Biomarcadores de exposición (metalotioneínas; esterasas; actividad EROD) 1.2. Biomarcadores de efecto (proteínas; iones plasmáticos; actividades enzimáticas; estrés oxidativo; contenido energético). 2. Nivel Organismo. Fisiológico. 2.1. Biomarcadores de efecto (osmoregulación; balance hídrico; campo de crecimiento; crecimiento; contenido e integraciones energéticas) Pruebas certificadas (Mencionar que tipo de certificación y su vigencia): Infraestructura con la que cuenta: 1. Infraestructura para mantenimiento de organismos acuáticos 2. Infraestructura para bionesayos agudos y crónicos en laboratorio e in situ 3. Equipo para la evaluación de los biomarcadores de exposición y efecto señalados 4. Equipo para la determinación de compuestos nitrogenados, metales y plaguicidas (organoclorados y organofosforados) Cultivo y mantenimiento de organismos y cepas (certificadas o no) 1. Crustáceos: 1.1. Artemia salina 1.2. Camarón (postlarvas y juveniles) 1.3. Cangrejos (juveniles y adultos) 2. Peces (especies y estadios diversos) 3. Anfibios (Ambystoma mexicanum: de huevo a juvenil) Compuestos de referencia certificados Personal disponible 2 Técnicos Académicos Alumnos de Licenciatura y Posgrado Disposición para dar capacitación a otros usuarios en las pruebas que realiza Disposición amplia. Disponibillidad de horarios de acuerdo a las pruebas a realizar y a la calificación del personal interesado 117 CUESTIONARIO DATOS GENERALES Nombre del investigador: OMAR ZAPATA PEREZ Institución (donde labora actualmente): Área o departamento: CENTRO DE INVESTIGACION Y DE ESTUDIOS AVANZADOSDEL IPN. UNIDAD MERIDA CENTRO DE INVESTIGACION Y DE ESTUDIOS AVANZADOSDEL IPN. UNIDAD MERIDA RECURSOS DEL MAR Grupo de investigación: ECOTOXICOLOGIA ACUATICA Puesto del Investigador: PROFESOR CINVESTAV 2C Dirección de la institución: Teléfono: KM 6 ANTIGUA CARRETERA A PROGRESO. COLONIA CORDEMEX. MERIDA, YUCATÁN. (999) 9812960 EXT 267 Fax: (999) 9812334 Dirección electrónica: ozapata@mda.cinvestav.mx Dependencia de adscripción: FORMACIÓN PROFESIONAL DOCTORADO EN TOXICOLOGIA Experiencia docente relacionada al tema de ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos CURSO A NIVEL DE POSGRADO “ECOTOXICOLOGIA ACUÁTICA” CURSO A NIVEL LICENCIATURA “TOXICOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS” IMPARTICIÓN DE CURSOS SOBRE EFECTOS DE COMPUESTOS ORGÁNICOS EN PECES (CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y DE CONTAMINACIÓN AMBIENTAL CICA Costa rica). INSTRUCTOR EN LOS CURSOS DE CONTAMINACION MARINA PARA EL PERSONAL NACIONA DE LA SECRETARIA DE MARINA. INVITADO POR LA IUPAC COMO PONENTE SOBRE EFECTOS DE PLAGUCICIDAS EN PECES Y ORGANISMOS ACUATICOS (SAN JOSE DE COSTA RICA) Proyectos realizados en ecotoxicología y/o aplicación de bioensayos EL USO DEL CYP1A COMO HERRAMIENTA PARA EVALUAR EL IMPACTO OCASIONADO POR HIDROCARBUROS EN TRES LAGOS DEL MUNICIPIO SAN MIGUEL, REFORMA CHIAPAS. 118 APLICACIÓN DE TECNICAS BIOQUÍMICAS Y MOLECULARES PARA EVALUAR EL IMPACTO ANTROPOGÉNICO SOBRE EL RECURSO CAMARON. PARTICIPACION EN EL PROYECTO DENOMINADO EVALUACION DEL IMPACTO DE LOS PLAGUICIDAS ORGANOCLORADOS EN LOS PECES ARIOPSIS ASIMILIS DE LA BAHIA DE CHETUMAL PRINCIPALES LINEAS DE INVESTIGACIÓN EN ECOTOXICOLOGÍA Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS 1. EXPRESION DE GENES PARA EVAUAR EFECTO DE COMPUESTOS ORGÁNICOS. 2.ACTIVIDADES ENZIMATICAS FASE I Y FASE II COMO INDICADORES DE EXPOSICION A CONTAMINANTES ORGÁNICOS 3.EXPRESION DE LAS METALOTIONEINAS 4.DETERMINACION DE PROTEINAS RELACIONADAS CON EL CYP450 Y CON DISRUPCION ENDOCRINA (WESTERN BLOT) 5. CINÉTICAS EN SANGRE DE PECES PARA EVALUAR EL TIEMPO DE ELIMINACION DE LOS COMPUESTOS ORGANICOS PUBLICACIONES RECIENTES EN LOS TEMAS DE ECOTOXICOLOGÍA Y/O APLICACIÓN DE BIOENSAYOS 1. O. Zapata-Pérez; Del-Río M.; Domínguez J.; Ceja V.; Chan Ricardo; GoldBouchot G. (in press). Preliminary Studies of Biochemical Changes (ECOD Activities and Vitellogenin Induction) In Two Species Of Shrimp (F. Duorarum And L Setiferus) From The Gulf Of Mexico. Ecotoxicology and Environmental Safety. EUA. 2. Castorena-Torres F, Mendoza-Cantú A, de León Cisneros, Zapata-Pérez O, López-Carrillo L, Salinas, Albores A. (In press). CYP1A2 phenotype and genotype in a population from the carboniferous region of Coahuila, Mexico. Toxicology Letters. Ireland Ltd. 3. Zapata-Pérez O, Gilberto Castañeda, Victor Ceja, Gerardo Gold-Bouchot, Arnulfo Albores (2004). Toxicokinetics of Pyrene in Tilapias Oreochromis niloticus Following and Intraperitoneal Administration. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology. 72: 1253-1259 4. Noreña-Barroso E, Simá-Alvarez R, Gold-Bouchot G, Zapata-Pérez O (2004) Persistent organic pollutants and histological lesions in Mayan catfish Ariopsis assimilis from the Bay of Chetumal, México. Marine Pollution Bulletin. 48: 263269 5. Zapata-Pérez O, Gold-Bouchot G, Ortega A, López T, and Albores A. (2002). Effect of Pyrene on Hepatic Cytochrome P450 1A (CYP1A) Expresión in Nile Tilapia (Oreochromis niloticus). Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 42: 477-485 6. Zapata-Pérez O, Sima-Alvarez R. Noreña-Barroso E, Güemez J, Gold- 119 Bouchot G, Ortega A and Albores-Medina A (2000). Toxicity of the Sediment from Bahía de Chetumal as assesed by Histophatology and EROD Induction in Tilapia Oreochromis niloticus. Marine Enviromental Research. 50: 385 - 391. CAPACIDAD ANALÍTICA Matrices ambientales que analiza: Agua dulce Agua Marina Sedimentos Suelos Otros Tipos de contaminantes que analiza: Metales: Plaguicidas: Compuestos orgánicos: Otros: Pruebas biológicas que realiza: Bioensayos con: PECES (PLAGUICIDAS E HIDROCARBUROS AROMÁTICOS POLICÍCLICOS (PAHS) Biomarcadores en: PECES CAMNARONES RATAS Y POSIBLEMENTE EN DELFINES Pruebas certificadas (Mencionar que tipo de certificación y su vigencia): Infraestructura con la que cuenta: Equipo de laboratorio TERMOCICLADOR CAMARAS DE ELECTROFORESIS LAMPARA DE UV MINICENTRÍFUGAS 120 Cultivo y mantenimiento de organismos y cepas (certificadas o no) Compuestos de referencia certificados Personal disponible 1 AUXILAIR DE INVESTIGACIÓN Disposición para dar capacitación a otros usuarios en las pruebas que realiza COMPLETAMENTE 121 ANEX0 3. CRITERIOS PARA LA SELECCIÓN DE PRUEBAS BIOLÓGICAS EN LABORATORIO PARA LA EVALUACIÓN ECOTOXICOLÓGICA DE SUSTANCIAS QUÍMICAS 122 CRITERIOS PARA LA SELECCIÓN DE PRUEBAS BIOLÓGICAS EN LABORATORIO PARA LA EVALUACIÓN ECOTOXICOLÓGICA DE SUSTANCIAS QUÍMICAS 1. Objetivos a alcanzar (¿para que queremos la batería de bioensayos? ¿Qué necesidades queremos que cubra). Los proyectos de la SEMARNAT pueden ser una base para iniciar la discusión. 2. Factibilidad y Bajo costo y Materiales y reactivos disponibles en la localidad y Tiempo máximo de desarrollo, 5 días (¿efectos a corto o largo plazo?) y Procedimiento de prueba simples y Fácil lectura de resultados 3. De los organismos y Fácil obtención (Cepario) y Fácil mantenimiento y Representatividad ecológica o De un grupo funcional (productores primarios, descomponedores, herbívoros, carnívoros, etc.) o De un grupo taxonómico (bacterias, plancton, bentos, peces, insectos, etc.) o De una ruta de exposición (dérmica, ingestión, branquial, combinadas, etc.) o De un tipo de respuesta (alteración en metabolismo, crecimiento, reproducción, mortalidad, daño genético, etc.) y Estadio más sensible y Respuesta relevante al tóxico(s) y Sensibilidad a bajas concentraciones y Sensibilidad a un amplio espectro de tóxicos y Sensibilidad no redundante con otras especies y Con información sobre su biología y Con información sobre su sensibilidad a tóxicos (Base de datos) y Distribución geográfica amplia y Especies nativas de México 4. De la prueba y Condiciones presentes en los ecosistemas mexicanos (temperatura, salinidad, dureza, etc.) y Concentraciones químicas reales (que se presenten en el medio) y Técnicamente seguros y no contaminantes y Posibilidad de ser estandarizada. y Buena exactitud y precisión analíticas y Aplicación universal (usos, ventajas y limitaciones) y Significado ecológico de los resultados 123 y Buenas practicas de laboratorio a. Validación de la salud de los organismos de prueba b. Requerimientos mínimos de sobreviviencia /reproducción en pruebas y testigos c. Edades o estadios de vida al inicio de la prueba d. Comprobación de concentraciones nominales. 124 ANEXO 4. FORMATO PARA LA BASE DE DATOS TOXICOLOGICOS DE MÉXICO (en revisión) 125 FORMATO PARA PRUEBAS DE LABORATORIO Tipo de prueba: ) Estática ( ) Flujo continuo ( ) In situ ( Estática con recambios ( ) cada _______ hrs. Organismo utilizado: Nombre común _____________________ _________________ Nombre Estadio (edad): ________________ ___________________________ científico Procedencia: Otra(s) ________________________________________________ característica(s) Período de Mantenimiento: _________________ De la prueba: Duración de la prueba: ____________ _____________ Régimen de alimentación ___________________ de los Período de aclimatación: organismos durante la prueba: _______________________________________________________________ _______ Tóxico(s) ___________________________________________________ Origen de la ____________________________________________________ Concentraciones o diluciones ________________________________________ Fase de la matriz utilizada: integra ( ) agua intersticial( ) utilizado(s): muestra: usadas: extracto ( ) Tipo de extracto: acuoso ( ) orgánico ( ) Disolvente ___________________________________________________ utilizado: 126 Vehículo de _______________________________________________ Matriz para preparar ________________________________________ Número de replicas: ________ __________ Número resuspensión: las de diluciones: organismos por réplica: Volumen de la cámara de prueba: _________ Volumen o peso de la matriz contaminada: ________ Relación sedimento : agua _____________ Efecto(s) medido(s)/Método ______________________________________ Criterio de aceptabilidad _______________________________________ utililizado: de la Control ________________________________________________________ Tóxico de _____________________________________________________ Limpieza de cámaras durante el experimento: si ( ) Aereación: si ( ) prueba: positivo: referencia: no( ) no( ) Se comprobaron las concentraciones nominales: si ( ) no ( ) Factores ambientales controlados o determinados: Temperatura: ___________ __________ Fotoperíodo __________ Calidad de la luz: _________ Humedad ________ _______ Salinidad: _________ Dureza:________ __________ Textura: ________ _____________ Intensidad luminosa: O. D. ____________ Amonio: _________ Potencial Redox: _________ pH Mat.Org: - Cap. Inter. Catiónico: 127 Otro(s):____________________________________________________________ ____ Análisis de las Muestras o Tóxico(s) utilizado(s): ( Matriz en la que se encontraba el tóxico: agua ( ) ) aire ( ) sedimento ( alimento ( ) suelo ) organismos ( ) Método de Extracción: ___________________________ Método analítico: _______________________________ Resultado(s) de la ____________________________________________________ prueba: __________________________________________________________________ _______ __________________________________________________________________ _______ __________________________________________________________________ _______ Comentarios: ______________________________________________________________ __________________________________________________________________ _______ __________________________________________________________________ _______ Publicado o reportado ____________________________________________________ en: __________________________________________________________________ _______ 128 BASE DE DATOS ECOTOXICOLOGICOS DE MÉXICO FORMATO PARA PRUEBAS DE CAMPO Organismo utilizado: Nombre común _____________________ Estadio (edad): __________________ _________________ Nombre ________________ Otra(s) característica(s) Tóxico(s) ___________________________________________________ Se midió la(s) concentración(es) del tóxico: si ( ) Matriz en la que se encontraba el tóxico: ( ) Vía de incorporación al organismo: cutánea ( ) Gastrointestinal ( ) varias ( presente(s): no ( ) agua ( ) aire ( ) científico sedimento ( alimento ( ) suelo ) respiratoria o branquial ( ) ) cuales? ________________ Número de replicas: __________ Factores ambientales medidos: Temperatura: __________ ___________ Fotoperíodo Intensidad luminosa: __________ Calidad de la luz: ______________ Humedad ________ Salinidad: _________ _____________ pH _______ Dureza:__________ Amonio: Otro(s): __________________________________________________________________ Efecto(s) medido(s): ________________________________________________________ __________________________________________________________________ _______ 129 Criterio de aceptabilidad de __________________________________________. la prueba: Control positivo: ___________________________________________________________ Resultado(s) de la ____________________________________________________ prueba: __________________________________________________________________ _______ __________________________________________________________________ _______ __________________________________________________________________ _______ Comentarios: ______________________________________________________________ __________________________________________________________________ _______ __________________________________________________________________ _______ Publicado o reportado ____________________________________________________ en: __________________________________________________________________ _______ 130 ANEXO 5. LISTADOS DE ESPECIES CANDIDATAS DE AMBIENTES DULCEACUICOLAS 131 FITOPLANCTON Selenastrum capricornutum Scenedesmus quadricauda Scenedesmus incrassatulus Scenedesmus acutus Chlorella vulgaris Ankistrodesmus falcatus ZOOPLANCTON Daphnia exilis Daphnia similis Daphnia magna Daphnia laevis Daphnia pulex Ceriodaphnia dubia Moina macrocopa Diaphanosoma birgei Simocephalus vetulus Brachionus angularis Brachionus patulus Brachionus calyciflorus Brachionus havanaensis Brachionus rubens Asplanchna brightwelli Asplanchna girodi Asplanchna sieboldi Eucyclops serrulatus NECTON Onchorhynchus mykiss Poecilia reticulata Poeciliopsis gracilis Bufo occidentalis (larvas) Xiphophorus sp. Petenia splendida Oreochromis sp. Cyprinus carpio (juveniles) Chirostoma sp. Cichalosoma urophtalmus BENTOS Hyalella azteca Chironomus tetans Cypridopsis vidua Machrobrachium rosenbergii Ambystoma mexicanum/proteg. Macrothrix triserialis 132 Simocephalus vetulus Hydra attenuata Cambarelus moctezumae Pomacea flagellata Limnodrillus hofmeisteri Heterocypris incongruens Cypris sp. Panagrellus redivivus (especifico) Caenorhabditis elegans PLANTAS SUPERIORES (Monocotiledoneas y Dicotiledoneas) Lemna minor Lactuca sativa Allium cepa Glicine sp. Hordeum sp. Avena sativa Lepidium sativum Amaranthus hypochondriacus Carthamus tinctorius BACTERIAS Vibrio fischeri Spirillum volutans 133 ANEXO 6. LISTADOS DE ESPECIES CANDIDATAS DE AMBIENTES SALOBRES Y MARINOS 134 FITOPLANCTON Tetraselmis suecica Isochrisis galbana Dunaliella tertiolecta Chaetoceros mulleri Spirulina platensis ZOOPLANCTON Brachionus plicatilis Artemia franciscana Calanus sp. Litopenaeus setiferus (larvas) Litopenaeus vannamei (larvas) Larvas de erizo Brachionus rotundiformis Acartia tonsa NECTON Mugil sp. Lutjanus gutatus Sphoeroides annulatus Paralabrax sp. BENTOS Mysidopsis bahia Neanthes arenaceodentata Tisbe sp. Gamarus sp. Litopenaeus setiferus Litopenaeus vannamei Uca sp. Mytella sp. Capitella sp. Nereis sp. Nephtys sp. Farfantepenaeus duorarum Crassostrea virginica Argopecten ventricosus Callinectes sp. Leptocheirus plumulosus Erizos Haliotis sp. Nemátodos Crassostrea gigas (larvas) BACTERIAS Vibrio fischeri 135 ANEXO 7. LISTADOS DE ESPECIES CANDIDATAS DE AMBIENTES TERRESTRES 136 METABOLISMO MICROBIANO Tasa Respiratoria Lipasas Deshidrogenasas Tasa de mineralización de nitrógeno Trifosfato de adenisina (ATP) MESOFAUNA Panagrellus redivivus Caenorhabditis elegans Eisenia andrei/foetida Colembolos Enchitreidos Isopodos PLANTAS SUPERIORES (Monocotiledoneas y Dicotiledonias) Lactuca sativa Allium cepa Glycine soja Hordeum vulgare Avena sativa Lepidium sativum Amarantus hipochondriatus Phaseolus sp. Zea mays Triticum aestivum Carthamus tinctorius BACTERIAS Pseudomonas putida Pseudomonas fluorescens Vibrio fischeri Bacillus cereus Salmonella typhimurium (Microfluctuación) Escherichia coli 137 ANEXO 8. PROTOCOLOS DE PRUEBA PARA AMBIENTES DULCEACUICOLAS, SALOBRES, MARINOS Y TERRESTRES 138 LISTADO DE PRUEBAS 1. Bioensayo con Cladoceros. Martínez Jerónimo F. 2. Bioensayo de toxicidad aguda con Daphnia magna. Díaz Báez, M.C., Pica Granados, Y., y A. Ronco. 3. Bioensayo de toxicidad crónica con Microalgas Clorofíceas. Martínez Jerónimo F. 4. Ensayo de toxicidad cronica con Selenastrum capricornutum (Pseudokirchneriella subcapitata) método de enumeración celular basado en el uso de hemocitómetro neubauer. Pica Granados, Y. Ronco, A y M.C. Díaz Báez. 5. Prueba de toxicidad aguda con lombriz (Eisenia) para suelos contaminados. Cuevas Díaz, M. C, Ferrera Cerrato, R., Roldán Martín A., y R. Rodríguez Vázquez. 6. Prueba de toxicidad aguda con lombriz de tierra (Eisenia foetida). Uribe Hernández, R. 7. Ensayo de toxicidad aguda con Allium cepa L., mediante la evaluación de la inhibición del crecimiento promedio de raíces de cebolla. Díaz Báez, M. C., Ronco, A., y Y. Pica Granados. 8. Ensayo de toxicidad aguda (efectos letales y subletales) con Hydra attenuata. Pica Granados, Y., Ronco, A., y M. C. Díaz Báez. 9. Ensayo de toxicidad aguda con semillas de lechuga (Lactuca sativa L.) Sobrero, M. C., y A. Ronco. 10. Prueba de toxicidad aguda con Vibrio fischeri (Photobacterium phosphoreum). Pica Granados, Y., y G. Trujillo Domínguez. 11. Ensayo de toxicidad con el nematodo Panagrellus redivivus. Pica Granados, Y. 12. Prueba de citotoxicidad aguda con celomocitos de lombriz de tierra (Eisenia foetida). Uribe Hernández, R. 13. Prueba de Germinación de semillas. Uribe Hernández, R. 14. Prueba de Ames por el método microfluctuación modificado para determinar genotoxicidad en compuestos químicos puros y muestras ambientales. Sandoval Villasana, A. M. 15. Bioensayo de la Actividad Deshidrogenasa. Barajas Aceves, M. 16. Bioensayo de Trifosfato de Adenosina (ATP). Barajas Aceves, M. 17. Bioensayo de la Tasa de Mineralización del Nitrógeno. Barajas Aceves, M. 18. Prueba para evaluar los efectos de contaminantes en almeja Catarina (Argopecten ventricosus). Sobrino Figueroa, A. S. 19. Bioensayos de toxicidad en camarones Peneidos. Vanegas C., Zúñiga S., Gaxiola G., Robles C. y Betancourt M. 139 BIOENSAYO CON CLADOCEROS Autor: Fernando Martínez Jerónimo Principio de la prueba La prueba se basa en la determinación de efectos letales agudos (inmovilización o mortalidad), observados en un tiempo de exposición de 48 horas, en especies dulceacuícolas de cladóceros planctónicos Este es un bioensayo que se puede aplicar con los cladóceros Daphnia exilis, D. pulex, Ceriodaphnia dubia o Moina macrocopa, aunque es necesario que la identidad específica sea determinada por un especialista, debiéndose proporcionar el origen de la cepa utilizada, y cuando sea procedente, el número de catálogo. Estas especies, conocidas genéricamente como “pulgas de agua”, son componentes habituales del zooplancton, distribuyéndose de manera natural en cuerpos de agua naturales, presas, bordos, charcas temporales y estanques con fertilización orgánica, en diferentes partes del territorio nacional. Son especies que se reproducen sexual y asexualmente, siendo esta última modalidad reproductiva una característica importante en la implementación de cultivos controlados de laboratorio. Se tiene bien documentado que la reproducción asexual, que se denomina partenogénesis, se presenta principalmente cuando las condiciones de desarrollo son las adecuadas, produciéndose entonces camadas exclusivamente de hembras, que pueden a su vez alcanzar la fase reproductiva y continuar reproduciéndose de manera asexual mientras persistan condiciones adecuadas de alimentación, densidad poblacional, principales factores ambientales y de calidad química del agua. Cuando alguno o algunos de estos factores se torna adverso, entonces parte de la progenie está constituida por machos que al crecer pueden propicia la reproducción sexual al fecundar a s hembras, dando lugar a la formación de una estructura de resistencia conocida como efipio, que contiene uno o dos embriones (dependiendo de la especie) en estado latente, y que mantienen la diapausa hasta que se propician condiciones ambientales adecuadas para que se reinicie el desarrollo embrionario y emerjan juveniles que pueden dar inicio a un nuevo ciclo de reproducción asexual. En la modalidad reproductiva partenogenética, el desarrollo embrionario es directo y se lleva a efecto en la cámara incubatriz de la hembra, de la que emergen juveniles que son liberados al medio. La fase de los juveniles es semejante a la del adulto, aunque obviamente son de menor talla. Todas estas especies son filtradoras, consumiendo una diversidad de partículas que incluyen diferentes especies de microalgas así como materia orgánica en suspensión, por lo que se les considera componentes importantes en los ecosistemas acuáticos al permitir el flujo energético entre los productores primarios y ordenes superiores de consumidores en las tramas tróficas de los sitios donde se distribuyen. La prueba se realiza con los neonatos de estas especies, que son los juveniles con edad menor a 24 horas contada a partir de su expulsión de la cámara incubatriz. La respuesta que se evalúa es la inmovilización o la mortalidad de los organismos de prueba, a 24 y 48 horas de exposición a las soluciones tóxicas ensayadas. 140 El bioensayo consiste en exponer a los neonatos a diferentes concentraciones de los materiales tóxicos, o diluciones porcentuales de efluentes y muestras de agua. Se requiere la preparación de al menos cinco concentraciones o diluciones, mas una serie control. Estas soluciones se preparan después de un ensayo preliminar para la definición del intervalo, siguiéndose una serie geométrica base 2. Para cada solución se debe contar con al menos tres réplicas, cada una de las cuales constará de al menos 10 neonatos. Esta es una prueba relativamente rápida, que en un lapso de 48 h proporciona información a partir de la cual es posible determinar la Concentración Letal Media (CL50). La talla de los neonatos es adecuada para preparar el bioensayo y hacer las evaluaciones de inmovilidad o mortalidad sin necesidad de emplear ningún equipo óptico. La prueba es adecuada para la evaluación de los efectos tóxicos agudos (letales) de efluentes con o sin tratamiento, muestras de agua de cuerpos de agua receptores de descargas, sustancias químicas puras y en mezclas de composición conocida o desconocida, principios activos y productos formulados comerciales. Es útil para la clasificación de la toxicidad de compuestos químicos, en el monitoreo de ecosistemas acuáticos y en la evaluación de la eficiencia de los sistemas de tratamiento de las aguas residuales. Material biológico Los organismos que se utilicen para llevar a cabo esta evaluación deben ser obtenidos de laboratorios que cuenten con cepas controladas. Se pueden obtener mediante compra en distribuidores científicos que garanticen la identidad específica y calidad del material biológico. Es posible obtenerlos mediante colecta, aunque en este caso se deberá desarrollar el cultivo hasta una F2, además de conseguir un certificado de identidad expedido por alguna institución acreditada, en la que se deberá depositar una muestra fijada o viva para que le sea asignada una clave de catalogo o colección. No es permitida la utilización de organismos comprados como alimento en tiendas de mascotas, pues no se conoce la procedencia ni historia química. Los laboratorios que realicen este tipo de bioensayos deberán contar con la cepa adecuada, como ya se mencionó anteriormente, y lograr su estabilización siguiendo las instrucciones específicas de mantenimiento que se detallan como parte de este protocolo. Los lotes de reproductores deberán ser monitoreados continuamente, poniendo especial énfasis en cualquier indicio que denote la reproducción sexual (detección de machos y/o efipios o hembras efipiadas), pues esto es síntoma de un cultivo inadecuado en el que hay factores que pueden afectar la calidad de respuesta de los organismos de prueba. Todos los cultivos de reproductores deben ser iniciados con hembras partenogenéticas de edad conocida, con alimentación controlada. Los neonatos para los bioensayos deberán proceder de lotes estabilizados y controlados, para los cuales se establecerá una duración máxima (dependiendo de la especie). Infraestructura en el laboratorio. Los laboratorios que se dediquen a este tipo de evaluaciones toxicológicas deberán contar con cámaras bioclimáticas o cuartos con fotoperíodo y temperatura controlados. 141 Adicionalmente tendrán que disponer de la infraestructura mínima indispensable para realizar el cultivo controlado de microalgas y el mantenimiento de la cepa de cladócero que emplearán para las evaluaciones de toxicidad aguda, la cual se detalla en el protocolo correspondiente. Material de laboratorio Los recipientes de cultivo para los reproductores deberán ser de vidrio borosilicatado, del volumen adecuado, dependiendo del protocolo de producción que se implemente. Para las pruebas de toxicidad aguda se emplearán preferentemente recipientes de vidrio borosilicatado, los cuales deberán ser sometidos a la rutina de limpieza adecuada para garantizar su uso libre de factores que pudieran modificar la toxicidad de las muestras analizadas. Para la realización de las evaluaciones se empleará la cristalería y equipos menores adecuados y suficientes para garantizar procedimientos seguros y repetibles, tales como pipetas automáticas calibradas, matraces aforados de la capacidad necesaria, pesamuestras, espátulas de acero inoxidable, etc. Reactivos Se deberá contar con los reactivos necesarios para la preparación del agua de dilución y de los medios de cultivo, tanto para los cladóceros como las microalgas. Los reactivos deberán ser grado analítico y libres de impurezas, tales como metales pesados. Se sugieren las marcas J. T. Baker, Aldrich y Sigma Chemical. En todos los casos se sugiere la preparación de soluciones concentradas (stock o madre) a partir de las cuales se puedan preparar los medios de cultivo y el agua de dilución. Se deberá tener un control sobre los procedimientos para la preparación de soluciones patrón y medios de cultivo y poner especial atención sobre la conservación de sustancias que pudieran degradarse o contaminarse (como las soluciones de vitaminas); en todos los casos se deberán aplicar las condiciones de mantenimiento que eviten la modificación de la concentración o alteración química de las soluciones. Equipos Los equipos requeridos son los básicos de cualquier laboratorio de análisis biológicos, los cuales incluyen balanza analítica, microscopio óptico, estereomicroscopio, autoclave, campana de flujo laminar o área esterilizada para trabajo microbiológico, potenciómetro, oxímetro, salinómetro/conductivímetro, autoclave, etc. Cultivo y mantenimiento de los organismos de prueba 142 El cultivo se divide en dos fases: el mantenimiento de la cepa y el lote de reproductores para la obtención de organismos de prueba. En el primer caso se emplearán los recipientes que resulten adecuados para la conservación de la cepa, pudiendo ser acuarios de volumen pequeño (menor a 5 litros) o vasos de precipitados de 1, 2 ó 3 litros, preferentemente de vidrio borosilicato o Nalgene®. En todos los caso, como medio de cultivo se deberá utilizar agua reconstituida de la dureza adecuada (dependiendo de la especie), preparada según se detalla en el protocolo correspondiente. La temperatura para ambos tipos de cultivo deberá ser de 20±2°C, y el fotoperiodo de 16:8 (luz: obscuridad); la iluminación será la ambiental de laboratorio (ca. 1,000 luxes). Como alimento se emplearán microalgas clorofíceas, preferentemente las especies Ankistrodesmus falcatus, Raphidocelis subcapitata (antes Selenastrum capricornutum) o Scenedesmus ssp. En cualquier caso, se deberá detallar cuál fue la especie empleada. Para mayor detalle se deberá recurrir al protocolo correspondiente. Debido a la diferencia en dimensiones de las especies de microalgas susceptibles de ser empleadas como alimento, se sugiere suministrar como concentración alimentaría adecuada 12 mg/l en peso seco. Los detalles adicionales para el cultivo del alimento, así como su separación (“cosecha”), conservación, viabilidad, etc., se detallan en el anexo correspondiente. La calidad de respuesta de los neonatos se deberá evaluar periódicamente mediante bioensayos con tóxicos de referencia (controles positivos), preferentemente con cromo hexavalente. Invariablemente se deberá contar con cartas de control que permitan realizar el seguimiento del lote de reproductores, así como de del cultivo “stock”. Los valores de control serán los establecidos en la las publicaciones científicas existentes Preparación del material antes de la prueba Se deberán seguir los lineamientos mínimos básicos para garantizar la calidad de la respuesta de los organismos de prueba, evitando cualquier posible interacción o alteración con probables residuos de materiales tóxicos remantes o persistentes en el material (cristalería) empleada para la realización de los bioensayos. Procedimiento de prueba Este bioensayo es de tipo estático, sin renovación de la solución de prueba, con una duración total de 48 horas, aunque es recomendable realizar observaciones preliminares a las 3, 6 y 24 horas de inicio de la prueba. Se deberán evaluar la concentración de oxígeno disuelto, el pH, la conductividad y salinidad, así como la dureza, al inicio y al término de la prueba definitiva. Como agua de dilución se empleará agua reconstituida de tipo semidura (80 a 100 mg/l como CaCO3, USEPA, 2002), ya que las tres especies recomendadas se desarrollan satisfactoriamente en este tipo de agua. La forma de preparar esta agua de dilución se muestra en la Tabla 1. En el caso de sustancias de baja hidrosolubilidad, se podrán dispersar en el agua de dilución mediante sonicación, o bien se utilizarán solventes de baja toxicidad como la acetona, etanol, metanol o dimetil sulfóxido. Como ya fue mencionado, la evaluación toxicológica se realizará con los neonatos de la especie seleccionada, los cuales serán obtenidos siguiendo el protocolo correspondiente. En ningún caso se deberá suministrar alimento a los organismos de prueba El resumen de las condiciones de prueba se muestra en la tabla 2. 143 Tabla 1. Composición del agua semidura reconstituida utilizada como medio de cultivo y para la obtención de neonatos de cladóceros, así como agua de dilución para bioensayos de toxicidad aguda. Tipo de agua Semidura a b Reactivos grado analítico (mg l-1), en agua destilada o desionizada NaHCO3 CaSO4.2H2O MgSO4 KCl 96 60 60 4 Características finales pHa Durezab 7.4-7.8 80-100 Alcalinidad 60-70 Valor de equilibrio después de 24 horas de aireación. expresado como mg l-1 de CaCO3. Tabla 2. Resumen de las condiciones y requerimientos para la determinación de la toxicidad aguda con cladóceros. Tipo de prueba Duración Estática, sin renovación de la solución de prueba 48 horas (Prueba definitiva) Intensidad luminosa 600-1,000 Luxes (ambiental de laboratorio) Fotoperiodo 16:8 (luz:obscuridad) Temperatura 20 ± 1 ºC Aireación No Suministro de alimento No Volumen de los recipientes de prueba Volumen de prueba 100 ml 80 ml Edad de los organismos Neonatos (Edad < 24 horas) Concentraciones o diluciones ensayadas Replicas por concentración Organismos por réplica Mínimo 5, más testigo Mínimo 3 10 Agua de dilución Reconstituída semidura (80-100 mg l-1 como CaCO3) Mortalidad o inmovilidad a 48 h, con Respuesta evaluada observaciones a 24 h. Criterio de aceptación de la prueba Inmovilidad o mortalidad en los testigos menor o máximo de 10 % Expresión de resultados Con los valores de inmovilidad o mortalidad a 48 horas de deberá construir la tabla resumen a partir de la cual se hará la estimación de la Concentración Letal Media (CL50). 144 Existen diversos programas de cómputo que permiten hacer este cálculo de manera sencilla, incluyendo la determinación del intervalo de confianza. Los métodos para hacer esta determinación puede ser cualquiera de los siguientes: Probit, Logit, Semilog y Ángulos móviles promedio. En cualquier caso se requiere proporcionar la referencia del método y del software empleado. Tratándose de sustancias puras o en mezclas, principios activos y productos formulados, se deberá clasificar el grado de toxicidad que se produce, de acuerdo a las tablas disponibles para este propósito. Referencias (Métodos estandarizados: EPA, Environment Canada, OECD, ISO, ASTM, etc.) Este método de prueba es semejante a los protocolos de la Agencia para la Protección Ambiental de los Estados Unidos de Norteamérica (USEPA, 2002; USEPA OPPTS 850.1010), y la Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económico (Método 202) Bibliografía. U.S. Environmental Protection Agency, 2002 Methods for measuring the acute toxicity of effluents and receiving waters to freshwater and marine organisms. 5th Edition. U.S. EPA Office of Water, Washington, DC. EPA-821-R-02-012, viii+266 pp. Anexo 1. Descripción de las condiciones de mantenimiento de la cepa y condiciones de cultivo de los reproductores para la producción de organismos de prueba (neonatos) de las especies de cladóceros propuestas como para la evaluación de la toxicidad aguda en ambientes dulceacuícolas. En todos los casos se aplicarán las siguientes condiciones: 1) Alimentos suministrados: Microalgas clorofíceas de las especies Ankistrodesmus falcatus, Raphidocelis subcapitata o Scenedesmus acutus. 2) Procedimientos para la preparación/obtención del alimento: Estas microalgas se obtendrán mediante cultivo en condiciones controladas de laboratorio. Se deberá mencionar la cepa utilizada (número de catálogo y origen) y detallar cualquier modificación en el proceso de cultivo a) Medio de cultivo. Se sugiere el Basal de Bold (Tabla 3), aunque es posible utilizar otros; si este último fuera el caso, se deberá incluir la formulación empleada y explicar las razones para utilizarlo. Invariablemente el medio de cultivo deberá ser 145 esterilizado por autoclave y todo el procedimiento del cultivo de microalgas se hará en condiciones asépticas. b) Recipientes de cultivo. Se sugiere que los cultivos se realicen en matraces de 2,000 ml, aunque esto dependerá de los requerimientos de cada laboratorio. c) Condiciones de iluminación. Los cultivos de microalgas deberán ser incubados con iluminación artificial continua y controlada de 4,500 luxes, proporcionada con lámparas fluorescentes “luz de día”. d) Temperatura. Deberá ubicarse en el intervalo de 25 a 28°C. e) Aireación. Se deberá suministrar aire comprimido como fuente de carbono y para evitar la sedimentación. El medio de cultivo sugerido carece de bicarbonato de sodio, que funcionaría como el aporte de carbono para la fotosíntesis, por lo que es absolutamente indispensable la aireación. En este caso se deberá tener cuidado en que el aire se encuentre filtrado para evitar introducir al medio de cultivo polvo o contaminantes biológicos, siendo preferentemente el empleo de compresoras libres de aceite. f) Inóculos. Los inóculos deberán ser renovados periódicamente y deberán partir de muestras mantenidas en medio de cultivo solidificado. Su manejo, al igual que en la fase de producción, se realizará en condiciones asépticas. No se requiere de cepas axénicas, aunque si es necesario evitar una carga bacteriana excesiva que pudiera influir sobre la calidad del alimento para los cladóceros. Para la fase de producción de las microalgas, se utilizarán inóculos líquidos en proporción porcentual del 10 al 20 % del volumen de medio de cultivo fresco. g) Tiempos de cosecha. Los cultivos serán “cosechados” en la fase de crecimiento exponencial, a cual se presenta en un lapso de 7 a 10 días cuando se parte de un inóculo del 10 %. h) Forma de cosecha. La biomasa será separada por centrifugación ó filtración. También se puede lograr una separación adecuada por sedimentación, preferentemente en condiciones de oscuridad y a baja temperatura. i) 3) Forma y tiempo de conservación. La biomasa “cosechada” se debe conservar en refrigeración y utilizarse por un periodo no mayor a dos semanas después de haber sido separada. Mantenimiento de cultivos “stock” o de reserva de cladóceros. Estos cultivos tienen como propósito la conservación de la cepa y funcionan como reservorio para la separación de juveniles o adultos a partir de los cuales se pueden implementar los cultivos para la obtención de organismos de prueba. a) Medio de cultivo. Se empleará agua semidura reconstituida (ver Tabla 1) b) Recipientes de cultivo (tipo, volumen). Se utilizarán preferentemente cristalizadores, vasos de precipitados o acuarios de entre uno y 5 litros, según las necesidades y de acuerdo a la infraestructura disponible. c) Alimento y cantidad: Como son cultivos de reserva, se alimentan al menos una vez por semana (preferentemente dos veces), con la suficiente cantidad de alimento d) Condiciones generales de mantenimiento. Se recambiará aproximadamente el 50 % del medio de cultivo cada 10 días. Se deberá vigilar que la densidad poblacional no se incremente excesivamente, pues esto propiciaría la aparición 146 de machos y la reproducción sexual; para evitar esta situación, periódicamente se realizará una “cosecha” de cladóceros. Tampoco es deseable la acumulación de metabolitos ni la proliferación de organismos saprobios en estos cultivos. 4) Producción de neonatos. Este sistema de cultivo es el que permite la producción controlada de los neonatos que se emplearán para las pruebas de toxicidad, por lo que es importante que se implemente una rutina detallada que garantice la cantidad adecuada para satisfacer los requerimientos en los tiempos programados, así como la calidad de la respuesta de estos organismos de prueba. a) Medio de cultivo. Se empleará también agua semidura reconstituida. b) Recipientes de cultivo (tipo, volumen). Preferentemente vasos de precipitados de vidrio, de 150 ml de volumen total. c) Volumen de cultivo. Se recomienda de 80 a100 ml como volumen de cultivo. d) Alimento y densidad. Preferentemente se empleará Ankistrodesmus falcatus en concentración de 400,000 células/ ml. Si se utilizan otras especies de las aquí sugeridas, la concentración de alimento será la equivalente a 8-10 mg/l en peso seco. e) Densidad de reproductores. En los recipientes de cultivo sugeridos se dispondrán individualmente a los organismos con que se iniciarán estos sistemas de producción de neonatos. f) Periodicidad de recambio de alimento y medio de cultivo. El medio de cultivo y el alimento deberán ser restituidos completamente tres veces por semana, en días alternos. g) Temperatura. Deberá mantenerse controlada en un valor de 20-22°C. h) Intensidad luminosa y fotoperiodo. La iluminación deberá ser la ambiental de laboratorio, proporcionada por lámparas fluorescentes “luz de día”. Si se prefiere alimentación natural, ésta nunca deberá ser directa sobre los cultivos. El fotoperiodo será de 16:8 (luz: oscuridad). i) Duración (vigencia) de los lotes de reproductores. Estos lotes se iniciarán a partir de neonatos obtenidos de reproductores previamente separados de los lotes de mantenimiento. A partir de su implementación, la duración máxima en condiciones producción efectiva de neonatos será de 35 días para Daphnia pulex y para D. pulex. En el caso de Ceriodaphnia dubia la duración será de 25 días y para Moina macrocopa de 20 días. Después de tales plazos de vigencia, el lote deberá ser desechado. Es necesario que se establezca un programa desfasado de inicio y finalización de los lotes a fin de que en todo momento se pueda contar con organismos de prueba de las características deseables j) Frecuencia y forma de separación (manejo) de la progenie. La progenie deberá ser separada todos los días en el periodo hábil (lunes a viernes). Esto evita efectos de sobrepoblación en los recipientes de producción y permite que se puedan iniciar pruebas toxicológicas todos los días en ese periodo hábil. Con las condiciones antes descritas, es posible garantizar la calidad del material biológico y reducir significativamente la variabilidad en los resultados. De cualquier forma, con una periodicidad no menor a 3 meses, se realizarán ensayos con el tóxico de referencia cromo hexavalente (a partir de dicromato de potasio). 147 Elaboró: Dr. Felipe Fernando Martínez-Jerónimo Lab. de Hidrobiología Experimental Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, I. P. N. 148 4.2. BIOENSAYO DE TOXICIDAD AGUDA CON DAPHNIA MAGNA MARIA CONSUELO DIAZ BAEZ Unidad Académica de Ingeniería Ambiental, Facultad de Ingeniería, Universidad Nacional de Colombia, Bogotá, Colombia YOLANDA PICA GRANADOS Instituto Mexicano de Tecnología del Agua, Cuernavaca, Morelos, México ALICIA RONCO Centro de Investigaciones sobre el Medio Ambiente, CIMA, Universidad Nacional de La Plata. Argentina 4.2.1. 4.2.2. 4.2.3. 4.2.4. 4.2.5. Principio Materiales, Reactivos y Equipos Cultivo y Mantenimiento de los Organismos de Prueba Procedimiento de la Prueba Expresión de los Resultados REFERENCIAS 4.2.1. Principio Dentro del grupo de cladóceros, las especies del género Daphnia son las más utilizadas como organismos de prueba o de referencia en pruebas de toxicidad. La amplia distribución geográfica, el importante papel que cumplen al interior de la comunidad zooplanctónica, la facilidad de cultivo en el laboratorio, la reproducción partenogenética (lo cual asegura una uniformidad de respuesta), y el corto ciclo de vida con la producción de un alto número de crías, han hecho de este grupo un ideal para la evaluación de toxicidad, a nivel universal. 149 El género Daphnia se ubica dentro del orden Cladócera de la clase Crustacea, y especies como Daphnia magna, Daphnia pulex, y Daphnia similis, son utilizadas extensivamente en pruebas de toxicidad, por lo cual existe una extensa información sobre las técnicas de cultivo, los requisitos de temperatura, luz y nutrientes, así como su respuesta a muchos tóxicos. Específicamente, los ensayos de toxicidad con Daphnia magna (Fig. 4.2.1), permiten determinar la letalidad potencial de sustancias químicas puras, aguas residuales domésticas e industriales, lixiviados, aguas superficiales o subterráneas, agua potable, y agua de poro de sedimentos, entre otros. Figura 4.2.1. Vista general de Daphnia magna En las pruebas de toxicidad con D. magna, neonatos menores de 24 h de edad son expuestos a la muestra o compuesto a probar, por un perÍodo de 48h, al término del cual se cuantifica el número de organismos muertos. Con estos resultados se establece la proporción o porcentaje de mortalidad producida. 4.2.2. Materiales, Reactivos y Equipos Material Biológico Las hembras partenogenéticas de D. magna pueden obtenerse directamente de compañías proveedoras de materiales biológicos, quienes certifican la especie. También pueden ser obtenidas de otras fuentes como laboratorios especializados donde se llevan a cabo pruebas de toxicidad con este cladócero o por medio de su recolección en campo; en estos casos la especie deberá ser taxonómicamente identificada. 150 Materiales de laboratorio Acuarios de 3 L de capacidad. Vaso de precipitado de 2000, 1000 y 600 mL. Pipetas volumétricas y graduadas de 1, 2, 5, 10 y 20 mL. Matraz aforado de 100 mL. Pipetas pasteur y bulbos de latex Pipetas volumétricas de 1, 2, 5 y 10 mL, peras para pipetas Pipetas automáticas de 250, 500 y 1000 μL; puntas para micropipetas. Recipientes plásticos de 30, 50mL, 100 mL Papel aluminio. Garrafón o bidón de 20 litros Manguera delgada para bombas de acuario. Matraz Kitasato de 2 litros. Platos para pesar reactivos. Espátulas Hielera y hielo o geles refrigerantes. Papel parafilm Tubos de ensayo Reactivos NaHCO3 MgSO4 KCl CaSO4.•2H2O Biotina Tiamina Vitamina B12 Na2SeO4 K2Cr2O7 Agua deionizada o destilada Equipos Microscopio Estereoscópico Balanza Analítica Plancha de Agitación con magneto. Bombas para acuario Controlador de temperatura ambiente (equipode aire acondicionado u otro). Refrigerador (4 ± 2 °C) Bomba de vacío 151 Mechero de Bunsen Autoclave o equivalente Medidor de oxígeno disuelto Potenciómetro Tituladores para dureza y alcalinidad. Termómetro. Sistema purificador de agua (deionizador, sistema Milli-Q) o una fuente de abastecimiento de agua destilada. Centrífuga 4.2.3. Cultivo y Mantenimiento de los Organismos de Prueba Los cultivos de D. magna pueden mantenerse en recipientes de 1, 2 ó 3 litros, o cualquier otro sistema que resulte funcional. Con el fin de mantener condiciones óptimas para el crecimiento de los individuos, se recomienda mantener una densidad poblacional de no mayor de 12 individuos /L Los organismos se mantienen en agua reconstituida con una dureza entre 160 y 180 mg CaCO3 /L. El agua se prepara en el laboratorio (APHA,1998), y puede suplementarse con una solución de vitaminas y selenio, cuando se detecten problemas en la reproducción, o se presente una alta mortalidad entre los 14 y 21 días por malformación de las antenas (Fig. 4.2.2). Ojo Corazón Antenas Ovario y Bolsa incubatriz Intestino Figura 4.2.2. Principales rasgos morfológicos de Daphnia magna 152 Los cultivos se mantienen a una temperatura de 21 ± 2ºC, un fotoperíodo aproximado de 16 h luz /8 h oscuridad y una intensidad lumínica de alrededor de 800 lux (ver condiciones en Tabla 4.2.1.). Agua dura reconstituida (APHA,1998): Para su preparación se recomienda colocar en un garrafón: 19L de agua deionizada o destilada, y adicionar 2.4 g de MgSO4, 3.84 g de NaHCO3 y 0.16 g de KCl. Agitar hasta disolver completamente las sales. Paralelamente, disolver 2.4 g de CaSO4 •2H2O en 1L de agua deionizada o destilada. Es necesario tener en cuenta que la disolución de esta sal puede requerir un período de tiempo prolongado. Terminada la solubilización de la sal, incorporar la solución de CaSO4•2H2O al garrafón, lo cual permitirá obtener 20L de agua dura reconstituida. Tabla 4.2.1. Resumen de las Condiciones Recomendadas para el Mantenimiento de Cultivos de Daphnia magna Temperatura Calidad de Luz Intensidad Luminosa Fotoperíodo Recipientes de Mantenimiento Alimentación Dosis de Alimento Suplemento Alimenticio Densidad Poblacional Limpieza Recolección de Neonatos 21 ± 2oC Fluorescente, blanco-frío ≤ 800 lux (luz blanca fría) en la superficie del liquido 16 horas luz - 8 oscuridad Los cultivos se mantienen en recipientes de 2L de vidrio transparentes, y deben permanecer tapados Cultivos puros de Selenastrum capricornutum u otras algas verdes unicelulares. La cantidad de alimento suministrada se calcula de la siguiente manera: V= A x B / C donde: V= volumen a ser adicionado A= número de organismos B= número de células por daphnia (1.5 x106 células por daphnia /día) C = densidad celular de la suspensión algal El alimento es suministrado diariamente. Los cultivos pueden suplementarse con las soluciones de vitaminas y selenito. No mayor de 12 individuos/L Diariamente se debe retirar las exubias (mudas) y los restos que se encuentren en el fondo de los recipientes. Cada viernes se cambia el agua de los acuarios que deben lavarse con una esponja o un paño de tela, enjuagar varias veces con agua des-ionizada. No se debe emplear jabón ni otros detergentes. Diariamente se retiran los neonatos con una pipeta Pasteur de plástico con una abertura lo suficientemente ancha para no ocasionar daños a los neonatos. 153 Suplementos (adicionar solo en caso de un crecimiento deficiente del cultivo): Cuando se determine la necesidad de suplementar el agua dura, debe prepararse por separado las soluciones de Biotina, Vitamina B12, Tiamina y Selenito de Sodio (Na2SeO4 ) (Elendt y Bias (1990)) de la siguiente forma: Solución de Biotina: Solución de Vitamina B12: Solución de Tiamina: Selenito de Sodio (Na2SeO4): 0.0075 g/L 0.010 g/L 0.075 g/L 0.010 g/L Las soluciones preparadas se deben mantener refrigeradas (4°C ± 2), y pueden almacenarse por un período de hasta seis meses. Para un volumen de 20 L de agua dura reconstituida, se adicionan los siguientes volúmenes de cada una de las soluciones: Tiamina (20 mL), Vitamina B12 (4 mL), Biotina (2 mL), y Selenito de Sodio (4 mL). Una vez terminada la preparación del agua reconstituida, se mide el pH, el cual deberá oscilar entre 7.6 y 8.0. Posteriormente, se airea el líquido de forma permanente hasta el momento de su uso (mínimo 24 h). El aire utilizado debe estar libre de grasas y aceites. Se recomienda que antes de utilizar el agua se determine: 1) la concentración de oxígeno (la cual debe estar por encima de 6 mg/L), y 2) y la dureza (que debe encontrarse dentro del intervalo preestablecido de 160180 mg CaCO3/L). En caso de que alguno de los parámetros de control se encuentre fuera de los intervalos mencionados, el agua deberá desecharse. Igualmente, con cada lote de agua dura preparada, antes de su utilización, ya sea como medio de cultivo y/o para la dilución de las muestras, se debe realizar un bioensayo que permita comprobar que no se presenta ningún efecto sobre la supervivencia de las daphnias. Para esta prueba, se colocan en tres recipientes un volumen de 30 mL de agua y 10 neonatos/recipiente. Al cabo de las 48 h la supervivencia deberá ser mayor del 90%, en caso contrario se debe descartar el agua reconstituida. Limpieza y mantenimiento Para el mantenimiento del cultivo se sugiere aplicar un ciclo de renovación definido a criterio del analista. El ciclo permite mantener un cultivo de organismos en etapas óptimas de reproducción. Algunos autores (CETESB/L5.018, 1991) recomiendan mantener lotes de individuos separados por edad, desde 0-1 semana hasta 4 ó 5 semanas de la siguiente forma: Madurez sexual Inicio de partos 154 0-24h 1 semana 2 semana 3 semana 4 semana 5 semana Neonatos con los que se reinicia un nuevo cultivo Hembras que se descartan Figura 4.2.3. Cultivo de organismos—ciclo de renovación Diariamente o cada tercer día dependiendo del desarrollo del cultivo, deben retirarse los neonatos, los cuales pueden ser destinados al desarrollo de pruebas o eliminados. Con igual periodicidad se deberá efectuar la limpieza y el suministro de alimento. Para la limpieza se emplea un sifón con el cual se remueve las exubias y los restos de alimento depositados en el fondo de los recipientes. Al finalizar, se recupera el volumen de agua en cada recipiente, adicionando y/o haciendo el recambio de 1/3 del volumen con agua reconstituida fresca. Una vez por semana (por ejemplo el viernes), después del retiro de los neonatos y antes del suministro de alimento, se transfieren las hembras adultas a recipientes limpios conteniendo partes iguales del agua antigua y agua de dilución fresca Se recomienda desechar los organismos mayores a 4 o 5 semanas, y reemplazarlos e iniciar un nuevo cultivo con los neonatos colectados ese día. Cuando se van a realizar pruebas, el día previo se extraen los neonatos presentes en el cultivo, para de esa forma garantizar que los neonatos encontrados al día siguiente tengan menos de 24 h de nacidos. Alimentación Para la alimentación de los cultivos, se puede emplear suspensiones de diferentes especies de algas (Selenastrum capricornutum, Ankistrodesmus falcatus, Chlorella sp. Scenedesmus sp., etc.). Para el cultivo de los dos primeros géneros, se recomienda utilizar medio AAP cuyos detalles de preparación se presenta en el protocolo de prueba para S. capricornutum (USEPA 1991); para las restantes especies se puede utilizar medio Bristol, cuya composición se detalla en la tabla 4.2.2 . La alimentación con cultivos de S. capricornutum se realiza cada tercer día, después de la limpieza. Para determinar la cantidad de alimento (cultivo algal) que 155 debe suministrarse a cada recipiente del cultivo, calcular el volumen siguiente manera: de la V = (AxB)/C donde V = volumen del concentrado algal, A= número de daphnias por acuario, B = dosis óptima recomendada (1.5 x 106 células por daphnia / día) C= concentración (Número de células/mL) de la suspensión de algas (para su determinación se utiliza una cámara de Neubauer cuyo manejo se presenta en el protocolo de prueba con Selenastrum capricornutum). 156 Tabla 4.2.2. Medio de Cultivo o Medio Bristol Solución de Macronutrientes: Compuesto Solución No. Solución Madre (g/L) 1 2 3 4 5 6 8 25 2.5 7.5 7.5 2.5 17.5 3.1 g/100Ml 5.0 g/100mL 0.498 g/100mL 0.1 mL/L 1.142 g/100mL NaNO3 CaCl2.H2O MgSO4 . 7H2 O K2HPO4 NaCl KH2PO4 KOH EDTA FeSO4.7H2O H2SO4 H3BO3 9 10 mL de la Solución Madre por L de solución 10 10 10 10 10 10 1 1 1 Solución de elementos traza: Compuesto 1 mL/L Solución Madre (g/100 mL) ZnSO4 .7H2 O MnCl2 . 4H2 O MoO3 CuSO4 .5H2O Co(NO3 )2 .6H2O 0.882 0.144 0.071 0.157 0.049 Control del Cultivo del Organismo de Prueba Para establecer si los individuos del cultivo tienen las condiciones fisiológicas óptimas para el desarrollo de pruebas de toxicidad, es necesario hacer un seguimiento de la sensibilidad del cultivo empleando tóxicos de referencia, así como evaluar alteraciones en el ciclo de vida. El control de estas características permitirá mantener el correcto desarrollo del cultivo. a. Prueba de sensibilidad Los cambios en el estado fisiológico del cultivo pueden ser detectados mediante la evaluación periódica de la respuesta de los individuos a un determinado tóxicos de referencia. Aunque existen varios tóxicos recomendados, uno de los más utilizados es el cromo (Cr IV) a partir de dicromato de potasio (K2Cr2O7). Para determinar si la sensibilidad del cultivo es adecuada es necesario, previo a iniciar 157 las pruebas rutinarias, evaluar la respuesta de los organismos ante la exposición al tóxico de referencia. La concentración en la cual se produce la muerte del 50% de la población de neonatos (Concentración Letal Media o CL50 ) deberá encontrase dentro del intervalo previamente establecido Para definir este intervalo es necesario realizar por lo menos 5 pruebas con el tóxico de referencia, con estos datos se inicia la construcción de la carta control que deberá completarse con la información generada en nuevas evaluaciones, las cuales se recomienda, se realicen de forma rutinaria una vez por mes, hasta alcanzar un número de veinte. Esta carta se debe mantener actualizada con los veinte datos más recientes (US EPA, 1991). A partir de estos resultados, se determina la CL50 promedio para la sustancia, así como la desviación estándar (σ) de la CL50. Los límites superior (Promedio + 2σ) e inferior ( Promedio - 2σ), corresponderán al intervalo de concentración en el cual varía la respuesta de los organismos al tóxico seleccionado (Figura 4.2.4.). Concentraci Límite Superior (Promedio + 2σ) CL50 Promedio (Σ (CL50 –1, CL50 –2, CL50 –3 ,CL50 –N) / N Intervalo de concentra Límite Inferior( Promedio Prueba Fig. 4.2.3. Modelo de construcción de la carta control para el tóxico de referencia Para estimaciones de punto como la CL50 con un nivel de probabilidad P0.05, se espera que solo 1 de 20 pruebas esté fuera de los límites del intervalo por azar. Si se produce más de un valor fuera de los límites de control, los resultados de las pruebas de toxicidad llevadas a cabo durante el mes que se produjo el valor fuera de los límites deberán considerarse provisionales y debe llevarse a cabo una cuidadosa revisión. Estos valores por fuera del control estarían indicando anomalías en la sensibilidad de los organismos de prueba. En caso que se presenten variaciones anómalas de la sensibilidad, se debe verificar las condiciones de cultivo y eliminar las posibles causas que están alterando la respuesta de los individuos. 158 b. Desarrollo óptimo del cultivo. En forma similar, se recomienda hacer regularmente un monitoreo del desarrollo del cultivo, el cual puede llevarse a cabo mediante el seguimiento del ciclo de vida de los individuos, estableciendo la edad de madurez sexual, la tasa reproductiva y la longevidad. Para el seguimiento del ciclo de vida, se coloca un número conocido de neonatos (5 a 10) del mismo parto, cada uno en un recipiente y se anota la fecha de inicio del proceso. Durante todo el período de monitoreo se deberá alimentar a los organismos y mantener los patrones de limpieza rutinarios recomendados anteriormente. Madurez sexual Durante la primera semana de seguimiento se harán observaciones del crecimiento y maduración de los neonatos así como de la formación de los huevos en su bolsa de incubación (Fig. 4.2.2.), este evento, así como el tiempo al cual se produce el primer parto debe registrarse a fin de definir la edad en que se alcanza la madurez sexual del cultivo De acuerdo a datos reportados en la literatura (Lewis & Maki, 1981; Goulden et al.,1982), los individuos de un cultivo sano alcanzan su madurez sexual entre los 8 y 12 días de edad En caso de que dicho período sea más prolongado o se observe mortalidad, es necesario revisar las condiciones del mantenimiento del cultivo o suplementar el agua reconstituida con vitaminas y selenio. Tasa reproductiva A partir del primer parto, se lleva a cabo un registro diario del número de crías que se producen, removiéndolas de los recipientes de monitoreo. El registro debe cubrir un tercio del ciclo de vida (21 días) o hasta cuando alguna de las hembras adultas muera (lo que suceda primero). Con los resultados obtenidos, se establece el número de crías promedio por hembra. Este valor puede oscilar entre 112 y 212 de acuerdo a algunos autores (Girling y Garforth, 1989; Klüttgen et al., 1994), Longevidad Para determinar la longevidad el seguimiento debe prolongarse hasta que queden con vida por lo menos el 20% del número inicial de organismos bajo observación. En el registro se debe anotar el tiempo al que se produce la muerte, valores que permitirán establecer la longevidad promedio de los individuos del cultivo. De acuerdo a Edley y Law (1988), Edley, M. T., y R. Law. 1988 Girling y Garforth (1989), la longevidad de las daphnias provenientes de un cultivo sano puede variar entre 40 y 60 días. 159 La detección de mortalidad en períodos más cortos, hará necesario la revisión de las condiciones de mantenimiento del cultivo o incluso el manejo de suplementos en el agua dura (vitaminas y selenio). 4.2.4. PROCEDIMIENTO DE LA PRUEBA Para el desarrollo de pruebas de toxicidad aguda con D. magna se emplean neonatos (< 24h nacidos) los que son expuestos a diferentes concentraciones de una muestra o de un agente tóxico durante un periodo de 48 h. Como resultado de dicha exposición, es posible determinar la concentración de la muestra o compuesto problema, que produce la muerte al 50 % de la población de neonatos expuestos (concentración letal media o CL50), con un nivel de confiabilidad del 95%. También puede determinarse la concentración mínima donde aún se observa efecto de mortalidad (Lower Observable Effect Concentration, LOEC) así como aquella donde la muestra no produce la muerte de neonatos (No observable Effect Concentration, NOEC). Cuando no hay un conocimiento de la toxicidad de las muestras, es recomendable llevar a cabo una prueba preliminar, en la cual se prepara un amplio número de concentraciones sin réplicas (por ejemplo: 0.001, 0.01, 0.1, 1,10, y 100 %). Para la prueba se coloca 30 mL de cada una de las diluciones en los vasos de prueba, se transfieren 10 neonatos, y a las 24 h se registra el número de organismos muertos. Con esta información podrá establecerse el intervalo de concentración en el cual se puede esperar el 0 y el 100% de mortalidad. Este intervalo, se utiliza como guía para la preparación de las diluciones en las pruebas definitivas. Para la preparación de las diluciones de las muestras, se utiliza como medio de dilución agua dura reconstituida (180 y 160 mg/L CaCO3-), sin ningún suplemento. En la preparación del agua, se debe determinar los parámetros (Numeral 4.2.3) señalados anteriormente (APHA, 1998). Preparación de las soluciones de Prueba: muestras ambientales (efluentes y aguas superficiales) Para preparar la diluciones de la muestra se recomienda utilizar un factor de dilución de 0.5 el cual permite cubrir un amplio intervalo de dilución (por ejemplo, 100, 50, 25, 12.5, 6.25% etc.). Si se observa un alto porcentaje de mortalidad durante las primeras horas del bioensayo, es necesario realizar más diluciones de a muestra y repetir el bioensayo. Las pruebas definitivas, requieren por lo menos 5 diluciones, por lo que es necesario preparar un mínimo de 100 mL por dilución. Este volumen será suficiente para el llenado de las tres réplicas (25 ml en cada uno) de cada concentración. Como recipientes se pueden emplear vasos de polietileno desechables (Fig 4.2.5.) de 30 mL, o vasos de precipitado de vidrio de 50 mL . 160 Además de las diferentes concentraciones de la muestra, se debe preparar junto con las respectivas réplicas, un control negativo con agua dura reconstituida sin suplementos, y un control positivo con una solución del tóxico de referencia (Cr VI) en la concentración que según la carta control previamente elaborada, corresponda a la CL 50 Una vez preparadas cada una de las soluciones, se transfieren 10 neonatos de menos de 24h de nacidos a cada uno de los recipientes. Para realizar este procedimiento, se puede utilizar una pipeta despuntada. Terminada la transferencia, se cubren los vasos con papel parafilm y se colocan bajo condiciones controladas de iluminación y temperatura (Tabla 4.2.2.) por un periodo de 48h. Transcurrido el tiempo establecido, se revisan los vasos de prueba y se registra el número de organismos muertos en cada uno. La muerte se reconoce, por la carencia de movilidad o la ausencia de ritmo cardíaco. Antes de efectuar las lecturas se agitan los recipientes en forma circular para reactivar su movimiento de los organismos que se posan inmóviles en el fondo. Aquellos que no presenten movilidad pueden observarse con un microscopio estereoscópico para confirmar la ausencia de ritmo cardíaco. En las Figuras 4.2.4. y 4.2.5 se presenta, un esquema del procedimiento de prueba, así como el diagrama de flujo de las actividades seguidas durante la elaboración de las pruebas de toxicidad con Daphnia magna. 161 Fig 4 2 4 Procedimiento de prueba 162 Cultivos de Mantenimiento Sustancias Tóxicas/ Muestra Neonatos 24 h Preparación de Diluciones No. de Diluciones (5) No. de Réplicas (3) Diseño Experimental Bioensayo Incubación 48h Toma de Datos No. de Muertos % de Mortalidad Análisis Estadístico (Probit) CL 50-48h Limites al 95% Fig. 4.2.5 Diagrama de Flujo de las Actividades Vinculadas al Desarrollo del Protocolo de Prueba de Daphnia magna 163 4.2.5. Expresión de los Resultados Calculo de la CL50 Para el cálculo de la CL50 y sus respectivos límites de confianza al 95%, se utiliza el método Probit, ya sea manualmente o con ayuda de paquetes estadísticos que tengan este procedimiento. El método de análisis PROBIT permite estimar la CE50 o CL50 ajustando los datos de mortalidad mediante una técnica de probabilidad para estimar los valores que siguen una distribución logarítmica de tolerancias. El porcentaje de organismos afectados, o muertos por la acción tóxica de una sustancia, se transforma a unidades probit. Esta transformación, permite el ajuste a una línea de regresión, en la cual la concentración correspondiente al probit 0.5, corresponderá a la cantidad de sustancia capaz de generar el efecto estudiado en la mitad de la población. Una de las restricciones del método es que para el cálculo de la CE50 o CL50 deben obtenerse valores intermedios entre 0 y 100% de mortalidad. Aceptabilidad de los resultados • • • La mortalidad en el control negativo no debe exceder el 10% La concentración final de oxígeno disuelto debe ser mayor de 2 mg/L. La CL50 para el tóxico de referencia deberá estar dentro de los límites de confianza preestablecidos en la carta control. En caso de emplear un control positivo de concentración cercana a la CL50, los valores de mortalidad obtenidos deberán encontrarse cercanos al 50%. Se puede considerar aceptable el encontrar mortalidades entre el 33 y 57% . REFERENCIAS APHA, 1998. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater.20th Ed. American Public Health Association. Ap. 8010G.. Washington D.C., pp. 8-20-8-23. CETESB, 1991. Agua-Teste de toxicidade com D. similis Clauss 1876, (Cladocera, Crustacea), Metodo de essaio. L5.018. Agosto 1991. CETESB. Dutka B.J. 1989. Methods for Microbiological and Toxicological Analysis of Water, Wastewaters and Sediments: National Water Research Institute (NWRI) Environment Canada. Burlington Ontario 164 Edley, M. T., y R. Law. 1988. Evolution of life histories and yields in experimental population of Daphnia magna. Biol. J. Limn. Soc. 34: 309-326. Elendt B. P. y Bias W. R. 1990. Trace nutrient deficiency in Daphnia magna cultured in standard medium for toxicity testing effects of the optimization of culture conditions on life history parameters of Daphnia magna. Wat. Res. 24 (9): 1157-1167. Girling, A. E. & Garforth, B. M. 1989. Influence of variations in culture medium on the survival and reproduction of Daphnia magna. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 42: 119-125. Goulden, C. E., Comotto, R. M., Hendrickson, J. A. Jr., Horning, L. L., & K. L. Johnson. 1982. Procedures and recomendations for the culture and use of Daphnia in bioassay studies. Aquatic Toxicology and Hazard Assessment: Fifth Conference, ASTM STP 766. J. G. Pearson, R. B. Foster, & W. E. Bishop, Eds., American Society for Testing and Materials. pp 139-160 Gutiérrez L. E., Lerdo de Tejada B. A., Herto-Delgadillo R. Y., y C. J. Garcia. 1989. Procedimientos de evaluación tóxica de efluentes industriales líquidos utilizando Daphnia magna Straus (Cladócera, crustácea), Instituto Mexicano de Tecnología del Agua. México. pp 105 Klüttgen, B., Dülmer, U., Engels, M., & H. T. Ratte. 1994 ADAM, and artificial freshwater for the culture of zooplankton. Water Research. 28 (3): 743-746. Lewis, M. A., & A. W. Maki. 1981. Effects of water hardness and diet on productivity of Daphnia magna Strauss, in laboratory culture. Hydrobiology. 85: 175-179. US EPA Environmental Protection Agency (EPA). 1991. Methods for Measuring the Acute Toxicity of Effluent and Receiving Waters to Freshwater and Marine Organisms. 4th ed: Weber, C.I., Ed. EPA-600/4-90-027. 165 Bioensayo de toxicidad crónica con Microalgas Clorofíceas Autor: Fernando Martínez Jerónimo En general, el método propuesto por Yolanda me parece adecuado, solo que propondría las siguientes modificaciones. Estas fueron ya comentadas con Yolanda en la pasada reunión del Taller, por lo que creo que no habría inconvenientes en que se pudieran incorporar para tener una propuesta que resulte mas conveniente para todos. Entre los cambios sugeridos se encuentran los siguientes: Principio de la prueba La prueba se basa en la determinación de los efectos que sobre la tasa de crecimiento poblacional pueden producir las sustancias tóxicas. El bioensayo se basa en que una población microalgal, cuando se encuentra en condiciones propicias para su desarrollo, es capaz de aumentar su tamaño de población. Debe recordarse que las microalgas, como componentes del fitoplancton, constituyen el grupo de productores primarios, que son fundamentales en todo ecosistema al permitir el desarrollo de consumidores de diferente nivel. Siendo la tasa de crecimiento una respuesta sensible y relativamente fácil de modificar adversamente por condiciones que afecten el desarrollo, entonces cuando se presenta una situación de estrés, la población disminuirá su tasa de incremento. Este supuesto es válido para especies de microalgas que se reproducen asexualmente, por fragmentación o por la formación de autosporas. El incremento en el tamaño de población se puede medir directa o indirectamente, lo cual también es una gran ventaja de esta prueba. Es una medida directa la densidad poblacional, la que se realiza mediante la cuenta de los individuos en muestras representativas (en una cámara de Neubauer o hemacitómetro); son medidas indirectas la determinación de densidad óptica (o absorbancia) a una longitud de onda adecuada, el peso seco, el contenido de clorofila ú otros pigmentos fotosintéticos, la concentración de proteínas, etc. El método consiste en exponer a las microalgas a una serie de concentraciones o diluciones de los materiales real o potencialmente tóxicos, espaciadas geométricamente en base 2; en el bioensayo definitivo, la concentración mayor deberá inhibir completamente el crecimiento, en tanto que la menor no deberá diferir significativamente del control. Se sugiere como organismos de prueba a las microalgas clorofíceas Raphidocelis subcapitata o Ankistrodesmus falcatus, que son especies reproducción asexual y unicelulares por lo que es sencillo realizar las cuentas para determinación de densidad celular La respuesta medida es la inhibición en la tasa de crecimiento poblacional en un periodo de 96 horas de exposición. La ventaja de esta prueba es de fácil realización y proporciona un a medida directa de los efectos sobre la población experimental. La prueba es adecuada para la evaluación de los efectos tóxicos agudos (letales) de efluentes con o sin tratamiento, muestras de agua de cuerpos de agua receptores de descargas, sustancias químicas puras y en mezclas de composición conocida o desconocida, principios activos y productos formulados comerciales. Es útil para la clasificación de la toxicidad de compuestos químicos, en el monitoreo de ecosistemas 166 acuáticos y en la evaluación de la eficiencia de los sistemas de tratamiento de las aguas residuales. Material biológico La cepa utilizada debe provenir de un cepario o colección de laboratorio autorizado. Aunque particularmente A. falcatus es una especie que puede ser colectada en muestras de fitoplancton, el proceso de aislamiento, purificación e identificación son laboriosos y tardados. La cepa debe ser conservada de acuerdo a las instrucciones del proveedor, en refrigeración y en medio de cultivo solidificado con agar bacteriológico. La calidad microbiológica de la cepa debe ser revisada periódicamente, pues aun cuando no se requiere de cepas axénicas, la carga bacteriana debe ser reducida y nunca debe contener hongos protozoarios ni otros organismos fotosintetizantes, tales como las cianobacterias, que con relativa facilidad pueden contaminar a una cepa monoespecífica, sobre todo cuando no se realiza un manejo aséptico o cuando no se trabaja con medios de cultivo y materiales debidamente esterilizados. Infraestructura en el laboratorio (cámaras especiales, campana de extracción, área estéril, etc.) Para esta prueba se requiere que el laboratorio cuente con un área para trabajo aséptico (cuarto de inoculación o campana de flujo laminar con filtración de aire), además de área para esterilización de materiales y soluciones (con horno y autoclave). Adicionalmente se deberá contar con una área acondicionada para el cultivo, la cual debe tener sistema regulado de iluminación artificial con lámparas fluorescentes “luz de día”, con control de temperatura y con suministro de aire comprimido y filtrado. El suministro de aire se emplea para la producción de inóculos y la propagación de cultivos activos de la cepa, pues los bioensayos se realizan sin aireación, aunque en este caso es deseable el contar con una placa agitadora orbital, a fin de evitar la sedimentación de las microalgas; esto último se puede sustituir en forma conveniente mediante agitaciones manuales periódicas durante el periodo de duración del bioensayo. Material de laboratorio La cristalería es la típica de un laboratorio, aunque debe incluir los requerimientos para el trabajo microbiológico, además de balanza analítica, pipetas automáticas, propipetas, etc. Reactivos Se requieren los reactivos para la preparación del medio de cultivo para el crecimiento algal (ver mas adelante); este medio funciona también como agua de dilución para la aplicación y exposición a los tóxicos durante el bioensayo. Para simplificar la preparación del medio de cultivo se sugiere la preparación de soluciones concentradas, que deberán 167 conservarse en frascos herméticos, protegidos de la luz y a baja temperatura. Todos los reactivos deberán ser grado analítico y de la máxima pureza posible a fin de evitar estar exponiendo a los organismos a elementos o compuesto potencialmente tóxicos, lo que podría afectar la respuesta de las microalgas durante el bioensayo. Cultivo y mantenimiento o almacenamiento de los organismos Las cepas se conservarán en tubos de ensaye con tapón de baquelita, que contendrán medio de cultivo solidificado con agar bacteriológico al 1.5 ó 2 %. También se recomienda mantener cultivos activos de la cepa en matraces pequeños. El mantenimiento de las condiciones asépticas es fundamental para garantizar la calidad de respuesta de las microalgas. El medio de cultivo sugerido es el recomendado la Agencia para la protección Ambiental de los Estados Unidos de Norteamérica (USEPA, 2002), que se muestra en la Tabla 1, que es adecuado tanto para la conservación de la cepa como para la propagación de los inóculos y como medio de dilución para los bioensayos. Sin embargo, para realizar cultivos de rápido crecimiento se recomienda de manera adicional el medio Basal de Bold, que se muestra en la Tabla 2. 168 Tabla 1. Concentraciones finales de macronutrientes y micronutrientes en el medio de cultivo (USEPA, 2002), en agua destilada o desionizada (con conductividad menor a 5 µS) (mg/l) Elemento NaNO3 25.5 N 4.20 MgCl2 6H2O 12.2 Mg 2.90 CaCl2 2H2O 4.41 Ca 1.20 MgSO4 7H2O 14.7 S 1.91 K2HPO4 1.04 P 0.186 NaHCO3 15.0 Na Macronutriente (mg/l) 11.0 K 0.469 C 2.14 Micronutriente (µg/L) Elemento (µg/L) H3BO3 185.0 B 32.5 MnCl2 4H2O 416.0 Mn 115.0 ZnCl2 3.27 Zn 1.57 CoCl2 6H2O 1.43 Co 0.354 CuCl2 2H2O 0.012 Cu 0.004 Na2MoO4 2H2O 7.26 Mo 2.88 FeCl3 6H2O 160.0 Fe Na2EDTA 2H2O 300.0 Na2SeO4 2.39 Se 33.1 0.91 169 Tabla 2. - Formulación del medio de cultivo Basal de Bold, para la propagación de microalgas clorofíceas. Solución No. 1 NaNO3 REACTIVO mg l-1 * 250 2 CaCl2 2H2O 25 3 MgSO4 7H20 75 4 K2HPO4 75 5 KH2PO4 175 6 NaCl 25 7 FeSO4 7H2O H2SO4 8 H3BO3 11.42 9 EDTA 50 KOH 31 ZnSO4 7H2O MnCl2 4H2O MoO3 CuSO4 5H2O Co(NO3)2 6H2O * En agua destilada o desionizada 10 4.98 0.001 (ml l-1) 8.82 14.4 0.71 1.57 0.49 Los medios de cultivo se preparan a partir de soluciones patrón o concentradas. Tanto para la propagación como para los bioensayos se requiere proporcionar iluminación continua, intensidad luminosa de 4,500 a 5,000 luxes, temperatura de 25±2 °C. La calidad de respuesta de la cepa debe ser evaluada periódicamente con el tóxico de referencia sulfato de cobre, evaluando la concentración media de inhibición (CI50). Los bioensayos en su fase definitiva, tiene duración de 96 horas Preparación del material antes de la prueba Todos los materiales empleados deberán ser de vidrio borosilicato, lavado de acuerdo al protocolo correspondiente para eliminar todo vestigio tóxico que pudiera afectar los resultados en el bioensayo. Como se ha dicho, todo el manejo debe realizarse en condiciones asépticas, con materiales, medios de cultivo y soluciones esterilizadas de la manera adecuada (calor seco, autoclave y/o filtración Millipore®. 170 Procedimiento de prueba La prueba es estática, sin renovación de la solución de prueba, realizándose siempre con soluciones acuosas de los materiales y muestras a evaluar. Cuando se trate de materiales de baja hidrosolubilidad, se deberán emplear solventes de baja toxicidad, como acetona, etanol, metanol o dimetil sulfóxido, procurando siempre que su concentración no sea superior a 1 ml/l, independientemente de que se deberá implementar una segunda serie control que contenga la máxima cantidad de solvente utilizada. Se deberá evaluar el pH y la conductividad al inicio y al término de la prueba. La prueba dura 96 h, siendo importante la determinación de efectos a la terminación, aunque se recomienda hacer observaciones intermedias (24, 48 y 72 horas), además de observaciones microscópicas de la morfología y coloración o cambio en los patrones de distribución citoplásmica de las células. Se ensayarán al menos 5 concentraciones o diluciones de los materiales a evaluar, contando cada una de ellas con al menos 3 réplicas. Los recipientes de prueba sugeridos son tubos de ensaye de 10X1.5, de preferencia con tapón de baquelita; en caso contrario se deberán utilizar tapones de algodón recubiertos de gasa. El volumen total de prueba será de 7 ml. La temperatura será de 25±2 °C, la iluminación continua con intensidad luminosa de 4,500 a 5,000 luxes proporcionada por lámparas fluorescentes “luz de día”. La respuesta evaluada será la densidad celular al inicio y al término de la prueba (preferentemente con observaciones intermedias). Para evaluar la densidad poblacional, se empleará la cámara de Neubauer o hemacitómetro. SE debe tener una variación máxima del 20 % entre cuentas consecutivas de una misma muestra, de lo contrario se deberá aumentar el número de cuentas por muestra. Expresión de resultados Se determina la Concentración Media de Inhibición (CI50) a las 96 horas. El criterio de aceptabilidad es un aumentó de al menos 16 veces de la densidad celular inicial en los testigos. Este método es semejante a los propuestos como métodos estandarizados: de la USEPA, la ASTM y la OECD. 171 4.5. ENSAYO DE TOXICIDAD CRONICA CON Selenastrum capricornutum (Pseudokirchneriella subcapitata) MÉTODO DE ENUMERACIÓN CELULAR BASADO EN EL USO DE HEMOCITÓMETRO NEUBAUER YOLANDA PICA GRANADOS Instituto Mexicano de Tecnología del Agua, Cuernavaca, Morelos, México ALICIA RONCO Centro de Investigaciones del Medio Ambiente, CIMA, Facultad de Ciencias Exactas, Universidad Nacional de La Plata, La Plata, Argentina MARIA CONSUELO DIAZ BAEZ Unidad Académica de Ingeniería Ambiental, Facultad de Ingeniería,Universidad Nacional de Colombia, Bogotá, Colombia 4.5.1. Principio 4.5.2. Reactivos, Soluciones y Cultivo de los Organismos de Prueba 4.5.3. Materiales y Equipos 4.5.4. Procedimiento para el Desarrollo de la Prueba 4.5.5. Análisis de Datos 4.5.6. Conteo con la Cámara de Neubauer REFERENCIAS 4.5.1. Principio El género y la especie de Selenastrum capricornutum fueron modificados formalmente a Pseudokirchneriella subcapitata (Hindak, 1990), sin embargo, para mantener consistencia con la literatura que la refiere, se empleará en éste procedimiento su nombre original,. Selenastrum capricornutum. El alga Selenastrum capricornutum , es una alga verde (clorofita) unicelular con forma de media luna (Figura 4.5.1.) y un volumen aproximado de entre 40 y 60 μm3, que puede encontrarse en sistemas acuáticos epicontinentales eutróficos u oligotróficos. Este método puede ser utilizado por sí mismo o como parte de una batería para estimar la potencial fitotoxicidad de aguas dulces superficiales o 172 subterráneas, aguas servidas y otro tipo de muestras líquidas, tales como: eluriados o lixiviados, agua intersticial de sedimentos o cualquier compuesto puro soluble en agua. La prueba es especialmente adecuada para ser practicada en laboratorios que cuenten con una infraestructura básica, siendo un ensayo sencillo y de bajo costo. Figura 4.5.1. Microfotografìa de Selenastrum capricornutum Cuando las células son expuestas a muestras que contienen contaminantes tóxicos su reproducción se afecta alterando la tasa de crecimiento de la población de las algas. El efecto de inhibición de la población causada por los agentes tóxicos en una muestra luego de 72 hs de exposición, bajo condiciones de temperatura controlada (24 ± 2º C), se determina comparándolo con el crecimiento normal observado en un sistema libre de agentes contaminantes conocido como control. Dependiendo del número de concentraciones y réplicas preparadas para el desarrollo del experimento, se determina la CI50 (Concentración de Inhibición Media), la LOEC (Concentración Mínima a la cual se Observa Efecto) y la NOEC (Concentración a la cual No se Observa Efecto). El protocolo de prueba con el alga Selenastrum. capricornutum presentado en este manual, es una modificación del método estándar publicado por la Agencia de Protección Ambiental de Canadá (Environment Canada, 1992 EPS1/RM/25). Los cambios introducidos (Blaise et al., 2000) corresponden al uso de volúmenes reducidos (2.6 mL en viales de borosilicato de vidrio de 20 mL) y la cuantificación de las células mediante una cámara de conteo (Neubauer) utilizando un microscopio óptico. 4.5.2. Reactivos, Soluciones y Cultivo del Organismo de Prueba Todos los reactivos utilizados deben tener calidad ACS, o al menos de 99% de pureza. Para su preparación se emplea agua destilada en vidrio o Millipore Super Q (USEPA,1992). 173 Medio de cultivo para proliferación de algas (1X) El medio de cultivo se basa en la preparación de una serie de cinco soluciones: la primera de ellas conteniendo micro-nutrientes, y las cuatro restantes con macronutrientes, todas ellas con las concentraciones adecuadas para asegurar un crecimiento óptimo de las algas durante el periodo de incubación. a. Preparación de soluciones Para la preparación de las cinco soluciones stock, rotular cinco frascos de 500 ml (preferentemente material aforado) de la siguiente manera: Solución 1, 2, 3, 4 y 5, respectivamente. Agregar 350 ml de agua a cada uno de ellos. Solución 1. Micro-nutrientes: Se inicia con la preparación de las soluciones de cloruro de zinc, cloruro de cobalto, molibdato de sodio y cloruro de cobre. Con este fin, se emplean 5 frascos de 100 ml de capacidad, que deben ser previamente etiquetados con el nombre del compuesto. En el caso del cloruro de cobre se etiquetan dos frascos, diferenciándolos con los números I y II. Posteriormente seguir las instrucciones que se señalan a continuación. Solución de cloruro de zinc Verter en el frasco 70 ml de agua, agregar luego 164 mg de cloruro de zinc (ZnCl2). Llevar a volumen final de 100 mL con agua y mezclar bien. A partir de esta solución transferir 1 mL mediante pipeta al frasco 1. Solución de cloruro de cobalto Verter en el frasco 70 mL de agua, agregar 71,4 mg de cloruro de cobalto (CoCl2·6H2O). Llevar a volumen con agua hasta completar 100 mL y mezclar bien. A partir de esta solución, transferir 1 mL mediante pipeta al frasco 1. Solución de molibdato de sodio Verter en el frasco 70 mL de agua, luego agregar 363 mg de Molibdato de Sodio (Na2MoO4·•2H2O). Finalmente completar el volumen hasta 100 mL con agua y mezclar bien. A partir de esta solución, transferir 1 mL mediante pipeta al frasco 1. Solución de cloruro de cobre Verter 70mL de agua en dos de los frascos de 100 mL, en el primero de ellos agregar 60,0 mg de cloruro de cobre (CuCl2·• 2H2O), luego llevar a volumen 174 de 100 mL con agua y mezclar bien. Una vez lista esta primera solución de cloruro de cobre, tomar 1 mL, verter en el segundo frasco y completar el volumen de 100 mL con agua. Un mL de esta segunda solución es la que se emplea para la preparación de la Solución No 1. de Micro-nutrientes. Cuando estén preparadas las soluciones anteriores, pesar el resto de los reactivos, tomar el frasco de 500 mL etiquetado como Solución 1 y agregar cada compuesto químico en el orden fijado a continuación. No alterar la secuencia ya que se formarán precipitados difíciles de solubilizar. Asegúrese que antes de adicionar el siguiente compuesto las sales se encuentren completamente disueltas. Tabla 4.5.1. Reactivos utilizados en la preparación de solución de micronutrientes 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Compuesto Fórmula Masa en gramos (g) o Volumen (mL) de solución stock Cloruro de Magnesio Cloruro de Calcio Ácido Bórico Cloruro de Manganeso Cloruro de Zinc Cloruro Férrico Cloruro de Cobalto Molibdato de Sodio Cloruro de Cobre Etilen diaminotetracético: sal disódica MgCl2·•6H2O CaCl2·•2H2O H3BO3 MnCl2·•4H2O* ZnCl2* FeCl3·•6H2O* CoCl2·•6H2O* Na2MoO4·•2H2O CuCl2·•2H2O Na2EDTA·•2H2O 6,08 2,20 0,0928 0,208 1 mL de la solución 0,0799 1 mL de la solución 1 mL de la solución 1 mL de la solución 0,150 * Estos compuestos pueden ser sustituidos por sulfatos. Por ejemplo, ZnCl2 o ZnSO4. Si así se hiciera, recalcular estequiométricamente las masa a utilizar. Después de haber agregado todos los componentes al frasco de la Solución 1, llevar a volumen de 500 mL con agua (Tabla 4.5.1). Soluciones de Macro-nutrientes: Adicionar en los frascos respectivos de 500mL restantes las cantidades de las sales indicadas a continuación (Tabla 4.5.2.). Tabla 4.5.2. Reactivos utilizados en la preparación de solución de macronutrientes 175 Compuesto Fórmula Masa (g) NaNO3 MgSO4·•7H2O 25,5 14,7 K2HPO4 1,044 NaHCO3 15,0 Frasco Solución 2 Nitrato de Sodio Solución 3 Sulfato de Magnesio Solución 4 Fosfato de Potasio Solución 5 Bicarbonato de Sodio Mezclar bien hasta disolver, y posteriormente adicionar agua hasta alcanzar el volumen de 1000mL en cada uno de los recipientes. Las soluciones stock pueden ser conservadas refrigeradas (sin congelar) durante dos meses. Este medio de proliferación también puede ser empleado para otras especies de algas tales como Ankistrodesmus sp, Scenedesmus sp, entre otras. Por cada litro de medio de cultivo que se desee preparar, se adiciona en agua destilada 1 mL de cada una de las 5 soluciones en forma ordenada. Así, se debe iniciar con la 1 hasta terminar con la 5, llevando a volumen al finalizar. Se sugiere no alterar el orden de adición de las soluciones ya que se pueden formar precipitados difíciles de eliminar. Mezclar bien después de la adición de cada solución. Al final el pH del medio deberá ser 7.5 ± 0.1 por lo que es necesario ajustarlo, ya sea con NaOH o HCl 1 N. Inmediatamente, filtrar el medio bajo condiciones asépticas (mechero o campana de flujo laminar) a través de una membrana de éster de celulosa de 0.22 µm de abertura de poro y 47 mm de diámetro. El sistema de filtración y el matraz de captación deben estar estériles. Para la filtración se puede utilizar una bomba de vacío. El medio nutritivo esterilizado se inocula con las algas. b. Cultivo y Propagación de las Algas La inoculación se realiza bajo condiciones de esterilidad ya sea mediante el trabajo cerca de un mechero, o utilizando una campana de flujo laminar. El cultivo se puede iniciar a partir de cepas mantenidas en medio sólido tomando las células con un asa y esparciéndolas en el medio nutritivo líquido, o a partir de un cultivo líquido de algas que haya alcanzado la fase estacionaria y tenga una densidad celular entre 1 y 3 millones de células/mL. Cuando los cultivos alcanzan esta densidad se caracterizan por presentar un color verde intenso, que se logra entre los 5 y 7 días después de la inoculación. En el caso que se seleccione esta última opción, se debe tomar 50 mL del cultivo por cada litro de medio estéril. El medio inoculado, se coloca a 24°C ± 2°C dentro de una cámara con iluminación superior a 2000 lux, manteniendo aireación permanente. En el caso que no se 176 cuente con el sistema de iluminación se puede utilizar un sistema similar al presentado en el Anexo 1. Para la aireación, se puede emplear una bomba de aire para acuarios, o se utiliza directamente el aire de la línea del laboratorio. En este último caso, se debe eliminar las impurezas intercalando filtros entre la fuente y el recipiente de cultivo. Los filtros permiten mantener condiciones axénicas, y eliminan las partículas sólidas o líquidas (polvo del aire, emulsiones de aceite, etc). Existen filtros especiales disponibles en el mercado de artículos para laboratorio, en el caso de no contar con ellos puede fabricarse en el laboratorio, empacando carbón activado y lana de vidrio. La manguera se conecta a un tubo hueco de vidrio o a una pipeta despuntada previamente esterilizados. El tubo se introduce en el medio inoculado cuidando de que el extremo llegue cerca del fondo del recipiente para que el burbujeo evite la formación de depósitos de algas. El extremo opuesto, se conecta a la manguera, y deberá sobresalir del recipiente; para ello, se fija a la boca de la botella de cultivo con un tapón estéril. Una vez que el cultivo alcanza la fase estacionaria (5-7 días), se retira de la cámara de incubación y se deja reposar a 4º C. Esto puede hacerse en el refrigerador o en el interior de un cuarto frío, bajo condiciones de oscuridad por 24 a 48 hs. El cultivo sedimentado es separado del sobrenadante por decantación, lo cual permite obtener el concentrado de algas que se utilizará en las pruebas de toxicidad, o en la alimentación de otros organismos como es el caso de Daphnia magna. Igualmente, las algas pueden ser concentradas mediante centrifugación. Reactivación de algas inmovilizadas Alternativamente al mantenimiento de un cultivo de algas, algunos laboratorios mantienen las algas inmovilizadas sobre alginato en la forma de perlas, las cuales pueden conseguirse comercialmente. En este caso, cuando se van a realizar pruebas de toxicidad, es necesario liberar las células de la matriz de alginato, para lo cual se sigue el procedimiento que se describe a continuación. Para la desinmovilización, se toman entre 10 y 12 perlas con algas asegurándose de que estén libres de medio líquido. Se transfieren a un tubo cónico de 50 mL, se adiciona 5 mL de citrato de sodio 0.1 M y se sella el recipiente. A continuación se agita vigorosamente durante 30 segundos, repitiendo el procedimiento cada 2 minutos hasta que la matriz se haya disuelto completamente (20-30 min). Con ayuda de un agitador o vortex (a intensidad moderada), se puede reducir el tiempo de proceso a 5 minutos. Una vez disueltas las perlas, centrifugar a 3000 rpm durante 10 minutos. Eliminar el sobrenadante, conservar las algas sedimentadas, resuspender las células en 5 mL de la solución amortiguadora utilizada para las pruebas (0.15 mg NaHCO3/L). Medio nutritivo enriquecido (18X) para las Pruebas de Toxicidad Este medio se prepara a partir de las soluciones 1, 2, 3, 4, y 5 empleadas en la elaboración del medio nutritivo para la proliferación de algas. Para la preparación 177 se recomienda utilizar un recipiente aforado de 1 L debidamente rotulado. Se coloca 800 mL de agua a los cuales se adiciona 18 mL de cada una de las soluciones ordenadamente como se indicó previamente. Terminada la adición de las soluciones, llevar a volumen con agua destilada y ajustar el pH a 7.5 ± 0.1 con NaOH o HCl 1 N. Solución amortiguadora para las Pruebas (15 mg NaHCO3/L) Para su preparación se toma un matraz aforado de 1L y se coloca 900 mL de agua destilada, se adiciona 1 mL de la Solución 5 empleada anteriormente, se mezcla y se completa a volumen. Medio sólido para mantenimiento de las cepas Disolver 1 g de agar-agar en 100 ml del medio nutritivo para desarrollo de Selenastrum capricornutum, y llenar con medio los tubos de ensayo hasta la mitad de su volumen. Cerrar los tubos y esterilizar en autoclave u olla de presión a 120° C, 15 lb durante 15-20 minutos. Al término del período, sacar los tubos, apretar sus tapas y dejar enfriar en posición inclinada hasta que el medio se solidifique. El medio sólido puede conservarse en refrigeración hasta por 1 mes. Inoculación de las algas en medio sólido Bajo condiciones de esterilidad, transferir con una asa bacteriológica las algas cultivadas en medio sólido al tubo con medio fresco, esparciendo las células en estría sobre la superficie del medio. La inoculación se inicia en zona más profunda del tubo, y se continúa hacia el exterior. Una vez inoculado los nuevos medios, incubar a 24 ± 2 ºC, con iluminación continua e intensidad de luz superior a 2000 lux por un periodo entre 48 y 72 h. Cuando se observe crecimiento se retiran los tubos de la cámara y se almacenan en oscuridad a 4 ± 2 ºC. Bajo estas condiciones, las algas continuarán creciendo pero de forma lenta 4.5.3. Materiales y Equipos Materiales • • • • • Pipetas de vidrio graduadas (5 y 10mL) Pipeta automática de 100µL con puntas estériles Pipeta automática de 100-1000 µL con puntas estériles Viales de centelleo de vidrio borosilicato claro de 20 mL de capacidad Papel (film) transparente 178 • • • • • • • • • • • • • • Cámaras de iluminación (ver en Anexo 1, como opción, un diseño de cámara para pruebas Gasa y algodón Tubo de vidrio o pipeta de vidrio despuntada Manguera de acuario Botellas de 1L o matraces aforados de igual capacidad 5 Botellas de 500 mL o matraces aforados de igual capacidad 6 Botellas de 100 mL o matraces aforados de igual capacidad Recipiente de vidrio claro para cultivo de boca angosta, preferentemente esterilizable, de 10-20L de capacidad Asas bacteriológicas Tubos de centrífuga (opcional) Tubos de cultivo con tapa de rosca. Tubos de centrífuga de 50 mL, plásticos con tapa de rosca y estériles (opcional) Hemocitómetro o Cámara Neubauer (ver en punto 4.5.6, indicaciones de manejo) Matraz de Filtración de 4L Equipos • Microscopio óptico con aumento de 100x • Potenciómetro • Balanza Analítica • Bombas de acuario • Bomba de vacío • Sistema de filtración • Mechero o Campana de flujo laminar • Centrífuga (opcional) • Base de agitación o Vortex (opcional) 4.5.4. Procedimiento para el Desarrollo de la Prueba Preparación del inóculo de algas para desarrollo de pruebas Conocido el número células presentes en el inóculo mediante cámara de Neubauer, se debe hacer una dilución con el fin de obtener en cada vial de prueba una concentración inicial de 10.000 cél./mL. Como el volumen final en cada vial incluyendo el inóculo es de 2.6 mL (Fig. 4.5.2.), se prepara 2 mL de una suspensión de algas que contenga 2.6 x 106 células/mL de la siguiente manera: Factor de dilución (FD) = Número cél./mL en el concentrado/2.6x106 cél./mL. Volumen (mL) del cultivo de algas para 2mL = 2mL / Factor de dilución 179 La preparación del inóculo que será utilizado en las pruebas debe provenir de un cultivo en fase exponencial. La densidad del cultivo será determinada con ayuda de un celda de conteo o Cámara de Neubauer. La densidad celular del cultivo se obtiene para poder calcular el factor de dilución necesario para asegurar una concentración de 2.6 millones de células por mililitro (2,6 x 106 cél./mL) en un volumen de 2 mL. Con el fin de ilustrar este cálculo se presenta el siguiente ejemplo: 1. Cálculo del factor de dilución (FD): FD = No. de cél./mL en el cultivo algal / 2.6 x 106 cél. /mL Si la concentración de células por mililitro en el cultivo fue de 2,9 x 106 cél./mL, entonces: FD = 2,9 x 106 cel/mL / 2,6 x 106 cel/mL= 1,115 2. Cálculo del volumen de cultivo de algas en 2 mL (V): V (mL) = 2mL / Factor de dilución Sustituyendo en el ejemplo, el volumen de cultivo en 2 mL será: V (mL) = 2mL / 1,115 = 1,79 mL El resultado indica que deberá tomarse 1.79 mL del concentrado de algas y adicionar solución amortiguadora hasta completar un volumen de 2mL. Esta dilución se puede realizar en tubos cónicos de centrífuga de 50 mL con ayuda de una pipeta automática. Los 2 mL tendrán una concentración de algas de 2.6 x 106 cél./mL, la cual nuevamente se diluye adicionando 18 mL del medio nutritivo enriquecido (18x) para tener una densidad final de 2.6 x 105 cél/mL . Método de dilución de muestras En las pruebas se requiere de 20 viales de borosilicato de vidrio de 20 mL similares a los utilizados en contadores de centelleo (Arensberg et al.,1995). Se toman 5 y se rotulan como control (C1 hasta C5), y se adiciona en cada uno de ellos 2.5 mL de la solución amortiguadora (NaHCO3 15 mg/L). Los restantes viales se organizan en 3 series de 5 viales cada una. Cada serie constituye una réplica. Se rotulan los viales de la primera serie de la siguiente manera: P1, Q1, R1, S1, y T1, la segunda, deberán rotularse de la misma forma pero con el subíndice 2, y la tercera con el subíndice 3. En los viales rotulados P1, P2, y P3 se colocan 5mL de solución más concentrada de la muestra (100%). Los restantes viales se utilizarán para la preparación de las diluciones seriadas de la muestra. 180 Para iniciar el proceso de dilución de la muestra, en cada uno de los viales restantes se coloca 2.5 mL de solución amortiguadora (NaHCO3 15 mg/L). A continuación, se transfiere 2.5 mL de la muestra (100%) del vial rotulado como P1 al vial Q1, la concentración en este vial corresponde a la primera dilución 1:2 o 50% (v/v). Se mezcla y se continúa el proceso tomando 2.5 mL del vial Q1 y pasándolo al R1 en cual se tiene la segunda dilución 1:2 y una concentración de 25% (v/v), y así sucesivamente hasta llegar al vial T1 , como al finalizar en el vial T1 se tiene un volumen de 5mL se toman 2.5 mL y se descarta. Se sigue el mismo procedimiento para las series 2 y 3 y al finalizar el proceso de dilución, se mezcla el contenido de cada uno de los viales del sistema de prueba. Terminado el proceso de dilución de la muestra, se procede a adicionar 100µL del inóculo de algas anteriormente preparado y cuya concentración es 2.6 x 105 cél/mL, a cada uno de los viales de la prueba. La concentración final de las algas en cada uno de los viales será 10.000 cél/mL. Se colocan los viales en la cámara con iluminación fluorescente (luz blanca fría), con una intensidad luminosa entre 60-80 µE/m2s (aproximadamente 4000 lux). En el Anexo 1 se presenta el diseño y procedimiento de elaboración de un modelo piramidal de cámara que puede ser construido con materiales de bajo costo y permite que en toda el área se tenga una distribución homogénea de luz. La incubación de los viales se lleva a cabo durante 72 h. Si no se cuenta con un sistema de agitación orbital, se debe hacer agitación manual de cada uno de los viales tres veces durante el día. La agitación contribuye a promover el adecuado desarrollo de la población de las algas. El resumen general de las condiciones de la prueba se presenta en la Tabla 4.5.3. y en las Figuras 4.5.2. y 4.5.3. 181 Tabla 4.5.3. Resumen de las Condiciones Recomendadas para las Pruebas de Toxicidad con S. capricornutum 1. Tipo de Ensayo 2. Temperatura 3. Calidad de Luz 4. Intensidad Luminosa 5. Fotoperíodo 6. Volumen del Recipiente 7. Volumen de la Solución de Prueba 8. Edad del Cultivo usado como Inóculo 9. Densidad Celular Inicial 10. Número de Réplicas 11. Velocidad de Agitación 12. Agua de Dilución 13. Factor de Dilución 14. Duración de la Prueba 15. Efecto Medido 16. Resultado Final 17. Aceptabilidad de los Resultados 18. Control positivo Estático 24 ± 2°C Fluorescente, blanco-frío 60-80 μE / m2/ s (4.000 lux) Iluminación continua Viales de 20 mL 2,6 mL 4 a 7 días 104 células/mL 3 manual, discontinua solución amortiguadora (NaHCO3 15 mg/L) 0,3 ó 0,5 72 h Crecimiento (conteo) IC50 Densidad Celular en el Control >16 veces la densidad inicial Cu(II) a partir de una solución de Cu SO4 182 1. PREPARACION DE INOCULO Conteo del número de células por microscopía óptica con cámara Neubauerl Dilusión del cultivo para obtener 2mL con 2.6 x 10 6 células Cultivo de S. capricornutum de 4 a 7 días en desarrollo de fase exponencial Adición de 18ml de medio de enriquesimiento 2. PREPARACION DE Inóculo con 2.6 x 10 5 células CONTROL 2.5mL agua moderadamente dura 5mL Muestra 2.5 mL buffer Transferencia secuencial de 2.5mL Mezclar Mezclar Mezclar Mezclar Descartar 2.5 mL REPLICA 1 REPLICA 2 REPLICA 3 Agregar 10µL a cada celdilla 100 50 % 25 12.5% 6.25% 3. DESARROLLO DE PRUEBA ((( Iluminación 3000lux ± 10% por 72h ))) Agitación tres veces por día 100 50 % 25 12.5% 6.25% 183 Fig. 4.5.2. Esquema del procedimiento de prueba con S. capricornutum 184 Diagrama de flujo ensayo S. capricornutum Cultivo de S capricornutum en medio sólido Subcultivo en medio líquido 3 días, 24°C, 100rpm Sustancias Tóxicas Subcultivo en medio líquido 3 días, 24°C, 100rpm Inóculo Preparación de Diluciones BIOENSAYO No. Cel./mL Inicial pH inicial Registro de Datos No. Cel./mL diaria (72 h) pH final Cálculo de la Biomasa % de Inhibición Análisis Estadístico (Probit) IE 50-96h 185 Fig. 4.5.3. Ensayo de toxicidad crónica con S. capricornutum 186 4.5.5. Análisis de Datos Al finalizar el tiempo de exposición se inicia el conteo del número de algas en cada vial. Para el conteo se toman entre 20 a 50 µl de la suspensión con ayuda de una pipeta automática, y se coloca en la celda de conteo o la cámara Neubauer. La cuantificación se efectúa siguiendo el método de manejo recomendado para este tipo de celdas, y que se describe en el numeral 4.5.6. Conocidos los recuentos del número de algas, se procede a establecer el porcentaje de inhibición (% I) en cada una de las diluciones, el cual se cuantifica de la siguiente manera: % I = 100 – [(promedio cél/mL de las réplicas en la dilución / promedio cél/mL de las réplicas del control)] x 100 4.5.6. Conteo con la Cámara Neubauer La cámara Neubauer, también conocida como hemocitómetro, consta de un cubreobjetos de cuarzo y un porta-objetos de un grosor mayor a los de uso común (Figura 4.5.4). En la parte superior del porta-objetos se encuentran cuatro canales longitudinales y uno transversal central. En la parte superior e inferior del canal transversal están grabadas dos rejillas de 9 mm2 de superficie, las cuales están a su vez subdivididas en una cuadrícula más pequeña (Figura 4.5.4. A-B) (UNAM, 1986). Usando el objetivo de 10x de un microscopio óptico, se enfoca de forma que en el campo se cubra un cuadrado cuya área corresponde a 1 mm2, generalmente se trabaja con el cuadro central. El área del cuadro central es de 1mm2 y se encuentra subdividida en 25 cuadrados. Cada uno de estos cuadrados mide 0.2 mm de lado, por lo que el área de cada uno será 0.04 mm2 (Fig. 4.5.4. C) Al colocar el cubre-objetos sobre el porta-objetos se tiene una profundidad de 0.1mm de forma que el volumen contenido en cada uno de los cuadrados grandes será 0.1 mm3 (1.0 mm2 x 0.1 mm = 0.1 mm3). El conteo con la cámara se lleva a cabo de la siguiente forma: • • • • Limpiar con papel de arroz la cámara de Neubauer. Colocar el cubre-objetos sobre los canales tal como se indica en la Figura 4.5.4. Agitar manualmente el frasco con la solución de algas a evaluar hasta observar coloración homogénea o disolver los agregados celulares. Con ayuda de una pipeta serológica de 1mL o con una pipeta automática de 100µL tome 0.1 mL de la suspensión de algas y colocando la punta de la pipeta en el borde del cubre-objetos dejar que la solución ingrese a la cámara 187 • • • • • • por capilaridad, sin que ella pase a los canales laterales (Fig 4.5.4.D). Si se forman burbujas se debe repetir la operación, lavando y secando la cámara previamente. Colocar la cámara Neubauer en la platina del microscopio y enfocar con el objetivo 10x. Localizar el cuadro central de la rejilla de 25 cuadros de 0.04 mm2, hacer un cambio de lente al objetivo de 40x y contar las células que se encuentran sobre el mismo (Fig. 4.5.4.C). Contar el número de células en el cuadrado central tomando precauciones para evitar contar dos veces la misma célula u omitir alguna. Para obtener resultados más exactos se recomienda tener un conteo entre 200 y 300 células por muestra. Cuando en el cuadro central existen menos de 200 células, es necesario revisar más cuadros para el conteo. Se sugiere continuar el conteo en los cuatro cuadros que forman las esquinas de la cuadrícula. Si aún así no se alcanza las 200 células, se debe contar el total en los 25 cuadros. Anotar el número de cuadros contados. En caso opuesto, en que el número de células sea muy elevado y se dificulte su conteo, será necesario diluir la suspensión en una proporción conocida, la que deberá ser tenida en cuenta en la estimación final. Determinación de la densidad celular La densidad celular de la suspensión de algas se calcula de la siguiente forma: 1. En caso de haber empleado los cuadrantes de 0.04 mm2 No. células en 0,1 mm3 = (No. total células contadas / No. cuadros 0,04 mm2 Esto dará el número total de células por 0,1 mm3 (volumen obtenido de multiplicar el área de 1mm2 x 0.1mm profundidad de la cámara). El número de células por mL, se obtendrá de multiplicar el valor obtenido anteriormente por 10.000. No. células por mL = No. células en 0,1 mm3 x 10.000 2. En caso de haber empleado los cuadrantes de 1 mm2 No. células en 0,1 mm3 =No. total células contadas / No. cuadros 1 mm2 en conteo Este valor corresponderá al número total de células en 0,1 mm3. Para obtener el número por mL, se multiplica por 10.000. 188 CámaraNeubauer A B 1 mm Canal transversal Canales longitudinales C 1 mm Colocarcubreobjeto 2 3 1 5 4 0.2 mm Conteopor cuadrantes Adicionar 0.1mL de soluciónalgal Fig. 4.5.4. Conteo Celular mediante la utilización de la 189 Cámara de Neubauer REFERENCIAS Arensberg, P.; Hemmingsen, V. H.; Nyholm, N. 1995. A. miniscale algal toxicity test . Chemosphere, 30:2103-2115. Blaise C, Forget G, Trottier S. 2000. Toxicity Screening of Aqueous Samples using a cost-effective 72-hour exposure Selenastrum capricornutum Assay. Environ Toxicol. 15:352-359. Environment Canada. 1992. Biological Test Method: Growth Inhibition Test Using the Freshwater alga Selenastrum capricornutum. Environmental Protection series EPS 1/RM/24. Hindak, F. 1990. Studies of the clorococcal algae (clorophyta) V. Biologicke Prace (Slovenskej Akademic Vied), Bratislava, 36:1-225 UNAM, 1986. Biología Celular. Manual de Prácticas. Departamento de Biología, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional Autónoma de México. pag. 20-28 U.S EPA. 1992. Short -term Methods for Estimating the Chronic Toxicity of Effluents and Receiving Waters to Freshwater Organisms EPA-600/4-91-022. 3th Edition. Philip L ewis A, L., Klem D. J., Lazorchak J. M. 190 ANEXO 1 CONSTRUCCIÓN DE UNA CÁMARA DE ILUMINACIÓN CASERA PARA EL ENSAYO DE TOXICIDAD CON S. capricornutum HOMERO HERNÁNDEZ SALGADO Instituto Mexicano de Tecnología del Agua, Cuernavaca, Morelos, México Materiales • • • • • • • • • • • • • 2 Pliegos de papel empleado para construcción de maquetas, color blanco, rígido y resistente (ej. Cascarón), de aproximadamente 1,40 x 0,60 m. Cinta adhesiva de 5-7 cm ancho Tijeras o navaja Papel aluminio Carrete de hilo nylon Marcador indeleble color azul o amarillo Guantes de látex Embudo de tallo largo de plástico transparente o vidrio de 10,5cm de abertura de boca y 10 de fondo 30 cm de alambre de 1mm de diámetro extensión eléctrica Socket para foco con entradas para clavija de conexión Bombilla de luz halógena fría 20W/11-860-120V.-350mA, 1155 lumen 50/60Hz, de triple foco (ej. Osram Dulux) Conexión para anterior Preparación de la pantalla de iluminación De los pliegos de papel para construcción, cortar cuatro triángulos de 60cm por lado, posteriormente cortar una de las esquinas de tal forma que se obtenga un polígono de 60 cm de base por aproximadamente 57cm de altura. (Fig 4.5.5. A) Forrar con papel aluminio los primeros 20 cm de la base de cada triángulo a manera de banda, la cual quedará en el interior de la cámara una vez armada (Fig. 4.5.5. B). Formar la cámara uniendo los triángulos por sus lados, para estructurar una pirámide trunca en su punta (Fig. 4.5.5. C) con ayuda de la cinta adhesiva. Pegar por la parte exterior. 191 Colocación del sistema de iluminación a. Sistema de filtrado A 20cm de la boca superior introduzca en una esquina hilo nylon resistente y cruce a la esquina opuesta, repita la operación en otra de las esquinas de tal forma que se forme una cruz o red de soporte (Fig. 4.5.6. D). Trozar el tallo del embudo hasta su base. Cortar el guante de cirujano conservando la banda de aproximadamente 8cm de la muñeca del mismo. Eliminar el resto. Colocar la banda de látex, obtenida del guante de cirujano, en la boca del embudo sin tallo, de forma que cubra solo 5 cm, y dejar un espacio traslúcido de 5 cm (Fig 4.5.6. D). Enderezar el alambre y enrollar uno de los extremos de tal forma que se fije en el interior del embudo. Introducir el alambre por el orificio dejado por el tallo del embudo. Dar un espacio de 5cm, y en el extremo saliente formar un gancho (Fig. 4.5.6. D). Colgar el embudo del centro de la red de sostén (Fig. 4.5.6. E). Colocación de lámpara Atornillar la bombilla de luz halógena de triple barra en el porta-lámpara correspondiente. Introducir el sistema por el interior de la pirámide de tal forma que la rosca del porta-lámpara salga por la punta de la pirámide. Tomar la conexión múltiple y enroscar al resto del sistema por el exterior. Esto dará estructura y soporte a la lámpara (Fig. 4.5.6. E). a. Base de la cámara Cortar un cuadrado de papel para construcción de 62 cm2. Forrar una cara con papel aluminio. Ubicar el centro del cuadrado y en torno a él dibujar un cuadrado de 10cm, después marcar dos más de forma concéntrica, el primero de 40 cm por lado y el segundo de 60 cm por lado (Fig. 4.5.6. F). Trazar líneas diagonales con el marcador, en la banda que se forma entre el cuadrado 1 y 3. El área marcada señalará la zona donde siempre deberán ser colocados los viales de prueba dentro de la cámara. En esta banda, bajo el diseño antes mencionado, la iluminación será homogénea proporcionando una intensidad luminosa de entre 2800 y 3000 lux. 192 El borde del recuadro 3 es el sitio donde la pantalla de la cámara de iluminación deberá ser colocada (Figs. 4.5.6. F y 4.5.7. G). Preparación de la Pantalla Vista Lateral 2.5 cm 2.5 cm A B cm cm 60 cm cm 60 60 60 20 cm 57 cm 60 cm Papel Aluminio 60 cm Vista interior C 60 cm 60 cm Fig.4.5.5. Preparación de pantalla de iluminación 193 Sistema de filtrado de luz D 5 cm de alambre Colocación de la lámpara Extensión eléctrica Socket para foco con entradas para clavija de conexión Cono de vidrio Cubierta de látex E 10 cm Socket para bombilla de luz fría, halógena 5 cm Bombilla de luz fría, halógena 10.5 cm Base de la cámara Forro de aluminio 3 2 F 1 Area de iluminación 10 cm 10 cm 40 cm 10 cm Borde de unión para la pantalla 60 cm Fig. 4.5.6. Colocación de sistema de iluminación 194 G Socket para foco con entradas para clavija de conexión Extensión eléctrica Socket para bombilla de luz fría, halógena Bombilla de luz fría, halógena 20 cm Alambre Red de sostén 5 cm Trampa de luz 20 cm Forro de aluminio Area de iluminación homogénea Fig.4.5.7. Vista tridimensional de la cámara de iluminación Sugerencias Cambiar la lámpara de iluminación de triple barra de forma regular, cada 45 días si es que el uso es continuo, o calcule las horas de uso equivalentes. El cambio debe efectuarse ya que el brillo de la lámpara tiende a disminuir con el uso reduciendo la intensidad luminosa, lo que puede reducir significativamente el crecimiento de las algas durante el desarrollo de pruebas 195 Prueba de toxicidad aguda con lombriz (Eisenia) para suelos contaminados María del Carmen Cuevas Díaz1,2, Ronald Ferrera Cerrato3, Adriana Roldán Martín1, Refugio Rodríguez Vázquez1 1 CINVESTAV-IPN, 2Universidad Veracruzana, 3Colegio de Posgraduados 196 Contenido Contenido .....................................................................................................................197 Resumen del bioensayo con lombrices a 14 días ........................................................198 1.1 Ensayo de toxicidad aguda con Eisenia andrei o foetida para suelo contaminado 199 1.2. Material, equipo, soluciones y organismo de prueba.........................................200 1.3 Preparación de las muestras de suelo................................................................202 1.4 Procedimiento .....................................................................................................203 1.5 Manejo de datos y reporte ..................................................................................205 Diagrama de flujo ensayo Eisenia andrei .....................................................................206 REFERENCIAS ........................................................................................................206 Referencias bibliográficas.............................................................................................206 Anexo 1.Cultivo de Eisenia...........................................................................................207 Anexo 2. Control positivo 2-cloroacetamida .................................................................207 Anexo 3 .Datos de la prueba de laboratorio .................................................................277 197 Resumen del bioensayo con lombrices a 14 días Duración del bioensayo 14 días Temperatura 20 ± 2º C Fotoperíodo 24 horas, usando luz ambiental(400 lx) Contenedores frascos de vidrio Cantidad requerida de muestra de suelo 1000 g Cantidad requerida por réplica 200-250 g Humedad del suelo 35-45% Organismo prueba Eisenia andrei o foetida Edad del organismo > 2 meses (clitelada) Número de organismos por réplica 10 Número de réplicas 4 Régimen No dar alimento durante la prueba pH del suelo 5-9, no realizar la prueba si el rango no es aceptable. Punto a medir Supervivencia, alteraciones morfológicas Control positivo 2-cloroacetamida Control negativo suelo artificial o suelo blanco no contaminado 198 1.1 Ensayo de toxicidad aguda con Eisenia andrei o foetida para suelo contaminado María del Carmen Cuevas Díaz1,2, Ronald Ferrera Cerrato3 Refugio Rodríguez Vázquez1 1 CINVESTAV-IPN, 2UV, 3Colegio de Posgraduados 1.1.1 Introducción Los bioensayos con lombrices son ampliamente reconocidos como prueba para evaluar la toxicidad de suelos contaminados (Lanno y McCarty, 1997; Dorn, et al., 1988; Wilson, et al., 2002). La lombriz más utilizada ha sido Eisenia en sus especies foetida y andrei. Pertenece a la familia Lumbricidae, es una lombriz exógena en México, pero de amplia distribución, fácil manejo y cultivo (Fragoso, 2002). Su característica morfológica principal es la presencia de segmentos externos e internos en su cuerpo, son hermafroditas, cuando son adultos se observa una protuberancia epidérmica denominada clitelo, en el que se forman los capullos en los cuales son depositados los huevos (Romero, 1996). Se desarrolla bien en pH de 5 a 7, temperaturas de 20 a 28º C (Kaplan, et al., 1980). Este protocolo incluye dos clases de pruebas toxicológicas: prueba por contacto con papel filtro, prueba con suelo artificial y muestras de suelo contaminado. La prueba por contacto en papel filtro puede ser utilizada opcionalmente como preliminar para determinar las concentraciones correspondientes a las que se tiene que llevar a cabo la prueba con suelo, siendo ésta última mas detallada. La prueba de contacto es fácil de realizar y da resultados reproducibles. El suelo artificial y el suelo contaminado son representativos de la exposición de la lombriz al compuesto químico analizado. El presente protocolo se basó en OECD Guidelines for toxical chemical 207 y la publicación 96-327 del Departamento de Ecología del estado de Washington, así como las experiencias obtenidas a nivel laboratorio. 199 1.1.2 Campo de aplicación Medio: suelo artificial, suelo blanco Sustancias probadas: TPH´s, benzo(a)pireno, pireno 1.1.3 Principio de la prueba La prueba por contacto en papel filtro involucra la exposición de las lombrices a sustancias prueba sobre un papel filtro húmedo con la finalidad de identificar el potencial del tóxico presente en el suelo, se realiza en 48 a 72 horas. El uso de suelo artificial involucra colocar a las lombrices en un suelo artificial aplicando la un rango de concentraciones diferentes de la sustancia prueba y el suelo objeto de estudio en la concentración que trae. La mortalidad es evaluada en 7 y 14 días. 1.1.4 Definiciones y unidades. Sustancias de referencias CL50 es la concentración letal media, esto es cuando una concentración dada del compuesto ocasiona la muerte de la mitad de los organismos durante el período de prueba. Concentración del material en agua, suelo o sedimento que se estima letal para el 50% de los organismos de ensayo. La CL50 y sus límites de confianza (95%) son usualmente derivados de análisis estadístico (Ronco y Díaz, 2004). Para la prueba de contacto la sustancia prueba se expresa en mg/cm2, para el suelo artificial y la muestra de suelo contaminado en mg/kg (base seca). 1.1.5 Condiciones para validar la prueba La mortalidad en el control no debe de exceder el 10% al finalizar la prueba. 1.1.6 Sustancia de referencia o control positivo La sustancia de referencia puede ser utilizada como control y ocasionalmente con la finalidad de asegurarse que las condiciones utilizadas en la prueba son adecuadas y no presentan cambio significativo, siendo la indicada la 2-cloroacetamida. 1.2. Material, equipo, soluciones y organismo de prueba Todos los reactivos utilizados deben tener calidad ACS o, al menos, 99% de pureza. Para su preparación se emplea agua destilada. Material y Equipo • • • • Potenciómetro Balanza analítica con capacidad para pesar lombrices de 0.1 g Balanza con capacidad para pesar muestras de suelo de 1.0 g Frascos de vidrio de 0.5 l o 1 l 200 • • • • • • • • • • • • Frascos de vidrio (diámetro de 4. 5cm y altura de 7 cm) Pipetas volumétricas clase A de 1 a 100 ml Pipetas serológicas de 1 a 10 ml graduadas Micropipeta de 200 a 1000 µl Termómetro Espátula de acero inoxidable Pinzas Guantes Papel filtro Malla 2 a 2.36 mm Baño o cuarto con control de temperatura 20 ± 2º C con intensidad luminosa de 400 a 800 lux. Base de agitación o vórtex Reactivos y soluciones Buffers para pH Solución buffer pH 4, 7 y 10 para calibrar el potenciómetro. Tóxico de referencia (control positivo) 2-cloroacetamida, 99% pureza. Agua destilada o desionizada tipo II Suelo artificial El suelo artificial presenta una composición de: 10% musgo (materia orgánica), 20% arcilla y 70% arena, CaCO3 para ajustar a pH de 7.0 ± 0.5 Muestra de suelo Se necesitan cuando menos 1100g de suelo, ya que son un mínimo de 4 réplicas cada una con 200 a 250g de suelo contaminado, 100 a 200 g del remanente se utiliza para realizar las determinaciones de pH, humedad y concentración del tóxico; pero si se requiere de caracterizar la muestra es necesaria la recolección de mayor cantidad de suelo. Los recipientes deben ser llenados en su totalidad. Si el análisis no se realiza de inmediato, las muestras deben ser selladas y empacadas para minimizar la pérdida de compuestos volátiles almacenadas a 4º C en la oscuridad. De preferencia el análisis se debe de realizar en un lapso de 24 horas y no debe ser mayor de 14 días, ya que la toxicidad pudiera no ser representativa por cambios del contaminante (degradación o pérdida). Organismos prueba Se utilizan lombrices adultas al menos de 2 meses (cliteladas) del mismo cultivo y la misma especie correspondientes al género Eisenia en sus especies andrei o foetida. Estas especies pueden tener como fuente de alimento el estiércol de caballo. 201 1.3 Preparación de las muestras de suelo Determinación de humedad Se calcula la humedad inicial para adicionar el agua de hidratación necesaria. Para determinar la humedad se toma una alícuota de 25 g de la muestra de suelo y se coloca en una cápsula de porcelana previamente a peso constante, se pesa con muestra. Se seca a 103-105º C durante 24 horas, colocándose en un desecador para enfriar. Una vez fría se pesa. La diferencia de pesos nos da el peso seco final. (Publicación No 96-327). Opcional: Se puede utilizar una balanza para determinar humedad del tipo de Kern MB-3 con capacidad de 50 g, para la cual se utiliza 1 g de suelo. Cálculos HS = (A-B)/[C-(A-B)]*100 HS = humedad de la muestra en % A = peso inicial de la muestra + cápsula (g) B = peso seco final de la muestra + cápsula (g) C = peso de la alícuota inicial (g) Ejemplo: A = 78.005 g B = 76.448 g C = 25.078 g HS = (77.168-76.063)/ [25.024(77.168-76.063) ]*100 HS = 4.61% Hidratación de la muestra de suelo Las muestras se pueden hidratar de 35 a 45% correspondiente al peso del suelo utilizado en la prueba. HA = T – HS HA = hidratación necesaria (%) T = humedad blanco (%) HS = humedad del suelo (%) Cálculos: T = 45% HS = 4.6% HA = 45% - 4.6% = 40.4% Para determinar la cantidad de agua a adicionar: V = (W*HA/100)F V = cantidad de agua a adicionar (ml) W = peso de la muestra (g) HA = hidratación necesaria (%) F = factor de conversión (1 ml/1g) Ejemplo: HA = 40.4% W = 250 g V = (250 g * 40.4%/100)*(1ml/1g) = 101 ml 202 pH del suelo Para medir el pH en el suelo se debe tomar una muestra de 5 g por 12.5 ml de agua, pero si el suelo es arcilloso, se utiliza el doble de agua destilada con la finalidad de poder procesar la muestra. Se agita la mezcla durante 5 minutos, dejando reposar por 30 minutos. Medir el pH de la solución sobrenadante. 1.4 Procedimiento 1.4.1 Prueba de contacto en papel filtro Lavar los contenedores de vidrio (diámetro de 4.5cm y altura de 7 cm) con agua caliente y detergente, dejar secar. Cortar papel filtro con 4 cm de ancho por 15 cm de longitud según el frasco y depositarlo en él, no debe exceder del borde del frasco. Se debe realizar una prueba de humedad con papel filtro para lo cual cuando menos se preparan 5 viales con diferentes cantidades de agua (1 a 5.5 ml), se deposita una lombriz en cada uno de ellos, la cantidad de agua a adicionar previo a la prueba será la correspondiente a la mínima cantidad de agua en donde la mortalidad corresponde a 0. La sustancia problema se disuelve en agua o en un solvente orgánico (acetona, diclorometano, acetona) para dar una concentración conocida. Se deposita 1 ml de esta solución problema en el papel filtro (con micropipeta), cuidando que se distribuya homogéneamente, se seca por rotación del frasco con papel filtro, ver figura 1. Los controles son: papel filtro con agua desionizada o destilada y papel filtro impregnado del solvente seleccionado y secado. Después de secado el papel filtro, se adiciona en cada vial de 1 a 5.5 ml de agua desionizada o destilada (de acuerdo a los resultados de humedad del papel filtro explicado previamente), cada vial es tapado con tela y con papel aluminio al que se le han realizado algunos orificios con la finalidad de preservar la humedad y de facilitar el intercambio de aire. Figura 1. Secuencia general de prueba con papel filtro Papel filtro Frasco gerber lavado y secado Adicionar solvente con compuesto a probar Secar en campana Adicionar agua destilada o desionizada Depositar lombriz lavada, secada y pesada Como ejemplo de concentraciones a utilizar tenemos: 203 Cantidad aplicada al Concentración de la papel filtro (mg/cm2) solución aplicada g/ml 1.0 7 x 10-2 0.1 7 x 10-3 0.01 7 x 10-4 0.001 7 x 10-5 0.0001 7 x 10-6 En el ejemplo anterior 70 mg /70cm2 = 1.0 mg/ cm2, el área depende del tamaño del papel y el frasco, al igual que la concentración. Las concentraciones a emplear no deben ser menores de cinco. Para cada tratamiento o nivel de concentración se realizarán 10 réplicas. Una lombriz se coloca en cada frasco, depositándola sobre el papel filtro húmedo. Antes de ser colocadas en los viales, las lombrices son depositadas por tres horas en papel filtro humedecido con la finalidad de vaciar sus intestinos, después son lavadas y secadas. Los viales son colocados en forma horizontal en la oscuridad, a una temperatura de 20 ± 2 ºC, durante un período de 48 horas y opcionalmente hasta 72 horas. Las lombrices se consideran muertas cuando no responden a ningún estímulo mecánico. Cualquier síntoma patológico se reporta. Esta prueba es rápida y nos indica las concentraciones a utilizar en la prueba de 14 días. NOTA: Para adicionar la sustancia problema al papel filtro, previamente se realiza una extracción de la misma del suelo contaminado, determinando su concentración y procediendo a realizar diluciones si es necesario de la misma. Tomando como solución madre a la concentración inicial del suelo. 1.4.2 Procedimiento con suelo contaminado y suelo artificial Se determina la humedad del suelo contaminado, se pesan 250 g y se deposita en un frasco de vidrio ajustando la humedad, se colocan un total de 4 réplicas. La duración de la prueba es de 14 días, realizando una evaluación a los 7 días, la temperatura es de 20 ± 2º C, con luz continua con la finalidad de asegurarse que se encuentran en todas partes del medio. La mortalidad se evalúa después de 7 días, por vaciamiento del medio en un recipiente de vidrio, separando las lombrices y observando sus reacciones a los estímulos mecánicos, posteriormente se vuelven a depositar en su contenedor hasta su evaluación final a los 14 días. Al final de la prueba, se determina la humedad y el pH. Control.- El control puede consistir de suelo no contaminado de la misma textura que la muestra al cual se le ajusta la humedad de la misma forma que se procedió para la 204 muestra. Se colocan 4 réplicas, cada una de 250 g. Adicionar 10 lombrices libres de alimento, para lo cual 3 horas antes se colocan sobre contenedor de vidrio cubierto con papel filtro humedecido con agua destilada o desionizada. Las lombrices se lavan, se secan y pesan. Se puede utilizar como control suelo artificial previo ajuste de humedad y pH, se colocan 4 réplicas, cada una de 250 g. Adicionar 10 lombrices libres de alimento, para lo cual 3 horas antes se colocan sobre contenedor de vidrio cubierto con papel filtro humedecido con agua destilada o desionizada. Las lombrices se lavan, se secan y pesan. Al igual que la muestra, a los controles también se les determina al finalizar la prueba humedad y pH. Suelo artificial La OECD 207 describe una prueba con suelo artificial de la misma composición que el proporcionado en el listado de reactivos y soluciones. Este puede ser utilizado para aquellos suelos muy arcillosos en los que el movimiento de la lombriz se dificulte por textura del suelo. En este caso se utilizaría el extracto del suelo contaminado. Como controles se tendría además del suelo humedecido, un suelo al que se le ha adicionado el solvente utilizado en la extracción (solvente como acetona, diclorometano, etc) con la finalidad de corroborar el efecto del solvente sobre el organismo prueba. 1.4.3 Prueba de ecotoxicidad directa Esta determinación denominada directa se puede utilizar para suelos contaminados y aquellos que se encuentran sujetos a bioremediación, para lo cual se pesan 200g de suelo problema, se ajusta con 10% de tierra de hoja y 15% de arena de río (previamente se le ha determinado humedad y pH), se ajusta humedad y pH de la manera descrita anteriormente. Se colocan cuando menos 5 contenedores de vidrio, depositando en c/u de ellos 10 lombrices cliteladas, a las que se dejó cuando menos 3 horas antes, lavadas, secadas y pesadas. Las lombrices se dejan a 20±2º C (también pueden dejarse a una temperatura de 24±2º C, sin que se observe efecto por la temperatura). El control puede ser suelo artificial sin contaminante o suelo cercano al sitio de recolección de la muestra que no contenga el contaminante. Se revisa al día 7 y se sacan las lombrices a los 14 días, se cuentan, lavan, secan y pesan. 1.5 Manejo de datos y reporte 1.5.1 Tratamiento de resultados Los datos de concentración/mortalidad (CL50) se pueden determinar por el método Probit o Trimmed-Spearman según sea el caso, para ello se puede utilizar el software proporcionado por EPA. 1.5.2 Reporte de la prueba Se debe incluir la información siguiente: 205 • • La sustancia a prueba, datos químicos Organismo prueba, edad, condiciones de cultivo, fuente de alimento, número de lombrices utilizadas por réplica. • Condiciones de la prueba, así como cualquier variación de las condiciones de la misma. Preparación del medio, esto es, si hay alguna variación en la forma de preparación del suelo artificial o de la muestra de suelo contaminado, así como si existe variación en la cantidad de suelo. • Los resultados deben incluir: • Peso promedio del organismo al inicio y final de la prueba • Descripción de cambios físicos o patológicos observados en el organismo blanco. • Humedad y pH del suelo y control al inicio y final de la prueba. • Método usado para determinar CL50 incluyendo los datos y resultados de la prueba. • Mortalidad en el control • Mortalidad con la sustancia prueba • La concentración más alta que no causa mortalidad • La concentración más baja que ocasiona 100 % de mortalidad. Diagrama de flujo ensayo Eisenia andrei Prueba en papel filtro (48-72 h) Suelo (14d) Suelo contaminado 4 réplicas por concentración + 10 lombrices en c/u Control: suelo sin contaminante + aguaREFERENCIAS destilada o desionizada; también se puede utilizar suelo artificial 4 réplicas + 10 lombrices en c/u Referencias bibliográficas Extracción de la sustancia problema Suelo artificial 4 réplicas por concentración + 10 lombrices en c/u Controles: 1)Suelo artificial + agua destilada o desionizada 2)Suelo artificial + solvente utilizado 4 réplicas + 10 lombrices Dorn, P.B., Vipond, T.E., Salanitro, J.P., and Wisniewksi, H.L. 1998. Assessment of the acute toxicity of crude oils in soil using earthworms, microtox and plants. Chemosphere. 37(5) pp 845-860. 206 Fragoso, G. C., 2002. Las lombrices de tierra en México: diversidad, distribución y manejo. II Simposium Internacional y Reunión Nacional Lombricultura y abonos orgánicos. Hamilton, M.A., Russo, R.C. Thurson, R.V. 1977. Trimmed Spearman-Karber method for estimating median lethal concentrations in toxicity bioassays. Env. Sci. Technol. 11(7) pp. 714-719 Kaplan, D.L., Hartenstein, R., Neuhauser, E.F., and Maleckit, M.R., 1980. Physicochemical requirements in the environment of the earthworm Eisenia foetida. Soil Biol Biochem. 12 pp 347-352. OECD1984. Guideline for Testing of Chemicals 207. Earthworm, acute toxicity tests. Publication No. 96-327. 1996. Earthworm Bioassay protocol for soil toxicity screening. Washington State Department of Ecology. Rida, A.M., Bouché M., 1997. Earthworm toxicology: from acute to chronic test. Soil Biol. Biochem., 29(3,4) pp 669-703. Ronco, A., Díaz, b. M.C., 2004. Interpretación y manejo de resultados en: ensayos toxicológicos y métodos de evaluación de calidad de aguas. Ed. Gabriela Castillo. Cap 7, 141-149. Santamaria R. S. 1996. Aspectos biotecnológicos del proceso de vermicomposteo y su aplicación agronómica. Tesis para obtener el título de de Ingeniero Agrónomo. Facultad de Ciencias Agrícolas. Universidad Veracruzana. Santamaría, R.S., Ferrera, C.R. 2002. Dinámica Poblacional de Eisenia andrei (Bouche 1972) en diferentes residuos orgánicos. Terra. 20(3) 303-310 Wilson, J.J., Hathcer, J and Goudey, J.S., 2002. Ecotoxicological endpoints for contaminated site remediation. Ann Ist.Super Sanita. 38(2) 143-147. www.igv.kvl.dk/download/software Anexo 1. Cultivo de Eisenia Eisenia puede desarrollarse en diferentes residuos animales, especialmente en estiércol de caballo, aunque puede ser una mezcla 50:50 de estiércol y residuos vegetales. El pH debe ser de 7 ±5, de conductividad baja, menos de 6.0 miliSiemens. Para asegurar una buena producción de lombrices se debe tener 20 kg de residuos por 1 kg de lombrices. Anexo 2. Control positivo 2-cloroacetamida El control positivo sirve como una referencia para determinar la sensibilidad del organismo. Por lo que cada vez que haya un cultivo nuevo, se debe realizar este control. Esta parte de la prueba debe llevarse a cabo previo a la exposición de la lombriz a la sustancia prueba. Para el control positivo se requieren cuandomenos tres concentraciones diferentes con cloroacetamida. Existen reportes de LC50 para 38.5 mg/kg (Edwards, 1984). Se sugieren concentraciones de 19.25, 38.5 y 77.0 mg/kg como tóxico de referencia. Los cálculos para determinar la cantidad a preparar de una solución stock para adicionar a 600 g de suelo artificial (200g c/u). Usando la concentración de 38.5 mg/kg como ejemplo: a) Calcular la cantidad de 2-cloroacetamida a adicionar en 600g de suelo artificial (Publication No. 96-327. 1996). T = W *F*C 207 T = Cantidad de tóxico de referencia a adicionar (mg) W= Peso de la muestra (g) F = Factor de conversión (1kg/1000g) C = Concentración de referencia del tóxico (mg/kg) W = 600 g C = 38.5 mg/kg T = (600 g) (1kg/1000g) (38.5 mg/kg) = 23.1 mg En este caso, 23.1 mg es lo que se necesita para 600 g de suelo, pero es necesario preparar una solución stock usualmente de 22.5 mg de 2-cloroacetamida/ml de agua (se puede utilizar cualquier concentración, tratando de evitar residuos). Si se utiliza la solución stock propuesta 22.5mg/ml (pesar 4.5 g y disolver en 200 ml de agua), realizar el siguiente cálculo: V = R/S V = volumen de la solución stock a adicionar (ml) R = cantidad del tóxico de referencia a adicionar (mg) S = concentración de la solución stock (mg/ml) R = 23.1 mg S = 22.5mg/ml V = (23.1 mg)/(22.5 mg/ml) = 1.03 ml Pero debemos recordar que es necesario hidratar el suelo en 45%, lo que equivale a adicionar 270 ml de agua. Si consideramos que la 2-cloroacetamida de la solución stock está disuelta en agua entonces tendríamos 270 -1.03 = 269 ml de agua por adicionar. Los 269 ml de agua y 1.03 ml de la solución stock se mezclan en un matraz agitando y se adicionan a los 600 g de suelo. Se mide también el pH y la humedad. 208 Anexo 3 . Datos de la prueba de laboratorio Inicio Clave de No de muestra réplica pH Tº Humedad Peso de No C % lombrices lombrices vivas pH Tº C Final Humedad Peso de No % lombrices lombrices vivas Efectos (movimiento lento, seccionamientos) Observaciones en el 7º día Tipo de organismo _____________________________ Fecha inicial _____________________ Fecha final __________________ Realizó _______________________________ 277 Prueba de toxicidad aguda con lombriz de tierra (Eisenia foetida). Autor: Raúl Uribe Hernández Introducción La contaminación del suelo por hidrocarburos del petróleo tiene un fuerte efecto adverso sobre las comunidades de invertebrados de suelo como son las lombrices de tierra, nematodos, otros poliquetos y microartropodos. En particular la lombriz de tierra ha sido utilizada en estudios en donde se evalúa la sobrevivencia, crecimiento y reproducción. Estos organismos son cosmopolitas en ambientes en donde se provee suficiente humedad y adecuada temperatura, siendo vulnerables a la mayoría de los factores que afectan este microecosistema especialmente aquellos asociados con la aplicación de químicos agrícolas y residuos dispuestos inadecuadamente. Método EPA 712-C-96-167-1996 y OECD-207-1984. Fundamento La exposición de estos organismos a suelos y sedimentos contaminados produce el contacto directo con la epidermis del organismo dando pauta para producir daño dermal o la absorción de tóxicos por esta vía al grado de provocar la muerte. La mortalidad en estos organismos es determinada por la falta de movimiento, como repuesta a estímulos táctiles definidos en su porción final. Otro aspecto con el que se determina la condición de muerte es la tendencia a su desintegración rápida, quedando como remanente del organismo una mancha amarillenta, síntomas patológicos previos son las lesiones superficiales y la hinchazón de la porción de intersegmentos o áreas ulceradas en la epidermis. 277 Materiales y Reactivos • Papel filtro Whatman de fibra de vidrio. • Diclorometano grado HPLC (fco. c/4 litros) • Hipoclorito de sodio 5% • Agua destilada • Frascos de vidrio de 250 ml • Cajas petri de 210 mm • Papel Aluminio • Parafilm • Micropipetas (10-1000μl) • Pipetas serológicas de 1, 5 y 10 ml • Regla o Bernier • Probetas de 50 y 100 ml Material biológico Organismos adultos de la lombriz de tierra Eisenia foetida con clitelo en la parte anterior del cuerpo, con peso entre 300 y 600 mg Instrumentos Cámara ambiental / Incubadora Balanza analítica Campana de extracción Procedimiento 1. Las pruebas preliminares o de tamiz, se realizaron con el extracto del suelo contaminado a una concentración al 100%. 278 2. Se colocaron discos de papel filtro Whatman de fibra de vidrio dentro de las cajas petri proporcionales al diámetro de la caja de cristal (aprox. 20 cm de diámetro). 3. Se colocó un control positivo agregando 1ml de diclrometano grado hplc en una caja petri. Y un control negativo en el que se adicionó agua destilada en otra caja petri. 4. Se adicionaron 2 ml de cada una de las disoluciones preparadas del extracto original en un intervalo de concentraciones amplio (en serie logarítmica), distribuyendo de forma homogénea sobre papel filtro. 5. Se dejó evaporar el disolvente, por 10min en una campana de extracción. 6. Posteriormente se agregó en la caja petri 1ml de agua destilada y 0.5 de dietil sulfoxido al 1% como vehículo para disolver el tóxico adecuadamente para el organismo. 7. Finalmente fueron colocadas 5 lombrices en cada caja, los organismos deben estar previamente pesados y aclimatados por 24 hrs. 8. Se mantuvieron las cajas en completa oscuridad a 22± 2°C y humedad relativa 50±5 %. 9. Se registraron los cambios morfológicos observados así como la mortalidad después de 7 días, (considerando como muerto al organismo que no responda a ningún estímulo mecánico). 10. Se adicionó agua 0.5 ml de agua destilada para evitar la desecación del organismo cada 48 hrs. 11. Posteriormente se realizaron las pruebas definitivas utilizando un intervalo de concentraciones más reducido (en serie geométrica), seleccionando aquellos tratamientos en los que se observo efecto adverso, para insertar entre alguno de ellos, este nuevo intervalo de concentraciones (ejemplo:100,50,25,12.5,6.25,3.125 %). 12. Se elaboró la curva dosis-respuesta de las diferentes concentraciones en un intervalo reducido y se calcularon los valores de CL50, por medio del método Probit. 279 Nota: Los organismos de la especie E. foetida que se seleccionen para la prueba debe permanecer dentro del rango de 300-600 mg y debe tener más de 6 semanas de edad. Calculo de la CL50 Se utiliza el metódo Probit, también conocido como método de unidades probabilísticas, que es utilizado para evaluar la relación de dosis-respuesta de un contaminante sobre un organismo, medida en términos de la concentración letal media (CL50) y su precisión o intervalo de confianza. Asignando el valor Probit de tablas respecto del porcentaje de mortalidad obtenido para cada concentración. Después efectuar el análisis de regresión lineal mediante el método mínimos cuadrados y utilizando los valores obtenidos de la ecuación de la recta, calcular la CL50, considerando el valor de la “y” a la mitad del numero de individuos utilizados en cada lote o tratamiento. Y finalmente calcular el intervalo de confianza al 95 % por medio de la desviación estándar y el valore de tablas del estadístico de “t” de student. Interpretación de resultados El resultado es un valor virtual obtenido estadísticamente, en términos de concentración, ya sea en mg de HTP/kg de suelo o de µg de algún compuesto HAP/kg de suelo, en base seca, este valor se relaciona de forma inversa con el potencial de toxicidad, es decir una sustancia es mas tóxica si requiere de una menor concentración para producir la letalidad o algún otro daño subletal. Para tal efecto se ha establecido una clasificación para asignar categorías de toxicidad en función de la concentración: Extremadamente tóxico <1 mg/kg 280 Altamente tóxico 1 a 50 mg/kg Moderadamente tóxico 50 a 500 mg/kg Ligeramente tóxico 0.5 a 5 g/kg Prácticamente atóxico 5-15 g/kg Relativamente inocuo mas de 15 g/kg Tomado de Loomis, 1978 Este valor es de importancia relativa, es decir se utiliza de forma comparativa con los valores obtenidos de otras sustancias o mezclas y no se maneja como una constante biológica, ya que de acuerdo a las condiciones de la muestra es el valor que se obtiene de toxicidad. Referencias - ASTME 1676: Standard Guide for Conducting a Laboratory Soil Toxicity Test with Lumbricid Earthworm Eisenia foetida (1997). - EPA, 1996. Earthworm subchronic toxicity test. Ecological Effects Test Guidelines. 712-C-96-167. OPPTS 850.6200, Washington DC, Abril 1996. - Loomis TA, 1978. Fundamentos de Toxicología. Ed. Acribia, 1ª ed. Zaragoza España. 274 pp. - OECD. 1984. Guideline for Testing of Chemicals. Eartworm acute toxicity test. 207, April. - ISO 11268 Soil Quality- Effects of Pollutants on Earthworms (Eisenia foetida). Part 1 Method for the Determination of the Acute Toxicity Using Artificial Soil Substrate. 281 4.1. ENSAYO DE TOXICIDAD AGUDA CON Allium cepa L MEDIANTE LA EVALUACIÓN DE LA INHIBICIÓN DEL CRECIMIENTO PROMEDIO DE RAÍCES DE CEBOLLA. MARIA CONSUELO DIAZ BAEZ Unidad Académica de Ingeniería Ambiental, Facultad de Ingeniería, Universidad Nacional de Colombia, Bogotá, Colombia ALICIA RONCO Centro de Investigaciones sobre el Medio Ambiente, CIMA, Universidad Nacional de La Plata. Argentina YOLANDA PICA GRANADOS Instituto Mexicano de Tecnología del Agua, Cuernavaca, Morelos, México 4.1.1. 4.1.2. 4.1.3. 4.1.4. Principio Reactivos y Materiales Procedimiento de la Prueba Expresión de Resultados REFERENCIAS 4.1.1. Principio Cuando un bulbo de cebolla (Allium sp) se re-hidrata se produce una estimulación del crecimiento de las células, lo cual permite la elongación de las raíces de la planta. Sin embargo, cuando la hidratación se lleva a cabo en presencia de sustancias tóxicas, la división celular de los meristemos radiculares puede inhibirse ya sea, retardando el proceso de mitosis o destruyendo las células. Este tipo de alteraciones generalmente impide el crecimiento normal de la raíz, y por tanto su elongación (Fiskesjô, G. 1985, 1993). El efecto puede determinarse en forma indirecta, mediante la comparación de la elongación de las raíces de cebollas expuestas al tóxico, con las de cebollas no expuestas, luego de un periodo de 72 h de prueba. La cuantificación del efecto se realiza estableciendo el porcentaje de inhibición del crecimiento de las raíces respecto a la longitud promedio de las raíces del control. 4.1.2. Reactivos y Materiales 282 Bulbos de Allium sp (cebolla amarilla) Para la elaboración de las pruebas se debe seleccionar bulbos de 1,5 cm de diámetro, secos y sin formación de hojas y/o raíz. Pueden ser obtenidos del mercado local o adquiridos a través de algún proveedor. Previo al montaje de la prueba, los bulbos deben limpiarse eliminando la epidermis seca y removiendo, con un bisturí o instrumento punzante, los restos de tejido y raíces del área radicular. (Fig. 4.1.1 (1)). No se deben dañar las raíces primordiales. Con el fin de eliminar los restos de tejidos es conveniente, colocar los bulbos en agua destilada por dos horas y secar. Medio de crecimiento La preparación del medio de crecimiento utilizado para el desarrollo del ensayo se indica en la tabla 4.1.1. La solución madre preparada para los elementos traza de acuerdo a lo indicado se diluye 10 veces con agua destilada, y el pH se ajusta a 7 antes de utilizar. También se puede utilizar con agua destilada, y el pH se ajusta a 7 antes de utilizar. También se puede utilizar agua dura o agua de la llave como medio de crecimiento. En el caso de utilizar cualquiera de estas opciones, el control negativo, y el agua utilizada para preparar las diluciones de los compuestos químicos o las muestras, deberá ser la misma. Tabla 4.1.1. Medio de Crecimiento para Allium sp. Masa de sal para disolver en un Litro de agua destilada Reactivo Ca (NO3)2• .4H2O KNO3 MgSO4•7H2O KH2PO4 Fe EDTA•3H2O mg 236,1 202 246 136,1 67,6 Elementos Traza Reactivo MnSO4 CuCl2 NaMnO4 ZnSO4 H3BO3 mg 0,55 (*) 0,0645 (*) 0,001 (*) 0,0007 (*) 0,23 (*) (*) Los componentes correspondientes a elementos traza deben ser adicionados a partir de una solución stock. 283 Materiales • • • • Tubos de ensayo de vidrio de 10 cm de largo y 1,5 cm de diámetro (o recipientes de mayor tamaño, dependiendo del tipo de bulbos a utilizar). Gradillas o soportes para tubos Bisturí Reglilla para hacer mediciones en cm o mm Almacenamiento de los bulbos de cebolla Se recomienda adquirir los bulbos en vísperas de la realización de pruebas o en su defecto, almacenarlos en un lugar donde se pueda garantizar condiciones secas, y una temperatura entre 10 y 20°C , a fin de evitar la aparición de hongos. En algunas regiones, los bulbos pueden mantenerse almacenados hasta por un año, sin embargo, en zonas geográficas donde la temperatura y humedad son altas, el almacenamiento está limitado a unos pocos días. 4.1.3. Procedimiento de la Prueba Preparación de diluciones Generalmente, se sugiere el empleo de una serie de cinco concentraciones, un control negativo, y uno o dos controles positivos. Para su preparación se emplea el método de dilución en forma secuencial aplicando un factor de 0,2 ó 0,3. Cuando se va a llevar a cabo, una evaluación presuntiva puede emplearse una serie de diluciones logarítmicas, por ejemplo: 100; 10; 1; 0,1; 0,01 etc., lo cual permitirá establecer el intervalo de concentración conveniente para la determinación de la Concentración Inhibitoria Media (CI50). Se recomienda igualmente utilizar, agua dura para el control negativo, así como para la preparación de las diluciones de la muestra, y la preparación del control positivo con el tóxico de referencia Cu(II). Ensayo Cuando se trabaja con bulbos de diámetro pequeño, las pruebas se realizan en tubos de ensayo de 10 cm de longitud x 1,5 cm de ancho, en el caso de bulbos de mayor diámetro puede utilizarse tubos o recipientes de mayor volumen, dependiendo del tamaño de los mismos. Es importante destacar que la profundidad de los recipientes debe ser tal que, al término de la prueba la elongación máxima no alcance el fondo del recipiente (Fiskesjô, G. 1985). En la prueba se utilizan cinco concentraciones de la muestra, un control negativo, y uno o dos controles positivos (ver capítulo 6), cada una con doce réplicas. El 284 ensayo se inicia con el llenado de los tubos con cada una de las diluciones y controles; este llenado deber hacerse hasta el borde del tubo. A continuación se colocan los bulbos limpios sobre la boca del tubo, cuidando que la zona radicular quede inmersa en el líquido (Fig. 4.1.1 (2)). Figura 4.1.1. Esquema gráfico de los pasos a seguir en la prueba con Allium cepa. 1) Limpieza y pelado de bulbos; 2) ubicación de bulbos en tubos para exposición a las soluciones de ensayo; 3) colocación de tubos en soporte; 4) agregado de soluciones a tubos durante el ensayo; 5) medición de longitud del haz de raíces al finalizar el tiempo de exposición de los bulbos. Los tubos se colocan en una gradilla, la cual se localiza sobre una mesa que no presente vibraciones y se mantienen a temperatura ambiente (20°C) por un periodo de tiempo de 72 horas. Debe evitarse la iluminación directa. Dos veces al día durante el periodo de prueba, se debe restablecer el volumen perdido por evaporación o absorción. Para restablecer este volumen se utiliza la muestra o dilución correspondiente. Se recomienda inclinar el bulbo sin sacar las raíces del tubo, adicionando cuidadosamente el volumen con ayuda de una pipeta Pasteur. (Fig. 4.1.1 (3 y 4). En las figuras 4.1.1 y 4.1.2 y en la tabla 4.1.2 se resumen las condiciones de prueba. 285 Condiciones de la Prueba Temperatura 20°C Iluminación Indirecta Volumen de Prueba 15-20 mL Tiempo de Prueba 72 h Control Negativo Agua Dura o de la Llave o Medio de Crecimiento 12 Réplicas Control Positivo Cu+2 Control Positivo Solución de Cu (II) 12 Réplicas Soluciones de Prueba 5 Concentraciones 12 Réplicas 72 h de Incubación Control Negativo Agua Dura o de la Llave o Medio de Crecimiento 12 Réplicas Control Positivo Solución de Cu (II) 12 Réplicas Soluciones de Prueba 5 Concentraciones 12 Réplicas Registro de Signos de Fitotoxicidad Disminución de la Longitud de las Raíces. Medición de elongación descarte valores extremos Cálculo del % de Inhibición del Crecimiento de las Raíces Cálculo de la CI50 Control Negativo Figura 4.1.2. Ensayo de Toxicidad con Allium cepa L. 286 Tabla 4.1.2. Resumen de las Condiciones Recomendadas para las Pruebas de Toxicidad con Allium cepa L. 1. Tipo de Ensayo 2. Temperatura 3. Calidad de Luz 4. Iluminación 5. Recipientes 6. Número de Réplicas 7. Material Biológico 8. Condición de los bulbos 9. Agua de Dilución 10. Número de concentraciones 11. Duración de la Prueba 12. Efecto Medido 13. Control Negativo 14. Control Positivo 15. Resultado Final Estático 20°C; Ambiente Fluorescente, blanco-frío Indirecta Tubos de Ensayo de 10 cm x 1,5 cm diámetro 12 Bulbos de aproximadamente 1,5 cm de diámetro Pelar los bulbos y la base, evitar dañar el anillo radicular. Agua de la llave o canilla o medio de crecimiento 5 72 h Inhibición de crecimiento de las raíces Agua de la llave o medio de crecimiento Cobre (II) a partir de una solución de CuSO4 CI50 4.1.4. Expresion de Resultados Medición Al término del período de exposición se registra la longitud promedio de las raíces, cuya medición se lleva a cabo con ayuda de una regla común con escala en milímetros (ver Figura 4.1.3. La medición se lleva a cabo, colocando la escala en el margen del tubo, se ubica el valor de longitud mínimo y máximo donde incide la mayoría de las raíces, y el punto medio se define como el promedio. Se efectúa la estimación en cada tubo y se obtiene el promedio matemático de diez réplicas (los dos valores más extremos se descartan). Para obtener el porcentaje de efecto de inhibición se debe realizar la siguiente operación: (Longitud del Control – Longitud de la Muestra) x 100/ Longitud del Control Con estos valores se construye una gráfica de concentración en función del porcentaje de inhibición y se calcula la CI50 mediante cualquiera de los siguientes métodos: Probit, Promedios Móviles o Sperman and Karber 287 Figura 4.1. 3 Elongación de las raíces de bulbos de cebolla después de un proceso de hidratación 0 1 2 Prom edio 3 REFERENCIAS Fiskesjô, G. 1985. The Allium test as standard in environmental monitoring. Hereditas 102:99-112. Fiskesjô, G. 1993. The Allium test in wastewater monitoring. Env. Toxicol. Wat. Qual. 8: 291-298 Fiskesjô, G. 1997. Allium test for screening chemicals; evaluation of cytological parameters. In: Plants for Environmental Studies. Wancheng W., J. W. Gorsuch, J. S. Hughes Eds. CRC Press. Florida, pp.308-329 288 4.3. ENSAYO DE TOXICIDAD AGUDA (EFECTOS LETALES Y SUBLETALES) CON HYDRA ATTENUATA YOLANDA PICA GRANADOS Instituto Mexicano de Tecnología del Agua, Cuernavaca, Morelos, México ALICIA RONCO Centro de Investigaciones sobre el Medio Ambiente, CIMA, Universidad Nacional de La Plata. Argentina MARIA CONSUELO DIAZ BAEZ Unidad Académica de Ingeniería Ambiental, Facultad de Ingeniería, Universidad Nacional de Colombia, Bogotá, Colombia 4.3.1. 4.3.2. 4.3.3. 4.3.4. 4.3.5. Principio Reactivos y Soluciones. Cultivo y Mantenimiento de los Organismos de Prueba Procedimiento de la Prueba Expresión de los Resultados REFERENCIAS 4.3.1. Principio Los pólipos de agua dulce del género Hydra son microinvertebrados de la clase Hydrozoa de amplia disribución geográfica y se caracterizan por ser animales pluricelulares, cuyas células se disponen en dos capas: la epidermis y la gastrodermis, separadas por una mesoglea gelatinosa la cual encierra una cavidad digestiva continua que se comunica directamente con el exterior a través de una abertura o boca. Algunas de las células intersticiales de la epidermis dan origen a los órganos característicos de defensa y ataque. Los más conocidos son los nematocistos, que corresponden a los miembros más simples de esta clase. En el extremo inferior presentan un pedúnculo con una base que se adhiere a diferentes superficies; en el extremo anterior se encuentra la boca, rodeada de cinco tentáculos (Campbell y Bode, 1983). Su tamaño varía de 5 a 20 mm de longitud y de 2 a 3 mm de espesor (Fig. 4.3.1). La especie Hydra attenuata es empleada como organismo de prueba por la facilidad de su cultivo en laboratorio, su rápida reproducción, su estructura primaria (ectodermo, mesodermo y endodermo) que favorece el intercambio intra e intercelular aumentando su potencial para la detección de tóxicos, así como el presentar cambios morfológicos fácilmente reconocibles bajo condiciones progresivas de intoxicación (Trottier et al., 1997). Los ensayos de toxicidad con Hydra attenuata, permiten determinar subletalidad y letalidad potencial de sustancias químicas puras, aguas residuales domésticas e 289 industriales, lixiviados, aguas superficiales o subterráneas, agua potable, y agua de poro de sedimentos, entre otros. Las pruebas de toxicidad con Hydra attenuata tienen una duración máxima de 96 h, tiempo durante el cual los organismos son expuestos al tóxico o muestra problema. Durante el ensayo, diariamente se hace un examen microscópico, y se registra los cambios morfológicos producidos. La exposición de los organismos a compuestos tóxicos da lugar a una serie de cambios morfológicos (efectos subletales), y dependiendo de la concentración puede producir la muerte de los individuos (efectos letales). Los resultados de las pruebas permiten además de la estimación de la CL50 y la CE50, establecer la LOEC, la NOEC, y la TOEC (Blaise y Kusui, 1997). Fig. 4.3.1. Morfología de Hydra attenuata Boca Hidróide Hipostoma Región Gástrica Columna Región de producción de gemas Pedúnculo Disco Basal 4.3.2. Reactivos y Soluciones Todos los reactivos utilizados deben tener una calidad ACS o por lo menos tener un 99% de pureza. Para la preparación de las soluciones se debe utilizar agua destilada en vidrio o agua calidad Millipore Super Q. Medio de cultivo de Hydra: Para el mantenimiento del cultivo y la limpieza del mismo después del proceso de alimentación, se utiliza el medio cuya formulación se presenta en la Tabla 4.3.1. Tabla 4.3.1. Reactivos utilizados en la preparación de medio de Hydra 290 Reactivo Cloruro de Calcio: CaCl2.2H2O N-tris (hydroximetil)metil 12aminoetanosulfónico, Buffer TES Acido Etilen-diamino-acético, EDTA Agua Destilada Cantidad 2,94 g 2,2 g 0,080 g 20,0 L Para la preparación del medio, se disuelven inicialmente los compuestos en 1L de agua, posteriormente se coloca la solución en un recipiente de polipropileno o equivalente (material inerte), y se completa a volumen (20L) con agua destilada. El pH del medio debe ser 7.0 ± 0.1, en caso contrario deberá ajustarse con una solución de NaOH o HCl 1 N. El volumen preparado se almacena a temperatura ambiente (20 ± 2ºC) y será suficiente para proveer medio fresco para dos semanas. Medio de cultivo de Hydra sin EDTA: Para el enjuague de las Hydras, antes de llevar a cabo las pruebas de toxicidad, se recomienda utilizar medio de cultivo sin EDTA. Su preparación se efectúa siguiendo el procedimiento anterior, pero sin la adición del Acido Etilen-diaminoacético (EDTA) Medio de cultivo de Hydra para suplementar las muestras de agua que van a ser ensayadas Cuando se analizan muestras de aguas naturales, aguas residuales, o agua de poro de sedimentos, se debe adicionar a la muestra una concentración de cloruro de calcio y buffer TES igual a la presente en el medio de cultivo de Hydra. Para adicionar estos compuestos se procede de la siguiente forma: a un volumen de 100 mL de muestra filtrada (0,22 μm) se adiciona 0.0147 g de Cloruro de Calcio y 0.011 g de Buffer TES. Se disuelven los compuestos y se ajusta el pH a un valor de 7.0 ± 0.1 con una solución de NaOH o HCl 1 N.. Este ajuste se realiza antes de la preparación de las diluciones de la muestra. 4.3.3. Cultivo y Mantenimiento de los Organismos de Prueba Para el cultivo masivo de H. attenuata se utilizan recipientes circulares de vidrio de fondo plano de aproximadamente 20 cm de diámetro. Los individuos se mantienen en un volumen de medio suficiente para llenar 2 ó 3 cm de la altura del recipiente. Los recipientes se mantienen a 20 ± 2° C, bajo una intensidad luminosa de 800 lux (equivalente a la incidencia de luz natural en áreas interiores,) y un fotoperíodo de 16h de luz y 8h de oscuridad. Los cultivos se alimentan con Artemia sp recién eclosionada, por lo menos cuatro días a la semana, y la limpieza se hace regularmente dos veces al día después de la alimentación. 291 Alimentación y limpieza 1. Dependiendo de la calidad de los huevos de Artemia, 24 ó 48h antes de la alimentación, se coloca media cucharadita de quistes de Artemia sp en 500 mL de una solución salina (10 g NaCl/L). Para una óptima eclosión de los quistes se debe mantener la solución con aireación constante, iluminación continua y una temperatura de 28 ± 2°C. Aunque existen diferentes diseños para obtener estas condiciones, la forma más simple de lograrlas, es colocar una bombilla de 100 wats sobre el recipiente a una distacia conveniente para evitar exceder la temperatura óptima de eclosión Una vez que los quistes han eclosionado y se obtienen nauplios, se procede a la desinfección de la Artemia, deteniendo el burbujeo de aire. Después de 5 minutos, los quistes no eclosionados sedimentan y los nauplios forman una nube que flota cerca al fondo del recipiente. 2. Una vez sedimentados los quistes, se succiona la nube de nauplios mediante una pipeta Pasteur, evitando tomar los quistes no eclosionados. A continuación, se los coloca en un tamiz de 125 mallas, permitiendo el drenaje del exceso de líquido. Inmediatamente, se sumerge el tamiz en un recipiente circular de vidrio de 10 cm de diámetro de fondo plano, que contenga 100 a 150 mL de una solución de NaCl (10g/L) y media pastilla de iodo disuelta en dicha solución. Generalmente se utilizan tabletas de iodo comerciales para desinfección de aguas formuladas con tetraglicina hidroper-yodo, en el caso que exista dificultad para obtenerlas, se puede utilizar cinco gotas de una solución de yodo-povidona de uso fármaceutico, cuya formulación debe indicar un contenido de 8 a 10 g de yodopovidona en 100mL. 3. Después de 10 ó 15 minutos se drena el tamiz para eliminar el excedente de la solución y se transfiere a otro recipiente de iguales dimensiones, con medio de cultivo de hydra. Se deja reposar 3 minutos, y se enjuaga dos o tres veces repitiendo la operación de transferencia a recipientes con medio fresco. Durante este proceso los quistes no eclosionados deben ser removidos, evitando su incorporación al cultivo de hydra durante la alimentación y reduciendo el riesgo de infecciones en el cultivo (Figura 4.3.2.) 4. Desinfectada la Artemia, se procede a alimentar a las hidras esparciéndolas sobre el cultivo masivo en forma de zig-zag, con ayuda de una pipeta Pasteur. Este procedimiento se lleva a cabo por lo menos cuatro días a la semana, en general se recomienda alimentar de martes a viernes. Una vez alimentado el cultivo, se debe esperar 1 ó 2 horas para efectuar una primera limpieza y eliminar los nauplios excedentes. Después de 4 ó 5 horas de la alimentación se debe llevar a cabo una segunda limpieza del cultivo para eliminar los residuos de la digestión. La limpieza se efectúa reemplazando todo el medio de cultivo con medio fresco. Durante el cambio, las hydras flotantes se recuperan al filtrar el medio de desecho con un tamiz de 60 mallas. 292 Desinfección con iodo Proliferación Fig. 4.3.2. Preparación de Artemia para alimentación 5. Se recomienda realizar una limpieza intensiva una vez por semana. Para ello se deben desprender los organismos del fondo del recipiente frotando suavemente con el dedo medio de la mano, posteriormente se mueve el líquido generando un efecto de vórtice. Se espera a que las hidras se acumulen en el centro del recipiente y luego se las transfiere a un tamiz de 60 mallas (esta operación puede realizarse con ayuda de una pipeta volúmetrica de 100 mL en posición invertida). A continuación se procede a eliminar las impurezas retenidas por el cultivo mediante el enjuague con medio fresco. Los recipientes vacíos se lavan con abundante agua destilada hasta eliminar la película mucosa formada en el fondo. Terminada la limpieza, se colocan los organismos en un recipiente limpio con medio de cultivo fresco y se cubren permitiendo la entrada de aire (Johnson et al., 1990) (Figura 4.3.3.). 293 Limpieza cotidiana Limpieza intensiva Desprendimiento de hidras y tamizado Fig. 4.3.3. Limpieza de Hydra attenuata Control del cultivo Antes de iniciar las pruebas de toxicidad, es importante verificar si la salud de las hydras y el desarrollo del cultivo están en condiciones óptimas. Para ello, se recomienda evaluar bajo las condiciones prevalentes en el laboratorio la tasa de crecimiento del cultivo. Para determinar la tasa de crecimiento, se coloca en un recipiente pequeño con suficiente medio de cultivo 5 organismos de similar tamaño, que presenten una gema. En una hydra adulta cada hidrante está localizado en la cabeza del animal, como cada hydra seleccionada tiene una yema, el número de hidrantes al tiempo cero será igual a 10. Durante todo el período de evaluación, se debe realizar la limpieza y alimentación de forma rutinaria evitando que durante la manipulación se produzca la pérdida de hidrantes. Diariamente, durante un período de 5 a 6 días, se cuenta y registra el número de hidrantes con ayuda de una lupa estereoscópica (Fig. 4.3.1.) Para el cálculo de la tasa de crecimiento (k) se utiliza la siguiente ecuación: k = (ln 2) / T = 0.693 / T donde T es el tiempo, expresado en días. requerido para que la población se duplique (días). 294 Se sugiere que la determinación de la tasa de crecimiento (k) se realice de forma periódica. En general los valores de k varían entre 0.3 y 0.4. En caso de obtenerse valores menores al mencionado intervalo, es necesario efectuar acciones correctivas sobre la alimentación y limpieza del cultivo a fin de lograr el crecimiento óptimo (Trottier et al., 1997). En la tabla 4.3.2. se resumen las condiciones de cría y mantenimiento de los organismos. Tabla 4.3.2. Resumen de las condiciones recomendadas para el mantenimiento de cultivos de Hydra attenuata 1 Temperatura 2 Calidad de Luz 3 Intensidad Luminosa 4 Fotoperíodo 5Recipientes Mantenimiento 6 Alimentación 7 Dosis de Alimento 8 Densidad Poblacional 9 Limpieza 21 ± 2oC Fluorescente, blanco-frío < 800 lux (luz blanca fría) en la superficie del liquido 16 horas luz - 8 oscuridad de Circulares de vidrio transparente de 20 cm de diámetro de fondo plano, tipo refractario. Deben permanecer cubiertos con un vidrio o papel de modo que se permita la entrada de aire. 4 días por semana alimentar con nauplios de Artemia sp, desinfectados con solución iodada. No requiere de control estricto, sólo la adición de 2 a 3mL de medio de hydra conteniendo una nube densa de artemias eclosionadas a cada recipiente de cultivo y homogeneizar su distribución para que cada hydra pueda tomar entre 1 y 6 nauplios. No requiere control estricto. Sólo requiere cuidado iniciar un nuevo recipiente cuando se observa una cobertura densa de hydras en el fondo y demasiados organismos libres flotando en el medio. Diaria; con dos recambios de medio: el primero 2 horas después de la alimentación, y el segundo 4 ó 5 horas más tarde. Recuperar organismos flotantes con tamiz de 60 mallas. Semanal; desprendimiento de organismos del fondo, recuperar con tamiz y transferir a recipientes limpios con medio de hidra fresco. 4.3.4 Procedimiento de la Prueba Preparación de la muestra: En caso de muestras acuosas, excepto soluciones de compuestos químicos puros, debe filtrarse un volumen aproximado de 150 mL de muestra a través de una membrana de 0,22 μm. 295 Preparación de diluciones: Para la realización de pruebas se recomienda trabajar con un mínimo de siete diluciones seriadas de la muestra problema, y una concentración del tóxico de referencia (ver capítulo 6). Para las pruebas preliminares con compuestos tóxicos puros o muestras ambientales, se recomienda emplear una serie de diluciones logaritmicas (100; 10; 1; 0,1; etc), e identificar posteriormente el intervalo de concentraciones conveniente en el que deberá desarrollarse la prueba definitiva. Para el control negativo, medio de dilución para la preparación de las diluciones de la muestra, y la del tóxico de referencia (sea Cr VI o NaCl), emplear agua dura reconstituida sin ningun suplemento. Ver fórmula del agua de dilución. en el protocolo de prueba para Daphnia magna (Numeral 4.2.3). Sistema de prueba: Las pruebas de toxicidad se llevan a cabo en micro placas de cultivo celular de 12 pozos (Figura 4.3.4.). En ellas se preparan tres réplicas por cada concentración de la muestra o del control positivo y tres más para el control negativo. El llenado de los pozos se efectúa adicionando un volumen de 4mL, se inicia con los tres pozos o réplicas del control negativo y se continúa con las diluciones de la muestra, comenzando con la de menor concentración. En paralelo, se adiciona un volumen de 3 a 4 ml de cada solución en cajas Petri de 35 x 10 mm. Incremento de la concentración de la muestra ( % v/v) Control negativo 1.56 3.125 6.25 12.5 25 50 100 R E P L I C A S Transferir de 10 a 15 hidras a cada caja de Petri y posteriormente tres a cada pozo Fig. 4.3.4. Disposición de las concentraciones de prueba en el ensayo y transferencia de organismos Transferencia de hydras: 1. Se selecciona un grupo de organismos mantenidos sin alimentación durante 24 h. Se elimina el medio de cultivo invirtiendo el recipiente y descartando el líquido, 296 los organismos permanecerán adheridos al fondo del recipiente, a continuación adicionar un volumen de medio de cultivo de hydra sin ácido etil-diaminoacético (EDTA). 2. Se resuspenden los organismos y se concentran en el centro del recipiente utilizando el mismo procedimiento indicado para la limpieza intensiva. En este procedimiento se omite el empleo del tamiz para retener a los organismos flotantes ya que puede producirse daño de la epidermis y causar hipersensibilidad de los organismos durante la prueba. 3. A continuación, se colocan las hydras en un recipiente de 10 cm de diámetro con medio de cultivo sin EDTA, y con la ayuda de una pipeta Pasteur se transfieren de 10 a 15 organismos a cada una de las cajas Petri. Esta transferencia permite reducir el efecto de dilución producido por el medio de cultivo sobre la concentración de la muestra. Posteriormente se colocan tres hydras en cada pozo, evitando aquellas que presenten gemas (Fig. 4.3.4.). 4.3.5. Expresión de los Resultados La prueba se desarrolla por un período de exposición de 96 h. Cada 24 h se realiza la observación de los organismos con la ayuda de un microscopio estereoscópico o lentillas de acercamiento con capacidad de 6 a 10X, con la intención de registrar los cambios morfológico ocurridos. Dichos cambios se clasifican como se establece en la Figura 4.3.5. Tentáculos con bulbos (B) Hydra attenuata normal (N) Tentáculos acortados (C) (B-C) = Expresiones de subletalidad Estado de tulipán (T) Desintegración (D) (T-D) = Expresiones de letalidad Fig. 4.3.5. Microfotografías de Hydra attenuata mostrando los diferentes cambios morfológicos. a) normal, b) bulbo, c) acortamiento de tentáculos, d) estadio de tulipán, e) desintegración (Trottier et al, 1997) Al términar la revisión diaria, sumar el número total de hydras que presentan el mismo estado morfológico en los tres pozos correspondientes a cada dilución. Con los resultados formar tres grupos; el primero definido por el número de hydras normales, el segundo con organismos que presentan efectos reversibles (No. 297 bulbos + No. cortas), y el tercero con organismos que presentan efectos irreversibles (No. Tulipán + No. desintegradas). A partir de los resultados registrados, obtener para cada concentración el porcentaje de efecto subletal y letal. El primero se calcula a partir de la suma del número de organismos que presentan anomalías en su morfología ya sea del tipo reversible o irreversible y el porcentaje de letalidad se obtendrá a partir del número de organismos con anomalías exclusivamente irreversibles. Con estos datos se estiman los valores de CE50 o de CL50, según correponda, mediante los métodos estadísticos Probit, Promedios Móviles o Sperman y Karber, así como los valores de la LOEC, NOEC, y TOEC (Threshold Observable Effect Concentration, por sus siglas en ingles), este último se calcula según: TOEC = (NOEC x LOEC)1/2. En la Tabla 4.3.3 y la Figura 4.3..4 se resumen las condiciones recomendadas para las pruebas de toxicidad con H. attenuata. Tabla 4.3.3. Resumen de las Condiciones Recomendadas para las Pruebas de Toxicidad con H. attenuata 1. Tipo de Ensayo 2. Temperatura 3. Calidad de Luz 4. Intensidad Luminosa 5. Fotoperíodo 6. Volumen del Recipiente 7. Volumen de la Solución de Prueba 8. Características de los organismos 9. Densidad inicial de organismos 10. Número de Réplicas 11. Agua de Dilución 12. Factor de Dilución 13. Duración de la Prueba 14. Efecto Medido 15. Resultado Final 16. Aceptabilidad de los Resultados Estático 22 ± 2°C iluminación natural (cercana a una ventana) fluorescente o blanco-frío, ≤ 800 lux 16 h luz/8 h de obscuridad 5mL en placas estériles de 12 pozos 4,0 mL pólipos (hydras ) sin gemas, en ayuno de 24 h 3 hydras por pozo 3 Agua dura (sin suplementos) 0,3 ó 0,5 96 h , revisión cada 24 h. Cambios morfológicos. Número de organismos normales, con tentáculos con bulbos o acortados (reversibles), o sin tentáculos y pólipos desintegrados (irreversibles) CE50 para subletalidad y (CL50) letalidad Morfología normal en el 100% de los organismos en el control negativo Cr (VI) a partir de una solución de K2Cr2O7 17. Control positivo 298 REFERENCIAS Blaise, C., and T. Kusui. 1997. Acute toxicity assessment of industrial effluents with a microplate-based Hydra attenuata assay. Environm. Toxicol. Water. Qual. 12:5360. Campbell,R.D., and H. R. Bode. 1983. Terminology for morphology and cell types, p.5 – 14, In H. M. Lenhoff (ed) Hydra: Research Methods, Plenum Press, New York. Johnson, E. M., Gabel, B.E. G., Newman, L. M., and R. Giacobbe. 1990. The Hydra assay manual. A practical guide to supplies, techniques and mechanics of the assay. Department Anatomy, Daniel Baugh Institute, Jefferson Medical College, Philadelphia. PA, USA 19107. 96p. Trottier S., Blaise, C., Kusui T., Johnson E.M. 1997. Acute toxicity assessment of aqueous samples using a microplate-based Hydra attenuata assay. Environm. Toxicol. Water. Qual. 12:265-271. 299 4.4. ENSAYO DE TOXICIDAD AGUDA SEMILLAS DE LECHUGA (Lactuca sativa L.) CON MARIA CECILIA SOBRERO Centro de Investigaciones sobre el Medio Ambiente, CIMA, Universidad Nacional de La Plata. Argentina ALICIA RONCO Centro de Investigaciones sobre el Medio Ambiente, CIMA, Universidad Nacional de La Plata. Argentina 4.4.1. Principio 4.4.2. Reactivos y Materiales 4.4.3. Procedimiento para el Desarrollo de la Prueba 4.4.4. Expresión de los Resultados 4.4.5. Interpretación de los Resultados REFERENCIAS 4.4.1. Principio El bioensayo de toxicidad con semillas de lechuga (Lactuca sativa L.) es una prueba estática de toxicidad aguda (120 hs de exposición) en el que se pueden evaluar los efectos fitotóxicos de compuestos puros o de mezclas complejas en el proceso de germinación de las semillas y en el desarrollo de las plántulas durante los primeros días de crecimiento. Como puntos finales para la evaluación de los efectos fitotóxicos, se determina la inhibición en la germinación y la inhibición en la elongación de la radícula y del hipocotilo. Es importante destacar que durante el período de germinación y los primeros días de desarrollo de la plántula, ocurren numerosos procesos fisiológicos en los que la presencia de una sustancia tóxica puede interferir alterando la supervivencia y el desarrollo normal de la planta, siendo por lo tanto una etapa de gran sensibilidad frente a factores externos adversos (Figura 4.4.1). Por otra parte, muchas de las reacciones y procesos involucrados son generales para la gran mayoría de las semillas por lo que la respuesta de esta especie y los datos obtenidos a partir de la aplicación de esta prueba son en gran medida representativos de los efectos en semillas o plántulas en general. El éxito o aptitud de una plántula para establecerse en un ambiente determinado es de importancia relevante para garantizar la supervivencia de la especie. La evaluación del desarrollo de la radícula y del hipocotilo constituyen indicadores representativos para determinar la capacidad de establecimiento y desarrollo de la planta. 300 Fig. 4.4.1. Morfología de la semilla y la plántula de lechuga A diferencia de la prueba tradicional de germinación de semillas, la evaluación del efecto en la elongación de la radícula y del hipocotilo de las plántulas permite ponderar el efecto tóxico de compuestos solubles presentes en niveles de concentración tan bajos que no son suficientes para inhibir la germinación, pero que sin embargo pueden retardar o inhibir completamente los procesos de elongación de la radícula o del hipocotilo, dependiendo ello del modo y sitio de acción del compuesto. De esta manera, la inhibición en la elongación de la radícula e hipocotilo constituyen indicadores subletales muy sensibles para la evaluación de efectos biológicos en vegetales, aportando información complementaria a la proporcionada al estudiar el efecto en la germinación. Este ensayo puede ser aplicado para la evaluación de la toxicidad de compuestos puros solubles, de aguas superficiales (lagos, ríos), aguas subterráneas, aguas para consumo humano, aguas residuales domésticas e industriales, además de lixiviados de suelos, sedimentos, lodos u otras matrices sólidas (Bowers et al, 1997; Cheung et al, 1989; Dutka, 1989). A diferencia de otras pruebas en las que se consideran algas o plantas acuáticas sumergidas como organismo diagnóstico, el bioensayo con semillas permite evaluar la fitotoxicidad de muestras coloreadas o con elevada turbiedad de manera directa y sin necesidad de filtración previa, reduciéndose así las interferencias debidas al pretratamiento además de simplificar el procedimiento de prueba. Si bien L. sativa no es una especie representativa de ecosistemas acuáticos, la información generada a partir de esta prueba de toxicidad proporciona datos acerca del posible efecto de los contaminantes en las comunidades vegetales cercanas a las márgenes de cuerpos de agua contaminados, siendo también una especie interesante de considerar por su importancia desde el punto de vista hortícola. Por otra parte, es de fácil y rápida germinación por lo que es posible desarrollar la prueba en pocos días. 301 Este bioensayo de toxicidad ha sido recomendado y aplicado por diferentes organismos de protección ambiental para la evaluación ecotoxicológica de muestras ambientales y compuestos puros, además de la evaluación del efecto fitotóxico de pesticidas sobre especies no blanco necesarios para el registro de pesticidas (OECD, 1984, Wang,. 1987; USEPA, 1989; Boutin et al., 1993). En la incorporación de esta prueba en una batería de bioensayos es importante considerar el compromiso entre la sensibilidad de la especie L.sativa, el reducido tiempo de exposición de la prueba con semillas, los bajos costos asociados y que no requiere equipamiento sofisticado, en particular en la aplicación a muestras ambientales o en el monitoreo de procesos de detoxificación, saneamiento, control de efluentes, o reuso de biosólidos. 4.4.2. Reactivos y Materiales • • • • • • • • • • • Material biológico: Semillas de lechuga (Lactuca sativa L var. mantecosa). Agua dura reconstituida (APHA, 1992). Para su preparación se recomienda utilizar reactivos Grado ACS y agua destilada en vidrio o Millipore Supera Q. Cápsulas de Petri de 100 mm de diámetro. Papel de filtro Whatman No. 3 (o equivalente), 90 mm de diámetro. El papel de filtro que se seleccione como sustrato de germinación debe tener las siguientes características: - Trama amplia y porosa que asegure una buena capacidad de retención de líquido. - Resistencia de la fibra del papel para que las radículas crezcan por su superficie sin atravesarlo, situación que dificultaría la remoción de las plántulas sin dañarlas. - Ausencia de residuos tóxicos (ej. blanqueadores). - Que no promueva el desarrollo de hongos (no asociados a las semillas). Matraces aforados de 50 mL Pipetas volumétricas de 1, 2, 5 y 10 mL. Regla u otro elemento de medición. Pinzas. Toallas de papel. Bolsas plásticas. Cámara oscura termostatizada (22±2 °C). Obtención, control y conservación de las semillas: La obtención de semillas de lechuga (L.sativa L. var. mantecosa) se realiza en semillerías locales, procurando que sean semillas sin curar (sin fungicidas o plaguicidas), con buen poder germinativo y baja variabilidad en la elongación de la radícula e hipocotilo. Los criterios de control del material biológico y del desarrollo de la prueba se describen en el capítulo 6. 302 Las semillas seleccionadas se almacenan fraccionadas a 4º C, en oscuridad y en ambiente seco. Conservadas en estas condiciones mantienen su vigor al menos durante 2 años. Un indicador de la reducción de la vitalidad y envejecimiento de las semillas es la reducción en el poder germinativo y el aumento en la variabilidad de las medidas de elongación de radícula e hipocotilo en el control negativo (Ver capitulo 6). En este caso se recomienda realizar las pruebas de toxicidad utilizando un nuevo lote de semillas. 4.4.3. Procedimiento para el Desarrollo de la Prueba Preparación de las diluciones: Para realizar una curva dosis respuesta se recomienda preparar un mínimo de 5 o 6 diluciones de la muestra o compuesto a estudiar de manera, que se obtengan valores de toxicidad intermedios entre el 100 y 0%. Para las muestras ambientales se recomienda el uso de un factor de dilución de 0,3 ó 0,5 para la preparación de la serie de diferentes concentraciones. El uso de un factor de 0,3 permite evaluar la toxicidad considerando el intervalo entre el 100% y 1% de la muestra realizando 5 diluciones (100%, 30%, 10%, 3% y 1%). Al aplicar un factor de dilución de 0,5, es necesario utilizar mayor número de diluciones para abarcar el mismo intervalo de concentraciones (100%, 50%, 25%, 12%, 6%, 3%, 1,5 %) pero se obtiene mayor precisión en los resultados. Para la preparación de cada dilución se utiliza agua dura reconstituida (es posible el uso de agua mineral dura para consumo humano), realizando el control negativo con el agua de dilución empleada. Para el caso de las muestras cuya toxicidad es desconocida, previo a la realización de la prueba definitiva, se sugiere hacer una prueba presuntiva (ensayo preliminar) utilizando diluciones logarítmicas (100,10,1,0.1,0.01) que permitan establecer el intervalo de concentración conveniente para obtener valores de efecto entre 100 y 0% necesarios para calcular la CI50. Con el fin de controlar la sensibilidad de las semillas, simultáneamente a la evaluación de la toxicidad de una muestra, debe realizarse un control positivo utilizando, por ejemplo, una sal de Zn(II) como tóxico de referencia. La concentración de prueba de este control es la correspondiente a la CI50 para el lote de semillas en uso (Ver capitulo 6). Protocolo de ensayo: En la Figura 4.4.2. y Tabla 4.4.1. se resume el procedimiento del ensayo de toxicidad aguda con semillas. • • Colocar en cada cápsula de Petri un disco de papel de filtro. Marcar correctamente cada caja con la dilución correspondiente, así como la 303 • • • fecha y hora de inicio y término del bioensayo. Saturar el papel de filtro con 4 ó 5 ml de la dilución evitando que se formen bolsas de aire. Con la ayuda de una pinza, colocar cuidadosamente 20 semillas, dejando espacio suficiente entre las semillas para permitir la elongación de las raíces. Tapar las cápsulas y colocarlas en bolsas plásticas para evitar la pérdida de humedad. Dado que algunas variedades de semillas de lechuga requieren oscuridad para que se produzca la germinación (semillas fotoblásticas negativas), las cajas de Petri deben cubrirse de la luz inmediatamente después de colocarlas en las cápsulas y durante el período de ensayo. Incubar por 120 horas (5 días) a una temperatura de 22 ± 2 ºC. Realizar repeticiones para cada dilución ensayada. Medida de los puntos finales de evaluación de la fitotoxicidad: Cada punto final se evalúa comparando el efecto generado en los organismos expuestos a la muestra con respecto a la respuesta en los organismos del control negativo sujetos a las mismas condiciones de ensayo, excepto por la ausencia de muestra. Terminado el período de exposición (120 hs), se procede a cuantificar el efecto en la germinación y en la elongación de la radícula y del hipocotilo. Efecto en la germinación: Registrar el número de semillas que germinaron normalmente, considerando como criterio de germinación la aparición visible de la radícula. 304 Figura 4.4.2. Esquema general del procedimiento de prueba de toxicidad con semillas 305 Tabla 4.4.1. Resumen de las condiciones recomendadas para las pruebas de toxicidad con Lactuca sativa L. 1. Tipo de ensayo Estático 2. Temperatura 22 ± 2°C 3. Calidad de luz Oscuridad 4. Volumen de solución de prueba 5. Agua de dilución 4 ml Agua dura reconstituída 6. Número de semillas por replica 20 7. Número de replicas 3 8. Duración de la prueba 120 h 9. Efecto medido Inhibición en la elongación de la radícula e hipocotilo. Inhibición en la germinación 10. Resultado final 11. Aceptabilidad de los resultados 12. Control positivo CE50, o CI50 o % inhibición Germinación > 90% Control positivo y negativo de acuerdo a los valores admitidos en las cartas control Zn (II) Efecto en la elongación de la radícula e hipocotilo: Utilizando una regla o papel milimetrado, medir cuidadosamente la longitud de la radícula y del hipocotilo de cada una de las plántulas correspondientes a cada concentración de tóxico o dilución de muestra y a los controles. La medida de elongación de la radícula se considera desde el nudo (región más engrosada de transición entre la radícula y el hipocotilo) hasta el ápice radicular. La medida de elongación del hipocotilo se considera desde el nudo hasta el sitio de inserción de los dos cotiledones (Figura 4.4.3.). La figura 4.4.4. muestra los distintos estadios de la semilla durante la prueba de germinación y elongación. 306 Figura 4.4.3. Esquema de plántula de L. sativa al finalizar el período de exposición hipocotilo cotiledones Antes de retirar las plántulas de las cápsulas de Petri para evaluar el efecto en los puntos finales anteriormente mencionados, es importante realizar una observación detallada del estado general de las radícula mismas y del crecimiento de la radícula sobre el papel de filtro. Informar cualquier indicador de fitotoxicidad o de crecimiento anormal en las plántulas tratadas y en los controles (ápices radiculares con necrosis, pelos absorbentes poco desarrollados, radículas con crecimiento ensortijado, necrosis en los cotiledones, etc.). La necrosis (presencia de tejido muerto) se evidencia como manchas localizadas de coloración parda, blanca o marrón. Al evaluar el efecto en la germinación, consignar además aquellas semillas con germinación anormal (emergencia de cotiledones o cotiledones e hipocotilo solamente, pero sin emergencia de la radícula) o con desarrollo de hongos. Un procedimiento factible de realizar para facilitar la medición de la radícula e hipocotilo, es proceder a congelar las cápsulas de Petri correspondientes a todos los tratamientos y descongelarlas a medida que se van midiendo (no conservar el material luego de ser descongelado). De esta manera las plántulas descongeladas adquieren una consistencia blanda, favoreciendo la medición. Si se procede a evaluar el efecto sobre las plantas descongeladas es importante proceder de igual manera con todas las réplicas de la prueba. Este procedimiento reduce la variabilidad en las medidas, principalmente cuando el crecimiento de las radículas es ensortijado o no es parejo. Por otro lado, antes de congelar el material se debe realizar previamente la observación general de efectos fitotóxicos en las plantas vivas al finalizar el período de exposición. Control de calidad de la prueba: El ensayo deberá repetirse en caso de que los controles presenten: En el Control negativo: • • Porcentaje de germinación inferior al 90 %. Alta variabilidad en la elongación de la radícula (CV>30%) En el Control positivo: • • Porcentaje de germinación inferior al 90 %. Variación de la sensibilidad de las semillas fuera de lo permitido por las cartas control (Ver capitulo 6) 307 Fig. 4.4.4. Estadios por los que atraviesa la semilla durante el ensayo de germinación y elongación Posibles interferencias en el proceso normal de germinación o desarrollo de las plántulas en los controles: • • • • Toxicidad del sustrato: cuando se reemplaza el papel utilizado por otras marcas más económicas o se utiliza papel de filtro cualitativo en planchas, hay que tener en cuenta los posibles efectos tóxicos del papel. Si se ha tenido buenos resultados con una marca o calidad determinada de papel, es conveniente no variar el sustrato de ensayo. Suciedad de las cápsulas: si no es posible utilizar material descartable, es importante asegurar un enjuague minucioso del material para evitar la presencia de residuos de detergente u otra solución de limpieza. Exceso de agua o de muestra utilizada para embeber el papel, lo que determina una baja disponibilidad de oxígeno necesario para el normal desarrollo del proceso de germinación. El papel de filtro utilizado como sustrato de germinación de las semillas debe estar bien mojado, con sobrante de líquido para evitar la desecación, pero en ningún caso las semillas deben quedar sumergidas. Déficit hídrico durante el periodo de exposición: se recomienda envolver las cápsulas con una bolsa plástica para evitar que el papel de filtro de las mismas pierda agua durante el ensayo. Si se esta experimentando con compuestos volátiles, no deben colocarse en una misma bolsa cápsulas que correspondan a diferentes concentraciones de ensayo. También se puede colocar dentro de la cámara de cultivo un recipiente con agua para generar un ambiente húmedo, reduciendo así la evaporación. Hay que tener en cuenta que la pérdida de humedad de las cápsulas genera una concentración del tóxico cuya toxicidad estamos evaluando y por lo tanto, las conclusiones a las que arribaremos serán erróneas. 308 • • Exposición a la luz durante el proceso de imbibición: inmediatamente después de colocar las semillas sobre el papel de filtro, se recomienda tapar y envolver las cápsulas de Petri cubriéndolas de la luz (Para el caso de semillas fotoblásticas negativas). Temperatura de ensayo: las semillas de L. sativa expuestas a una temperatura superior (apenas unos grados) a la óptima para la germinación, no germinarán aunque se les coloque posteriormente a temperaturas inferiores (termodormancia o dormancia inducida por la temperatura). 4.4.4. Expresión de los Resultados Se realizan los siguientes cálculos: • promedio y desviación estándar de la elongación de la radícula y del hipocotilo de las plántulas de cada repetición. • porcentaje de inhibición del crecimiento de la radícula y del hipocotilo con el promedio de elongación para cada dilución respecto del promedio de elongación del control negativo. • porcentaje de inhibición en la germinación. Elaborar la gráfica dosis-respuesta colocando en la ordenada el porcentaje de inhibición y en la abscisa la concentración. Mediante un método gráfico o el uso de programas estadísticos, calcular la concentración que produce el 50% de inhibición (CI50/CE50) para cada punto final evaluado. Para el caso de muestras en donde la inhibición es inferior al 50%, o para determinar el valor correspondiente al NOEC o LOEC, se realiza el análisis de comparación de medias (t Student, Dunnett) para verificar la significancia estadística en el porcentaje de efecto. 4.4.5. Interpretación de los Resultados Los efectos cuantificados sobre la elongación de la radícula o del hipocotilo son efectos subletales. La inhibición en la germinación podría considerarse como un efecto letal siempre y cuando podamos corroborar que finalizada la exposición a una muestra las semillas no germinaron por muerte del embrión y que no existe simplemente un retraso en el proceso de germinación manteniéndose la viabilidad de la semilla. Al evaluar la fitotoxicidad de muestras ambientales complejas o con compuestos volátiles, en algunos casos se ha observado que al finalizar el período de exposición la inhibición en la germinación es elevada, pero si se extiende el período de ensayo, sin renovar la exposición a la muestra, las semillas comienzan a germinar. La vitalidad de las semillas que no han germinado es posible verificarla mediante la prueba de tetrazolium para viabilidad (Ellis et al., 1985), pudiendo de esta manera asignarle con certeza a la inhibición de la germinación, el valor e importancia de un efecto letal. No obstante esto, la inhibición en la germinación registrada al finalizar la prueba, se considera fitotoxicidad aunque el efecto en la germinación sea reversible. Otro aspecto a considerar es el mayor desarrollo en la elongación de la radícula o el hipocotilo en algunas muestras con respecto al control. La exaltación en un 309 punto final u hormesis no debe ser interpretada como un efecto favorable o estimulante. Si bien es posible que muchos compuestos (Ej.: Cu, Zn) a bajas concentraciones produzcan exaltación por ser micronutrientes vegetales, esta respuesta debe ser evaluada de manera conjunta con los efectos registrados en otras pruebas. En la aplicación de la prueba con semillas a muestras ambientales conjuntamente con otros organismos como parte de una batería, se ha detectado en diferentes ocasiones que la exaltación en la respuesta en el hipocotilo y/o radícula se corresponde con toxicidad frente a otros ensayos de la batería. REFERENCIAS APHA-AEEA-WPCF, 1992. Metodos Normalizados para el Análisis de Aguas Potables y Residuales. Ed. Diaz de Santos, S.A., Madrid. 1576 pp. Bowers N., Pratt J.R., Beeson D. & Lewis M., 1997. Comparative evaluation of soil toxicity using lettuce seeds and soil ciliates. Environ. Toxicol.and Chemistry 16(2), 207-213. Cheung Y.H., Wong M.H. & Tam N.F.Y., 1989. Root and shoot elongation as an assessment of heavy metal toxicity and “Zn Equivalent Value” of edible crops. Hydrobiologia 188/189, 377-383. Dutka B., 1989. Short-Term Root Elongation Toxicity Bioassay. Methods for Toxicological Analysis of Waters, Wastewaters and Sediments. National Water Research Institute (NWRI). Environment Canada. Ellis RH, Hong TD & Roberts EH, 1985. Handbook of Seed Technology for Genebanks. Vol.1 Principles and Methodology. International Board of Plant Genetic Resources, Rome, pp 210. Organization for Economic Cooperation and Development, 1984. Terrestrial plants: growth test. Guideline for testing of chemicals N ° 208. OECD Publications Service, Paris. USEPA, 1989. Protocols for short term toxicity screening of hazardous waste sites. US Environmental Protection Agency. 600/3-88/029, Corvallis. Wang W, 1987. Root elongation method for toxicity testing of organic an inorganic pollutants. Environmental Toxicology & Chemistry 6, 409-414. 310 I. Prueba de toxicidad aguda con Vibrio fischeri (Photobacterium phosphoreum), procedimiento al 100%. YOLANDA PICA GRANADOS GISSEL TRUJILLO DOMÍNGUEZ Instituto Mexicano de Tecnología del Agua, Cuernavaca, Morelos, México 1.1. Principio 1.2 Campo de aplicación 1.3 Definiciones 1.4. Reactivos 1.5. Materiales y Equipos 1.6. Procedimiento para el Desarrollo de la Prueba 1.7. Cálculos 1.8. Interferencias 1.9. Control de Calidad REFERENCIAS I.1 PRNCIPIO La toxicidad aguda de la solución de prueba sobre una población de 10 6 bacterias de la especie V. fischeri (bacteria bioluminiscente), se determina a través del cambio en la intensidad de luz emitida después de un período controlado de exposición. I.2 CAMPO DE APLICACION Estudios de toxicología acuática, control legal de descargas agrícolas, industriales y municipales, evaluación de procesos de tratamiento y estudios integrales de contaminación, donde para el análisis de toxicidad se requiera manejar una concentración inicial de la muestra del 100%. Este método puede emplearse también para el análisis de extractos orgánicos y elutriados de suelos y sedimentos o sustancias puras líquidas o sólidos solubilizables. 311 I.3 DEFINICIONES Estas definiciones han sido adecuadas a las necesidades del procedimiento. Bioluminiscente.- es un fenómeno en donde los organismos vivos emiten luz como resultado de procesos enzimáticos ligados a la respiración. Blanco.- es usado indistintamente con la palabra control. Concentración efectiva media (CE50).- es la concentración estimada de material que causa un efecto no letal detectado por la reducción del 50% de la intensidad luminosa generada por una población de 106 bacterias. Control.- Se asigna este término al lote o tratamiento, dentro del diseño experimental, que replica las condiciones que afectan al conjunto de tratamientos, excepto la sustancia o mezcla de ellas que son investigadas en la prueba. Cultivo.- conjunto de plantas o animales que se mantienen bajo condiciones definidas y controladas, para producir organismos saludables. Efecto tóxico agudo.- es aquel que es inducido y observado en un período corto, que puede ser de 5 a 30 minutos para el caso de V. fischeri. Este periodo de respuesta óptimo, está definido a partir de estudios previos basados en el conocimiento de biología bacteriana en conjunto a la química de los tóxicos. Se ha observado la existencia de procesos que facilitan el paso de tóxicos al interior de las células bacterianas, siendo más ágiles y rápidos los relacionados a compuestos orgánicos que los de incorporación de elementos metálicos (Bulich, 1979; Bulich et. al., 1981; Kaiser, 1984; Bulich, 1988). Liofilizado.- significa congelado y deshidratado al vacío, y es aplicado a la bacteria usada en la prueba Microtox, la cual está comercializada. Porcentaje (%).- es una concentración expresada en partes por ciento. Representa una unidad o parte del material (por ejemplo efluente, o agua receptora) diluida con agua a un total de 100 partes. Las concentraciones pueden ser preparadas en volumen-volumen o peso-peso y son expresadas como un porcentaje de material de prueba en la solución final. Toxicidad.- es la capacidad o potencialidad inherente de un material para causar efectos adversos en los organismos. El efecto puede ser letal o subletal. Prueba de Toxicidad.- también denominados bioensayos o ensayos de toxicidad, los cuales consisten en la exposición de organismos vivos a soluciones preparadas o muestras naturales con el fin de evaluar en ellas la presencia de algún compuesto tóxico a través de alteraciones de la vitalidad o funcionamiento metabólico de los organismos de prueba. 312 Tóxico de referencia.- sustancia química pura utilizada en ensayos de toxicidad para determinar la sensibilidad de los organismos de prueba y validar las mediciones de toxicidad. Agua desionizada.- es el agua que a través de purificación se le han removido los iones en solución, pasando a través de columnas de resina o sistema de ósmosis inversa. Análisis replicado.- es la prueba realizada a una muestra en dos o más ocasiones durante la misma sesión de trabajo. Blanco de pretratamiento.- Deberá entenderse como blanco de pretratamiento aquel que se prepara de la misma forma que las muestras pero sin contener a la muestra. Se realiza cuando las muestras son tratadas previamente al análisis de toxicidad y se elabora para evaluar en que medida el pretratamiento contribuye a la toxicidad de la muestra. I.4 REACTIVOS - Reactivo liofilizado (bacteria Vibrio fischeri liofilizada). - Solución diluente, para fase líquida. - Solución de ajuste osmótico - Solución de reconstitución I. 5. MATERIALES Y EQUIPO - Sistema Microtox ® Modelo 500 constituido por: Fotosensor (Luminómetro) Pozos de incubación con temperatura controlada de 15°C Pozo para reactivo reconstituido con temperatura controlada de 5°C (pozo de activación). - Congelador a una temperatura de –20°C. - Sistema de cómputo acoplado con: software MTX7, Probit u otro de utilidad, y hojas de cálculo. - Hielera y hielo o geles refrigerantes. - Pipetas automáticas de 250, 500 y 1000 µL (de volúmen fíjo o ajustable). - Pipeta automática de 10 µL o de repetición ajustable a medición de 10 µL. - Puntas para micropipetas. - Jeringas de 0.6 mL para pipeta de repetición. - Celdillas de vidrio borosilicato. 313 I.6 PROCEDIMIENTO PARA EL DESARROLLO DE PRUEBA Este protocolo es una versión ampliada y modificada por el Instituto Mexicano de Tecnología del Agua, basada en MICROBICS (1992) y en la Norma Mexicana NMX-A-112-1995-SCFI (1995). I.6.1 Obtención, manejo y transporte de la bacteria (Vibrio fischeri) La bacteria Vibrio fischeri, es abastecida por la representación en México de la empresa con derecho de patente y de comercialización de la tecnología. Durante su traslado debe conservarse siempre en congelación, de preferencia a una temperatura de -20 ± 4°C. El inadecuado manejo de las bacterias, afecta la sensibilidad de estos microorganismos y por consecuencia la confiabilidad de los resultados. Para el transporte de las bacterias, utilizar hieleras con geles refrigerantes, hielo o hielo seco, para mantener en frío a una temperatura de 4 ± 2 °C. De esta forma pueden permanecer hasta 8 horas. En caso de traslados breves puede emplearse bandejas con hielo o geles fríos 1.6.2. Preparación de la bacteria. Encender el equipo y permitir la estabilización automática de las temperaturas en los pozos de incubación (15 ± 1°C) y de activación (5 ± 1°C). El tiempo requerido es de aproximadamente 15 minutos, lo cual se verifica al apagarse en la pantalla del equipo, la señal de termómetro. Colocar 5 celdillas en los pozos de incubación del sistema Microtox® (ej. fila A). Colocar una celdilla en el pozo de activación del sistema Microtox® Agregar a la celdilla del pozo de activación, 1000 µL de solución de reconstitución. Dejar estabilizar por un tiempo aproximado de 5 a 10 minutos para que ésta alcance una temperatura de 5 ± 1°C la que será controlada internamente por el equipo. Sacar un frasco de bacteria liofilizada del congelador y manejar en frío hasta que de inmediato se vacíe en ella la solución de reconstitución mantenida en el pozo de activación a 5 ± 1°C y disolver. Estas acciones deben efectuarse rápidamente para evitar un efecto de choque osmótico a las bacterias. Transferir la mezcla nuevamente a la celdilla de activación y continuar su incubación a 5 ± 1 °C. Mezclar la bacteria, ya sea con ayuda de una pipeta automática, aspirando y eyectando la mezcla en la celdilla o por medio de agitación suave generando el efecto ligero de vórtice. Dejar reposar por un tiempo aproximado de 15 minutos con el propósito de que la bacteria se hidrate y revitalice. 314 1.6.3 Preparación de la prueba. Para muestras de agua epicontinental. Agregar 1000 µL de solución diluente en las celdillas A1, A2, A3 y A4 a la A4 indicadas en 11.2.2. Agregar 250µL de solución de ajuste osmótico y 2500 µL de la muestra a analizar. Mezclar por pipeteo absorbiendo y eyectando la solución 3 veces con ayuda de la pipeta de 1000 µL. Para muestras de agua marina y salobre Se requieren preparar dos sistemas de prueba, uno igual al de muestras de agua epicontinental (ver numerales 11.3.1-2), conteniendo 250µL de solución de ajuste osmótico y 2500 µL de la muestra de agua salina por analizar y otro preparado sin la solución de ajuste osmótico, es decir 2750 µL de la muestra por analizar. El empleo del análisis de la muestras con y sin ajuste osmótico nos es de ayuda para elegir el método de trabajo adecuado para las muestras por analizar, ya que cuando la adición del ajuste osmótico representa un exceso de sales para la bacteria los niveles de luminosidad adquieren valores significativamente más elevados que en el control y no es posible usar este sistema para la obtención de la CE, cuando esto sucede, generalmente el sistema preparado en ausencia de ajuste osmótico da lecturas útiles para los cálculos de la CE, o viceversa. En forma paralela, se prepararán muestras replicadas y de blancos de procedimiento, cuando este aplique, consideradas para el control de calidad analítico, así como muestras preparadas con tóxicos de referencia elaboradas con la adición de 250 µL de solución de ajuste osmótico y 2500 µL de la solución de fenol de aproximadamente 100 µg/mL. Elaborar una serie de diluciones transfiriendo 1000 µL de A5 a A4, de A4 a A3 y de A3 a A2, mezclando cada vez. Efectuar la transferencia en el orden indicado, con la pipeta automática de 1000 µL empleando una sola punta. Desechar 1000 µL de A2 y 750 µL de A5 para uniformizar volúmenes a 1000 µL. La celdilla A1 será considerada como control. Se emplearán las pipetas automáticas de 1000, 500 y 250 µL. Dejar estabilizar el aparato durante aproximadamente 5 minutos para que las soluciones alcancen una temperatura de 15 ± 1 °C 1.6.4 Preparativos para capturar los datos Una vez preparado el sistema experimental de prueba, se deben disponer las herramientas de captura de datos. Con este fin, puede emplearse el sistema en 315 línea de captación automática por software MTX7 o cualquiera otro de utilidad. De no ser posible el empleo del software integrado, se puede efectuar la toma de datos directa de la pantalla del Microtox y su registro en bitácora o a una hoja electrónica diseñada en Excell para la corrección de los valores de luminiscencia a porcentaje de efecto, (ver numeral 1.7). En el caso de toma directa de datos, los valores pueden ser ingresados manualmente al programa MTX7, Probit o cualquier otro de utilidad para el manejo de los mismos y el cálculo de la CE. En este caso, es importante el uso de un cronómetro o reloj, que permita el control del término del tiempo de exposición (ej: 5 o 15 minutos), para dar inicio a la lectura de cada celdilla. Al término del tiempo de exposición colocar la celdilla A1 (control) en el pozo de lectura y efectúe la autocalibración presionando el botón SET (aparecerán en la pantalla del equipo valores entre 90-100). Posteriormente oprima el botón READ. La lectura de la celdilla A1 aparecerá en la pantalla y deberá ser anotada en la bitácora o en la hoja de excell, en el sitio asignado para las lecturas de las celdillas control. Retire la celdilla A1(control) y continúe la lectura de las celdillas restantes o experimentales (ej: A2, A3, A4 y A5) iniciando con la de menor concentración, oprimiendo el botón READ del equipo cada vez. Ingrese una nueva celdilla para lectura de forma inmediata a la expulsión de la anterior, registrando los datos que aparecen en la pantalla del equipo. Al término de las lecturas, el analista efectuará el cálculo de la CE, ya sea ingresando los datos al programa MTX7, Probit o cualquier otra herramienta de utilidad a su alcance. I.7 CALCULOS Los resultados se expresan a través de la CE50 (concentración efectiva media) y las unidades pueden estar en porcentaje, mL/L o mg/L, Eq. mg/ml, o cualquiera otra unidad acorde con el tipo y manejo de muestra que se desee analizar. Los cálculos para la determinación de la CE50, así como la elaboración de la curva asociada pueden ser realizados a través de diversas herramientas como los software MTX 7 o el de mas reciente creación, ambos producidos por el fabricante de Microtoxo para el registro automático de datos. Estos programas despliegan la información en pantalla y después esta puede ser impresa. De no contarse con estos programas, también puede emplearse el programa Probit (versión US EPA 1.5 o cualquiera otro que pueda efectuar dicho análisis). En caso de emplear el Probit será necesario hacer la conversión de los valores de luminiscencia a porcentajes de efecto los cuales deberán ser capturados en el programa Probit en los espacios correspondientes al número de organismos afectados para cada dilución. 316 Para efectuar la corrección deberá hacerse lo siguiente 1) Tomar el valor de luminiscencia del control (si es solo uno) o promediar el valor de los controles (si se cuenta con más de uno) y hacerlo equivalente a 100% a través de una regla de tres (ver ejemplo). 2) Tomar el valor de luminiscencia de cada dilución para obtener su valor en equivalencia respecto al control de acuerdo a: Ejemplo de una dilución: Luminiscencia del control 96 100% Luminiscencia de la dilución 70 X Resultado X= 72.91 3) Restar de 100 cada valor de dilución obtenido de la corrección de acuerdo a : 100 - 72.91 = 27.09 El valor de 27.09 es el porcentaje de efecto que deberá ingresase al Probit como el número de organismos afectados. 4) Realizar este ajuste a cada una de las distintas diluciones I.8 INTERFERENCIAS Color en la muestra original y diluida. Si se sospecha de interferencia por color, hacer la corrección de la lectura siguiendo el numeral 11.5 de éste protocolo. Turbiedad en las muestras diluidas. Dejar sedimentar la muestra y emplear el sobrenadante. En caso en que la muestra contenga compuestos volátiles, es factible que la pérdida continua de estos agentes sean un factor de variabilidad que afecta la estabilidad de la respuesta y puede generar, en caso de análisis replicados, resultados poco consistentes. Para evitar dicha alteración se sugiere correr en paralelo a la muestra original, muestras aireadas, de modo que los resultados de toxicidad que así se obtengan corresponderán a la fracción soluble y no volátil de la muestra. Si es requerido conocer la toxicidad de muestras con carga volátil sin que esta sea removida, es importante tener en cuenta que los métodos biológicos como el de V. fischeri, Daphnia magna o Selenastrum capricornutum, entre otros, son de gran 317 utilidad para la detección de tóxicos solubles o solubilizados y los agentes volátiles no entran en estas categorías, principalmente por su corta persistencia en fase acuosa que limita el desarrollo de pruebas en sistemas abiertos cuya duración, que en términos generales, es mayor a 24h. En este sentido, la única prueba factible de ser aplicada para esta clase de agentes con V. fischeri, por su corto periodo (5 minutos) y por la posibilidad de manejarse en frío y en sistemas parcialmente cerrados. Estas propiedades, manejadas por técnicos con experiencia, pueden permitir lograr lecturas analíticamente confiables, sin embargo esta clase de análisis no se realizaran de rutina y deben ser protocolizados como investigaciones o procesos especiales dada la complejidad de su manejo y necesidad de ser interpretadas por gente especializada. 1.9 CONTROL DE CALIDAD Tóxicos de referencia. De acuerdo a Microbics Coo. (1992), actualmente “Strategic Diagnostics Incorporated (SDI)”, el Fenol es el compuesto utilizado como tóxico de referencia para la prueba con V. fischeri (P. Phosphoreum) y alternativamente pueden ser empleados otros compuestos cuya respuesta sea bien conocida, tal es el caso del Zn(II) o alguno otro. Sin embargo, en todos los casos los reactivos deberán presentar una pureza mínima del 99%. Preparación de la solución de Fenol Es necesario elaborar una solución de prueba de aproximadamente 100 µg/mL (ppm). Para su obtención se sugiere preparar una solución madre, colocando 0.1g del reactivo en un matraz volumétrico clase A de 100mL y aforar con agua destilada o desionizada para obtener una concentración de 1000µg/mL. A partir de ella pueden transferirse 10mL, medidos con una pipeta volumétrica clase A, a un segundo matraz volumétrico de 100mL (clase A) aforándolo con agua destilada o desionizada para obtener una concentración final de 100µg/mL (solución de prueba). Estas cantidades y forma de preparación podrán modificarse, siempre y cuando la concentración de la solución de la solución final no sea alterada. La solución de fenol deberá ser valorada de forma regular (por lo menos una vez cada tres meses), empleando el método de titulación con tiosulfato en su apartado de valoración de solución madre de fenol, al que se hace mención en la NOM-AA050 de la SCFI,2001. La soluciones deberán mantenerse en frascos ámbar o protegidos de la luz con cubierta de papel aluminio a 4 ± 2 ºC (refrigeración). En estas condiciones, la solución de prueba podrá preservarse por un promedio de 20 días o continuar su empleo siempre y cuando el valor de CE50 no exceda los límites del ámbito de respuesta preestablecido para el tóxico de referencia (13 a 26 µg/mL.) y/o su concentración, verificada a través de la valoración, no indique cambios relevantes . 318 Prueba con el tóxico de referencia. Para confirmar la sensibilidad y el estado fisiológico de los microorganismos (V. fischeri), se preparará una serie de 4 o 5 diluciones a partir de la solución de prueba de fenol, de acuerdo al numera 1.6.3 que contiene el protocolo de realización de la prueba de toxicidad. Los resultados de CE50 para el fenol, después de un tiempo de exposición de 5 minutos deberá ser de entre La prueba de verificación con tóxicos de referencia deberá realizarse al inicio de la sesión de trabajo y/o cuando se abra una nueva ampolleta correspondiente a un lote de bacteria distinto al que se ha estado trabajando. Carta control El valor de CE50 obtenido para el Fenol, al inicio de la sesión de trabajo, se marcará en la carta control para el tóxico de referencia en la cual se indican los límites máximos y mínimos ( ± 2ds) en que debe encontrarse la CE50 del tóxico seleccionado, construyéndose de esta forma un gráfico que puede también ser empleado como Gráfico de exactitud Análisis replicados. Estos se efectuarán a una de las muestras por grupo de muestras o en caso de que este contenga un número elevado de muestras (>30) a un 10 % de éstas. Los análisis replicados deberán realizarse a lo largo de la misma sesión de trabajo y bajo condiciones idénticas. Análisis de pruebas replicadas. Los resultados de CE50 obtenidos de los análisis replicados de una muestra serán sometidos a una prueba de significancia estadística para el análisis de las diferencias siguiendo el método indicado por Standard Methods, 1992. Blanco de procedimiento. Se incluirá un blanco por cada lote de muestras procesadas y sometidas a pretratamiento. La preparación del blanco variará de acuerdo a los procedimientos aplicados, como pueden ser extracción con solventes orgánicos o producción de elutriados , entre otros, sin embargo el efecto o toxicidad resultante del proceso de manejo de muestra y/o del uso de solventes en la prueba, no deberá exceder del 319 10% (Standard Methods, 1992) ya que de lo contrario pueden producirse interferencias importantes que alteren los resultados de la prueba. El análisis de toxicidad de los blancos de procedimiento deberá realizarse al igual que las muestras REFERENCIAS Bulich, A.A. 1979. Use of luminiscent bacteria for determining toxicity in aquatic environments, p. 98-106. In: L.L. Markings and R.A. Kimerle (ed.), Aquatic Toxicology. ASTM 667. American Society for Testing Materials. Bulich, A.A. , M. W. Greene, and D.L. Isenberg. 1981. Reliability of the bacterial luminiscence assay for determination of the toxicity of pure compounds and complex effluents, p. 338-347. In: D.R. Branson and K.L. Dickson (ed.), Aquatic Toxicology and Hazard Assessment: 4a Conferencia ASTM STP 737. American Society of Testing and Materials. Bulich, A. 1988. Analytical application of the MICROTOX system. Analytical Techniques and Residuals Management in Water Pollution Control Federation Specialty Conference, April 19-20, Atlanta. Kauser, K. L. E: 1984. Organic contaminants in the environment: Research Progress and Needs. Environm. Int., 10: 241-250. Environment Canada. (1992). Biological test method: Toxicity test using luminiscent bacteria (Photobacterium phosphoreum). Environmental protection Series. EPS 1/RM/24 November 1992. Standard Methods. 1992. For the Examination of Water and Wastewater. 18 th Ed. American Public Health Association. Ap. 8010G. pag 8-20-8-23. Microbics Corporation. (1992). Manual Microtox. Carlsbad, California, U.S.A. Part No. 55H550-1-5. Secretaria de Comercio y Fomento Industrial. 1995. Norma Mexicana NMX-AA112- SCOFI. Análisis de agua y sedimentos. Evaluación de toxicidad aguda con Photobacterium phosphoreum. Método de pruebas DGN. Pag. 36. 320 2. ENSAYO DE TOXICIDAD CON EL NEMATODO Panagrellus redivivus YOLANDA PICA GRANADOS Instituto Mexicano de Tecnología del Agua, Cuernavaca, Morelos, México 2.1. Principio 2.2 Campo de aplicación 2.3. Reactivos, Soluciones 2.4. Materiales y Equipos 2.5 Cultivo de los Organismos de Prueba 2.6. Procedimiento para el Desarrollo de la Prueba 2.7. Análisis de Datos REFERENCIAS 2.1 . PRINCIPIO Panagrellus . redivivus es una especies dioica y ovovivípara. El primer estadio de desarrollo ocurre en el útero de las hembras y es denominado como J1, en el que se desarrolla la embriogénesis con una duración aproximada de 20 hrs. Cuando el estadio J1 muda, da lugar a la los juveniles o J2 que emergen del huevo y son expulsados por la vulva de la hembra como libres nadadores ( figura 1) Fig. 1. Microfotografía de Panagrellus redivivus 321 Fig. 1. Microfotografía de Panagrellus redivivus Los recién nacidos (J2) continúan su crecimiento pasando pon dos estadios juveniles más, J3 y J4 hasta alcanzar el estado adulto a las 96 h posteriores a su nacimiento. Cada estadio se caracteriza por la longitud del organismo (Burke D.J. y Samoiloff M. R. 1980., Samoiloff M.R. et. al. 1980 ), ámbito que esta bien definido para P. redivivus. (tabla 1 ), sin embargo bajo condiciones adversas del medio de vida los organismos responden ya sea muriendo o mostrando alteraciones en su periodo de desarrollo. Las manifestaciones de efecto se determinan por el monitoreo del crecimiento de una población de 100 organismos en estadio J2 a lo largo de un periodo de 96 h. A partir de su seguimiento es posible determinar efectos letales, a través del número de organismos muertos, así como efectos subletales crónicos y de genotoxicidad, a través del número de organismos estancados en etapas retardadas de desarrollo (J2, J3 y J4), o en caso de alcanzar etapas adultas también se pueden evaluar efectos de mayor escala temporal a través del por el número de hembras grávidas y el número de sus huevos 2.2 CAMPO DE APLICACIÓN El nematodo de la especie Panagrellus redivivus es un organismo de prueba aplicable al biomonitoreo de aguas y sedimentos. Se ha usado para la detección de toxicidad de muestras ambientales complejas como son aguas residuales, suelos, sedimentos y lodos contaminados, ya sea a través del análisis de fracciones químicas obtenidas a partir del pretratamiento de muestras, a través de la obtención de elutriados y/o extractos ( Samoilof et al 1983, Ongley et al , 1988). 2.3 REACTIVOS, SOLUCIONES Y CULTIVO DEL ORGANISMO DE PRUEBA Todos los reactivos utilizados deben tener calidad ACS, o al menos de 99% de pureza. Para su preparación se emplea agua Tipo II destilada o desionisada (ASTM, 1983). Buffer M 9 Es una solución buffer no nutritiva empleada durante la transferencia o inoculación de P. redivivus a medios de cultivo masivo o de aislamiento y producción de J2 . Provee solo condiciones estándar del ambiente de vida adecuado para los nemátodos, se compone de : 322 1 2 3 4 5 Compuesto Fórmula Masa en gramos (g) o Volumen (mL) de solución stock Fosfato de sodio dibásico Fosfato de potasio monobásico Cloruro de sodio Agua Destilada (tipo II, ASTM 1983) Autoclavear la anterior mezcla y después agregar : Sulfato de magnesio solución 1M (12.034 g/100mL) Na2HPO4 •7H2O KH2PO4 Na Cl H2O 6.00 3.00 5.00 1000 Mg SO4 1 .00 Mezclar los reactivos señalados uno a uno en el orden señalado, disolver y autoclavear a 121°C durante 15 minutos . El buffer M-9 es un líquido no nutritivo usado para lavar animales limitando su crecimiento y dando un medio ambiente estándar. En el caso que se observara precipitación de las sales después de autoclavear se puede esterilizar el medio por filtración utilizando una membrana de 0.22 μ. Solución de colesterol P. redivivus requiere esteroles para lograr su maduración, esta solución proveerá la cantidad necesaria para todos los medios relacionados con su crecimiento. La solución se prepara mezclando 1g de colesterol en 10 ml de etanol. Se debe calentar suavemente, mezclando hasta que el colesterol se disuelva. Esta solución provee los esteroides requeridos en el medio de crecimiento. Medio Harina – agua para cultivo masivo Se emplea para mantener los cultivos en stock Su elaboración consiste en mezclar 100 g de harina, preferentemente de trigo, de producción orgánica y poco refinada, en 100 mL de agua desitiada. L mezcla se vacía en un frasco de boca ancha evitando ensuciar sus paredes y se cubre con un plato de caja de Petri . Esta mezcla se autoclavea a 121 °C por 15 minutos. 323 Fig. 2 Cultivo masivo de Panagrellus redivivus Medio Agar - Agua Medio útil para mantener los cultivos stock para la reproducción de hembras grávidas y posterior obtención de organismos en estadio J2 . En 1000 ml de agua destilada mezclar 17 g de Agar bacteriológico (Oxoid No.3 o Bioxon). Una vez disuelto el agar, autoclavear la mezcla por 15 minutos a 121°C. Después, agregar 0.5 ml de la solución de colesterol al agar caliente agitándolo para evaporar el etanol. Dejar entibiar y vaciar aproximadamente 20 ml de en cajas de Petri de 100 mm. Las placas pueden mantenerse en refrigeración hasta su inoculación con nematodos. Después de enfriar y solidificar las placas se almacenan en un refrigerador. Figura. 2 . Medio Agar-agua. Para reproducción posterior aislamiento de J2 de hembras grávidas y 324 Suspensión de levadura Disolver 50 mg de levadura en 100mL de agua destilada, distribuir 4 mL en una serie de viales o tubos de 7 mL y autoclavear durante 15 min a 121° C. Esta suspensión es usada como una fuente de comida para cultivos en crecimiento. Medio de crecimiento M9Y Es un medio limitado en nutrientes que se emplea como medio de dilución durante la preparación del sistema de prueba. Se elabora mezclando 99 mL de buffer M 9 y 1 mL de suspensión de levadura. La solución se autoclavea por 15 minutos a 121°C. Posteriormente y antes de que se enfríe, agregar 0.05 mL de la solución de colesterol y agitar el agar para evaporar el etanol de dicha solución. Todas las soluciones y medios descritos pueden conservarse en refrigeración, a 4 ± 2 °C hasta por dos meses. 2.4. MATERIALES Y EQUIPOS Materiales • • • • • • • • • • • • • • • • Pipetas sexológicas de vidrio graduadas (1 y 10mL) Pipeta automática de 100µL con puntas estériles Pipeta automática de 100-1000 µL con puntas estériles Pipeta automática para tubo capilar de 25µL ( ej. Drummond serie 200 dialamatic) Pipetas Pasteur Puntas Geloader para pipeta Eppendorf Viales de vidrio borosilicato de 2.5 ml de fondo plano Bases para viales de 2.5 mL, pueden emplearse microplacas de 16 pozos sin tapa para tal fin. Recipientes para preparación de diluciones, pueden emplearse tubos de cultivo de 20 mL. Aro de soporte para mini tamiz y malla de nylon poliamida de 12 µm Aro de soporte para mini tamiz de 2 a 2.36 mm de maya (8 mallas ) para separación de material sólido (sedimento o suelos) en la lectura de pruebas 6 Cajas de petri de vidrio de 100 mm 6 Cajas de petri de vidrio de 35 x 10 mm Pipetas volumétricas de vidrio, clase A de 1 a 100 mL Matraces volumétricos de vidrio , clase A o de 10 a 1000 mL 2 Frascos de vidrio de 1L de boca ancha 325 • • • • • • 4 Botellas de dilución de 250 mL 1 Matraz Erlen Meyer de 1L autoclaveable Gasa y algodón Bulbos para pipetas Pincel de pelo natural con mango de madera (autoclaveable) Tubos de centrífuga de 50 ml de vidrio con tapa. Equipos • • • • • • • • • Microscopio estereoscópico con resolución de 10x/21 Retícula para lente ocular de 100 x 1 mm2 Balanza Analítica capas de medir 0.001 g calibrada Autoclave o similar Sistema de filtración Mechero o Campana de flujo laminar Base de agitación o Vortex (opcional) Controlador de temperatura ambienta o incubador (20 ± 2°C) Centrífuga con capacidad de 700 Gs 326 Figura 3. Materiales y preparación de prueba. Separación de J2 y colocación en viales con muestras para análisis. 2.5 . PROCEDIMIENTO PARA MANEJO DE CULTIVO Cultivo masivo . El cultivo de P. redivivus se mantiene en frascos con medio de harina- agua, el cual se inocula con una pequeña población (varios cientos de individuos en buffer M-9 utilizando una pipeta Pasteur, después de algunos días los enjambres de nematodos pueden ser observados en las paredes del frasco . Poblaciones muy grandes pueden ser mantenidas por varios días en este cultivo pero deberán ser preparados nuevos cultivos por lo menos una vez al mes. Cuando se tienen programadas una serie de pruebas es conveniente preparar una semana antes , el medio de cultivo A en cajas de Petri las cuales se inoculan con el nematodo de la forma mencionada , éstos organismos al reproducirse empezarán a hacerse visibles en la tapa de la caja de Petri de donde pueden lavarse con buffer M9 para obtener las hembras sin arrastrar restos de harina que interfieran en la prueba . Cultivos para pruebas de toxicidad. La prueba se inicia con organismos en estado de desarrollo J3 por lo que un día antes de cada prueba se separan hembras y se inoculan en placas de cultivo con medio agar-agua (P. redivivus) que contiene también colesterol, para tener un adecuado suplemento de animales J3 en un estado fisiológico similar. Los nematodos de un cultivo stock en caja de Petri son inundados con buffer M-9 y son pasados a través de un tamíz , en la maya de éste quedarán los organismos de 327 mayor tamaño los cuáles serán recuperados mediante un enjuague con buffer M-9 sobre una placa fresca de agar a una profundidad no mayor de 2-4 mm de buffer . Dentro de éstos adultos separados habrá muchas hembras grávidas, estas hembras producirán de 10 a 20 organismos J2 en un período de 12 hrs . Al día siguiente se tamizan nuevamente los organismos y se lavan con medio M-9 , pero ahora los organismos que se utilizarán serán los que pasan por el tamiz , ésta progenie definida en estado J3 será usada en el bioensayo. Se recomienda lavar perfectamente a las hembras y a los J3 con buffer M-9 (P.R) o medio K (C .E), a temperatura ambiente para remover los residuos de harina que pudieran tener. 2.6 PROCEDIMIENTO PARA DESARROLLO DE LA PRUEBA (ver figura 3) 2.6.1 Preparativos 2.6.1.1 Muestras líquidas Preparación de diluciones (ej : agua, extractos orgánicos y elutriados) Para bioensayos se preparan alícuotas de 10 ml. de material de prueba diluidas en M9-Y, con este fin pueden ser empleadas los siguiente principios de preparación Muestras acuosas ( la concentración mas alta podrá ser de solo el 10%) 1.0 ml de muestra + 9.0 ml. de M9-Y Extracto orgánico metanol (contenido máximo 3 % ) 0.3 ml. de extracto orgánico de la muestra en 9.7 ml. de M9-Y Extracto orgánico DMSO ( contenido máximo 1% ) 0.1 ml. de extacto orgánico de la muestra + 9.9 ml. de M9-Y Para cada serie de pruebas se debe preparar un serie del blanco l de procedimiento para cada medio empelado en la preparación de muestras ( ej. agua, metanol, DMSO ) en M9-Y a la misma concentración empleada en el montaje de las muestras por evaluar y un control con solo M9-Y. 328 2.6.2 Montaje del sistema de prueba 2.6.2.1 Muestras líquidas Bajo el microscopio y con la ayuda de una micropipeta Drummond con capilar y punta ( Eppenor geloader tips ) se toman 10 nematodos J2 y se colocan en cada 1 Mezcla 1:1 de harina se prepara cada 4-6 Stock Cultivo Masivo de Placas harina - 3 Sol. amortiguadora 2 2-3 semanas más observan los formando una red en la de la caja de Se inician cultivos cada semana en el centro de la caja de Petri con agua de 3-4 ml de nematodos en con M-9Y para tener un constante de nemátodos 4 Lavar los nematodos de la tapa caja de Petri con buffer M-9 tamíz con malla de 5 Sol. amortiguadora Los adultos que quedan en el tamíz muchas hembras grávidas, éstas se buffer M-9. para transferirlas a una agar-agua con buffer M-9 a una mayor de 2 mm. y se incuban 6 Adul Después de 12 hrs. se mezcla de adultos y J2 el tamíz para separar los adultos que quedan en el pueden usarse para iniciar cultiv J2 en 7 Con la ayuda del estereoscópico se selecciónan 8 10 J2 juveniles en cada Cuadrícula de 100 x 2 1 Registro de No. de longitud de los Adultos 750Despúes de 96 hs. vasos se abren y nematodos se microscó Se preparan 10 vasos cada control y cada J4 550J3 350- Muest Si es necesario, solvente en Cont (J2 en M9 329 Figura 3. Procedimiento para el desarrollo de pruebas recipiente de análisis que para el caso de muestras líquidas pueden ser recipientes de fondo plano de 2.5 ml para después agregar 0.5 ml de la muestra diluida a cada vaso, en caso de análisis de sedimentos se sugieren cilindros de polipropileno de palcas de 2.9 a 35 mm de base, fondo plano y un altura de 1-2.6 cm . Se hacen 10 réplicas para dilución de la muestra a probar así como para los controles y blancos mencionados, es muy importante que la gota en que se tomen a los diez nematodos sea lo más pequeña posible a fin de que la dilución de la muestra problema sea lo mínimo posible. Los animales se dejan crecer en los vasos bien tapados durante 96 h. con control de temperatura a 20 ± 2 ° C . Después de 96 h, los recipientes se abren y se registra el número de sobrevivientes en cada vaso. Los vasos se tapan y se colocan en agua caliente a 60°C por unos minutos, el calor mata a los nemátodos y provoca su estiramiento para una mejor apreciación de su tamaño, posteriormente se tiñen con una gota de rosa de bengala (0.5 g/L) referentemente, aunque también pueden emplearse otros colorantes como azul-algodón-lactofenol ó azul de metileno. La longitud debe determinarse de forma inmediata midiendo a través de un microscopio con reglilla ocular, se recomienda hacer la medición a un aumento de 1.6X . De esta manera se registra el número de animales en cada estadio de acuerdo al siguiente rango. Tabla 1. Longitud corporal de nematodos en las distintas etapas de desarrollo Etapas J2 J3 J4 Adulto Talla 250 a 350 μm 350 a 550 μm 550 a 750 μm 750 a 2000 μm 2.7. ANÁLISIS DE DATOS Los efectos sobre la sobrevivencia, el crecimiento y la maduración de la población expuesta a muestras problema son expresados como porcentajes en relación a los valores obtenidos para estos mismos parámetros en la población del control. 330 2.7.1 Sobrevivencia: Es el porcentaje de sobrevivientes en la población expuesta a una muestra que se sospecha tóxica, en relación a los sobrevivientes de la población control, este parámetro se estima a partir de : Sobrevivencia = 100 x ST SC donde ST es sobrevivientes de la prueba SC es sobrevivientes del control Para determinar si la diferencia de la sobrevivencia observada para la muestra problema es significativamente distinta respecto a la del control se calcula el valor de x2 de la siguiente forma : x² = ( ST - SC) ² SC Si x² es mayor a 5 indica que la letalidad es significativa. 2.7.2 Crecimiento. El segundo parámetro empleado es la inhibición del crecimiento, término que se aplica cuando un número significativo de animales en la prueba no alcanza el estadio J4 o el estado adulto. Su calculo se obtiene a partir de la siguiente expresión : Crecimiento = donde 100 x ( J4T + AT ) / ST ( J4C + AC ) / SC J4T y AT = J4 y adultos en la población prueba. J4C y AC = J4 y adultos en la población control. La determinación de la significancia de este parámetro respecto al los resultados observados para la población control se calculan también a través del análisis por x².. de modo que sea posible establecer la significancia de la inhibición o determinar estimulación del crecimiento x²= ( ( J4T + AT ) - ( J4C + AC ) ) ² ( J4C + AC ) 2.7.3 Maduración. La maduración, resulta de un desarrollo normal hasta el estadio de J4, sin embargo los nematodos no logran la maduración gonádica que les permite convertirse en adultos y avanzar con su reproducción 331 La evolución del estadio J4 a adulto requiere de la acción de esteroides y de la actividad genética. La inhibición específica de ésta muda sugiere la acción de agentes genotóxicos. Para el cálculo de este parámetro se emplea la siguiente expresión: Maduración = 100 x ( AT ) / ( J4T + AT) ( AC ) / ( J4C + AC) La significancia estadística de las diferencias entre al maduración ene le control y la muestra problema se calcula por x². a paritr de : x²= ( AT - AC )² AC Si x² es mayor a 5 indica un efecto significativo en la maduración. 2.7.4 Estado general de salud Es una valor sumario que relaciona los diversos parámetros y pone gran énfasis en la comparación del crecimiento y de la maduración. Para ello, se da a los diferentes parámetros un valor de peso ponderado que para la sobrevivencia es de 4, para el crecimiento de 2 y para la maduración de 1. Para su cálculo se emplea la notación siguiente Estado General de Salud = = 100 x ( 4 x ST ) + ( 2 x GT ) + MT 7 Donde ST , Gt y Mt representan las sobrevivencia , el crecimiento y la maduración . 2.7.7 Consideraciones para la aceptación de resultados Los resultados de la prueba deben ser ignorados y la prueba repetida si alguno de los siguientes puntos es observado : a) Si menos que el 90 % de la población control alcanza el estado adulto. 332 b) Si más del 10 % de la población control muere. c) Si hay crecimiento microbiano excesivo en el sistema de prueba. control)] x 100 REFERENCIAS Abdulrahman , M ., and M . R . Samoiloff . 1975 . Sex specific aging in the nematode Panagrellus redivivus . Can. J. Zool. 53 : 651-656 . 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Los organismos vivos integran el efecto tóxico por la exposición a diferentes xenobioticos o contaminantes ya que repoden de manera integral, en sus diferentes niveles de organización (subcelular, celular, tejidos, órganos y sistemas), al efecto adverso de compuestos químicos o mezclas de ellos. Los bioensayos proveen una medida más directa de la toxicidad ambiental relevante en los sitios contaminados que los análisis químicos, ya que se integra la repuesta de los factores ambientales y de los contaminantes Método Citotoxicidad Rojo Neutro-50 (Babich y Borenfreund, 1992) Fundamento Este ensayo se basa en la asimilación y retención del colorante la matriz lisosomal de las células vivas después de la incubación con agentes tóxicos. 335 Materiales y Reactivos Benzo (a) pireno Ácido acético Rojo neutro 50 µg/ml en sol. amortiguadora de fosfatos Azul de tripan al 0.2% Dimetil-sulfoxido (DMSO) Etanol absoluto Formol al 40 % Cloruro de calcio Medio RPMI-1640 Cajas Petri de 100 mm Frascos de vidrio con tapon de rosca de 100 ml Jeringa desechable de 10 ml Matraz Erlenmeyer de 100 y 250 ml Matraz Erlenmeyer con tapon de rosca de 50 y 125 ml Micropipetas de 50,500 y 1000 μl Pipetas graduadas de 1,5 y 10 ml Pipetas Pasteur Probetas de 50 y 100 ml Tubos con tapón de rosca de 120 mm Tubos de centrifuga de 15 ml con tapón de rosca Tubos de ensaye de 13x100 mm Vasos de precipitados de 50 y 100 ml Material biológico Celomocitos obtenidos de organismos adultos de la lombriz de tierra Eisenia foetida con clitelo en la parte anterior del cuerpo, con peso entre 300 y 600 mg 336 Instrumentos Agitador vortex. Balanza analítica Cámara de Neubauer Campana de flujo laminar Centrifuga Espectrofotómetro uv-visible Incubadora hasta 60°C Microscopio de contraste de fases Balanza analítica Campana de extracción Procedimiento Obtención de los celomocitos 1.- Se lava cada individuo en una sol. de NaCl al 4 % y se coloca sobre papel filtro humedecido con la misma solución. 2.- Se aplica masaje suavemente en los últimos segmentos de la región posterior del cuerpo. 3.- Se colocó cada individuo en una caja petri sobre un trozo de hielo, durante 2 min. 4.- Se practico una incisión superficial a nivel de la región abdominal, posterior al segmento donde se donde se encuentra el clitelo. 5.- El fluido celomico se extrajo por medio de un pipeta Pasteur y se colocó en 337 tubos de vidrio con 5 ml de sol. LBSS. 6.- Se lavo con sol. LBSS, centrifugando a 2000 rpm durante 10 min. a 4 º C 7.- El botón celular se resuspendió en 1ml ajustando a 106 células/ml Viabilidad celular 1.-Se mezclaron 0.1 ml de la suspensión celular con 0.1 ml de azul de tripan al 0.08 % en un tubo de ensayo y se agitaron. 2.-Se dejaron reposar durante 3 min, colocar 20 μl en la cámara de Newbauer con un cubre objetos sobrepuesto. 3.-Después se contó el número de células teñidas de azul en el cuadrante del centro y en los cuatro de las orillas. 4.- El número de células por ml es calculado multiplicando el promedio de los cuadrantes por el factor de dilución y por el volumen de la cámara 104. La viabilidad se calculó dividiendo el numero de células viables entre el total y multiplicado por 100. Viabilidad Celular =(No. de células no teñidas / No. de células totales) x 100 = Prueba de citotoxicidad con rojo neutro 1. Las pruebas preliminares o de tamiz, se realizan con el extracto del suelo contaminado a una concentración al 100%. 2. El extracto de diclorometano se concentra a sequedad y es disuelto en 1 ml de de DMSO y se preparan las diluciones en un volumen de 2.5 µl de DMSO. 338 3. Se coloca un testigo agregando del extracto de diclrometano. Y un control negativo en el que se adiciona medio RPMI-1640. 4. Se adicionan cada una de las disoluciones preparadas del extracto original en un intervalo de concentraciones amplio (en serie logarítmica), agitando suavemente. 5. En la campana de flujo laminar, utilizando tubos de ensayo, se adicionan 50 μl de la suspensión celular en cada uno de los tubos, se agregaron 2 ml del medio de cultivo RPMI 1640. Se incuban a 22 °C por 24 hrs en una atmósfera de CO2 al 5%. 6. Son reemplazadas con medio de cultivo con diferentes diluciones del tóxico a un volumen final de 2 ml se incuban a 22 °C por 24 hrs en una atmósfera de CO2 al 5%. 7. Se elimina el agente tóxico por centrifugación a 2500 rpm 5 min, se resuspenden las células en una solución amortiguadora de fosfatos y se vuelve a centrifugar. 8. Se resuspendieron en 2 ml de una solución del colorante Rojo Neutro (50 µg/ml) cada uno de los tubos. 9. Posteriormente fueron incubados 3 hrs en las mismas condiciones anteriores. Se eliminó el colorante por centrifugación a 2500 rpm durante 5 min y se resuspende el cultivo rápidamente, en una solución de amortiguadora de fosfatos. 10. Se agregaron 1.3 ml de una solución de ácido acético (1%)-etanol al 50% a cada tubo y se dejó a temperatura ambiente por 15 minutos. 339 11. En el sobrenadante se hace la lectura de absorbancia en un Espectrofotómetro de luz visible a 540 nm. El porcentaje de viabilidad se c calculó con las a absorbancia obtenida, tomando como referencia al testigo con 100 % de viabilidad y calcular la RN50 o CL50 , efectuando una regresión lineal entre las concentraciones y los porcentajes de viabilidad transformados a logaritmo. 12. Posteriormente se realizaron las pruebas definitivas utilizando un intervalo de concentraciones más reducido (en serie geométrica), seleccionando aquellos tratamientos en los que se observo efecto adverso, para insertar entre alguno de ellos, este nuevo intervalo de concentraciones (ejemplo:100,50,25,12.5,6.25,3.125 %). 13. Se elaboró la curva dosis-respuesta de las diferentes concentraciones en un intervalo reducido y se calcularon los valores de CL50, por medio del método de regresión logarítmica . Calculo de la CL50 Se utiliza el metódo Probit, también conocido como método de unidades probabilísticas, que es utilizado para evaluar la relación de dosis-respuesta de un contaminante sobre un organismo, medida en términos de la concentración letal media (CL50) y su precisión o intervalo de confianza. Asignando el valor Probit de tablas respecto del porcentaje de mortalidad obtenido para cada concentración. Después efectuar el análisis de regresión lineal mediante el método mínimos cuadrados y utilizando los valores obtenidos de la ecuación de la recta, calcular la CL50, considerando el valor de la “y” a la mitad del numero de individuos utilizados en cada lote o tratamiento. Y finalmente calcular el intervalo de confianza al 95 % por medio de la desviación estándar y el valore de tablas del estadístico de “t” de student. 340 Interpretación de resultados El resultado es un valor virtual obtenido estadísticamente, en términos de concentración, ya sea en mg/kg de suelo o de µg de algún compuesto HAP/kg de suelo, en base seca, este valor se relaciona de forma inversa con el potencial de toxicidad, es decir una sustancia es mas tóxica si requiere de una menor concentración para producir la letalidad o algún otro daño subletal. Para tal efecto se ha establecido una clasificación para asignar categorías de toxicidad en función de la concentración: Extremadamente tóxico <1 mg/kg Altamente tóxico 1 a 50 mg/kg Moderadamente tóxico 50 a 500 mg/kg Ligeramente tóxico 0.5 a 5 g/kg Prácticamente atóxico 5-15 g/kg Relativamente inocuo mas de 15 g/kg Tomado de Loomis, 1978 Este valor es de importancia relativa, es decir se utiliza de forma comparativa con los valores obtenidos de otras sustancias o mezclas y no se maneja como una constante biológica, ya que de acuerdo a las condiciones de la muestra es el valor que se obtiene de toxicidad. 341 Referencias - Babich H. and Borenfreund E., 1992. Neutral Red Assay for Toxicology in vitro.In In vitro Methods of Toxicology. CRC Press, Boca Raton, Florida, USA.pp. 238-248. - EPA, 1996. Earthworm subchronic toxicity test. Ecological Effects Test Guidelines. 712-C-96-167. OPPTS 850.6200, Washington DC, Abril 1996. - Loomis TA, 1978. Fundamentos de Toxicología. Ed. Acribia, 1ª ed. Zaragoza España. 274 pp. - OECD. 1984. Guideline for Testing of Chemicals. Eartworm acute toxicity test. 207, April. 342 Prueba de Germinación de semillas Autor: Raúl Uribe Introducción La contaminación del suelo por hidrocarburos del petróleo tiene un fuerte efecto adverso sobre las comunidades vegetales. Los hidrocarburos de bajo punto de ebullición del petróleo exhiben alto grado de toxicidad de contacto en las porciones frágiles o jóvenes de raíces y brotes después del derrame, sin embargo tienen poco efecto sobre las partes leñosas de arbustos y de arboles. Una de las etapas mas importantes del desarrollo de una planta es la germinación de las semillas y la emergencia del primer cotiledón. En la germinación ocurren cuatro procesos; a) la imbibición o toma física de agua, b) la formación de los sistemas enzimáticos e inicia la síntesis de proteínas y de RNA, c) emergencia de la radícula e d) iniciación del crecimiento. Método EPA-OPPTS 850.4200 Fundamento Las pruebas de germinación son importantes para la evaluación de suelo debido a que se observa el efecto que causa el tóxico en la promoción o inhibición del surgimiento radicular en la semilla a diferentes concentraciones del tóxico, siendo registrada la frecuencia del evento y cuando se registra el 50 % de la germinación en el testigo se da por concluido la prueba. La activación de la semilla es inhibida, ante la presencia de sustancias tóxicas, afectando la germinación de la misma. La división celular de los meristemos radiculares puede afectarse, retardando el proceso de mitosis o alterando el 343 proceso de alargamiento radicular, por lo que la fitotoxicidad de un compuesto puede ser determinada a través de la medición de éste parámetro. Materiales y Reactivos • Papel filtro Whatman de fibra de vidrio • Diclorometano grado HPLC (fco. c/4 litros) • Hipoclorito de sodio 5% • Agua destilada • Frascos de vidrio de 250 ml • Cajas petri de 210 mm • Papel Aluminio • Parafilm • Micropipetas (10-1000μl) • Pipetas serológicas de 1, 5 y 10 ml • Regla o Bernier • Probetas de 50 y 100 ml Material biológico Semillas certificadas de Allium cepa, Glycine max Instrumentos Cámara ambiental / Incubadora Balanza analítica Campana de extracción Procedimiento 1. Las pruebas preliminares o de tamiz, se realizaron con el extracto del suelo contaminado a una concentración al 100%. 344 2. Fueron seleccionadas y escarificadas las semillas con cloro al 5% durante 15 min, se enjuago con agua de la llave y al final con agua destilada. 3. Se colocaron discos de papel filtro Whatman de fibra de vidrio dentro de la caja petri de 110 mm, proporcionales al diámetro de la caja (aprox. 9 cm). 4. Se adicionaron 2 ml de cada una de las disoluciones preparadas del extracto original en un intervalo de concentraciones amplio (en serie logarítmica), distribuyendo de forma homogénea sobre papel filtro. 5. Como testigo positivo se utilizó una caja agregando 2 ml de diclorometano o del solvente utilizado para la extracción. Y como testigo negativo se adicionó agua destilada. 6. Se dejó evaporar el disolvente, durante 10min, dentro de la campana de extracción. 7. Se colocaron 10 semillas por cada caja, distribuyendo de tal forma que se permitiera un adecuado crecimiento. Efectuando 3 réplicas por tratamiento. 8. Se incubaron las semillas dentro de una cámara ambiental controlada a temperatura de 22 +2 ºC y en total oscuridad hasta que el 65% de las semillas del testigo negativo hayan germinado. 9. Se registró el número de semillas germinadas, siguiendo el criterio de germinación con radicula mayor de 5 mm. 10. Posteriormente se realizaron las pruebas definitivas utilizando un intervalo de concentraciones más reducido (en serie geométrica), seleccionando aquellos tratamientos en los que se observo efecto adverso, para insertar entre alguno de ellos, este nuevo intervalo de concentraciones (ejemplo:100,50,25,12.5,6.25,3.125 %). 11. Se elaboró la curva dosis-respuesta de las diferentes concentraciones en un intervalo reducido y se calcularon los valores de CL50, por medio del método Probit. Calculo de la CL50 Se utiliza el metódo Probit, también conocido como método de unidades probabilísticas, que es utilizado para evaluar la relación de dosis-respuesta de un contaminante sobre un organismo, medida en términos de la concentración letal 345 media (CL50) y su precisión o intervalo de confianza. Asignando el valor Probit de tablas respecto del porcentaje de mortalidad obtenido para cada concentración. Después efectuar el análisis de regresión lineal mediante el método mínimos cuadrados y utilizando los valores obtenidos de la ecuación de la recta, calcular la CL50, considerando el valor de la “y” a la mitad del numero de individuos utilizados en cada lote o tratamiento. Y finalmente calcular el intervalo de confianza al 95 % por medio de la desviación estándar y el valore de tablas del estadístico de “t” de student. Interpretación de resultados El resultado es un valor virtual obtenido estadísticamente, en términos de concentración, ya sea en mg de HTP/kg de suelo o de µg de algún compuesto HAP/kg de suelo, en base seca, este valor se relaciona de forma inversa con el potencial de toxicidad, es decir una sustancia es mas tóxica si requiere de una menor concentración para producir la letalidad o algún otro daño subletal. Para tal efecto se ha establecido una clasificación para asignar categorías de toxicidad en función de la concentración: Extremadamente tóxico <1 mg/kg Altamente tóxico 1 a 50 mg/kg Moderadamente tóxico 50 a 500 mg/kg Ligeramente tóxico 0.5 a 5 g/kg Prácticamente atóxico 5-15 g/kg Relativamente inocuo mas de 15 g/kg Tomado de Loomis, 1978 Este valor es de importancia relativa, es decir se utiliza de forma comparativa con los valores obtenidos de otras sustancias o mezclas y no se maneja como una constante biológica, ya que de acuerdo a las condiciones de la muestra es el valor que se obtiene de toxicidad. 346 Referencias - EPA 712-C-96-154 Abril 1996, OPPTS 850.4200. - Loomis TA, 1978. Fundamentos de Toxicología. Ed. Acribia, 1ª ed. Zaragoza España. 274 pp. - OECD. 1984. Guideline for Testing of Chemicals. Terrestrial Plants, Growth test. 208, April. - ISO. 1997. 11269 Soil Quality- Determination of the effects of Pollutants on Soil Flora. Part 1. Method for the Measurement of Inhibition of Root Growth. 347 Nombre Prueba de crecimiento de plantas terrestres y de alargamiento radicular. Introducción La fitotoxicidad generalmente se refiere a la manifestación o aparición de una o más respuestas adversas o desfavorables en las plantas, resultado de la exposición (por una o varias vías) a una sustancia o mezcla de ellas (Kapustka ,1998). La Fitotoxicidad de un xenobiótico, por tanto, es evaluada a través del análisis cualitativo y cuantitativo del efecto provocado en uno o más parámetros fisiológicos que se consideran relevantes o representativos. En este sentido, es común que las pruebas de fitotoxicidad estén orientadas a la valoración de: 1) la mortalidad (toxicidad aguda), 2) el índice de germinación, 3) la elongación radicular, 4 el crecimiento o producción de biomasa, 5)el contenido de clorofila y 6) la tasa fotosintética, principalmente. Método Combinación de los métodos OECD-208 y EPA-OPPTS 850.4200. Fundamento Comparado con los arboles y arbustos, las plantas herbáceas especialmente los pastos tienen características de rápido crecimiento característica que las hace excelentes organismos de prueba para la evaluación de los parámetros biometricos mencionados y ser utilizados como puntos finales de respuesta tóxica. En algunas plantas los hidrocarburos forman una película grasosa alrededor de la raíz, lo que impide la entrada de agua provocando un estrés hídrico que afecta algunas etapas de su crecimiento, vulnerables a las sustancias tóxicas. Con 348 efectos negativos en los parámetros biometricos ya mencionados (Ramanathan, 1996) El conocer los efectos fitotóxicos que provoca un compuesto, permite valorar y determinar los factores de riesgo asociados a su exposición así como el grado de tolerancia o sensibilidad de la planta examinada, lo cual, en conjunto puede aportar mayor certeza, aunque no contundente, para vislumbrar el impacto ambiental y, en un momento dado, poder también atribuirle a una especie el papel de bioindicador ambiental para un xenobiótico o conjunto de ellos en particular. Procedimiento 1. Se partió del intervalo de concentraciones obtenidas de la prueba de toxicidad aguda (CL50), de germinación para aplicar concentraciones similares o ligeramente por abajo de CL50. 2. Se seleccionaron y escarificar las semillas con cloro al 5% durante 15min, se enjuagaron con agua de la llave 10 min y al final destilada. 3. Fueron colocados 10 g de material inerte (agrolita) en un frasco de vidrio de 250 ml y se humedeció con 30 ml de agua destilada, alcanzando aproximadamente el 40 % de humedad. 4. Se adicionaron 2 ml de cada una de las disoluciones preparadas del extracto original en un intervalo de concentraciones amplio (en serie logarítmica), distribuyendo de forma homogénea sobre la agrolita en toda la base del frasco. 5. Como testigo positivo se utilizó un frasco agregando 2 ml de diclorometano o del solvente utilizado para la extracción. Y como testigo negativo se adicionó agua destilada. 6. Como testigo positivo se utilizó una caja agregando 2 ml de diclorometano o del solvente utilizado para la extracción. Y como testigo negativo se adicionó agua destilada. 7. Se colocaron 10 semillas por cada caja, distribuyendo de tal forma que se permitiera un adecuado crecimiento. Efectuando 3 réplicas por tratamiento. 8. Se incubaron las semillas dentro de una cámara ambiental controlada a temperatura de 22 +2 ºC y en total oscuridad hasta que el 65% de las semillas del testigo negativo hayan germinado. 349 9. Posteriormente se les aplico iluminación con lámparas luz de día (30 μmolm-2/s1 ) y con un fotoperíodo (16:8) luz/obscuridad. 10. Adicionar a las plantas diariamente 1ml de solución de agua destilada. 11. Se realizaron las observaciones diariamente de las plantas y se registraron anomalías (decoloración, necrosis de hojas, etc.). 12. Después de 14 días a partir de la germinación se da por terminada la prueba y se miden los parámetros de crecimiento: Biomasa, Longitud de tallo y raíz. 13. De ser necesario se realizan las pruebas definitivas en un intervalo de concentraciones más reducido. 14. Se elaboró la curva dosis-respuesta de las diferentes concentraciones en un intervalo reducido y se calcularon los valores de CE50 (Concentración efectiva cincuenta), por medio del método Probit. Calculo de la CE50 Se utiliza el metódo Probit, también conocido como método de unidades probabilísticas, que es utilizado para evaluar la relación de dosis-respuesta de un contaminante sobre un organismo, medida en términos de la concentración efectiva cincuenta (CE50) y su precisión o intervalo de confianza. Asignando el valor Probit de tablas respecto del porcentaje de mortalidad obtenido para cada concentración. Después efectuar el análisis de regresión lineal mediante el método mínimos cuadrados y utilizando los valores obtenidos de la ecuación de la recta, calcular la CE50, considerando el valor de la “y” a la mitad del numero de individuos utilizados en cada lote o tratamiento. Y finalmente calcular el intervalo de confianza al 95 % por medio de la desviación estándar y el valore de tablas del estadístico de “t” de student. 350 Interpretación de resultados Para la interpretación de resultados del EC50 se maneja en los mismos términos que la CL50, es un valor virtual obtenido estadísticamente, en términos de concentración, ya sea en mg de HTP/kg de suelo o de µg de algún compuesto HAP/kg de suelo, en base seca, este valor se relaciona de forma inversa con el potencial de toxicidad, es decir una sustancia es mas tóxica si requiere de una menor concentración para producir la letalidad o algún otro daño subletal. No se manejan valores de referencia por no ser una constante biológica y solo se puede interpretar en términos de comparación. Siendo de gran valía en el contexto de riesgo ambiental, la obtención de los percentiles del 1, 5 y10 %, que permiten obtener niveles de efecto umbral, además con la pendiente de la recta, poder estimar el margen de seguridad para el tóxico o contaminante en cuestión. Reactivos y materiales. • Agrolita • Diclorometano (fco. c/4 litros) • Agua destilada • Frascos de vidrio de 250 ml. • Parafilm • Micropipetas (10-1000μL) • Regla u otro elemento de medición (vernier) • Material biológico: Semillas certificadas de Allium cepa y Glycine max. 351 • Instrumentos: Cámara ambiental / Incubadora Balanza semianálitica Luxometro Higrómetro Timer Referencia: - EPA 712-C-96-154 Abril 1996, OPPTS 850.4200. - OECD Guideline for Testing of Chemicals. Terrestrial Plants, Growth test. 208 Abril 1984. -ISO 11269 Soil Quality- Determination of the effects of Pollutants on Soil Flora. Part 1. Method for the Measurement of Inhibition of Root Growth. 352 Método Microfluctuación modificado para determinar genotoxicidad en compuestos químicos puros y muestras ambientales Autor: Ana María Sandoval Villasana 353 INDICE 1 OBJETIVO ..............................................................................................................355 2 CAMPO DE APLICACIÓN ......................................................................................355 3 DEFINICIONES ......................................................................................................355 4 FUNDAMENTO.......................................................................................................356 5 EQUIPO ..................................................................................................................357 6 REACTIVOS ...........................................................................................................357 7 MATERIAL ..............................................................................................................366 8 INTEREFERENCIAS ..............................................................................................368 9 PRECAUCIONES ...................................................................................................368 10 DESCRIPCIÓN DE LA PRUEBA ........................................................................369 11 PROCEDIMIENTO ..............................................................................................369 12 RESULTADOS ....................................................................................................376 13 RECOMENDACIONES .......................................................................................378 BIBLIOGRAFÍA.............................................................................................................378 354 1 OBJETIVO Determinar la posible genotoxicidad y/o mutagenicidad de muestras ambientales empleando una versión modificada de la prueba de microfluctuación de Ames tradicional (Gee, et. al.,1998). 2 CAMPO DE APLICACIÓN La prueba de microfluctuación de Ames tradicional Ames (Ames et. al., 1975) se emplea en la evaluación de mutagenicidad y/o genotoxicidad de muestras ambientales (agua, aire, lixiviados de residuos sólidos, extractos acuosos, etc) asimismo en la detección y localización de fuentes potenciales de agentes genotóxicos. Este método tiene la ventaja de poder ser utilizado en muestras que presentan alta viscosidad, siendo en estos casos, el uso de la técnica de pre-incubación (Maron & Ames, 1983). 3 DEFINICIONES Para los efectos de esta prueba son adoptadas las siguientes definiciones: 3.1 ADN Ácido desoxirribonucleico. 3.2 Auxótrofico Organismo mutante que presenta exigencias nutritivas más allá de las presentadas por los organismos silvestres. 3.3 Operón Conjunto de genes que controlan la biosíntesis de una proteína. 3.4 Mutación Mecanismo biológico universal que promueve modificaciones genéticas en los organismos. A nivel molecular, hay una alteración de la molécula de ADN, resultando en la formación de proteínas alteradas o ausentes en el organismo que sufre una mutación. 3.5 Mutación rfa Mutación que causa modificaciones en la capa de lipopolisacaridos de la membrana celular bacteriana, propiciando una mayor permeabilidad de la célula a moléculas grandes. 3.6 Mutación uvrB Mutación causada por la delección de los genes responsables por la reparación de excisión, e igual impide a una bacteria reparar algunos tipos de daños causados al ADN, tornándose más sensible a agentes mutagénicos. Por razones técnicas, una delección del gene uvrB se extendió hasta el gen de biotina y, consecuentemente, las cepas se tornaron auxótroficas para biotina (bio-). 3.7 Plásmido pAQ1 Plásmido que contiene un gene para resistencia a tetraciclina y contiene una mutación hisG428 3.8 Plásmido pKM101 Plásmido que contiene un gen para resistencia a ampicilina. Su presencia confiere una bacteria con mayor sensibilidad a mutágenos. 3.9 Prototrofico Organismo de tipo silvestre. 12.6 p.a. Para análisis (o grado reactivo) 3.10 c.s.p. Cantidad suficiente para 4 FUNDAMENTO En este procedimiento se presenta una prueba alternativa a realizar completamente en medio líquido empleando una versión modificada de la prueba de microfluctuación de Ames tradicional, basada sobre puntos múltiples de color/no color (Hubbart, 1984). El bioensayo esta basado en la prueba de mutación génica reversa conocida como la prueba de Ames La prueba emplea cepas mutantes de Salmonella typhimurium, la mutación en el operón de la histidina codifica para la biosíntesis de la histidina. Cuando esta bacteria es expuesta a agentes mutagénicos, bajo ciertas condiciones de mutación reversa ocurre un cambio de auxótrofos aminoácido (histidina) a prototrofos. La prueba de microfluctuación ofrece ventajas metabólicas debido a que la concentración del material citosolico es constante (Gatehouse, 1990). 356 Las cepas de Salmonella typhimurium, fueron especialmente construidas, para detectar productos químicos que causan mutaciones génicas por dislocamiento del cuadro de lectura ("frameshift") o por sustitución de pares de bases del ADN. Para la detección de substancias promutagénicas, se incluye el ensayo de fracción microsomal de hígado de rata, un sistema de activación metabólica, que permite una evaluación de metabolitos de la sustancia de prueba. 5 EQUIPO 5.1 Agitador tipo vortex 5.2 Autoclave 5.3 Balanza analítica 5.4 Balanza granataria 5.5 Campana de seguridad biológica (cámara de flujo laminar vertical). 5.6 Congelador 5.7 Espectrofotómetro para medir densidad óptica a 600 nm 5.8 Incubadora bacteriológica 5.9 Incubadora con agitación orbital. 5.10 Potenciómetro 5.11 Refrigerador 5.12 Ultracongelador 6 REACTIVOS 6.1 Para la preparación de medios de cultivo y las soluciones empleadas en esta prueba, se requieren los siguientes reactivos 6.1.1 2-aminofluoreno 6.1.2 Acido cítrico (C6H8O7•H2O) p.a. 6.1.3 Ácido picrolónico 6.1.4 Agar 6.1.5 Ampicilina 6.1.6 Ácida de sodio (NaN3) 357 6.1.7 β–nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADP) 6.1.8 D-biotina 6.1.9 Caldo nutritivo N° 2 (OXOID 6.1.10 Cloruro de magnesio (MgCl2•6H2O) p.a. 6.1.11 Cloruro de potasio (KCl) p.a. 6.1.12 Dimetilsulfoxido 6.1.13 D-glucosa 6.1.14 Fosfato de sodio dibásico (Na2HPO4) 6.1.15 Fosfato de sodio monobásico (NaH2PO4) 6.1.16 Fosfato de potasio dibásico (K2HPO4) p.a. 6.1.17 Fosfato de sodio y amonio (NaNH4PO4•.4H20) p.a. 6.1.18 Fracción S9 – Homogeneizado de hígado de rata, inducido con Aroclor 1254, congelado, proveniente del Instituto de Investigaciones Biomédicas,. UNAM – Ciudad Universitaria, México D.F. 6.1.19 Glucosa-6-fosfato 6.1.20 Hidróxido de sodio 6.1.21 L-histidina HCl 6.1.22 Púrpura de bromocresol 6.1.23 Sulfato de magnesio (MgSO4.•7H20) p.a. 6.2 Los reactivos deben ser grado p.a. o bacteriológicos y de procedencia idónea, no deben presentar olor, color y consistencia alterada, deben estar libres de elementos bacteriostáticos inespecíficos, por ejemplo, carbohidratos inespecíficos 6.3 Preparación de Medios de cultivo 6.3.1 Agar nutritivo Formula: Nutrient Broth N° 2 (OXOID) Agar Agua destilada pH final después de la esterilización: 7.0 2.5.0 1.5.0 g 100.0 g mL Forma de preparación: Pesar los componentes y adicionar 100 mL de agua destilada fría, dejar en reposo durante aproximadamente 15 minutos. Agitar hasta una completa 358 homogeneización de los ingredientes. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Después de esterilizar, estabilizar el medio a una temperatura de 50 °C. Con todos los cuidados de asepsia, distribuir aproximadamente 24 mL en cajas de Petri esterilizadas. Las cajas de Petri que contienen agar nutritivo son almacenadas en refrigeración (4 ± 2 °C) durante un periodo de 14 días. 6.3.2 Caldo nutritivo Oxoid Formula: Nutrient Broth N°2 (OXOID) Agua destilada 2.5 g 100.0 mL Forma de preparación: Pesar el caldo nutritivo y disolver en 100 mL de agua destilada fría. Distribuir alícuotas de 5 mL en tubos de ensaye de 15 mm x 150 mm, con tapa de rosca. Posteriormente esterilizar a 121 °C durante 15 minutos, almacenar en refrigeración (4 ± 2 °C) durante un periodo de 30 días. 6.4 Soluciones 6.4.1 Solución de ampicilina 8 mg/mL Formula: Ampicilina Hidróxido de sodio 0.02 N c.s.p 0.08 g 10.0 mL Forma de preparación: Una solución de ampicilina debe ser preparada como sigue: a) Preparar una solución de hidróxido de sodio 0.02 N con la siguiente composición: Hidróxido de sodio (NaOH) Agua destilada 0.08 g 100.0 mL Para la preparación de esta solución, disolver el hidróxido de sodio en 100 mL de agua destilada esterilizada fría. b) Preparar la solución final disolviendo la ampicilina en 10 mL de solución de hidróxido de sodio 0.02 N. Esterilizar por membrana de filtración (0.45 μm), en un 359 vial con tapa de rosca, previamente esterilizado y envuelto en papel de aluminio. Los tubos que contienen una solución de ampicilina son almacenados en refrigeración (4 ± 2 °C) durante un periodo de máximo de 30 días. 6.4.2 Solución Vogel Bonner/Histidina/Biotina Formula: Glucosa Medio Vogel- Bonner “E” (10X) Solución de histidina/biotina 100.0 mL 100.0 mL 5.0 mL Esta solución se prepara como sigue: a) Preparar la glucosa de la siguiente manera: D-Glucosa Agua destilada 10.0 g 100.0 mL Pesar la glucosa y adicionar 100 mL de agua destilada fría. Agitar inmediatamente hasta disolución completa. Esterilizar en autoclave a 121 °C por 15 minutos. c) Preparar el medio de Vogel-Bonner “E” (50X) con los siguientes componentes: Sulfato de magnesio (MgSO4.•7H20) p.a. Acido cítrico (C6H8O7•H2O) p.a. Fosfato de potasio dibásico (K2HPO4) p.a. Fosfato de sodio y amonio (NaNH4PO4•.4H20) p.a. Agua destilada 10.0 g 100.0 g 500.0 g 175.0 g 1000.0 mL Pesar las substancias mencionadas arriba en las cantidades especificadas y disolver en 1000 mL de agua destilada fría. Distribuir en un frasco color ámbar y mantener a temperatura ambiente A partir de la solución preparada de Vogel-Bonner “E” (50X) tomar 10 mL y adicionarlos a 90 mL de agua destilada, obteniéndose una solución de VogelBonner “E” (10X). Agitar inmediatamente hasta disolución completa. Esterilizar en autoclave a 121 °C por 15 minutos. d) Juntar asépticamente los medios de glucosa, Vogel-Bonner "E" (10X) y adicionar asépticamente 5 mL de solución de histidina0.5%/biotina 5 mM (ver 6.4.3). Agitar suavemente y distribuir en frascos volúmenes de 20 mL son almacenadas en refrigeración (2 a 8 °C) durante un periodo de 14 días. 360 6.4.3 Solución Vogel Bonner/Biotina Formula: Glucosa Medio Vogel- Bonner “E” (10X) Solución de biotina 100.0 mL 100.0 mL 5.0 mL Se preparan los reactivos especificados y mezclan de acuerdo a lo especificado. 6.4.4 Solución de biotina Formula: D-biotina Agua destilada 0.0138 g 100.0 mL Forma de preparación: Pesar la D-biotina y disolver en 100 mL de agua destilada caliente (temperatura de ebullición). Distribuir volúmenes de 20 mL en frascos cubiertos con aluminio. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Los frascos son almacenados en refrigeración (4 ± 2 °C) durante un periodo máximo de 45 días. 6.4.5 Solución de histidina/biotina Formula: L-histidina HCl D-biotina Agua destilada 0.0117 g 0.0138 g 100.0 mL Forma de preparación: Pesar los componentes y disolver en 100 mL de agua destilada caliente (temperatura de ebullición). Distribuir volúmenes de 20 mL en frascos cubiertos con aluminio. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Los frascos son almacenados en refrigeración (4 ± 2 °C) durante un periodo de máximo de 45 días. 6.4.6 Solución de Púrpura de Bromocresol Púrpura de bromocresol (5’-dibromo-o-cresolsulfonaphaleno) Agua destilada 0.1 g 50 mL Forma de preparación: 361 Pesar y disolver en 100 mL de agua destilada. Distribuir volúmenes de 5 mL. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Los frascos son almacenados en refrigeración (4 ± 2 °C) durante un periodo máximo de 45 días. 6.4.7 Solución amortiguadora de fosfatos 0.2 M Fórmula. Solución amortiguadora A 81.0 mL Solución amortiguadora B 19.0 mL pH final: 7.4 Para la preparación de la solución, se procede como sigue. a) Solución amortiguadora A. Fosfato de sodio dibásico (Na2HPO4) p.a. Agua destilada c.s.p. 2.84 g 100 mL Disolver el fosfato de sodio dibásico en 100 mL de agua destilada fría. Esterilizar en autoclave a 121 °C por 15 minutos b) Solución amortiguadora B: Fosfato de sodio monobásico (NaH2PO4) p.a. Agua destilada c.s.p. 2.76 g 100 mL Disolver el fosfato de sodio monobásico en 100 mL de agua destilada fría. Esterilizar en autoclave a 121 °C por 15 minutos c) Mantener a) y b) en refrigeración (4 ± 2 °C) durante un periodo máximo de 60 días. d) Cuando se lleva a cabo el experimento juntar la solución stock A en la solución stock B 6.4.8 Solución de cloruro de potasio 1.65 M Formula: Cloruro de potasio (KCl) p.a. Agua destilada c.s.p. 20.5 g 100 mL Forma de preparación Disolver el cloruro de potasio en 100 mL de agua destilada. Esterilizar en autoclave a 121 °C por 15 minutos, almacenar en refrigeración (4 ± 2 °C) durante un periodo máximo de 60 días. 362 6.4.9 Solución de cloruro de magnesio 0.4 M Formula: Cloruro de magnesio (MgCl2•6H2O) Agua destilada c.s.p. 8.14 g 100 mL Forma de preparación Disolver el cloruro de magnesio en 100 mL de agua destilada. Esterilizar en autoclave a 121 °C por 15 minutos, almacenar en refrigeración (4 ± 2 °C) durante un periodo máximo de 60 días. 6.4.10 Solución de glucosa-6-fosfato 1M Formula: Glucosa-6-fosfato Agua destilada c.s.p. 0.282 g 1.0 mL Forma de preparación: Para la preparación de esta solución, disolver la glucosa-6-fosfato en 1 mL de agua destilada esterilizada. Esterilizar por membrana filtrante (0.45 μm) en un vial desechable previamente esterilizado. Los tubos con la solución son almacenados en congelador (-20 ± 2°C) durante un período máximo de 60 días. 6.4.11 Solución de NADP 0.1 M Formula: β–nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADP) Agua destilada 0.03827 g 5.0 mL Forma de preparación: Para la preparación de esta solución, disolver el NADP en 5 mL de agua destilada esterilizada. Esterilizar por membrana filtrante (0.45 μm) en un vial con tapa de rosca previamente esterilizado. Esta solución debe prepararse el mismo día y el volumen necesario que se va a requerir para el experimento. 6.4.12 Fracción S9 La fracción S9 – Homogeneizado de hígado de rata, inducido con Aroclor 1254, congelado, proveniente del Instituto de Investigaciones Biomédicas,. UNAM – Ciudad Universitaria, México D.F. Es mantenido en viales congelados a –70 ± 2°C en ultracongelador o a –195 °C en tanque de nitrógeno líquido durante tres años. Cuando este se va a requerir para un experimento únicamente se descongela la cantidad de viales necesarios si sobra volumen de esta fracción esta se desecha. Para emplearlo en la mezcla S9 este de ser esterilizado por membrana filtrante (0.45 μm) en un vial con tapa de 363 rosca previamente esterilizado. Esta solución debe prepararse el mismo día del experimento 6.4.13 Mezcla S9 4% La combinación de la fracción S9 y los cofactores se denomina mezcla S9 y en su preparación se utiliza la siguiente formula: Formula: Agua destilada Amortiguador de fosfatos 0.2 M Glucosa 6-fosfato Solución de NADP 0.1 M Solución de cloruro de potasio 1.65 M Solución de cloruro de magnesio 0.4 M Fracción S9 375 μL 500 μL 5 μL 40 μL 20 μL 20 μL 40 μL Forma de preparación: Esta solución debe ser preparada en una campana de flujo laminar y todos los componentes se deben mantener en baño de hielo. Adicionar los componentes asépticamente en tubos con tapón de rosca o matraces según el volumen que se vaya a preparar, tomando cuidado de que al adicionar los componentes en el orden presentado arriba (S9 al último) y manteniendo la solución final en baño de hielo o refrigerador a 4 ± 2°C hasta el momento de ser utilizado en la prueba. Al mismo tiempo, se debe hacer el control de esterilidad de cada solución tomando 10 μL de cada solución con una micropipeta y distribuir el volumen sobre una placa de agar nutritivo. Dejar que la gota se absorba en el agar Esta placa de agar nutritivo debe estar marcada previamente en la parte del fondo de la caja, con el nombre de cada una de las soluciones. Realizar por duplicado incubar en forma invertida las placas durante 24 horas a 37 ± 2°C. 6.4.14 Solución de azida de sodio 1 mg/mL Formula: Azida de sodio (NaN3) Agua destilada esterilizada 1.0 mg 1.0 mL Forma de preparación: Pesar 1 mg de azida de sodio, con mascarilla de protección respiratoria para pesar tóxicos y con guantes quirúrgicos, colocarlo en viales desechables estériles. Adicionar 1 mL de agua destilada esterilizada bajo condiciones asépticas. Almacenar los viales, en el congelador a –20 ± 2° por tiempo indefinido 364 6.4.15 Solución de 2-aminofluoreno 1mg/mL Formula: 2-aminofluoreno Dimetilsulfoxido 1.0 mg 1.0 mL Forma de preparación Pesar 1 mg de 2-aminofluoreno, utilizando mascarilla de protección respiratoria para tóxicos y con guantes quirúrgicos desechables, colocarlo en viales desechables. Adicionar 1 mL de dimetilsulfoxido bajo condiciones asépticas. Almacenar a –20 ± 2 °C por 18 meses. Las alícuotas de esta solución solo se descongelaran el día de la prueba. 6.4.16 Solución de Ácido picrolónico Formula: Ácido picrolónico Agua destilada esterilizada 1.0 mg 1.0 mL Forma de preparación Pesar 1 mg de ácido picrolónico, utilizando mascarilla de protección respiratoria para tóxicos y con guantes quirúrgicos desechables, colocarlo en viales desechables. Adicionar 1 mL de dimetilsulfoxido bajo condiciones asépticas. Almacenar a –20 ± 2°C por 18 meses. Las alícuotas de esta solución solo se descongelaran el día de la prueba. 6.4.17 Agua destilada Agua destilada pH 7.4 1000 mL a) Distribuir, en frascos de dilución, cantidades adecuadas para que el volumen final, después de la esterilización, sea de 100 mL ± 2 mL b) Tapar los frascos sin apretar y esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos c) Una vez fríos, apretar las tapas y almacenar a temperatura ambiente o en refrigeración a 4 ± 2 °C. 6.4.18 Preparación del medio de exposición con indicador Mezclar Asépticamente estos componentes en un matraz estéril de 50 mL como sigue: Solución de Solución Vogel-Bonner/Biotina (7.5 mL) + Solución de Púrpura de Bromocresol (12.5 µL) 365 NOTA: Para todas los medios de cultivo y soluciones se debe realizar una prueba de esterilidad de la siguiente manera: Después de ser preparadas, y antes de ser usadas, cualquier solución, y medios de cultivo, deben probarse de manera rutinaria en cuanto a la presencia de hongos/y o bacterias. La prueba consiste en que inmediatamente que fueron esterilizados. Se dejan estabilizar hasta temperatura ambiente. Posteriormente son incubados a 37 ± 2 °C durante 24 a 48 horas. Constituye una evidencia de la presencia de microorganismos cualquier turbidez en el caso de medios de cultivo líquidos o semisólidos así como en soluciones. Para el caso de medios sólidos hay contaminación cuando hay crecimiento de colonias en el agar. Si ocurre esto desechar y volver a preparar nuevamente material. Una contaminación puede ocurrir debido a fallas en el proceso de esterilización o contaminación después de la esterilización. 7 MATERIAL 7.1 Biológico Las cepas de Salmonella typhimurium TA98 y TA100 proceden del laboratorio del Dr. B.N. Ames (University of California, Berkeley, CA). 7.2 Cristalería 7.2.1 Matraces Erlenmeyers De borosilicato (pyrex) o de vidrio neutro, con tapa de rosca, no tóxica 7.2.2 Matraces para la preparación de medios de cultivo De borosilicato (pyrex) o de vidrio neutro, con capacidad de un litro. 7.2.3 Frascos para soluciones De borosilicato (pyrex) o de vidrio neutro, con tapa de rosca, no tóxica. 7.2.4 Pipetas Pipetas bacteriológicas, de 1 mL, 5 mL y 10 mL con graduación de 1/10. 7.2.5 Tubos de ensaye De borosilicato (pyrex) o de vidrio neutro, de medidas aproximadas de 13 x 100 mm y 15 x 150 mm, con tapón de rosca de material no tóxico. 7.3 Otros materiales 366 7.3.1 Asas de inoculación Con una longitud de 7 a 8 cm de diámetro de 0.5 mm. 7.3.2 Tubos criogénicos De polipropileno autoclaveables, con tapas apropiadas para congelar de –70 °C (ultracongelador) o –195 °C (nitrógeno líquido) para volúmenes máximos de 2 mL. 7.3.3 Mechero de Bunsen 7.3.4 Gradillas 7.3.5 Filtros para esterilización Del tipo swinnex, de polipropileno con diámetro de 13 mm o del tipo unidades de filtración, con diámetro de 47 mm. 7.3.6 Cinta indicadora de esterilidad 7.3.7 Lámpara germicida (UV) de 15 W. 7.3.8 Guantes quirúrgicos 7.3.9 Membranas de filtración estériles De acetato de celulosa, con poros de 0.45 µm y 0.22 µm 7.3.10 Microplacas de 24 pozos con capacidad para 3 mL por pozo, esterilizadas por radiación gamma. 7.3.11 Microplacas de 384 pozos con capacidad para 240 µL por pozo, esterilizadas por radiación gamma. 7.3.12 Micropipetas con capacidad para medir volúmenes de 10 a 100 µL, 100 a 1000 µL. 7.3.13 Papel filtro 7.3.14 Parafilm 7.3.15 Pipeteador 367 7.3.16 Pinzas 7.3.17 Porta-pipetas de acero inoxidable 7.3.18 Jeringas desechables 3, 5 mL La prueba debe de realizarse lo más rápido posible y las muestra deberá ser siempre mantenida en refrigeración (4 ± 2°C) hasta el momento de realizarla. El recipiente debe llenarse completamente para evitar la pérdida de volátiles. 8 INTEREFERENCIAS Verificar el pH de la muestra. En caso de que se presenten valores menores a 5.0 o mayores de 8.0, ajustar el pH a 7.0 antes de proceder a la filtración de la muestra. Presencia de sólidos suspendidos y microorganismos por lo que se debe proceder a la filtración de la muestra en membranas de acetato de celulosa de 0.45 μm, para obtener la esterilidad de la muestra. En el caso en que las muestras presenten mucho material particulado, es recomendable una pre-filtración con prefiltro. Verificar la esterilidad de la muestra en placas de agar nutritivo, inoculando 200 μL e incubándolas por 24 horas a 37 ± 2 °C. En caso de que la muestra presente contaminación, repetir el proceso de filtración. 9 PRECAUCIONES Entre las personas que trabajan en el laboratorio, aquellas que tienen menor tiempo de entrenamiento y las que están más directamente asociadas a las maniobras con el material contaminado, son aquellas que presentan mayores posibilidades de ser contaminadas accidentalmente. Una inhalación de los aerosoles, una aspiración de las soluciones contaminadas a través de pipetas y otros accidentes deben prevenirse por el uso de protectores faciales adecuados, pipeteadores y por la obediencia a las normas especificas relativas al trabajo y al uso del equipo. 368 Protector facial y máscaras de protección contra gases y tóxicos. De utilización obligatoria (en forma conjunta con los guantes adecuados) durante la preparación de soluciones de ácidos que son utilizados en el lavado de materiales, la forma de preparación de soluciones de compuestos mutagénicos y la manipulación de solventes. 10.1 Cuidados en la manipulación de cepas Salmonella typhimurium Salmonella typhimurium puede causar diarreas e intoxicación alimenticia cuando es ingerida. La baja virulencia presentada por estas cepas es debida a la presencia de mutación rfa. Como precaución rutinaria, se debe autoclavear cualquier material contaminado, antes de lavar o desechar. No se debe mantener ningún tipo de alimento en el interior de los refrigeradores, o donde se encuentran las cepas almacenadas, 10 DESCRIPCIÓN DE LA PRUEBA Aproximadamente 107 bacterias de his- son expuestas a cuatro concentraciones de la sustancia de prueba, además de incluir controles positivos y negativos, por 90 minutos en medio conteniendo suficiente histidina para mantener dos divisiones celulares. Después de 90 minutos, los cultivos de exposición son diluidos en un medio con indicador de pH, y distribuido en 48 pozos por concentración. En 48 horas, la células sufren una reversión a His. El número de pozos conteniendo células revertantes son contadas para cada dosis y comparadas con el control de dosis cero. Un incremento en el número de revertantes en la exposición de la sustancia de prueba relacionado al control de dosis cero indica que la sustancia de prueba es mutagénica en la prueba de Ames_microfluctuación. 11 PROCEDIMIENTO 11.1 Preparación de los inóculos de Salmonella typhimurium empleados en la prueba 11.1.1 Sembrar con la ayuda de un asa de inoculación calibrada, una pequeña cantidad del crecimiento del cultivo de la placa “maestra” en tres tubos que contienen 5 mL de caldo nutritivo estéril y previamente marcados con TA98, TA100 y blanco negativo. 11.1.2 Adicionar 10 μL de ampicilina (8 mg/mL) a los tres cultivos de prueba 369 11.1.3 Incubar a 37 ± 2 °C durante 16 a 18 horas, con agitación (150 a 170 rpm). 11.1.4 Una vez transcurrido el tiempo del tubo marcado como blanco tomar 1000 μL y colocar en la cubeta para espectrofotómetro. 11.1.5 De cada uno de los tubos marcados con las cepas TA98 diluir el cultivo de una noche 1:10 en caldo nutritivo (100 µL de cultivo bacteriano de una noche en 900 µL de caldo nutritivo) en una cubeta para espectrofotómetro. 11.1.6 Agitar para mezclar homogéneamente y tomar la lectura de DO600 de cada uno de los cultivos con las cepas 11.1.7 Multiplicar la lectura de DO600 por 10 para obtener la densidad óptica de los cultivos de una noche y registrar los valores. Cultivo de una noche TA98 TA100 Control negativo OD600 (X10) Rango aceptable Aceptación ≥2.0 ≥2.0 ∼0.0 11.1.8 Verificar que los valores de DO600 para las cepas TA100 y TA98 sea de al menos 2.0, y que los valores de DO600 del control negativo sea ∼0.0. Realizar el siguiente paso solo si este paso no es aceptado. 11.1.9 Si los cultivos de una noche no presentan una DO600 ≥2.0, no ha ocurrido el crecimiento suficiente de una noche. Verificar que las tapas hayan sido cerradas adecuadamente para permitir la aireación y que las cepas estaban almacenadas correctamente a –70 °C. Los tubos de cultivo pueden incubarse un tiempo adicional si así se requiere, pero no debe exceder un tiempo de incubación de 24 hrs. Si los valores de DO600 del control negativo es considerablemente mayor que 0.0, se debe a una contaminación y no se recomienda que sean utilizados los cultivos. 11.2 Forma de preparación de la mezcla S9 11.2.1 Preparar las cantidades adecuadas de la mezcla S9 conforme a recomendaciones en 6.4.11, inmediatamente antes del inicio de la prueba. 11.2.2 Mantener la mezcla en baño de hielo o refrigeración (4 ± 2°C) por no más, de cinco horas. 370 11.2.3 Observar los cuidados de asepsia durante la forma de preparación de la manipulación de la mezcla S9. 11.3 Controles negativos Los controles negativos consisten en el solvente utilizado para la disolución del producto químico o muestra de prueba. Utilizar el volumen equivalente en el mayor volumen de muestra probada. 11.4 Controles positivos Todo ensayo debe ser realizado incluyendo controles positivos para confirmar las propiedades de reversión de especificidad de cada cepa, bien como una eficiencia del sistema de activación metabólica. Recomendándose el uso de las substancias estándar descritas en la Tabla 1 pudiéndose emplear otros controles en las concentraciones adecuadas. TABLA 1 Controles positivos empleados en la prueba Prueba Sin activación (-S9) Con activación (-S9) Compuesto (b) Solvente Concentración por placa Cepas Ácido picrolónico DMSO (a) 100 μg TA98 Azida de sodio Agua destilada 5.0μg TA100 2-aminofluoreno DMSO (a) 10.0 μg TA98, TA100 Notas: a) DMSO - dimetilsulfoxido b) Las soluciones de los compuestos mencionados arriba deben ser manipulados con máximo cuidado de forma de evitar cualquier contacto con el operador. 11.5 Procedimiento para determinar el rango de dosis óptimo de una sustancia de prueba Si se prueba una sustancia por primera vez, se deben determinar los efectos de citotoxicidad y solubilidad en una prueba de depuración antes de realizar la prueba de microfluctuación. Para esta prueba debe utilizarse la concentración más alta del compuesto y evaluar si esta concentración es soluble en el solvente a utilizar. A través de la misma se evalúan los efectos citotóxicos de las concentraciones solubles. 371 Si el mismo cultivo de una noche es usado en la prueba de depuración y la prueba de microfluctuación modificada, ambas pruebas se pueden ejecutar el mismo día. 11.5.1 Preparación de las concentraciones estándar de la sustancia de prueba. 11.5.1.1 Se requiere preparar un estándar químico 25 veces más concentrado que la concentración más alta a ser usada en la prueba. para alcanzar la concentración 1X donde incluye la dilución en el cultivo de exposición. 11.5.1.2 Colocar siete tubos de ensaye y marcar del 1 al 7. 11.5.1.3 Transferir 100 μL de esta concentración 25X del estándar al tubo marcado como 7, este tubo se considerará como control positivo (+). 11.5.1.4 Adicionar 90 μL del solvente a los tubos 0 a 6 de la placa de la estándar químico. La concentración del solvente debe ser la misma en todos los tubos de la sustancia química del 0 a 7. Nota: los volúmenes adicionados a esto y el siguiente paso es dependiente del factor de dilución a ser usado. Se requiere 60 μL de cada concentración de la sustancia de prueba. Por consiguiente, planear los volúmenes a adicionar en estos pasos para que después que se realicen la serie de diluciones, debe haber suficiente volumen a dosificar. 11.5.1.5 Realizar diluciones seriales 1 a 10 de la sustancia de prueba transfiriendo 10 μL del pozo de la sustancia química del pozo 7 al 6, y mezclar pipeteando suavemente de arriba abajo. 11.5.1.6 Una vez que se tiene una solución mezclada uniformemente transferir 10 μL del compuesto químico del pozo 6 al pozo 5, y mezclar pipeteando suavemente de arriba abajo. 11.5.1.7 Completar la serie de diluciones de los pozos 5 a 4, 4 a 3, 3 a 2, 2 a 1. No transferir la sustancia química al pozo 0. El pozo 0 es la dosis control y debe contener solvente únicamente. Llenar la siguiente tabla con los estándar químicos y el solvente usado en las diluciones realizadas. 372 Químico: Solvente: ___________________ Conc. Inicial (25X) __________%S9: Pozo Concentración Conc. de exposición 1X 6 5 4 3 2 1 0 + TA98 + TA100 11.6 Preparación del cultivo de exposición para la depuración (Gee, et. al., 1994, 1998) 11.6.1 Adicionar 2.7 mL del medio Vogel-Bonner/histidina/biotina a un tubo de ensaye y 0.3 mL del cultivo de una noche de TA98 ó TA100; (agitar el contenido del tubo de cultivo antes de tomar el volumen indicado). 11.6.2 Marcar una placa de 24 pozos como “depuración”. Del tubo con el medio de cultivo y la bacteria transferir 240 μL a los pozos de las columnas 1A a 6D de la placa de exposición 11.6.3 Transferir 10 μL de los tubos con la sustancia de prueba marcados del (0 a 3) a la columna 1,3, y 5 de la placa de 24 pozos. Y de los tubos marcados como 4,5,6 y “+” a las columnas 2, 4, y 6. Cambiar las puntas en cada transferencia. 11.6.4 Una vez llenados los 24 pozos colocar la microplaca en la incubadora con agitación a 37 °C, 150-170 rpm durante 90 minutos. 11.6.5 Repetir los pasos 1 a 2 con la cepa TA100 en otra microplaca. Registrar el tiempo de incubación 11.6.6 Después de los 90 minutos de exposición, sacar la microplaca y comparar visualmente la turbidez de cada pozo. Las dosis no citotoxicas de la sustancia química de prueba deben estar turbias, como la dosis cero (tubo 1). Y las dosis altamente citotoxicas no presentan turbidez. 373 11.6.7 Finalmente las dosis de prueba son seleccionadas por las limitaciones de solubilidad. Seleccionar la concentración más baja de la sustancia química que presento citotoxicidad o la concentración de mayor solubilidad con respecto a la concentración más alta de la prueba. 11.6.8 A los pozos que presentan estas características adicionar 2.8 mL del medio Vogel-Bonner/biotina con indicador. 11.6.9 Marcar una microplaca de 384 pozos con la cepa a dosificar y la concentración de la sustancia de prueba. Colocar la placa de cultivo de exposición con los 24 pozos ocupados al lado de la primera placa de 384 pozos. 11.6.10 Deslizar la cubierta de la placa de cultivo de exposición de las cepas de los 24 pozos ocupados hasta dejar la columna 1 descubierta. 11.6.11 Usando una pipeta multicanal, mezclar la solución en los pozos de la columna 1 de la placa de 24 pozos pipeteando suavemente de arriba abajo. 11.6.12 Distribuir alícuotas de 50 μl en las primeras columnas 1 a 12 de la placa de 384 pozos. Cada punta especifica para cada pozo, así una transferencia completa requiere de llenar 48 pozos por concentración de la mezcla de la cepa y la sustancia de prueba. 11.6.13 Deslizar la cubierta de la placa de cultivo de exposición de la mezcla de cepas de los 24 pozos hasta dejar la columna 1 y 2 descubiertas. 11.6.14 Cambiar las puntas de la pipeta y mezclar la solución en los pozos de la columna 2 de la placa de los 24 pozos ocupados pipeteando suavemente de arriba abajo. 11.6.15 Distribuir alícuotas de 50 μl en las primeras columnas 13 a 24 de la placa de 384 pozos en la posición A. Una punta especifica para cada pozo de la placa. 11.6.16 Repetir este procedimiento para las columnas restantes de la placa de 24 pozos. Las columnas 3 y 4 de la placa de 24 pozos distribuirlas en la segunda placa de 384 pozos, y las columnas 5 y 6 de la placa de 24 pozos es distribuida en la tercera placa de 384 pozos. 11.6.17 11.6.18 Realizar el mismo procedimiento para la cepa TA100. 374 Colocar las cubiertas de las cuatro microplacas y sellarlas con papel parafilm. Para prevenir la evaporación durante los 2 días de incubación a 37 °C. Registrar el tiempo de incubación al que se inicia y termina . 11.6.19 11.6.20 Sacar las microplacas de la incubadora. 11.7 Manejo de la muestra cuando se trabaja con activación metabólica. 11.7.1 Adicionar 6.0 mL del medio Vogel-Bonner/histidina/biotina, a siete tubos marcados con MS9. 11.7.2 Adicionar 0.8 mL de cultivo de una noche al tubo marcado con la cepa apropiada. Agitar el contenido de los tubos de cultivo antes de tomar el inoculo. 11.7.3 Adicionar 1.2 mL de la mezcla S9 al 30% a estos tubos. 11.7.4 Inmediatamente después la mezcla S9 es adicionada al contendor, transferir 240 µL de toda la mezcla a cada pozo de la placa de 24 pozos. 11.7.5 Repetir los pasos 3 a 17 de la prueba sin activación metabólica. 11.8 Realizar los controles negativos y positivos (utilizar aquellos de acuerdo con las cepas que se utilizaran en el experimento). A los controles negativos únicamente se les adiciona 0.1 mL de cultivo bacteriano de una noche y 0.5 mL de la mezcla S9, mientras que para los controles positivos debe adicionarse un volumen adecuado del control especifico (ver Tabla 1) y 0.1 mL de cultivo bacteriano de una noche y 0.5 mL de la mezcla S9. 11.9 Transcurrido el tiempo de incubación de dos días proceder al conteo del número de pozos positivos en secciones de 48 pozos, y registrar los datos en la siguiente tabla. Los pozos positivos son aquellos que cambiaron a color amarillo o tiene crecimiento bacteriano visible en el fondo del pozo. La solución indicadora de púrpura de bromocresol es sensible al pH que pasa de un color púrpura a amarillo cuando ocurre crecimiento (revertantes) en los pozos generándose un pH ácido, el medio inicialmente tiene un pH de 7.0. 375 Número de pozos positivos en la cepa TA98 Concentració n 0 1 2 3 4 5 6 + Placa 1 Placa 2 Placa 3 Número de pozos positivos en la cepa TA100 Concentració n 0 1 2 3 4 5 6 + Placa 1 Placa 2 Placa 3 La presencia de crecimiento en los pozos control de medio de cultivo sin inoculo indica contaminación por lo que la microplaca seria desechada. El ensayo deberá repetirse si la si la tasa de reversión espontánea estuviera fuera de lo esperado (ver tablas 2) o si los controles positivos no tuvieran actividad mutagénica frente a las cepas de prueba. 12 RESULTADOS 12.1 Expresión de evaluación Los resultados son expresados cuantitativamente a través del número de revertantes por mL o litro de muestra, determinado por la inclinación de la recta obtenida de la curva dosis-respuesta. Los resultados son también expresados a 376 través de la razón de mutagenicidad (RM) que es una razón entre el número de pozos positivos por concentración dividida entre el número promedio de pozos positivos del control cero. Nota: Si el número promedio de pozos positivos para el control dosis cero es >1.0, ajustar a 1.0 para este cálculo. Se expresan los resultados gráficamente a través de una curva dosis respuesta, colocando en la abcisa las concentraciones de la muestra probada y en la ordenada el número de revertantes inducidos en cada dosis. Calcular la desviación estándar de los pozos positivos por concentración. 12.2 Interpretación de los resultados Una muestra es considerada positiva cuando existe una relación dosis-respuesta entre las concentraciones probadas y/o el número de revertantes inducidas en por lo menos una dosis, la razón de mutagenicidad (RM) es mayor o igual a 2. 12.3 Evaluación de la prueba 13.3.1 Resultados positivos Indican que, con base a las condiciones de la prueba, una muestra en la prueba induce mutaciones de punto por substitución de bases o del tipo “frameshift” en el genoma de estos microorganismos. 13.3.2 Resultados negativos Indican que, con base a las condiciones de la prueba, la muestra no presenta actividad mutagénica frente a las cepas probadas de Salmonella typhimurium. 13.3.3 Informe técnico El informe técnico sobre la prueba debe incluir la siguiente información: a) b) c) d) e) f) Tipos de cepas empleadas; Sistema de activación metabólica empleando; Resultados de la prueba Interpretación de los resultados; Método empleado; Nombre y firma del responsable de los análisis Una vez que hayan contado totalmente el número de microplacas que constituyeron el experimento los resultados serán vaciados a los formatos electrónicos (ver 14.0), dichos formatos serán posteriormente impresos y anexados a la carpeta de resultados con la firma del analista y el responsable del área. 377 13 RECOMENDACIONES Para un análisis de rutina la actividad mutagénica de una muestra, se recomienda el uso de las cepas TA98 y TA100, se ha demostrado su eficiencia en la detección de un gran número de mutágenos ambientales; dependiendo de la muestra, el objetivo, y de las condiciones del volumen de la muestra disponible para prueba, también son utilizadas otras cepas (por ejemplo, TA102, TA104, TA97a, TA1535, TA1538, TA1537). Debe tomarse cuidados especiales con relación a la estandarización de la metodología, la verificación de las características genéticas de las cepas empleadas, la actividad de la fracción S9, el control de calidad de los reactivos, medios de cultivo y cristalería utilizada en la prueba, a fin de asegurar la confiabilidad de los resultados, BIBLIOGRAFÍA Ames, B.N.; McCann, J. & YAMASAKI, E. Methods for detecting carcinogens and mutagens with the Salmonella/mammalian microsome mutagenesis test. Mutat. Res. , 31; 347-364, 1975. Gatehouse D.G., (1984). Basic mutagenicity tests: UKEMS recommended procedures. Cap. 2. Bacterial mutation assays. Edited by Kirkland David J. Hubbard, S.A., Green, M.H.L., Gatehouse, D. and J.W. Bridges (1984). The Fluctuation Test in Bacteria. In: Handbook of Mutagenicity Test Procedures. 2nd Edition. Ed. Kilbey, B.J., Legator, M., Nichols, W. and Ramel, C., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, pp. 141-161. Maron, D.M., and B. N. Ames, (1983). Revised methods for the Salmonella mutagenicity test. Mutation Research 11:173-215. Gee, P., Sommers, C.H. Melick, A.S., Gidrol, X.M., Todd, M.D. Burris, R.B. Nelson, M.E., Klemm, R.C. nad Zeiger, E. Comparison of response of basespecific Salmonella tester strains with the traditional strains for identifying mutagens: The results of a validity study. Mutation Res. –Genetic Toxicology and environmental Mutagenesis 412,117-132,1998. Gee, P., Maron, D.M., Ames, B.N. Detection and classification of mutagens: A set of base-specific Salmonella tester strains Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 91 pp. 1160-11610, November 1994. 378 Bioensayo de la Actividad Deshidrogenasa Martha Barajas Aceves Depto. de Biotecnología y Bioingeniería, Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del IPN. Av. IPN 2508, Col. San Pedro Zacatenco México D.F. Principio La oxidación microbiana de sustancias orgánicas bajo condiciones aeróbicas está ligada a la cadena de transporte de electrones enlazada a la membrana con O2 como aceptor final. El sistema de transporte de electrones está acoplado con la síntesis de ATP, llamado fosforilación oxidativa. NADH es la forma en el cual los electrones son colectados de diferentes sustancias a través de la acción de NAD-ligado deshidrogenasa. Los electrones son además trasportados al sistema de citocromos, donde son oxidados por O2 (Leninger, 1975). En los años de 1930 la medida de una o más actividades enzimáticas en la cadena respiratoria podría ser usada como un índice para las actividades oxidativas totales de las células, de tal forma que la actividad deshidrogenasa en suelos se ha usado como una medida para la actividad microbiana global (Lenhard, 1956; Klein et al, 19971; Casida, 1977). El método está basado en la suposición de que en la ausencia de O2 el cloruro de 2, 3, 5trifeniltetrazolium (TTC) actúa cuantitativamente como el aceptor terminal de H para el sistema dehidrogenasa con la formación del rojo de trifeniltetrazoliumformazan (TPF). TTC + 2H+ + 2e- = TPF + HCl Cuando esta prueba se aplica a suelos, las condiciones son hechas anaeróbicas, y la deshidrogenasa anaeróbica tanto como la deshidrogenasa aeróbica se asume que usan el TTC como aceptor de H. Materiales y aparatos Tubos de ensaye de 16 x 150 mm. Vortex Estufa de Incubación ajustable a 37 ˚C. Espectrofotómetro Papel filtro Whatman No. 42 Extractante Acetona (grado analítico) ó Metanol Compuestos químicos y Soluciones 379 CaCO3 Solución TTC 3 % W/V de 2, 3,5-cloruro de trifeniltetrazolium en agua destilada Curva estándar de TPF TPF Solución estándar Disolver 100 mg de TPF en 80 ml de acetona (1000 µg TPF ml-1) y aforar con acetona a 100 ml. Procedimiento Pesar 3 porciones de suelos de suelos húmedos equivalente a 6 g de suelo seco en tubos de ensaye de 16 x 150 mm. A cada tuvo se adiciona 67 mg CaCO3, 1 ml de una solución acuosa de 2, 3,5-cloruro de trifeniltetrazolium (TTC) al 3% (w/v) y 2.5 ml de agua destilada. Los contenidos son mezclados en el vortex para excluir tanto como sea posible el aire atrapado. Los tubos son incubados por 24 hr a 37 ˚C. Al finalizar la incubación, el trifenilformazan (TPF) formado por la reducción de TTC se extraen agitando a mano en un embudo de separación con 10 ml de acetona por 5 min y filtrar. Esto se repite de 7 a 8 veces para asegurar una extracción completa del TPF. El filtrado se diluye con acetona adicionar a un volumen final de 50 ml. Se lee a una absorbancia de 485 nm usando acetona como blanco. La actividad deshidrogenasa en suelos se expresa como µg TPF producido g-1 suelo 24 hr-1. La absorbancia se comparan con una curva estándar de 0 – 1000 mg TPF l-1 en acetona. Los blancos se utilizan con extractos de suelos acetónicos o metanólicos sin TTC o TPF. Curva de Calibración Pipetear 0, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0 y 4.0 ml de la solución estándar de TPF en un matraz volumétrico (50ml) y adicionar 8.3 ml de buffer Tris (pH 7.6) y se afora con acetona a 50 ml para obtener las siguientes concentraciones: 0, 10, 20, 40, 60 y 80 µg TPF ml-1. Cálculos La lectura de las concentraciones (µg/ml) de la curva de calibración, corregidos por los valores control y calculados: TPF (µg/ml) x 40 Dwt x 5 380 De donde: dwt es le peso seco de 1 g de suelo húmedo, 5 es el peso húmedo usado (g) y 40 es el volumen de la solución adicionada (acetona) a la muestra de suelo en el ensayo. Referencias Casida L.E. Jr., Klein, D.A., Santoro T., 1964. Soil Dehydrogenase activity. Soil Science. 98, 371-376. Casida L.E. Jr., 1977. Microbial metabolic activity in soil as measured by dehydrogenase determinations. Applied and Environmental Microbiology. 34, 630-636. Klein D.A., Loh T.C., Goulding R.L., 1971. A rapid procedure to evaluate the dehydrogenase activity of soils low in organic matter. Soil Biology and Biochemistry. 3, 385-387. Lenhard G., 1956. The dehydrogenase activity in soils as a measure of the activity of soil microorganisms. Z. Pflanzenernah Düng Bodenkd. 73, 1-11. Lenninger A.L., 1975. Biochemistry. Worth Publishers, Inc. New York. 381 Bioensayo de Trifosfato de Adenosina (ATP) Martha Barajas Aceves Depto. de Biotecnología y Bioingeniería, Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del IPN. Av. IPN 2508, Col. San Pedro Zacatenco México D.F. Principios El trifosfato de adenosina (ATP) es un compuesto de energía importante en el metabolismo de todos los organismos vivos. El contenido de ATP en suelos está correlacionado muy de cerca con otros indicadores de biomasa por ejemplo; C, N, etc., y puede servir como una estimación independiente del contenido de biomasa en suelos. En la extracción de ATP del suelo pueden ocurrir algunos problemas tales como: obtener la máxima liberación del ATP de células vivas, la hidrólisis de ATP por ATPasas en suelos y la absorción de ATP en los coloides del suelo. El método desarrollado por Jenkinson y Oades (1979), se usa un reactivo; ácido tricloroacético/fosfato/paraquat para extraer ATP y ultra zonificación para romper las células microbianas. El anión (fosfato) y el catión (paraquat) son absorbidos fuertemente en los sitios positivos y negativos del suelo, bloqueando de esta forma, los sitios donde pudieran absorberse el ATP microbiano. Aún usando estos reactivos, algo de ATP pudiera absorberse al suelo, por lo que se hace necesario calcular la cantidad recuperada. Esto se hace por la adición de una cantidad conocida de ATP al extractante B y comparando la cantidad obtenida con los obtenidos del extractante A sin adición de ATP. El ATP se mide usando el análisis del sistema luciferina-luciferaza, descrito por Tate y Jenkinson (1982) usando el extracto purificado de luciferaza. La luz emitida durante la reacción es medida usualmente por un contador de centiliación. A. Extracción del ATP Reactivos ATP (Adenosine 5¨-trifosfato (ATP) sal de disodio hidratado – Sigma FL-AAS Ácido tricloroacético Na2HPO4.12H2O (ortofosfato de hidrogeno disodio dodecahidratado) Dicloruro de paraquat (dicloruro de 1,1-dimetil-4,4’-bipiridina) Solución 0.01 mM ATP Disolver 59.9 mg en agua y ajustar a 1 Lt y almacenar a -15 ˚C. Nota: el peso molecular de la fórmula puede cambiar de un lote a otro debido al contenido de agua. Calcular la molaridad de la fórmula dada en la botella adquirida. Solución stock del extractante 382 Pesar 81.6 g de ácido tricloroacético y diluir en 600 ml de agua destilada. Pesar 89.6g Na2HPO4.12H2O y disolver en los 600 ml con tricloroacético, adicionar 70 ml del bicloruro de paraquat 36%, aforar en un litro con agua destilada y almacenar a -15 ˚C. Esto da una solución de 0.5M con respecto al TCA, 0.25M a fosfato y 0.1M a paraquat. Se recomienda preparar un volumen de la solución stock considerable como para usarse a través de todo el número de muestras para el análisis planeado de ATP. Advertencia: Algunos de los reactivos usados en la extracción de ATP y análisis son altamente tóxicos, carcinogénicos y mutagénicos. Usar guantes y protección para los ojos todo el tiempo. Extracto A Tomar una alícuota de 5 ml de agua destilada y usar la solución stock para aforar a 1lt. Extracto B Tomar una alícuota de 5 ml de 0.1nM ATP y aforar con la solución stock a 1 litro. Método 1.- Por cada réplica de la muestra, (normalmente 3), pesar 2 muestras de suelo de 2.5g. Colocar una de las muestras en un tubo marcado con A y el otro con B. Los tubos deben ser de centrífuga (50ml) para resistir la utrasonificación. Se adicionan 25 ml del extracto A al tubo A y 25 ml de extracto B al tubo B. 2.- Inmediatamente después de adicionar el extracto A al primer tubo, se zonifica por 2 min. con la ultrasonificador usando una sonda de 12.5 mm a toda potencia. 3. – Enfriar el tubo en hielo por lo menos 5 min. 4.- Continuar el siguiente tubo con el mismo procedimiento Es necesario trabajar los tubos individualmente, de donde es importante que el extracto esté en contacto con el suelo por el mismo tiempo. 5.- Filtrar usando papel filtro Whattman No 44 hasta que se obtenga de 5 a 10 ml del filtrado. 6.- Almacenar los extractos a -15˚C. Advertencia: La sonificación con paraquat puede producir aerosoles. El ultra-sonicador deberá estar colocado dentro de una campana de extracción de gases. B. Medida de ATP Reactivos 31.2g Na2HAsO4.7H2O (sal de sodio ácido arsénico hepta hidratado) 10 ml 0.2M EDTA (etilén-diamino-tetra-ácido acético) 2.46 g MgSO4.7H2O (sulfato de magnésio) 383 H2SO4 IM Preparación Pesar 31.2g de Na2HasO4.7H2O y disolver en 800 ml de agua destilada, adicionar 10 ml 0.2M EDTA y después adicionar 2.46g de sulfato de magnesio disuelto en 100 ml de agua destilada. Ajustar el pH a 7 con H2SO4 IM. Aforar a 1 litro con agua destilada. Esto dará una solución 0.1M con respecto a Arsenato, 0.01M con respecto a Mg2+ y 0.002M a EDTA. Solución de la enzima Reactivo ATP assay Mix FLAAM ─ Sigma Nota: un vial es suficiente para 50 ensayos Preparación 1.- Reconstituir la dilución buffer inyectando de 10 a 12 ml de agua de alta pureza con una jeringa de plástico y mezclarla suavemente para evitar la formación de espuma. 2.- Reconstituir el reactivo por la adición del contenido completo de la solución buffer y permitir que la solución repose en hielo por 1 hora antes de usarse. Nota: Se especifica por el proveedor que la preparación es capas de detectar la concentración de ATP de 2 x 10-10 a 2 x 10-7 moles por litro, pero si no se requiere tal sensibilidad, la solución puede ser diluida con buffer, pero si se requiere más sensibilidad, se debe adicionar extra luciferina. Preparación de los estándares Solución 1 Pipetear 1 ml de la solución 0.1 nM ATP en un matraz volumétrico de 50 ml y aforar con el extractante A. Esto da 100 pmoles de ATP en 50 ml de la solución estándar. Solución 2 Pipetear 2 ml de la solución 0.1 nM ATP en un matraz de 50 ml y aforar con la solución del extractante A. Esto da 200 pmoles de ATP en 50 ml de la solución estándar. 384 Tabla 1 - Concentración de estándares de ATP para la construcción de la curva de calibración ATP pmoles/50 µl 0 10 20 40 50 80 100 120 150 200 Solución 1 ml 1 2 4 5 8 10 - Solución 2 ml 6.0 7.5 10 Extractante A ml 10 9 8 6 5 2 0 4 2.5 - Sí se trabaja con suelos adicionados con sustratos, usar los estándares arriba de 100 pmoles. Método 1.- Arreglar los viales de 25 ml para Contador de Centiliación 2.- Pipetear 5 ml del buffer de arsenato en cada vial 3.- Pipetear 50 µl de los estándares, o extractaos de suelo en el buffer de arsenato en los viales. 4.- Preparar la solución enzimática Pico enzima F 5.- Pipetear 50 – 75 µl de la solución enzimática en las muestras y mezclar suavemente girando los viales 6.- Tapar los viales y contar en un Contador de Centiliación utilizando el unquenched Standard de calibración 14C. Nota: La exactitud del pipeteo es extremadamente importante especialmente cuando la solución de la enzima es pipeteada. Sugerencias del orden de la corrida 3 replicas de cada estándar 3 replicas del Blanco A (o ppm) 3 replicas del Blanco B 3 replicas de las muestras de suelo A y B Repetir los estándares y blancos A y B al final de la corrida 385 Se recomienda que no se analicen más de 130 muestras (incluyendo blancos A y B y estándares). Esto es porque se toma 1 hora en contar las muestras y por se un número máximo manejable ara una persona con exactitud. Cálculos % Recuperación de ATP adicionado = (Cuenta ext B ─ Cuenta ext A) × 100 (Blanco B – Blanco A) ATP (nmol g-1 suelo) = (Cuenta ext B ─ cuenta ext A) × SF × (25 + w) % Recuperación × 5 × 50 De donde: Cuenta ext B = cuenta del suelo con extacto B Cuenta ext A = cuenta del suelo con extacto A Blanco B = cuenta del extracto B Blanco A = cuenta del extracto A SF = la inversa de la pendiente de la curva estándar (ATP/cuenta) w = agua contenida en la muestra de suelo 25 = ml del solución extractante A o B 5 = g de suelo en base seca 50 = µl del extracto de suelo usado para el análisis de ATP Referencias Jenkinson D.S. and Oades J.M. (1979). A method for measuring adenosine triphosphate in soil. Soil Biology and Biochemistry 11, 193-199. Tate K.R. and Jenkinson D.S., 1982. Adenosine triphosphate measurements in soil: an improved method. Soil Biology and Biochemistry 14, 331-335. 386 Bioensayo de la Tasa de Mineralización del Nitrógeno Martha Barajas Aceves Depto. de Biotecnología y Bioingeniería, Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del IPN. Av. IPN 2508, Col. San Pedro Zacatenco México D.F. Principios Tanto las plantas como los microorganismos dependen del nitrógeno combinado para su nutrición. El nitrógeno combinado es la forma de amonio, nitratos o compuestos orgánicos, a menudo son el factor limitante para los procesos biológicos del suelo (Haynes and Goh, 1978). Por esta razón, el ciclo de la transformación de la materia orgánica nitrogenada son de gran importancia en el recambio total de este elemento en el suelo. La mineralización del nitrógeno consiste en dos procesos importantes: la amonificación de compuestos orgánicos por un gran número de microorganismos heterótrofos y la oxidación de amonio liberado a nitritos y nitratos (nitrificación), principalmente por bacterias autótrofas. La mineralización de nitrógeno orgánico depende principalmente en la temperatura, humedad, aireación, tipo de N orgánico y pH. El nitrógeno inorgánico producido por mineralización está sujeto a la inmovilización del N y fijación por arcillas. También se puede perder por desnitrificación y lixiviación. Principios del método. El método esta basado en la incubación del suelo húmedo (ajustado entre un 40 a 50 % capacidad de retención de agua) a 25˚C y seguido por la determinación de nitratos y amonio extraídos con una solución 0.5 M K2SO4 . Procedimiento Las muestras de suelos húmedos (25 g en base seca) se pesan (por triplicado) en frascos de vidrio de 100 ml y se colocan dentro de botellas de vidrio de 1Lt de boca ancha de color ámbar. Tres muestras de suelo húmedo se congelan inmediatamente (control) a 20˚C. En el fondo de la botella de 1Lt se colocan 10 ml de agua destilada para evitar la deshidratación y un vial con 20 ml de NaOH 1N para atrapar el CO2 desprendido durante la incubación. Se tapan la botella de 1lt con tapas de rosca, perfectamente selladas y se incuban de 7 a 30 días a 25˚C. Extracción Las muestras pesadas (25 g) por triplicado en los recipientes de plástico limpios y secos, se adiciona el 0.5 M K2SO4 en una proporción 4:1 (ml de sulfato de potasio: muestra seca) (100 ml) y se agita a 200 rpm a temperatura ambiente por 30 min. Terminada la agitación se filtra inmediatamente con el papel Whatman # 42 a un recipiente de plástico limpio y seco. Se guardan los extractos en congelación (< 5˚C) hasta su análisis. 387 Solución extractora: 0.5 M K2SO4 Pesar 871.35 g de K2SO4 y diluir a 10 Lt de H2O destilada. Mezclar y agitar por 2 horas a 75 rpm en una agitadora transversal. Cálculos de la tasa de nitrógeno mineralizado Nmin (µg g-1 suelo seco día-1) = (NH4-tx+NO3-tx+NO2-tx) – (NH4-t0+ NO3-t0+NO2t0) t x PS De donde: NH4-tx es concentración del NH4 después de la incubación, NO3-tx es la concentración de NO3 después de la incubación, NO2-tx es la concentración de NO2 después de la incubación, NH4-t0 es la concentración de NH4 del control, NO3-t0 es la concentración de NO3 del control, NO2-t0 es la concentración de NO2 del control t es el tiempo de incubación y PS es el peso en base seca del suelo húmedo. Referencias Haynes R.J., Goh K. M., 1978. Ammonium and nitrate nutrition of plants. Biol. Rev. 53, 465-510. Determinación de amonio Martha Barajas Aceves Principios El nitrógeno orgánico (ejemplo, proteínas y ácidos nucleicos) es convertido por la descomposición microbiana a amonio. La primera etapa de la hidrólisis de la proteina por ejemplo, la liberación de aminoácidos, los cuales son hidrolizados bajo condiciones aeróbicas o anaeróbicas (Ladd and Jenkinsosn, 1982). La velocidad de amonificación depende en la relación C/N de los compuestos orgánicos, altas tasas de amonificación generalmente ocurren a una relación baja de C/N (Alef and Kleiner, 1986a, Alef and Kleiner, 1986b, Nannipieri et al, 1990). Excepto para la hidrólisis de urea por ureasa extracelular, la amonificación es enlazada al metabolismo de las células activas. Principio del método El amonio y el nitrato de la solución del suelo se pueden destilar directamente sin ninguna preparación de la muestra. La transformación de amonio a amonia el cual es colectado en el destilado, se logra con la adición de MgO. (Keeney and Nelson, 1982) 388 Reactivos Acido bórico 4 % Oxido de magnesio H2SO4 0.02 N Rojo de metilo Azul de metileno Etanol 95 % NH4SO4 Solución indicadora Pesar 200 mg de rojo de metilo y aforar a 100 ml con etanol al 95%. Pesar 100 mg de azul de metileno y disolver en 50 ml de etanol al 95%. Combinar las dos soluciones. Preparar mensualmente. Acido Bórico Pesar 40 g de ácido bórico y disolver en 900 ml de agua destilada. Aforar a 1 litro. Adicionar 10 ml de la solución indicadora. Solución stock 1000 µg NH4SO4/ml Pesar 3.66 g de NH4SO4, disolver y aforar a 1000 ml con agua destilada. Solución de trabajo 10 µg NH4SO4/ml Tomar una alícuota de 10 ml de la solución stock (1000 µg NH4SO4/ml) y aforar a 1000 ml con agua destilada. Procedimiento Tomar una alícuota de 10 ml de la muestra extraída con 0.5 M K2SO4 en un tubo de destilación de 500 ml, adicionar 10 ml de agua desionizada y adicionar 0.2 g de óxido de magnesio e insertar el tubo en el aparato de destilación. El destilado es colectado en 10 ml de ácido bórico al 4 %. Recibir 100 ml del destilado. Titular con H2SO4 0.02 N Factor de conversión Tomar una alícuota de 10 ml de la solución de trabajo (10 µg NH4SO4/ml) y repetir todo el procedimiento de las muestras extraída. Repetir de 4 a 5 veces y calcular el promedio del gasto de H2SO4 0.02 N. Cálculos NH4+ (µg g-1 suelo) = (ml H2SO4 gastados * 100*Y) 10*25 De donde: 389 100 = ml de 0.5 M K2SO4 usados para extracción Y = factor de conversión (µg NH4SO4 destilados de la alícuota de la solución patrón / ml promedio del gasto de H2SO4 0.02 N). 10 = alícuota de la muestra destilada 25 = g de suelo en base seca usados para la extracción. Referencias Alef K., Kleiner D. 1986a. Arginine ammonification, a saple method to estimate microbial activity potentials in soils. Soil Biology and Biochemistry. 18, 233-135. Alef K., Kleiner D. 1986b. Arginine ammonification in soils samples. In: The application of enzymatic and microbiological methods in soil analysis. Veroff Landwirtsch-Chem. Bundesanstalt Linz/Donau 18, 163-168. Nannipieri P., Grag S., Ceccanti B. 1990. Ecological significance of the biological activity in soil. In: Soil Biochemistry, vol. 6 Bollag J.M. Stotzky G. (eds) Marcel Dekker, New York. Pp 293-355. Keeney D.R., Nelson D.W., 1982. Nitrogen inorganic forms. In Methods of Soil Analysis. Part 2, 2nd edn. Page A.L., Miller R.H., Keeney D.R. (eds) American Society of Agronomy, Madison, Wt. pp. 643-698. 390 Determinación de nitratos Martha Barajas Aceves Principios La conversion de amonio a nitratos es a través de dos grupos de bacterias altamente especializadas: chimioautótrofas, aeróbicas obligadas. La nitrificación ocurre en dos etapas: primeramente, el amonio es oxidado a nitrito y segundo el nitrito es oxidado a nitrato. El amonio más que el nitrato se puede adsorber en los coloides orgánicos e inorgánicos del suelo. La estimación de la velocidad de mineralización de nitrógeno se puede usar como un criterio cuantitativo de actividad microbiana en suelos, y se ha usado para estudiar la influencia de contaminantes y factores ambientales en actividades microbiana en suelos (Greaves et al., 1980; Somerville and Graves, 1987). Principio del método La determinación de NO3- con el ácido 2,4 fenol-fenoldisulfónico en un medio ácido, que al añadir el KOH desarrolla el color amarillo de la sal potásica del ácido nitrofenoldisulfónico. Reactivos H2SO4 12 N KOH KNO3 Fenol blanco Ácido fenol disulfónico. Pesar 25 g fenol blanco puro en 150 ml de H2SO4 fumante (15% de SO3 libres) Se agita bién y se calienta por 2 horas en baño. Se enfría y se guarda en un frasco ámbar a temperatura ambiente. Sol. 1N H2SO4 Se disuelven 28 ml H2SO4 concentrado en 1 Lt de agua destilada Sol Madre de NO3 Pesar 7.223 g KNO3 en 1000 ml agua destilada concentración es de 1000 µg/ml de NO3N. 25 ml de la solución stock (1000 µg/ml de NO3-N) diluir a 500 ml con agua destilada. Concentración final 50 µg/ml de NO3-N Curva tipo: ml de la solución patrón conc. 50 µg/ml de NO3-N: 0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1.0. Concentraciones en µg: 0, 5, 10, 15, 20, 25, 50. 391 Procedimiento Tomar una alícuota de 10 ml de muestra en un vaso de precipitado de 100 ml y evaporar en una parrilla de calentamiento con temperatura controlada. Adicionar 2 ml de ácido fenoldisulfónico y dejar reposar por 10 ml. Disolver con 15 ml de agua destilada. Adicionar 7 ml sol KOH 12 N lentamente hasta desarrollar color. Aforar a 100 ml con agua destilada. Leer a 410 nm. El color es estable por varias horas y las lecturas se pueden hacer más tarde si es necesario. Cálculos NO3-N (µg g-1 suelo) = Abs × Fc × 100 25 × 10 De donde: Abs = absorbancia leída a 410 nm Fc = factor de conversión, que es la inversa de la pendiente de la curva de estándares 100 = ml de K2SO4 usados para la extracción del suelo 25 = gramos de suelo en base seca 10 = alícuota tomada para la determinación de nitratos Referencias Graves M.P., Poole N.J. Domsch K.H. Jagnow G., Verstraete W., 1980. Recommended test for assessing the side effect of pesticides on soil microflora. Tech. Rep. Res Council, Weed Res Organization No 59; 1-15. Somerville L. Graves M.O. 1987. Pesticide effects on soil microflora. Somerville L. And Graves M.P. (eds.) Taylor and Francis. London, New York. Pp 115-132. Primo Yúfera E., Carrasco J.M.., 1973. Química Agrícola. Tomo I. Editorial Alambra. 392 Determinación de nitritos Martha Barajas Aceves Principios El contenido de nitritos en suelo, normalmente es muy pequeño. Sin embargo, en suelos abonados con fertilizantes nitrogenados, se pueden acumular cantidades apreciables. El nitrito se determina por la formación de un colorante azo púrpura rojizo, producido a pH 2.o a 2.5 por acoplamiento de sulfanilamida diazotizada con diclorohidrato de N-(1-naftil)etilendiamina (diclorhidrato de NED). Reactivos Clorhidrato de L-Naftilamina Ácido sulfanílico EDTA disódico Acetato de sodio NANO2 6 N NaOH Sol. Ácido sulfanílico Ácido sulfanínico 0.60 g Ácido clorhídrico 70 ml Agua destilada ……aforar a 100 ml Sol EDTA disódico Pesar 0.5 g de EDTA y disolver en 100 ml de agua destilada Sol. Clorhidrato de L-naftilamina Clorhidrato de L-naftilamina 0.60 g Ácido clorhídrico 1 ml Agua destilada ……aforar a 100 ml Refrigerar Evitar inhalación o exposición a la piel Sol amortiguadora de acetato de sodio 2M Acetato de sodio 16.4 g Acetato de sodio.3 H2O 27.2 g Agua destilada libre de NO2 100 ml NaOH 6N Disolver 240g de NaOH en 1000 ml de agua destilada 393 Solución Madre de NO2 Pesar 1.232 g NaNO2 en 1000 ml agua destilada, adicionar 1 ml de cloroformo concentración es de 250 µg/ml de NO2-N. 50 ml de la solución madre (250 µg/ml de NO3N) diluir a 250 ml con agua destilada. Concentración final de la solución intermedia 50 µg/ml de NO2-N. Solución patrón, tomar 10 ml de la sol intermedia (50 µg/ml de NO2-N) y diluir a 1000 ml, solución Patrón 0.50 µg. Curva tipo: ml de la solución patrón conc.: 0, 1, 2, 3, 5, 10, 10, 15, 20ml. Las concentraciones en µg son: 0, 0.50, 1.0, 1.50, 2.50, 5, 7.50, 10. Procedimiento 10 ml de muestra 40 ml de agua destilada 1 ml naftilamina, agitar 1 ml de ácido sulfanílico 1 ml EDTA, Dejar reposando por 10 min. Adicionar 1 ml naftilamina 1 ml de acetato de sodio Reposar por 30 min. Leer a 520 nm Cálculos NO2-N (µg g-1 suelo) = Abs × Fc × 100 25 × 10 De donde; Abs = absorbancia leída a 520 nm Fc = factor de conversión, que es la inversa de la pendiente de la curva de estándares 100 = ml de K2SO4 usados para la extracción del suelo 25 = gramos de suelo en base seca 10 = alícuota tomada para la determinación de nitritos Referencias Primo Yúfera E., Carrasco J.M.., 1973. Química Agrícola I. Editorial Alambra. Pag. 301. 394 MÉTODOS PARA EVALUAR LOS EFECTOS DE CONTAMINANTES EN Argopecten ventricosus Autor: Alma Socorro Sobrino Figueroa Los organismos que se utilizaron para los bioensayos se obtienen de Laboratorios de Cultivo de Moluscos, o de “Parque de Cultivo” o “vivero”, que se localizan en el mar, en jaulas suspendidas por medio de flotadores. a una profundidad no mayor a 4-8 metros. Se tomarán muestras de agua y se evaluará in situ la salinidad y temperatura. Los especimenes y las muestras de agua se transportaran en hieleras de plástico al laboratorio o al lugar donde se desarrollará la parte experimental de la investigación. Inducción en el laboratorio para la obtención de larvas de almeja catarina Organismos reproductores de A. ventricosus provenientes del campo se recolectaron cuidadosamente. En el laboratorio se realizará una inspección visual para seleccionar a los individuos “maduros” (con gónada evidente) y aquéllos que tengan esa condición se someterán a estimulación térmica para inducir el desove. Este proceso denominado por Lossanoff y Davis (1963), como “choque térmico”, consiste en variar de forma alternada la temperatura del agua donde se encuentran los organismos de 18 ºC hasta 27 ºC. Después de la inducción, 14 ± 2 organismos se colocaran en canastas de plástico (denominadas canastas Nestier), mismas que se sumergirán en tanques de fibra de vidrio con capacidad para 1500 litros, con agua marina filtrada (15, 10, 5 y 1 m) e irradiada con luz ultravioleta (UV). A las 12 ± 2 horas después de la estimulación se retiraran los reproductores de los tanques de cultivo. Los procesos de desove, la fecundación, el desarrollo del primer estadío larval (trocófora) y del segundo (larvas veliger “D”) se verificaran en las primeras 18 horas después del choque térmico. Las larvas en estadíos de veliger “D” (85 a 96 m de altura) (Figura 1), se concentraran por medio de una malla de 50 micras a un volumen de 1litro. Se tomará 1 ml de esta suspensión para realizar un conteo por quintuplicado en una cámara SedgwickRafter, para determinar el número de larvas presentes. 0 50 μm Figura 1. Larvas veliger “D” de Argopecten ventricosus de aproximadamente 96 altura y de 8 días de edad. m de 395 Posteriormente las larvas “D” se colocaran en estanques de 500 litros de capacidad, llenos con agua marina filtrada e irradiada con luz UV, a una densidad de 5 larvas/ml. Se mantendrán a 36 o/oo, 23 ± 2 °C y con suministro diario de alimento, que consiste en una mezcla de microalgas (Isocrysis galbana. y Chaetoceros calcitrans), a densidades de 80,000 a 120,000 cel/ml. Parte de las larvas “D” obtenidas, permanecerán 2 a 4 días en aclimatación (APHA, 1994), en las siguientes condiciones: 36 %o, 20 ± 2 °C y burbujeo constante. Asimismo se les alimentaran diariamente con una mezcla de las microalgas Tetraselmis sp. y Chaetoceros sp. a una densidad de 300,000 a 800,000 cel/ml, cultivadas con medio F/2 Guillard (Stein, 1973). Otra parte de la cohorte se mantendrá por un periodo máximo de 21 días, hasta que alcanzaron el estadio de pediveliger (con mancha ocular; 200 a 350 m de altura). para efectuar los bioensayos. Evaluación del efecto de los metales y sus mezclas sobre larvas de A. ventricosus Los efectos de los metales sobre las larvas de almeja catarina se evaluaran en bioensayos con recambios de agua. Supervivencia de larvas veliger y pediveliger de A. ventricosus Para evaluar el efecto deletéreo de los xenobioticos sobre la supervivencia de las larvas veliger (“D”) y pediveliger de almeja catarina, se efectuaran microbioensayos, siguiendo las recomendaciones de Hunt et al., (1998). Se utilizaran placas multipozos, cada pozo con un volumen de 3 ml. En estas pruebas se realizaran con recambios de agua cada 24 horas, para mantener constante la concentración de los metales. Se probaran 5 concentraciones de metal por quintuplicado además de un testigo. Cada 24 horas se evaluará la supervivencia de los organismos para cada concentración de tóxico por medio de observaciones directas con la ayuda de un microscopio de disección. La muerte de los especimenes se determinará de acuerdo a los criterios establecidos por FAO (1982; 1986). Con los datos obtenidos, se determinara la CL50 (Concentración Letal 50) a 24, 48 y 72 horas, por medio del método Probit (Finney, 1971). Fijación de larvas pediveliger El efecto de los metales sobre la fijación de las larvas al sustrato se evaluará mediante un bioensayo. El experimento se realizará en cristalizadores de vidrio Pyrex con capacidad de 400 ml. En el fondo de éstos se colocaran sustratos, consistentes en placas delgadas de vidrio (Roosenburg et al., 1980), las cuales se revisaran cada 24 horas con ayuda de un microscopio de disección. Se efectuara un conteo del número de organismos adheridos a las placas, para determinar los porcentajes de especimenes fijos y no fijos a las 24, 48 y 72 horas (Roosenburg et al., 1980). Con los datos obtenidos se determinara la CE50 (Concentración Efectiva 50) que es la concentración de metal, donde se observó una disminución del 50% en la fijación de larvas en comparación con el testigo. 396 Evaluación del efecto de los contaminantes sobre juveniles y adultos de A. ventricosus Para evaluar el efecto tóxico de los xenobioticos sobre juveniles y adultos se realizaron bioensayos con juveniles de 3 a 4 meses de edad y con adultos de 12 a 14 meses de edad. Las pruebas de letalidad o de intoxicación aguda se efectuarán con juveniles de 3 a 10 mm de altura y adultos de 40 a 50 mm de altura. Se realizaran bioensayos con recambios de agua cada 48 horas, siguiendo los protocolos propuestos por la FAO (1982, 1986), Buikema et al., (1982) y APHA (1994). Las pruebas con juveniles se realizaran en cristalizadores de vidrio Pyrex con capacidad de 400 ml, los cuales permanecieron cerrados durante el desarrollo del experimento para evitar la evaporación del agua y la variación de los niveles del metal. Se probaran 5 concentraciones de los xenobioticos por triplicado, además de un testigo sin tóxico y otro sin organismos. Se colocaran 10 juveniles por recipiente. El tiempo de duración de las pruebas fue de 168 horas. Los experimentos con adultos se realizaran en acuarios de 12 litros de capacidad en donde se colocaran de 5 a 6 organismos por acuario. Se probaron 5 concentraciones de los tóxicos por duplicado, además de un testigo sin tóxico y otro sin organismos. El agua marina que se utilizará en todos los bioensayos, debe ser filtrada (5 y 1 m) e irradiada con luz UV. Cada 48 horas se evaluaron los siguientes parámetros en ambos experimentos: niveles de metales en el agua, por medio de un espectrofotómetro de absorción atómica (AA Perkin Elmer mod. 3100), concentración de oxígeno con un oxímetro (Cole Palmer Mod. 5946-55), pH con un potenciómetro (Orion Mod.520A), salinidad con refractómetro (Makko), temperatura con termómetro de 0.1 ºC de precisión y concentración de amonio, según el método descrito por Lind (1985). Además cada 24 horas se registró la supervivencia de los organismos en cada prueba. Con los datos de supervivencia y mortalidad se determinó la CL50 a 24, 48, 72, 96, 120, 144 y 168 horas, por el método Probit (Finney, 1971), utilizando el programa para computador “TOXIC” (Amin 1994, com. pers). El TL50 (Tiempo Letal 50) que por definición, es el tiempo que tardan en morir el 50% de los organismos expuestos a cada una de las concentraciones de metales probadas, se calculó también por medio del método Probit (Finney, op. cit.). La CL50 asintótica, que se define como la concentración en la cual la CL50 se aproxima a una constante teórica, en la que ya no ocurren más muertes, se obtuvo experimentalmente entre las 120 y 168 horas de observación (FAO, 1982; 1986). La Razón de Potencia, que compara la toxicidad de un metal con respecto a otro, al analizar sus CL50, se calculó con la relación descrita por Ahsanullah et al., (1981): Donde R.P. = Razón de potencia. ACL50 ACL50 = CL50 del metal A (mg/l). R.P. = BCL50 BCL50 = CL50 del metal B (mg/l). (4) Las curvas de mortalidad obtenidas se ajustan al modelo potencial negativo y fueron calculadas con la relación: y = axb (5) 397 Donde y = CL50 (mg/l). x = tiempo (horas). a y b son constantes. Evaluación de la tasa de crecimiento de juveniles expuestos a metales tóxicos En pruebas con juveniles de 3 ± 0.5 mm de altura, expuestos a los xenobioticos durante 30 días, se evaluará el efecto de estos xenobióticos sobre su crecimiento. Se probaran 5 concentraciones de tóxico además de un testigo sin tóxico, por triplicado (Tabla 2). Se expondrán 60 organismos en cada concentración. Durante el experimento, las almejas serán alimentadas diariamente con una mezcla de microalgas Tetraselmis sp. Chaetoceros sp, con una densidad de 600,000 ± 150,000 (AvilésQuevedo, 1990). Al inicio y término del experimento los especimenes se midieran para determinar su altura, con un microscopio de disección provisto de una reglilla graduada y calibrada en m. La tasa de crecimiento se calculó mediante la relación propuesta por Stromgren (1982): T.C. = h final - h inicial (3) Tiempo Donde T.C. = Tasa de crecimiento (mm/día). h final = Altura de los organismos en el tiempo final de observación (mm). h inicial = Altura de los organismos al inicio del experimento (mm). Tiempo = Días. El aumento de la biomasa de los juveniles, se determinó por la diferencia del peso seco de los especimenes al inicio y al final del experimento. Treinta organismos de cada tratamiento, fueron extraídos de su concha y se pesaron en una balanza analítica (Mettler, mod. Toledo, ag2-45 de ± 0.01 mg) para determinar su peso húmedo. Posteriormente se colocaron en una caja Petri y se secaron en un horno a 60 - 70 °C por un lapso de 12 horas o hasta alcanzar peso constante. Después las muestras se colocaron en un desecador durante una hora e inmediatamente se pesaron para determinar tanto el peso seco como su porcentaje de humedad. Con los datos obtenidos se determinó la CE50 (Concentración Efectiva 50), que es la concentración de metal donde se observó una disminución del 50% en la tasa de crecimiento en comparación con el testigo. Evaluación de la tasa de consumo de oxígeno en juveniles y adultos de ventricosus A. La tasa de consumo de oxígeno se determinó siguiendo las recomendaciones de Barber y Blake (1985), mediante cámaras cerradas (sistemas estáticos) de volumen conocido, las cuales contenían en disolución la concentración de metal a que fueron expuestos los organismos. Los niveles de oxígeno al inicio ( [O2 ini] ) y al final ([O2 fi] ) del tiempo de permanencia de los especimenes en estos dispositivos, se determinaron mediante un oxímetro de 0.1 ppm de lectura mínima, con corrección para salinidad. 398 En los bioensayos con juveniles se colocaron 10 organismos en recipientes de 400 ml de capacidad y se realizaron 3 mediciones, con un lapso de 2 horas entre cada medición . En los experimentos con adultos se utilizaron cámaras de 1 litro de volumen, se colocó un organismo por cámara (Figura 2). Se hicieron de 3 a 4 registros con un lapso de 1 hora entre cada uno. Para determinar el consumo de oxígeno se aplicó la relación descrita por Cech, (1990): ([O2 fi] - [O2 ini]) V Consumo de O2 = Donde Tiempo ([O2 fi ]) = Concentración de oxígeno (mg/l) al final del tiempo de observación. ([O2 ini]) = Concentración de oxígeno (mg/l) al inicio del tiempo de observación. V = Volumen de la cámara (litros). Tiempo =Tiempo transcurrido entre cada medición (horas). Los valores de consumo de oxígeno se corrigieron con los datos obtenidos en la cámara sin organismos. La tasa de consumo de oxígeno se obtuvo al normalizar el consumo de oxígeno con el peso seco de las almejas y se expresó en ml O2/h/g (peso seco). Además, se determinó la CE100 (Concentración Efectiva 100) que es la concentración de metal en la cual se observó un aumento del 100% en la tasa de consumo de oxígeno y la CE50 (Concentración Efectiva 50) que es la concentración de metal en la cual disminuye el 50% la tasa de consumo, en comparación con lo observado en el testigo. 1 5 4 2 3 Figura 4. Dispositivo construido para realizar las evaluaciones de consumo de oxígeno: 1) cámara hermética; 2) Oxímetro; 3) agitador magnético; 4) Electrodo para la lectura de oxígeno; 5) cámara testigo sin organismos. Evaluación de la tasa de excreción de juveniles y adultos de expuestos a metales tóxicos A. ventricosus 399 (6) La tasa de excreción se evaluará paralelamente en los bioensayos donde se hicieron las determinaciones del consumo de oxígeno. En las cámaras herméticas se determinó el contenido de NH3-N en el agua al inicio y término de los experimentos. Se tomaron muestras de 50 ml, se fijaron con fenol 5% (0.5 ml) y se almacenaron a 5 ºC hasta el momento de realizar las determinaciones. Posteriormente se analizaron alícuotas de 10 ml por duplicado, mediante la microtécnica descrita por Solórzano, modificada por Lind (1985) (ver anexo 1). Los valores de excreción de amonio se corrigieron con los datos obtenidos en la cámara control sin organismos y normalizados con el peso seco de las almejas, para obtener la tasa de excreción de NH3-N y se expresaron en g NH3-N /h/g (peso seco). Evaluación del efecto de los metales y sus mezclas sobre la tasa de aclaración La tasa de aclaramiento (tasa de filtración) se estimó de manera indirecta por medio de la remoción de partículas (microalgas Chaetoceros sp.), de una suspensión con volumen y densidad conocidas. Se usó un inóculo de 498,079 cel/ml, mismo que se determinó como el más adecuado en pruebas preliminares, ya que no se observó la formación de seudoheces (Grifftihs y King, 1979). Tanto juveniles como adultos se expusieron a 5 concentraciones de metal y un testigo por triplicado (Tabla 2), además de una cámara sin organismos que se utilizó para determinar el porcentaje de sedimentación de las microalgas. Durante el desarrollo de estos experimentos los organismos fueron alimentados para evitar problemas de estrés por falta de alimento. Las pruebas con juveniles se realizaron en recipientes de 400 ml de capacidad, con burbujeo constante, donde se colocaron 20 organismos. Después de aplicar el inoculo de microalgas, se tomaron muestras (10 ml, por duplicado) cada hora hasta obtener 3 alícuotas las cuales se fijaron con formalina al 5%, para ser analizadas posteriormente. Los experimentos con adultos se hicieron en cámaras de 1 litro de volumen, con burbujeo constante, donde se colocó un organismo por cámara. Se tomaron muestras cada hora después de que se adicionó el inoculo de microalgas, hasta obtener 4 muestras, las cuales se fijaron con formalina al 5%. En las muestras se contó el número de células presentes, con la ayuda de un hematocitómetro (American Optical). El cálculo (7) de la tasa de filtración se hizo mediante la ecuación de Griffiths y King (1979). T. A. V x (ln [Ci]– ln [Cf ]) t Donde T. A. = Tasa de aclaramiento(l/h). V = Volumen de la cámara (litros). Ci = Concentración inicial de células (células/l). Cf = Concentración final de células (células/l). T = Tiempo (horas). También se calculó la CE100 (la concentración efectiva 100) que es la concentración de metal donde la tasa de filtración aumenta 100% en comparación con el testigo y la CE50 (Concentración efectiva 50) donde se observó una disminución del 50% en la tasa de filtración. 400 BIOMARCADORES Determinación de niveles de lipoperoxidación en glándula digestiva y branquia La formación y el efecto de radicales libres originados por la acción de los metales, se evaluará por medio de la técnica desarrollada por Buege y Aust (1978). Este análisis se basa en la reacción del ácido tiobarbitúrico para identificar la presencia de malondealdehídos (MDA) que son el producto de la actividad de los radicales libres sobre las membranas. Se tomaron alícuotas de 1 ml de los homogenizados de la branquia y de la glándula digestiva y se incubaron a 90 ºC con una mezcla de ácido tiobarbitúrico (15%), ácido tricloroacético (0.375%) y ácido clorhídrico (0.25 M) durante 20 minutos. Posteriormente las muestras se centrifugaran (150 rpm) y se analizaran en un espectrofotómetro a 535 nm. Para el cálculo de la concentración de MDA presente en la muestra se utilizó la fórmula de Buege y Aust (op. cit.): C= A εP Donde C = Concentración de MDA (nM de MDA). A = Absorbancia de la muestra. = Coeficiente de extinción 1.56 x 105 M/cm. P = Grosor de la fotocelda (1 cm). Los valores obtenidos se expresaron en nM de MDA/g. (peso seco) (14) Evaluación de daño genético en el tejido de la branquia. El daño genético en las células del tejido de la branquia se evaluará con la técnica de electroforesis unicelular conocida también como ensayo cometa (Singh et al., 1988). Este método consiste en la evaluación de la integridad del material genético de una muestra de por lo menos 100 células, las cuales se lisan bajo condiciones alcalinas y con los núcleos se realiza una electroforesis. La migración del núcleo forma una cauda similar a la cola de un cometa, con el material genético dañado. La longitud de la cauda o cola de cometa es proporcional al grado de daño que tiene la célula (Figura 4). La branquia de los organismos supervivientes en los bioensayos, se extrajo y se pesó en una balanza analítica; posteriormente se disgregó en forma manual. Del disgregado se tomaron 20 l, colocándose sobre una capa de agarosa soportada en un portaobjetos esmerilado. Los portaobjetos con las muestras (dos por cada organismo) se colocaron en una solución (2.5 M NaCl, 100 mM EDTA, 10mM Tris, 1% Tritón X100 y 10% DMSO), para romper las células y obtener los núcleos. Después los portaobjetos se colocaron en la cámara de electroforesis y se les agregó buffer (10 N NaOH, 200 mN NaCl). La duración de la electroforesis fue de 20 minutos, a 25 voltios y 300 amperios. Al término de este proceso, las laminillas con las muestras se tiñeron con 75 l de bromuro de etidio y se analizaron en un microscopio de epifluorescencia con un filtro de 560 nm. 401 Se evaluará la frecuencia de núcleos con y sin cauda, así como el tamaño de las caudas en una muestra de 100 núcleos. Se aplicó la prueba estadística de "t" de student, para determinar la existencia de diferencia entre los lotes de células expuestas al genotóxico y las no expuestas. B A Figura 5. Evaluación de daño genético con la técnica de Electroforesis unicelular. A) núcleo sin daño; B) núcleo con daño genético, se observa el desarrollo de la cauda o cola de cometa. Con el peso de la branquia se determinó el Índice de Tejido Branquial (ITB) mediante la relación: I.T.B. = Peso de la branquia X 100 Peso del organismo (15) Evaluación de cambios histológicos (Histopatología) Para la evaluación histológica, se tomaran muestras de organismos (2 a 3 por tratamiento) cada 24 horas de iniciado un experimento. Los ejemplares se fijaran con formalina al 10% durante 24 horas y después se cambiaron a alcohol etílico al 70%. Posteriormente las muestras se lavaran en agua corriente durante 1 hora y se deshidrataran con alcohol etílico de concentraciones graduales en un procesador de tejidos, luego se incluirán en parafina. Los bloques se cortaran en un micrótomo de rotación para obtener cortes histológicos de 3-5 micras de espesor. Las muestras de tejido se montaran sobre portaobjetos y posteriormente se tiñeron con hematoxilina-eosina (NOAA, 1983; Martoja y Person, 1970;). Las preparaciones se revisaran al microscopio (Olympus con cámara) (40X1200X) para evaluar los cambios en los tejidos con respecto al testigo. 402 BIOENSAYOS DE TOXICIDAD EN CAMARONES PENEIDOS Vanegas C., Zúñiga S., Gaxiola G., Robles C. y Betancourt M. 1. Campo de aplicación. Los lineamientos que se presentan se centran en la evaluación de la toxicidad aguda y crónica de xenobióticos en los camarones peneidos, haciendo énfasis en el camarón blanco Litopenaeus setiferus (Golfo de México) y Litopenaus vannamei (Pacífico mexicano). Se efectúa el mayor énfais en la determinación de la toxicidad aguda (CL50) de tóxicos aislados en agua si bien se señalan lineamientos para la determinación de la toxicidad crónica de xenobióticos. 2. Selección de organismos. El camarón blanco L. vannamei y L. setiferus presentan una amplia distribución en el Pacífico mexicano y en el Golfo de México. Ambas especies presentan una reconocida importancia comercial a la vez que desempeñan un papel ecológico relevante en el ecosistema marino y en los ambientes lagunares-estuarinos. L. vannamei ha sido ampliamente cultivado a nivel mundial mientras que estudios recientes demuestran el elevado potencial de L. setiferus como especie cultivable en México. La reproducción y obtención de ambas especies bajo condiciones de laboratorio ha sido exitosa lo cual garantiza un suministro constante de especímenes. Numerosa literatura ha sido reportada para L. vannamei en contraste con la generada para L. setiferus. No obstante estudios recientes han abordado la fisiología, nutrición, reproducción y ecología de esta última especie (16). Evidencia directa demuestra que las postlarvas y juveniles de la especie son sensibles al efecto tóxico de compuestos nitrogenados (7-11), a los metales pesados (12, 13), a plaguicidas y bifenilos policlorinados (14-20) y a fluidos de perforación del petróleo (21). 3. Origen de los organismos Los organismos para las pruebas, en etapa de larva y/o postlarva deberán de provenir de Laboratorios de producción de postlarvas de reconocida calidad. Para garantizar la calidad de los organismos, deberá de conocerse el manejo previo de los reproductores, el mantenimiento previo de los organismos a ser utilizados en los bioensayos (patrón y dinámica de alimentación; parámetros fisicoquímicos; densidad; pruebas de calidad; etc.) así como las condiciones de su transporte al laboratorio donde se efectuarán las evaluaciones. Los lineamientos que se señalan se circunscriben a los estadios de postlarva y juvenil. 4. Mantenimiento Dependiendo del origen de los organismos, a su llegada al laboratorio deberán ser mantenidos al menos durante los tres primeros días en las condiciones de envío. Los parámetros fisicoquímicos de temperatura y salinidad deberán ser ajustados en una tasa de 1 °C/d y 1 ups/d hasta alcanzar las condiciones de evaluación requeridas, siempre dentro de los intervalos óptimos para cada estadío y para cada especie (Tabla 1). Una vez alcanzadas las condiciones adecuadas, los organismos deberán ser mantenidos en éstas al menos durante tres días antes de los ensayos. 403 Tabla 1. Parámetros fisicoquímicos considerados adecuados para el mantenimiento en condiciones de laboratorio de diferentes estadios de L. setiferus y L. vannamei. T N-NH3 N-NO2S pH O.D. mg/l mg/l mg O2/L °C ups PL 9 25 30 8.4 < 0.2 <5 L. setiferus ≥ 5.0 PL 20-30 28 25-28 8.4 < 0.2 < 5 ≥ 5.0 Juveniles 28 25-28 8.4 < 0.2 <5 ≥ 5.0 > 30 días < 0.2 <5 L. vannamei Juveniles 28 30-35 8.1 ≥ 5.0 1.6±0.1 g T: temperatura; S: salinidad; O.D: oxígeno disuelto; PL-x: días después de larva. Espécie Estadio Densidad n/l 2 org/ L 2 org/ L 1 org/ L Referencia 9;10;4;5;8 9;10;4;5;8;21 9;10;8;21 1 org/ L 22 de la última metamorfosis De manera ideal los organismos deben ser mantenidos en sistemas con filtro biológico y agua de mar artificial (o reconstituída) o bien en sistemas de flujo de agua marina proveniente de áreas no contaminadas, previamente filtrada, y garantizando las condiciones de calidad de la misma. El agua utilizada no deberá estar en contacto con bombas o tubería metálica. El agua de mar artificial (o reconstituída) deberá mantenerse en aireación intensa el mayor tiempo posible antes de su uso tanto para el mantenimiento de los organismos como para las pruebas experimentales. Durante la etapa de mantenimiento y aclimatación, el fotoperiodo se mantendrá acorde a la estación climática o bien 12:12 luz:oscuridad. Diariamente se deberán registrar, controlar y/o regular los parámetros fisicoquímicos. El patrón de alimentación deberá ajustarse de acuerdo a los requerimientos nutricionales de los estadios de cada especie que garantizen una condición fisiológica óptima (Tabla 2). Tabla 2. Patrones de alimentación para diferentes estadios del camarón blanco. Espécie L. setiferus Estadio PL 9 Proteína* Suministro % ad libitum 60 PL 20-30 50 Complemento Referencia Nauplios Artemia sp; 40 1;3;4;5;8 n/d/org Nauplios Artemia sp; 20 1;3;4;5;8 100% PH 2-3 veces/d n/d/org 100% PH 8 2-3 veces/d Juvenile 40 s > 30 días L. vannamei Juvenile 25 – 35 3 veces/d s 1.6±0.1 g * Porcentaje proteico de alimento formulado, particulado. PH: peso húmedo. 22 Esquemas de alimentación para estadios tempranos de L. setiferus y L. vannamei (misis a PL7-10) han sido establecidos por Brito et al. (4) y Brito et al. (5) incluyendo en la dieta nauplios de artemia, Chaetoceros gracilis, Tetraselmis chuii y alimento microparticulado formulado, de acuerdo a las necesidades específicas proteicas de los diferentes estadios tempranos de la especie. La evaluación de los niveles de nitrógeno del amoníaco (N-NH3; mg/L) y del nitrógeno de nitrito (N-NO2; mg/L) deberan efectuarse de manera rutinaria para evitar su acumulación y 404 en consecuencia su acción tóxica sobre los organismos (8,9). La evaluación de los niveles del nitrógeno del amonio total (N-AT; mg L-1) y del nitrito pueden realizarse a través de los métodos de azul de indofenol y de sulfanilamida, respectivamente (23). La determinación de la concentraciónes del N-NH3 se obtendran a través de las ecuaciones señaladas por Bower y Bidwell (24), considerando la salinidad, la temperatura y el pH de la solución experimental. Durante el periodo de aclimatación y mantenimiento los organismos deberán de ser revisados constantemente. Si más del 20% del grupo bajo análisis presenta mortalidad, muestra señales de enfermedad o presenta una condición fisiológica inadecuada, el lote deberá ser descartado para experimentación. 5. Pruebas de toxicidad 5.1. Tóxicos Los tóxicos utilizados deberán tener un elevado grado de pureza (grado reactivo). Si el tóxico es soluble en agua, la solución stock deberá ser preparada en agua desionizada. Si el tóxico es estable en solución, deberá prepararse una solución stock única al inicio de las pruebas. Si el tóxico no es estable en solución (ej. sujeto a oxidación u otras transformaciones químicas y/o biológicas) una nueva solución deberá prepararse previo a su uso. Si el tóxico es una substancia orgánica, no soluble en agua, una solución acuosa stock puede ser obtenida por la disolución inicial del compuesto orgánico en un solvente adecuado (ej. acetona, etanol, propilen-glycol) y posteriormente ser disuelto en un volumen conocido de agua desionizada; si se presenta alguna precipitación se deberá eliminar la solución stock preparada. Cabe señalar que cuando se utiliza un solvente orgánico para preparar la solución acuosa de un tóxico se deberá considerar un testigo reactivo en las pruebas experimentales (evaluación de la concentración del solvente adicionado en el acuario conteniendo la mayor concentración del tóxico evaluado). El volumen máximo que se adicionará de la solución stock a los acuarios experimentales deberá ser el menor volumen posible que no modifique las características del medio experimental (ej. volumen; salinidad; pH). La concentración real del tóxico deberá ser al menos evaluada en submuestras del medio al inicio y al término de los bioensayos. Si se presumen transformaciones y/o cambios en las concentraciones de los tóxicos, se deberán evaluar las concentraciones reales durante el transcurso de las pruebas. Si se efectuán recambios del medio, se deberán evaluar las concentraciones reales antes y después del recambio. 5.2 . Sistema de bioensayos 5.2.1. Cámaras experimentales Los bioensayos deberán ser de tipo estático o semi-estático dependiendo del suministro, la calidad del agua, de la estabilidad del compuesto en estudio y de los estadios de los organismos en evaluacion. El agua para los experimentos provendrá de un sistema contínuo de bombeo de agua de mar de una playa cercana, previamente filtrada (filtración mecánica, química y UV), fuertemente aireada y decantada en oscuridad al menos 48 h antes de su utilización; alternativamente se utilizará agua de mar artificial preparada según protocolos convencionales, fuertemente aireada y decantada en oscuridad al menos 48 h antes de su utilización. Los acuarios experimentales deberán ser preferentemente de vidrio, lavados previamente con agua ácida y enjuagados con agua de mar antes de su uso. La forma de las cámaras dependerá de los estadios bajo análisis; en el caso de los juveniles de los camarones el área es un aspecto de importancia dado el hábito bentónico 405 de los organismos. El volumen de las cámaras deberá de considerar la edad y el peso de los organismos. Se recomienda un litro de solución por gramo de tejido animal si bien de manera ideal deberá de utilizarse de 2 a 3 l de solución por gramo de tejido animal. 5.2.2. Parámetros fisicoquímicos En el transcurso de las pruebas deberán registrarse y mantenerse constante la salinidad, el pH, la temperatura y el oxígeno disuelto (la aireación deberá ser constante, de burbujeo fino); los niveles de amonio y de nitrito no deberán exceder los señalados en la Tabla 1. El fotoperiodo se mantendrá en 12:12 luz:oscuridad. 5.2.3. Alimentación 24 h antes del desarrollo de las pruebas, los organismos no deberán ser alimentados a fin de evitar interferencia de los procesos digestivos (9-11). Dependiendo del tiempo de exposición y de los objetivos de las pruebas, los organismos serán o nó alimentados durante el transcurso de éstas. Si los organismos son alimentados, el suministro deberá ser de manera ideal una vez al día, retirando el alimento remanente después de periodo de alimentación adecuado para cada estadio y retirando posteriormente las heces producidas. En este caso, el agua de los acuarios deberá ser recambiada diariamente (al menos 50%) y las soluciones y concentración de los tóxicos deberán ser apropiadamente ajustadas. 5.2.4. Organismos Tanto las postlarvas como los juveniles en analisis deberán estar en etapa de intermuda y deberán de presentar estadios y pesos similares. De manera ideal los organismos a ser colocados en las cámaras experimentales deberán ser pesados y medidos. Alternativamente, una sub-muestra representativa (mínimo 30 organismos) deberá ser pesada y medida. Durante el desarrollo de esta actividad los organismos deberán manipularse lo menos posible para evitar un estres excesivo. 5.2.5. Duración de las pruebas y recambio El periodo de exposición dependerá de los objetivos que se persiguen. De manera ideal las pruebas se realizarán durante 72 h para postlarvas y de 96 h para juveniles. Para periodos mayores, los organismos deberán ser alimentados para evitar alteraciones nutricionales o de inanición. Cuando los organismos no son alimentados, en el caso de pruebas con tóxicos de baja estabilidad química y biológica, las soluciones de prueba deberán ser recambiadas diariamente; en caso contrario, la prueba será inválida. Para tóxicos de conocida estabilidad, de manera ideal las soluciones deberán ser renovadas cada 48 h. Por otro lado, cuando los organismos son alimentados diariamente, se deberán renovar las soluciones inmediatamente después del retiro de las heces producidas. En las pruebas con recambio se deberán tomar muestras de las soluciones antes y después de los recambios para determinar las concentraciones reales de los tóxicos. Si la concentración de los tóxicos se modifica más del 20% respecto a las concentraciones nominales, se deberán considerar mayores volúmenes de recambio. 5.3. Biobúsqueda o Pruebas de Intervalo de toxicidad Para estimar la toxicidad de un xenobiótico se deberán efectuar pruebas previas de biobúsqueda o de intervalo de toxicidad. Cuando se carece de la información relativa a la toxicidad del producto se deberán de utilizar progresiones de las concentraciones en escala logarítimica; cuando existe información disponible, por ej. en otras especies de peneidos de estadios y habitas similares, se podrán utilizar progesiones de las concentraciones en escala aritmética. Se considerará un mínimo de seis concentraciones 406 experimentales y un grupo testigo sin adición del tóxico. En el caso de que el tóxico se requiera disolver para incrementar su solubilidad deberá de considerarse un grupo testigo adicional para valorar el efecto del solvente utilizado. Se considerará al menos una réplica por cada concentración. Por cada concentración se expondrán un mínimo de 20 organismos en el caso de postlarvas y de 10 en el caso de juveniles, los cuales en cada caso serán elejidos de los sistemas de mantenimiento y colocados al azar en los acuarios experimentales de exposición. Previo a la adición de los tóxicos, los organismos se mantendrán mínimo 24h en aclimatación en los acuarios de exposición, sin adición de alimento. El volumen máximo que se adicionará de la solución stock a los acuarios experimentales a fin de obtener las concentraciones seleccionadas de los tóxicos, deberá ser el menor volumen posible que no modifique las características del medio experimental (ej. volumen; salinidad; pH). La adición deberá efectuarse de manera muy lenta (para evitar una posible exposición de los organismos a la elevada concentración de la solición stock o madre) con una agitación suave, garantizando la completa mezcla del tóxico en el medio y cuidando de no alterar el comportamiento de los organismos expuestos. La mortalidad se registrará a lo largo del tiempo de exposición, con observaciones a las 0, 2, 4, 8, 12 y cada 12 horas posteriores hasta el término de la exposición. Los organismos muertos durante el periodo de exposición deberán ser removidos lo antes posible para evitar el deterioro de la calidad del agua. En adición a la mortalidad, se registrarán posibles cambios en el comportamiento de los camarones (ej. alteraciones del equilibrio, nado errático, cambios en la actividad locomotora, alteraciones en la alimentación, etc.) así como las mudas producidas. La falta de respuesta de los organismos cuando sean tocados suavemente con una varilla de vidrio se considerará como criterio de mortalidad. Si en el transcurso de las pruebas, la mortalidad de los grupos testigo excede el 10%, la prueba se invalida; el uso de factores de corrección por la mortalidad de los testigos no es válida. 5.4. Bioensayo definitivo. A partir de los resultados de la biobúsqueda, se establecerán las concentraciones adecuadas para evaluar la toxicidad aguda del producto o compuesto. Se seguirá el mismo procedimiento señalado previamente si bien se recomienda en este caso evaluar un mínimo de dos réplicas por concentración experimental. Al igual que en la biobúsqueda, la mortalidad se registrará a lo largo del tiempo de exposición, con observaciones a las 0, 2, 4, 8, 12 y cada 12 horas posteriores hasta el término de la exposición la cual puede prologarse hasta 144 h o más dependiendo de los objetivos que se persiguen y garantizando siempre un suministro de alimento adecuado para los organismos. El periodo fijado de exposición deberá ser durante el periodo de intermuda de los organismos, a fin de evitar interferencias con los eventos (bioquímicos y fisiológicos) que se desencadenan en el proceso de muda. 5.5. Cálculos A partir de los resultados de mortalidad obtenidos se determinará la concentración letal media (CL50-t), esto es la concentración (X) a la cual muere el 50% de la población en un tiempo determinado (t, h) y/o el tiempo mediano de muerte (TL50), esto es el tiempo (t, h) en el cual muere el 50% de la población en una concentración determinada (X). En ambos casos no se considerarán en los análisis el grupo testigo (no adición del tóxico; mortalidad < 10%) o las concentraciones en las cuales se obtuvo el 100% de mortalidad. 407 Para la determinación de la CL50 y/o TL50, se utilizarán los programas de cómputo diseñados para ello utilizando preferentemente modelos probit : X, probit : log X y/o arcoseno : X, seleccionando el modelo de mejor ajuste y estableciendo la significatividad de los modelos a través de la prueba de X2. En cada caso se obtendrán los valores de CL50-t ± I.C. y TL50-x ± I.C. (I.C. = intervalo de confianza; α = 0.05). 5.6. Validación de los bioensayos definitivos. Los bioensayos serán validos siempre y cuando cumplan con los siguientes especificaciones: a) La mortalidad del grupo testigo no deberá ser mayor del 10% en el caso de juveniles. Para el caso de postlarvas, la mortalidad del grupo testigo no debera ser mayor a la mortalidad natural de cada una de las especies. b) La concentracion real de los toxicos no debera exceder el 20% de la concentracion nominal de los mismos c) Independientemente de la aceptación del modelo seleccionado, el valor de la CL50 deberá estar incluido dentro de las concentraciones experimentales (interpolación) con la finalidad de asegurar un adecuado nivel de confianza. 5.7. Literatura Citada (1) Gaxiola G. 1994. Requerimientos nutricionales de las postlarvas de Penaeus setiferus y Penaeus duorarum (Crustacea, Penaeidea). Tesis de Grado de Doctor en Ciencias. Facultad de Ciencias. Universidad Nacional Autónoma de México. México. (2) Rosas C., A. Bolongaro-Crevenna, A. Sánchez, G. Gaxiola, I. Soto and E. Escobar. 1995a. Role of digestive gland in the energetic metabolism of Penaeus setiferus. Biological Bulletin. 189: 168-174. (3) Rosas C., A. Sánchez, P. Gallardo, J. Quiroz, G. Gaxiola, E. 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Posgrado en Ciencias del Mar y Limnología. Universidad Autónoma de México. UNAM. 408 (7) Alcaraz G., V. Espinoza, X. Chiapa and C. Vanegas. 1997. Temperature tolerance of Penaeus setiferus exposed to ammonia and nitrite. Aquatic Toxicology. 39 (3-4): 345-353. (8) Robles C. 1997. Alteraciones fisiológicas de postlarvas y juveniles de camarón blanco Penaeus setiferus (Crustacea, Decapoda) por efecto del amoniaco. Tesis de Grado de Maestría en Ciencias. Facultad de Ciencias. Universidad Nacional Autónoma de México. México. (9) Alcaraz G., X. Chiapa, V. Espinosa and C. Vanegas. 1999a. Acute toxicity of ammonia and nitrite to white shrimp Penaeus setiferus postlarvae. Journal of the World Aquaculture Society. 30 (1): 90-97 (10) Alcaraz G., V. Espinosa and C. Vanegas. 1999b. Acute effect of ammonia and nitrite on respiration of Penaeus setiferus postlarvae under different oxygen levels. Journal of the World Aquaculture Society. 30 (1): 98-106. (11). Frias-Espericueta,M.G., M. 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Litopenaeus vannamei juveniles energetic balance and immunological response to dietary proteins. Aquaculture. 239: 375-395. (23) Rodier, J. 1981. Analisis de las aguas. Omega. Barcelona. 504 p (24) Bower, C. E. y J. P. Bidwell. 1978. Ionization of ammonia in seawater: Effects of temperature, pH and salinity. J. Fish Res. Board. Can. 35:1012-1016. (25) UNEP/FAO/IAEA. 1986. Test of the lethal toxicity of pollutants to marine fish and invertebrates. Reference Methods for Marine Pollution Studies. No 43. UNEP. 23 pp 410 BIOENSAYOS DE TOXICIDAD EN Xiphophorus montezumae G. Alcaraz y M. Badillo 1. Campo de aplicación. Los lineamientos que se presentan se centran en la evaluación de la toxicidad aguda y crónica de tóxicos en peces poecílidos de la especie Xiphophorus montezumae. Se efectúa el mayor énfasis en la determinación de la concentración letal media (CL50) de tóxicos aislados, si bien se señalan lineamientos para la determinación de la toxicidad crónica de xenobióticos. 2. Selección de organismos. El pez cola de espada de Moctezuma (X. montezumae) es una especie endémica de México. Se distribuye en el noroeste de México, en las cuencas del río Tamesí en Tamaulipas, al norte de Veracruz y en los afluentes del río Pánuco en San Luis Potosí. Sin embargo, su localidad tipo es en el manantial Capuchinas y Río Verde, cerca de Rascón en San Luis Potosí (Espinoza, 1993). En general todas las especies del género Xiphophorus son cultivables y pueden estar a disposición de cualquier acuarista. Sin embargo, el 95% de los “Xifos” que se encuentran en los comercios de peces nada tienen que ver con los ejemplares silvestres. Es decir, los Xifos comerciales con llamativos colores son consecuencia de la hibridación realizada por el hombre entre especies de peces con espadas (como X. helleri) y los Platys o especies de peces sin espada (como X. Maculatus). Por lo tanto, los organismos que se adquieran en comercios para ser utilizados en las pruebas de toxicidad deberán ser descendientes directos de organismos silvestres o bien deberán ser capturados de las cuencas de donde son endémicos. 3. Origen de los organismos Los organismos para las pruebas deberán de ser capturados o ser descendientes de organismos silvestres, de preferencia de alguna de las localidades tipo en San Luis Potosí (Manantial Capuchinas y Río Verde). Para garantizar la calidad de los organismos deberán de capturarse organismos sanos. Durante su traslado al laboratorio, donde se 411 realizarán las evaluaciones de toxicidad, los organismos deberán ser manipulados lo menos posible para disminuir el estrés. 4. Mantenimiento Las condiciones físicas y químicas del agua en que se mantendrán los organismos en el laboratorio dependerán del origen de los organismos, dado que se mantendrán las condiciones de colecta. Los organismos se mantendrán durante los tres primeros días en las condiciones de captura. Los parámetros fisicoquímicos de temperatura deberán ser ajustados a los niveles deseados a una tasa de 1 °C/d hasta alcanzar las condiciones de evaluación requeridas (siempre dentro de los intervalos registrados en el ambiente). Una vez alcanzada las características físico-químicas deseadas, los organismos se mantendrán en éstas al menos durante 7 días antes de dar inicio a los ensayos. La temperatura óptima para esta especie es de 25 °C aunque se puede mantenerse de manera adecuada en un intervalo de 20 a 27 °C. El pH adecuado es Neutro-alcalino (7 8) y la dureza debe de mantenerse entre 4 y 8 dH (tipo dura). El control de la concentración de amonio, nitritos y nitratos en el agua se mantendrá a través de cambios parciales de agua. Durante la etapa de mantenimiento y aclimatación, el fotoperiodo se mantendrá a 12:12 luz:oscuridad. Diariamente se deberán registrar y controlar los parámetros fisicoquímicos del agua. Los organismos se mantendrán en tanques medianos o grandes (40 –80 L de capacidad) equipados con sistemas de filtro biológico o filtros de cascada. El sistema de filtración debe ser potente, pero con poca generación de corriente. Se deberá de evitar el contacto del agua con bombas o tubería metálica, el agua almacenada para recambios deberá de mantenerse con aireación intensa el mayor tiempo posible antes de su uso, tanto para el mantenimiento de los organismos como para las pruebas experimentales. En cuanto a la alimentación se recomienda un aporte alimenticio combinado entre alimento comercial en hojuelas y de tipo congelado (Artemia sp) o vivo (Artemia, larvas de mosquito o Daphnia). El patrón de alimentación diaria será: alimento vivo o congelado por las mañanas y en hojuelas por las tardes. 412 Tabla 1.- Valor nutricional del alimento desecado en hojuelas Análisis Porcentaje Proteína cruda 46 Grasa cruda 8.0 Fibra cruda 2.0 Humedad 6.0 Fósforo 1.3 Vitamina 193 mg/kg Durante el periodo de aclimatación y mantenimiento, los organismos deberán de ser revisados constantemente. Si se presenta mas del 10% de mortalidad en el grupo, se observan indicadores de enfermedad o se detecta algún tipo de condición funcional o conductual inadecuada, el lote deberá ser descartado para experimentación. 5. Pruebas de toxicidad 5.1. Tóxicos Los reactivos utilizados para las pruebas deberán tener un elevado grado de pureza (grado reactivo). Si el tóxico es soluble en agua, la solución stock deberá ser preparada en agua desionizada. Si el tóxico es estable en solución, deberá prepararse una solución stock única al inicio de las pruebas. Si el tóxico no es estable en solución debido a posibles transformaciones químicas y/o biológicas deberá de prepararse una nueva solución antes de su uso. Cuando se trate de una sustancia orgánica, no soluble en agua, deberá de realizarse una disolución inicial del compuesto orgánico en un solvente adecuado (de acuerdo al químico de que se trate), para y posteriormente ser disuelto en un volumen conocido de agua desionizada. En estos casos será necesario utilizar un testigo reactivo en las pruebas experimentales. El volumen máximo que se adicionará de la solución stock a los acuarios experimentales deberá ser el menor volumen posible, de tal manera que no modifique de manera significativa las características físico-químicas del medio experimental (volumen, pH, etc). 413 En todos los casos la concentración real del tóxico deberá ser evaluada en muestras del medio al inicio y al término de los bioensayos. Si se presumen transformaciones y/o cambios en las concentraciones de los tóxicos, se deberán evaluar las concentraciones reales de manera frecuente durante el transcurso de los ensayos. 5.3 . Sistema de bioensayos 5.2.1. Cámaras experimentales Los bioensayos deberán ser de tipo estático o semi-estático. El agua para los experimentos se almacenará en tanques de plástico y será aireada en oscuridad 48 h antes de su utilización. Los acuarios experimentales deberán de ser de vidrio. El material que se utilice debe estar limpio; el lavado deberá de realizarse con agua ácida y el enjuague con agua destilada. Se deberá de utilizar el material completamente seco. Las dimensiones y volumen de los acuarios experimentales dependerán del tamaño y peso de los organismos bajo análisis. Aunque de acuerdo a la literatura se recomienda un litro de solución por gramo de tejido animal para organismos juveniles, para asegurar condiciones adecuadas deberá de utilizarse de 2 a 3 L de solución por gramo de tejido animal. 5.2.2. Parámetros fisicoquímicos En el transcurso de las pruebas deberán registrarse y mantenerse constante el pH, la salinidad, la temperatura, la dureza y el oxígeno disuelto (la aireación deberá ser de burbujeo fino y constante durante el tiempo de exposición). El fotoperiodo se mantendrá en 12:12 luz:oscuridad. 5.2.3. Alimentación Se suspenderá la alimentación de los animales 24 h antes iniciar el desarrollo de las pruebas, esto con el fin de evitar interferencia de los procesos digestivos. Cuando se trate de exposiciones crónicas o semi-crónicas los organismos deberán de ser alimentados durante el transcurso de los ensayos. En este caso la alimentación deberá de ser estrictamente controlada en cuanto a la cantidad y tiempo de alimentación (restringiendo el tiempo de esta actividad a dos periodos de 1 h/ día). Es indispensable retirar el alimento remanente al término del periodo de alimentación y las heces producidas posteriormente; estas actividades se deberán de realizar evitando al máximo generar estrés en los animales. En los casos en los que se requiera alimentar a los animales durante los ensayos se deberán de realizar recambios de agua diariamente, ajustando la 414 concentración de los tóxicos de manera adecuada. Se deberá en este caso de medir la concentración real del tóxico de manera diaria. 5.2.4. Organismos Todos los organismos experimentales deberán de ser medidos y pesados cuidadosamente 24 horas antes de colocarlos en los acuarios experimentales. Los organismos experimentales expuestos a los diferentes niveles del tóxico deberán de ser similares en talla (longitud estándar y peso), así como en madurez sexual (se recomienda usar juveniles). 5.2.5. Duración de las pruebas El periodo de exposición dependerá de los objetivos que se persigan. Las pruebas de toxicidad aguda deberán de realizarse por un periodo mínimo de 96 h. Como se señala anteriormente, para periodos mayores los organismos deberán de ser alimentados durante la prueba para evitar alteraciones nutricionales. Cuando se requiera alimentar a los animales, los recambios de agua deberán de realizarse después del retiro de las heces. En todos los casos en que se practiquen recambios se deberán tomar muestras de las soluciones de exposición antes y después de los recambios para determinar las concentraciones reales de los tóxicos. En caso de que la concentración del tóxico difiera en más del 20% respecto a la concentración nominal, se deberán considerar mayores volúmenes de recambio. En el caso de tóxicos de baja estabilidad química y biológica, las soluciones de prueba deberán ser recambiadas diariamente. En el caso de tóxicos de conocida estabilidad las soluciones deberán ser renovadas cada 48 h. 5.3. Biobúsqueda Antes de iniciar las pruebas de toxicidad definitivas se deberán de efectuar pruebas previas o biobúsqueda para determinar los intervalo de toxicidad. Se recomienda utilizar progresiones de las concentraciones en escala logarítimica. Sólo cuando se cuente con información disponible sobre la toxicidad del químico y de la especie se sugiere utilizar progresiones de las concentraciones en escala aritmética. Se utilizará mínimo de siete concentraciones experimentales y un grupo testigo sin adición del tóxico. En el caso de 415 que el tóxico se requiera disolver para incrementar su solubilidad deberá de considerarse un grupo testigo adicional para valorar el efecto del solvente utilizado. Se considerará al menos una réplica por cada concentración. Por cada concentración se expondrán un mínimo 10 organismos. Los organismos se mantendrán durante un mínimo e 24h en aclimatación en los acuarios de exposición antes de añadir el tóxico. La mortalidad se registrará a lo largo del tiempo de exposición, con observaciones a las 0, 2, 4, 8, 12 y cada 12 horas posteriores hasta el término de la exposición, la cual se sugiere de 96 h para juveniles. Los organismos muertos durante el periodo de exposición deberán ser removidos inmediatamente para evitar la contaminación del agua. En adición a la mortalidad, se registrarán posibles cambios en el comportamiento de los organismos (ej. alteraciones del equilibrio, nado errático, alteraciones en la alimentación, etc.). La falta de respuesta de los organismos cuando sean tocados suavemente con una varilla de vidrio se considerará como criterio de mortalidad. Si en el transcurso de las pruebas, la mortalidad de los grupos testigo excede el 10 %, la prueba se considerará inválida. En ningún caso deberá de aplicarse el uso de factores de corrección para la mortalidad de los testigos. 5.4. Bioensayo definitivo. A partir de los resultados de la biobúsqueda se establecerán las concentraciones adecuadas para evaluar la toxicidad aguda del tóxico. Se seguirá el mismo procedimiento señalado previamente si bien se recomienda en este caso evaluar un mínimo de dos réplicas por concentración experimental. Al igual que en la biobúsqueda, la mortalidad se registrará a lo largo del tiempo de exposición, con observaciones a las 0, 2, 4, 8, 12 y cada 12 horas posteriores hasta el término de la exposición. Se considerarán 96 horas en pruebas de toxicidad aguda o más en pruebas crónicas, dependiendo de los objetivos. 5.5. Cálculos A partir de los resultados de mortalidad obtenidos de las pruebas de toxicidad aguda se determinará la concentración letal media (CL50) y/o el tiempo mediano de muerte (TL50). Para el análisis no se considerarán los datos de los grupos testigos, las concentraciones o tiempos en que la sobrevivencia sea 100% o bien 416 las concentraciones con 100% de mortalidad. Para la determinación de la CL50 y/o TL50, se utilizarán los programas específicos de cómputo diseñados para este fin. Preferentemente se utilizarán modelos tipo probit : X, probit : log X y/o arcoseno: X. Se utilizará el modelo de mejor ajuste. La validez de los modelos se determinará a través de la prueba de X2. En cada caso se obtendrán los valores de CL50-t ± I.C. y TL50-x ± I.C. (I.C. = intervalo de confianza; α = 0.05). 5.6. Referencias Alcaraz G., X. Chiapa, V. Espinosa and C. Vanegas. 1999a. Acute toxicity of ammonia and nitrite to white shrimp Penaeus setiferus postlarvae. Journal of the World Aquaculture Society. 30 (1): 90-97 Alcaraz G., V. Espinosa and C. Vanegas. 1999b. Acute effect of ammonia and nitrite on respiration of Penaeus setiferus postlarvae under different oxygen levels. Journal of the World Aquaculture Society. 30 (1): 98-106. Espinoza, H. P. 1993. Listados faunísticos de México III. Los peces dulceacuícolas mexicanos. Depto. De Zoología, I.B. Universidad Nacional Autónoma de México. México. Kruesi, C. K. 2004. Desempeño de nado en machos de Xiphophorus montezumae: El costo de un ornamento. Tesis Licenciatura. Facultad de Ciencias, UNAM. 45 p. Vanegas C. 1996. Efectos subletales del cadmio y del zinc en el camnarón blanco Penaeus setiferus. Tesis de Grado de Doctor en Ciencias. Facultad de Ciencias. Universidad Nacional Autónoma de México. México. 417 ANEXO 9. PROCEDIMIENTO PARA LA GENERACIÓN DE EXTRACTOS ORGÁNICOS Y ELUTRIADOS DE SUELOS Y SEDIMENTOS PARA SU ANÁLISIS EN PRUEBAS DE TOXICIDAD 418 3. PROCEDIMIENTO PARA LA GENERACIÓN DE EXTRACTOS ORGÁNICOS Y ELUTRIADOS DE SUELOS Y SEDIMENTOS PARA SU ANÁLISIS EN PRUEBAS DE TOXICIDAD YOLANDA PICA GRANADOS Instituto Mexicano de Tecnología del Agua, Cuernavaca, Morelos, México 3.1. Principio 3.2 Campo de aplicación 3.3 Definiciones 3.4. Reactivos 3.5. Materiales y Equipos 3.6. Procedimiento 3.7 Precauciones 3.8. Manejo de datos REFERENCIAS 3. 1 PRINCIPIO La toxicidad, medida a través de los protocolos de prueba actualmente planteados para organismos como Daphnia magna, Vibrio . fischeri, P. subcapitata y algunos otros, esta referida a los efectos causados por compuestos en la fase soluble o solubilizados, de tal modo que en el caso de matrices sólidas es necesario llevar a esta fase los materiales contaminantes contenidos en los sólidos que se desean analizar ( ej. sedimentos, suelos y productos industriales ) aplicando un procedimiento controlado que permita el análisis de su toxicidad empleando diversas especies de organismos de prueba sin la generación de falsos positivos. Causados por la interferencia del tratamiento de las muestras. 3. 2 CAMPO DE APLICACIÓN Es aplicable en el análisis de matrices sólidas (ej. suelos, sedimentos, productos químicos etc.) con el objetivo de extraer los compuestos tóxicos solubilizables en los solventes de extracción seleccionados por su posibilidad de aplicarse, en volúmenes controlados, para el desarrollo de pruebas de toxicidad. Los resultados de toxicidad que surjan de esta clase de manejo de muestra ya sea por medio de elutriados, de extractos orgánicos o ambos, pueden ser aplicables 419 para comparaciones de dosis efectos cuando se comparan con el contenido de contaminantes químicos (en casos en que las propiedades de polaridad de los solventes empleados sea consistente para ambos), así mismo es de utilidad para zonificar los gradientes de afectación en un sitio (ej. suelos o sedimentos), o en su defecto, para el seguimientos del comportamiento en el tiempo, de un material que se sospecha tóxico (ej. suelo, sedimento o materiales diversos), entre otros. La aplicación de esta herramienta en estudios ambientales más amplios también puede ser aplicable con fines de investigación ya que brindan información sobre el potencial tóxico, sin embargo su interpretación requerirá de conjuntar otras variables acordes a los objetivos de cada proyecto, de modo que la integración y las implicaciones de dicha información deberá ser manejada por especialistas en el tema. 3.3 DEFINICIONES Estas definiciones han sido adecuadas a las necesidades del procedimiento. Elutriado.- Extracto acuoso Blanco .- es usado indistintamente con la palabra control. Control negativo o blanco de procedimiento.- se asigna este término al lote o tratamiento, dentro del diseño experimental, que replica las condiciones que afectan al conjunto de tratamientos, excepto la sustancia o mezcla de ellas que son investigadas en la prueba. Control positivo se asigna este término a una muestra, dentro del diseño experimenta del procedimiento de trabajo, cuya respuesta (CE 50) y su variabilidad ha sido previamente evaluada y calibrada a través de pruebas de toxicidad. Esta muestra se prepara tomando como muestra materiales empleados como de referencia. 3. 4 REACTIVOS • • Metanol calidad HPCL, Plaguicida o Nanogrado. Agua destilada o desionisada 3.5 MATERIAL Y EQUIPO Material • • • • Sistema de extracción soxhlet. Vaso pp. 250 o 500 mL Conos de papel filtro No.1 purificados Pipetas pasteur 420 • • • • • Viales cromatográfico de 5 mL con tapa de rosca Viales aforados de 5mL Tubos de centrífuga plástico, desechables, estériles y de fondo cónico de 50 mL con tapa Tamiz de No. 60 Morteros y mano de mortero Equipo • • • • • • • • • Balanza analítica Parrilla de extracción: Evaporador Rotatorio Buchi Horno de secado (40 ± 5 °C). Plancha de calentamiento o Dispensador de nitrógeno. Refrigerador a temperatura de 4 ± 2°C. Pipetas automáticas de 1000 μL Centrífuga Baño ultrasónico 3.6 PROCEDIMIENTO Para el análisis de materiales sólidos (ej. suelos, sedimentos u otros) se maneja el material con base en peso seco para la producción de extractos orgánicos. Para la generación de elutriados puede emplearse el material en su estado original (base húmeda o seca). 3.6.1 Preparativos Para muestras de suelo y sedimentos, y en otros casos en que esto aplique, el material es secado a temperatura ambiente o, en su defecto, con ayuda de un horno de secado a una temperatura de 40 ± 5 °C. Posteriormente el material se disgrega y se muele en mortero hasta que este logre su paso por un tamiz de malla del No. 60 (equivalente a 2mm de apertura de malla). En caso de productos químicos o manufacturados cuya presentación sea en polvos, estos se procesan en su forma original sin molido o tamizado previo . Una vez listo el material, se pesan idealmente 20 gr, sin embargo de no haber muestra suficiente puede emplearse cantidades de 10 gr. en adelante o incluso menores (5 gr), sólo si se sospecha que la muestra podría contener carga elevada de tóxicos. 421 El material, para la producción de los extractos orgánicos, se pesa llenando un cono de papel filtro del No. 1 (12.5 cm.) donde quedarán empacados. El papel filtro se purifica con días de anticipación empleando la extracción en soxhlet en los mismos términos del manejo indicado para muestras (11.5.1- 11.5.5) dejándose secar a temperatura ambiente. En el caso de la producción de elutriados, el material se pesa llenando un tubo de centrífuga de 50 mL de material plástico esterilizado en el que se efectuará el elutriado. Para ambos casos, extractos orgánicos o elutriados, deberá registrarse en la bitácora del analista. el peso correspondiente 3.6.2 Extracción soxhlet (extracto orgánico) La muestra contenida en el cono de papel filtro se introduce en el vaso del sistema soxhlet y se monta junto con el refrigerante y el matraz de bola. El volumen del solvente en el matraz de bola puede variar dependiendo de la capacidad del sistema soxhlet en uso,, requerirá de 250 mL para el mas pequeño o hasta 350 ml para uno de mayor volumen Ajuste el volumen del solvente considerando que al condensarse e ir goteando en el interior del vaso del soxhlet, debe llegar al codo de vaciado sin que el matraz de bola se vacíe, en el debe quedar siempre un excedente para evitar que el extracto se queme. Montar el sistema soxhlet en la parrilla de extracción. En el caso del uso de metanol como solvente de extracción, encender cada parrilla colocando el indicador de temperatura en el número 5 o 6, conectar simultáneamente el sistema de enfriamiento a una temperatura de 10 a 18 °C, cuanto más frío la condensación será más eficiente. En el caso de uso de metanol la extracción debe mantenerse en funcionamiento por un tiempo de alrededor de 20 h, que es equivalente a aproximadamente a 10 o 12 ciclos de renovación. En caso del uso de otro solvente el tiempo de extracción puede variar, en cuyo caso deberán hacerse los ajustes de tiempo, temperatura y ciclos adecuados correspondientes. Al término del periodo apagar las parrillas y dejar enfriar aun con el flujo de enfriamiento en funcionamiento. Desmontar los sistemas de extracción Recuperar en el matraz de bola el solvente aún contenido en el vaso. 422 Cubrir con papel aluminio la boca de los matraces de bola que contienen los extractos orgánicos y mantener en refrigeración hasta que se proceda a la evaporación y concentración del extracto. Por cada lote de muestras monte un blanco y un control positivo 3.6.3 Evaporación Llene el Baño Maria del equipo de evaporación a un nivel que cubra los matraces de bola una vez inmersos en él. Si el extractos es con base en metanol, caliente el baño a 40 ± 5 °C y conecté la fuente de enfriamiento del refrigerante del mismo cuidando que se logre un a cuya temperatura de 10 a 18 °C. En caso de la concentración de extractos metabólicos, acoplar una bomba de vacío conectada al refrigerante del evaporador rotatorio Colocar el matraz de bola conteniendo el extracto, ajustar el seguro de la boca de evaporador y girar a cierre la válvula de alivio del condensador del evaporador rotatorio. Encienda la bomba de vacío y ajústela a una presión de 30 a 40 psi, simultáneamente gire la perilla de rotación del equipo evaporador para que el matraz de bola empiece a girar. Elija una velocidad media. Ajuste su sistema de evaporación a fin de optimizar el proceso de concentración, para ello ajuste la presión, la temperatura del Baño Maria y de la fuente de enfriamiento tomando como base la siguiente información. Cuanto menor es la presión que se emplea se requiere manejar la temperatura del baño en el límite máximo aceptable (45 °C) y la de enfriamiento en los niveles más bajos mientras que cuando la presión es mayor podemos emplear una menor temperatura en el baño y un enfriamiento de temperatura media dentro del ámbito optimo señalado. Cuando el volumen del solvente sean de alrededor de 2 ml, detenga la rotación de la bola, apague la bomba de vacío y gire la válvula de alivio del condensador para abrirla y liberar el vacío. Una vez hecho lo anterior podrá retirar el matraz de bola y colocar el siguiente. 3.6.4 Trasvasado Enjuague los viales de 5 ml con metanol y deje secar. Transfiera el concentrado contenido en el matraz de bola a un vial de 5 ml empleando una pipeta Pasteur (no las reutilice). Tome volúmenes adicionales de solvente limpio (ej. Metanol) para limpiar las paredes del matraz, recupérelo y adiciónelo también al vial junto con el concentrado previamente trasvasado. Reduzca los volúmenes del concentrado del extracto colocando los viales sobre una parrilla tibia, logre la temperatura idónea solo encendiendo la parrilla sin 423 seleccionar niveles de calor (aproximadamente 30- 45 °C), también puede hacerse uso de flujo de nitrógeno para su concentración. Cuando el nivel del volumen en el vial se encuentre reduzca a la mitad de su capacidad, podrá nuevos volúmenes que resulten de los enjuagues posteriores del matraz de extracción. Enjuague este recipiente hasta que las paredes queden limpias, siempre incorporando el solvente al vial con el concentrado. Una vez terminada la limpieza del matraz deje reducir e volumen del concentrado contenido en el vial hasta alcanzar un aproximadamente 3 mL.. Cubra y guarde los viales en refrigeración hasta toxicidad. su análisis en pruebas de 3.6.5 Preparativos para pruebas de toxicidad de extractos orgánicos Transfiera el volumen de los viales conteniendo el concentrado a viales aforados. Emplee enjuagues al vial original usando solvente limpio (ej. metanol), adicione al vial aforado hasta alcanzar el nivel de 4 mL Para preparar su sistema de prueba emplee como volumen máximo del extracto orgánico, un volumen menor o igual a la concentración de solvente ( % v/v) correspondiente al nivel de efecto no observable (NOEC), el cual deberá haber sido previamente determinado. Dentro del sistema de prueba, la manera de demostrar una adecuada selección de los volúmenes de solvente a niveles que no generan falsos positivos es a través de la respuesta obtenida del análisis de toxicidad del Blanco de procedimiento el cual deberá no presentar efecto en las pruebas de toxicidad, o en su defecto. este no deberá ser mayor al efecto observado en el control negativo . Para el caso del metanol, la concentración máxima de este solvente en el sistema de prueba que se establece como recomendable para Daphnia magna, Vibrio fischeri, e Hydra attenuata, debe ser ≤ 1.2 .% . En caso de P. subcapitata este debe ser ≤ 0.1%. Tomando como ejemplo el sistema de prueba con Vibrio fischeri, cuyo volumen final en el preparado de la concentración inicial es de 2750 μL, que se logra al adicionar 250μL de solución de ajuste osmótico (MOAS) y 2500mL de la muestra, entonces se tendría que hacer el siguiente preparado: Adicional los 250 μL de MOAS a la celdilla que contendrá la máxima concentración Posteriormente adicionar 2500 μL de agua de reconstitución. Mezclar con ayuda de la micropipeta de 1000 μL, succionando y eyectando el líquido tres veces Con ayuda de una micropipeta de volumen variable ajustada a 30 μL, succionar ese volumen de la celdilla en preparación, de modo que quede a 2720 μL su llenado. 424 Posteriormente restituir el volumen, nuevamente a 2750 μL, adicionando 30 μL del concentrado del extracto orgánico. Bajo este esquema de preparación de la muestra, se logra una concentración de metanol en el sistema de prueba de 1.09% (v/v), menor al máximo recomendado. Para efectuar los cálculos de la concentración inicial del sedimento en el sistema de prueba ver 3.8 3.6.6 Elutriados El material contenido en los tubos de centrífuga deberá asentarse al fondo del recipiente. Logrará esto golpeando ligeramente la base del tubo sobre una superficie, al terminar mida el volumen que ocupa el material leyendo en la escala que presentan los tubos. Anote el dato en la bitácora junto con el registro del peso correspondiente. Mezclar el sedimento con agua destilada en una relación máxima de 1:4 (una parte de sedimento por cuatro de agua) haciendo uso de la lectura del volumen que ocupa el material de la muestra para establecer las proporciones. Puede elegir el uso de relaciones de volumen menores, tal como 1:2, o 1:3, considere que la limitante será la capacidad del tubo a 50 mL. Cierre los tubos y agite vigorosamente a fin de mezclar material en el agua y anote el volumen adicionado anteriormente señalados. homogéneamente el junto con los datos Posteriormente puede colocar los tubos en una parrilla de agitación defecto emplear un baño ultrasónico. o en su En caso de usar baño ultrasónico, llene la tina a la capacidad correspondiente, introduzca los tubos y cúbralos manteniéndolos sumergidos en el agua hasta el nivel de la base de su tapa. Ajuste el baño ultrasónico para su funcionamiento por 60 minutos calentamiento, tiempo que los tubos deberán permanecer en su interior sin Al término de una hora de agitación o sonicación apague los instrumentos y saque los tubos. Déjelos reposar en posición vertical dentro de un refrigerador para su sedimentación. Por cada lote de muestras o número de control monte un blanco y un control positivo 425 Previo al desarrollo de pruebas de toxicidad, coloque los tubos en centrifugación por un tiempo de 15 min, hasta que se sedimente una velocidad de 2000 a 4000 rpm será suficiente. Detenga la centrifugación y emplee el sobrenadante acuoso (elutriado) para el desarrollo de pruebas de toxicidad obteniendo los volúmenes necesarios succionando el líquido sin resuspender el sedimentado. Debido a que el elutriado es un extracto acuoso el procedimiento de prueba podrá desarrollarse de la misma forma en que se llevan a cabo las pruebas de toxicidad rutinarias. Para efectuar los cálculos para determinar la concentración inicial emplee las guías correspondientes indicadas en el numeral 12.1 haciendo los ajustes de volúmenes y pesos que correspondan. 3.7 PRECAUCIONES Cuidar que los materiales empelados en la producción de extractos o elutriados este siempre libres de tóxicos. Cuidar que a lo largo del procedimiento para la elaboración de extracto orgánico no se adicione a este agua que puede incorporarse por condensación en los refrigerantes del sistema soxhlet o por un inadecuado secado de la muestra. Cuidar que durante la extracción, la cantidad de solvente siempre sea la suficiente para alcanzar el nivel de vaciado del vaso del soxhlet, a fin de que se mantengan los ciclos de renovación de extracción funcionando, de otra manera se quemará el extracto contenido en el matraz de bola. En caso de que este no alcance el nivel necesario puede adicionarse más solvente al matraz de bola cuidando de apagar la parrilla y dejar enfriar previamente. Cuidar que la temperatura del agua empleada para enfriar los refrigerantes se mantenga en un intervalo adecuado para promover la condensación del solvente, en el caso de metanol se recomienda manejar una temperatura de 10- 18 °C, de emplearse otro solvente deberá ajustarse a la temperatura que convenga de acuerdo a su volatilidad, evitando siempre la pérdida del solvente de extracción. Para el enfriamiento puede emplearse un baño de recirculación de agua o en su defecto agua directa de la toma. Cuidar que al término o al inicio de cada lote extraído o por extraer en el sistema soxhlet, se efectúe un enjuague con acetona (grado HPLC, nanogrado o plaguicidas) y posteriormente con Metanol (grado HPLC, nanogrado o plaguicida) con el objetivo de evitar contaminación cruzada. 426 Cuidar que mientras el sistema soxhlet no este en uso, se protejan las entradas de los refrigerantes con papel aluminio para aislar de polvos. Cuide que durante el uso del evaporador rotatorio se maneje un balance de las variables de presión y temperatura del baño María a fin de evitar que el extracto de la muestra se proyecte en el interior del condensador y lo contamine, o en su defecto, se provoque la pérdida del extracto. Cuide que durante la reducción de volúmenes durante el trasvasado de la muestra a los viales de 5 mL si emplea parrilla de calentamiento , esta se encuentre solo tibia de lo contrario el concentrado se proyectará y la muestra se perderá. En el caso de la producción de elutriados, etiquete los tubos escribiendo directamente sobre la pared o la tapa del mismo con plumón indeleble ya que las etiquetas de papel puede desintegrarse en el baño ultrasónico 3.8. MANEJO DE RESULTADOS. Consideraciones para los cálculos de concentración. Tomando en cuenta que en el caso de la producción de extractos orgánicos, el volumen de concentrado que se emplea para el análisis de toxicidad será solo una porción del concentrado, deberemos hacer los ajustes y cálculos necesarios para expresar adecuadamente el resultado. Continuando con el ejemplo de la prueba con V. fischeri, se empleó una proporción de 30 μL de un volumen total del concentrado de 4 mL obtenidos a partir de un peso inicial de la muestra que para fines del ejemplo será de 20 g, entonces podemos decir que la concentración inicial, expresada con mg Eq./ ml, en la máxima concentración preparada sería de 54.54 mg Eq. /mL, a partir de los siguientes cálculos 20 g_______ 4000 μL / 30 μL 150 mg/mL/ 2.750 mL x 1000 = 150 mg/ml = 54.54. mg Eq../ml Donde: 20 g 4000 μL = Peso inicial del material extraído = Vol. del concentrado del extracto 427 30 μL 2.750 m = Vol. Del concentrado del extracto adicionado al sistema de prueba para análisis de toxicidad = Volumen total de la solución en el sistema de prueba. La concentración obtenida debe ser expresada anteponiendo el término “Equivalentes”, que se expresa como Eq. (54.54 mg Eq. /mL). Se introduce esta modalidad ya que debe considerarse que la concentración obtenida esta referida a una cantidad de material que fue extraída, de modo que en realidad los organismos de prueba se exponen al material soluble o extractado cuya cantidad no es posible determinar, sin embargo esta es relativa al peso medido del material trabajado. Las concentraciones de las diluciones subsecuentes tendrán que afectarse por el factor de dilución empleado para su preparación. 3.8.1 Interpretación de resultados Los resultados de la prueba al concentrado del control negativo o blanco de procedimiento, proveen información útil para detectar la posibilidad de falsos positivos, ya que a través de su análisis se determinar la contribución que el proceso de manejo de muestras, ya sea por producción de extractos o elutriados, tiene sobre la respuesta tóxica obtenida en pruebas de toxicidad, así como la del posible efecto que pueda causar la adición de volúmenes de solvente en el sistema de prueba. Con fines de aceptación de los resultados, las pruebas de toxicidad del blanco de procedimiento deberán demostrar que no hay efecto, o que este no es mayor al efecto observado en el control negativo. Esto indicará que el proceso de manejo de muestra así como el volumen de solvente adicionado al sistema de prueba no contribuye a la toxicidad ni a la generación de falsos positivos.. El control positivo permitirá controlar la efectividad del proceso de extracción de tal manera que la respuesta de la prueba de toxicidad del concentrado o elutriado deberá encontrarse en una concentración previamente determinada para el material de referencia, tanto e el caso del elutriado como del extracto orgánico. REFERENCIAS Pica-Granados Y., Huerto-Delgadillo R.I., Trujillo D. G., Hernández S. H y Bucio O.U.. 1998. “ CONTROL INTEGRAL DE LIRIO ACUATICO E IMPLICACIONES TOXICOLOGICAS EN EL LAGO DE CHAPALA”. Proyecto CONACyT 0768P-B. Subcoordinación de Hidrobiología y Evaluación Ambiental. Coordinación de Tratamiento y Calidad del Agua. Instituto Mexicano de Tecnología del Agua. México. Vol II: 58pp 428 Ho. T.Y. H. and Quinn G. J. 1993. Physical and Chemical Parameers of sediment extaction and fractionation that influence toxicity as evaluated by Microtox. Env. Toxicol and Chem. 12:615-625. Secretaria de Comercio y Fomento Industrial. 1995. Norma Mexicana NMX-AA112- SCOFI. Análisis de agua y sedimentos. Evaluación de toxicidad aguda con Photobacterium phosphoreum. Método de pruebas DGN. Pag. 36 Sveson A., Vikor T and Remberger M. 1997. Toxicity of elemental sulfur in sediments 1998. Env. Toxicol. 13: (3): 217-224 Jonson T and Long. E. R. 1998. Rapid toxicity assessment of sedimets from estuarine ecosystems a new tandem in vitro testing aproach. Environm. Toxicol. Chem. 17 (6) 1099-1106. Hong Do C. L. Becker-van Stooten K, Jean-Jacques S., Lam Minh T., Tarradellas J. 2000. Toxicity of sediments from the Ho Chi Minh city canals and Saigon River , Viet Nam. Env. Toxicol. 15: (5): 469-475 Wang C., Wang, Y. , Mo Z. and Wang Z. 2003. Ecotoxicological Examination of sediment extracts of Huaihe River, China by in vitro bioassay. Bull. Env. Contam. Toxicol. 71: 782-790. U.S Army Corps of Enginierrs, 1976. Ecological Evaluation of proponed discharge of dredge or fill material into navegable waters. COE D-76-17 Final Report U.S Army Engineer Water Ways Experiment Sation Vicksburg. MS. 429 DETERMINACION DE DUREZA 1.0 Objetivo y Alcance 2.0 Definiciones 3.0 Referencias 4.0 Interferencias 5.0 Medidas de Seguridad 6.0 Equipos y Materiales 7.0 Reactivos y Materiales de Referencia 8.0 Control de Calidad 9.0 Desarrollo 10.0 Cálculos 430 1. Objetivo y Alcance 1.1 Objetivo Establecer el procedimiento para determinar Dureza total. 1.2 Alcance Este procedimiento es aplicable para muestras de agua, naturales, residuales y residuales tratadas. 2.0 Definiciones 2.1 Dureza Concentración total de iones de calcio y magnesio expresada como su equivalente en Carbonato de Calcio ( CaCO3 ). 3.0 Referencias 3.1 NOM-AA-072-SCFI-2001, “Análisis de agua.- Determinación de Dureza Total en aguas naturales, residuales y residuales tratadas. 4.0 Interferencias 4.1 El E.D.T.A forma complejos con hierro, manganeso, cobre, zinc, plomo, cobalto, níquel, bario, estroncio y algunos otros metales. 4.2 En la titulación de calcio y magnesio, los estados altos de oxidación del manganeso reaccionan rápidamente con el indicador para formar productos de oxidación incoloros. 4.3 En presencia de aluminio en concentraciones mayores a 10 mg/L, el color azul que indica el punto final de la titulación puede aparecer y en poco tiempo puede regresar a rojizo. 4.4 La materia orgánica coloidal o en suspensión también puede interferir en el punto final. 5.0 Medidas de Seguridad 5.1 Cuando se trabaje con cualquiera de los compuestos químicos descritos en el Procedimiento, usar equipo de seguridad tales como; bata, guantes de látex y lentes de seguridad. 431 6.0 Equipos y Materiales 6.1 Equipos 6.1.1 Balanza analítica con precisión 0.1 mg 6.2 Materiales 6.2.1 Matraces erlenmeyer de 250 mL 6.2.2 Pipetas volumétricas de diferentes capacidades clase A 6.2.3 Bureta de 25 o 50 mL clase A 6.2.4. Vasos de precipitado 6.2.5 Matraces aforados de diferentes volúmenes. 7.0 Reactivos y Materiales de Referencia Todos los reactivos utilizados deben ser grado reactivo analítico. El agua utilizada debe entenderse como agua desionizada. 7.1.1 Cloruro de Amonio (NH4 Cl) 7.1.2 Hidróxido de Amonio concentrado (NH4 OH) 7.1.3 E.D.T.A de Magnesio 7.1.4 E.D.T.A de Sodio 7.1.5 Indicador negro de eriocromo T (sal sódica del ácido 1-(1-hidroxy-2Naftilazo)-5 Nitro-2 Naftol- 4 Sulfónico) 7.1.6 Clorhidrato de Hidroxilamina ( NH2 OH HCl). 7.1.7 Cloruro de Sodio (NaCl) 7.1.8 Carbonato de Calcio (CaCO3) 7.1.9 Acido Clorhídrico (HCl) 7.1.10 Rojo de metilo. 7.1.11 Agua desionizada. 432 7.1.12 Solución Amortiguadora. Puede prepararse por cualquiera de los procedimientos siguientes: 7.1.12.1 Disolver 16.9 g de cloruro de amonio (NH4Cl) en 143 mL de hidróxido de amonio concentrado (NH4OH), agregar 1,25 g de sal de E.D.T.A. de magnesio y diluir a 250 mL con agua. 7.1.12.2 En ausencia de la sal de magnesio de E.D.T.A., disolver 1,79 g de la sal y 0,78 g de MgSO4 H2O o 0,644 g de MgCl2 6H2O en 50 mL de agua destilada. Disolver 16,9 g de NH4Cl en 143 mL de NH4OH concentrado. Mezclar ambas soluciones y aforar a 250 mL con agua. Guardar en un recipiente de plástico de vidrio resistente, herméticamente cerrado para evitar pérdida de NH3 o entrada de CO2. Renovar mensualmente o cuando al añadir 1 o 2 mL a la muestra el pH sea < 10.0 ± 0.1. 7.1.13 Indicador Negro de Eriocromo T mezcla seca pulverizada. 7.1.14 Solución valorada de E.D.T.A. Pesar 3.723 g de E.D.T.A. de sodio, disolver en agua destilada y aforar a 1 L. 7.1.15 Reactivos para preparar la solución estándar de carbonato de calcio. 7.1.16 Indicador de rojo de metilo. Disolver 0.1 g de sal de sodio de rojo de metilo y diluir a 100 mL con agua 7.1.17 Solución de ácido clorhídrico 1:1 Mezclar un volumen de ácido clorhídrico concentrado con un volumen igual de agua. 7.1.18 Solución de hidróxido de amonio 3N. Diluir a 1 L de agua 240 mL de hidróxido de amonio (NH4OH). 7.1.19 Preparación de la solución estándar de Calcio. Secar el carbonato de calcio CaCO3 anhídro en polvo (bajo en metales pesados, álcalis y magnesio) a 200 0C durante toda la noche. Pesar 1,0 g de carbonato de calcio en un matraz erlenmeyer de 500 mL. Colocar un embudo en el cuello del matraz y agregar poco a poco, solución de ácido clorhídrico 1:1 hasta que todo el carbonato se disuelva. Agregar 200 mL de agua y hervir por unos minutos para eliminar el CO2. Enfriar y agregar unas cuantas gotas del indicador rojo de metilo y ajustar a un color intermedio anaranjado, por adición de hidróxido de amonio 3N o ácido clorhídrico 1:1. Aforar a un litro en un matraz aforado. Esta solución es equivalente a 1.0 mg de CaCO3 por 1.0 mL. 433 7.1.20 Valoración de la solución de E.D.T.A. 7.1.20.1 Tomar 10 mL de la solución estándar de carbonato de calcio y diluir a 50 mL con agua en un matraz Erlenmeyer de 250 mL. 7.1.20.2 Agregar de 1 a 2 mL de la solución amortiguadora para llevar la solución a un pH de 10 +/- 0.1 7.1.20.3 Agregar de 1 a 2 gotas o una cantidad adecuada del indicador en polvo de negro de eriocromo T. 7.1.20.4 Titular con la solución de E.D.T.A lentamente, con agitación continua hasta un vire a color azul. 7.1.20.5 Hacer un mínimo de tres titulaciones y calcular F. Cálculo de (F): F = mg de CaCO3 en la solución titulada Volumen de solución de E.D.T.A., empleada en la titulación. 8.0 Control de Calidad 8.1 Analizar por duplicado las muestras. 8.2 Al titular agregar lentamente el titulante agitando continuamente la muestra. 9.0 Desarrollo 9.1 Tomar 50 mL de la muestra o una alícuota llevada a 50 mL con agua desionizada. 9.2 Ajustar a un pH de 10 +/- 0,1 adicionando el volumen necesario de solución amortiguadora (generalmente de 1 a 2 mL). 9.3 Agregar una cantidad adecuada de negro eriocromo T (0.2g). 9.4 Titular con la solución de E.D.T.A. valorada 0.01 M agitando constantemente hasta que desaparezcan los últimos matices rojizos. Añadir las últimas gotas a intervalos de 3 a 5 segundos hasta a azul. 434 10 Cálculos 10.1 El cálculo de la dureza total se determina utilizando la siguiente ecuación. (A-B) x 1000 x C Dureza total en mg/L de CaCO3 = D Donde: A= mL de solución de E.D.T.A. gastados en la titulación. B = mL de solución de E.D.T.A. gastados en la titulación del blanco. C = Factor obtenido en la valoración de la solución de E.D.T.A. D= mL de muestra utilizados. Medición de pH 10.0 Objetivo y Alcance 11.0 Definiciones y Notaciones 12.0 Referencias 13.0 Interferencias 14.0 Medidas de Seguridad 15.0 Equipos y Materiales 16.0 Reactivos y Materiales de Referencia 17.0 Control de Calidad 18.0 Calibración 10.0 Desarrollo 11.0 Prevención de la contaminación 435 1.0 Objetivo y alcance. 1.1 Objetivo. Establecer el procedimiento acuosas. para la medición del pH en soluciones 1.2 Alcance. Este procedimiento es aplicable a muestras de agua o soluciones acuosas. 2.0 Definiciones y notaciones. 2.1 Definiciones. 2.1.1 Potencial de hidrógeno pH. Es el logaritmo negativo de la concentración del ión hidrógeno en una solución acuosa o el logaritmo del recíproco de la concentración de iones hidrógeno. El valor del pH es la acidez o alcalinidad de una sustancia expresada en términos de la relación entre la fuerza electromotriz (E) expresada en volts, entre un electrodo de vidrio y uno de referencia cuando se sumergen en el agua, y la fuerza electromotriz (Es) expresada en volts, entre los mismos electrodos cuando se sumergen en una solución reguladora de referencia. pH = - Log [H+] 2.1.2 Acidez. Es la capacidad cuantitativa del agua para reaccionar con los iones hidroxilos. 2.1.3 Alcalinidad. Es la capacidad cuantitativa del agua para reaccionar con los iones de hidrógeno. 2.2 Notaciones 2.2.1 Potencial de hidrógeno ( pH ) 2.2.2 Compensador de temperatura ( ATC ) 2.2.3 Control de calidad ( CC ) 2.2.4 Muestra duplicada ( MD ) 2.2.5 Calibración ( CAL ) 436 2.2.6 Lectura ( READ ) 3.0 Referencias. 3.1USEPA Método 9040 C Medición electrométrica de pH Revisión 3, Agosto 2002. 3.2 NMX-AA-008-SCFI-2000 Determinación de pH en Agua. 3.3 Standard Methods for the Examination of water and Wastewater American Health Association American Water Works Association Water Pollution Control Federation 14 Edition 3.4 1978 Annual Book of ASTM Standards Part 31 D 1293 “Standard Test Method” 4.0 Interferencias. 4.1 Error por Sodio a niveles de pH > 10 pueden ser reducidos o eliminados utilizando un error para bajo error en sodio, el cual puede funcionar a temperaturas elevadas y para medir valores de pH superiores a 10. Las variaciones de la temperatura pueden causar errores en la medición por lo que siempre se debe de indicar la temperatura a la cual se ha medido el pH. 4.2 Puede haber errores de lectura si el electrodo se recubre con algún material grasoso que no se remueva fácilmente con los enjuagues, por lo que el electrodo se puede limpiar con detergente y enjuagarlo varias veces con agua, dejarlo remojar en una solución 1:10 HCl de tal forma que la tercera parte baja del electrodo esté sumergido, y después enjuagar con agua en abundancia. 5.0 Medidas de seguridad. 5.1 Usar bata, guantes y lentes de seguridad. 6.0 Equipos y materiales. 6.1 Equipos. 6.1.1Medidor de pH capaz de medir el pH en el intervalo de 0 a 14 por medio del empleo de un electrodo de vidrio y otro de referencia o un electrodo combinado. De preferencia con compensación de temperatura. 6.1.2 Electrodo bajo error en Sodio 437 6.1.3 Parrilla de agitación. 6.2 Materiales. 6.2.1 6.2.2 6.2.3 6.2.4 Vasos de precipitados 250 ml Pizetas de 500 ml. Cepillo pequeño de cerdas suaves. Barras de agitación magnéticas. 7.0 Reactivos y materiales de referencia. 7.1 Reactivos. 7.1.1 Todos los productos químicos usados en este procedimiento deben ser grado reactivo analítico a menos que se indique otro grado, el agua utilizada debe entenderse que se trata de agua desionizada. 7.1.2 Acido Clorhídrico 7.1.3 Detergente líquido neutro libre de fosfatos. 7.1.4 Solución interna para electrodo de referencia KCl 3.33 mol. 7.2 Materiales de referencia. 7.2.1 Se usarán soluciones amortiguadoras, con trazabilidad a un organismo autorizado. Las soluciones amortiguadoras utilizadas deben cubrir el intervalo de medición en el que se trabaja. Estas soluciones se pueden deteriorar por el crecimiento de hongos o por contaminación, por lo cual se recomienda que se conserven bien tapadas y en refrigeración. 8.0 Control de calidad. 8.1 Secuencia de análisis: 8.1.1Calibrar el equipo en el intervalo de medición adecuado. 8.1.2Leer el lote de muestras. 8.1.3Por cada 10 muestras leer una muestra por duplicado. 8.1.4Por cada 10 muestras leer una solución amortiguadora de pH conocido para verificar la calibración del potenciómetro. 8.1.5Terminar el análisis leyendo una solución amortiguadora de pH conocido. 438 9.0 Calibración. 9.1 Para calibrar el equipo elegir dos soluciones amortiguadoras a temperatura ambiente que cubran el intervalo de trabajo. 9.1.1 Para el primer punto de calibración, colocar la punta del electrodo en la primera solución amortiguadora y proceder de acuerdo al manual del equipo para calibrar la solución amortiguadora seleccionada para la primera lectura. 9.1.2 Enjuagar el electrodo con agua, secar y calibrar el Segundo punto de calibración. Introducir la punta del electrodo en la segunda solución amortiguadora y proceder de acuerdo al manual del equipo para calibrar la segunda solución amortiguadora seleccionada. 10.0 Desarrollo. 10.1 Poner a temperatura ambiente las muestras, no deben diferir por más de 2 ºC con la solución amortiguadora. 10.2 El potenciómetro cuenta con compensador de temperatura en caso de que no fuese así tomar la temperatura con un termómetro calibrado. 10.2 Vaciar en un vaso de precipitado un volumen de 50 ml de cada muestra, agregar una barra de agitación y poner en una parrilla de agitación. 10.3 Introducir el electrodo de manera que no toque el fondo para permitir la agitación de la muestra con la barra magnética. 10.4 Repetir la medición con otro volumen igual de muestra, las lecturas no deben diferir por < 0.1 unidades de pH. 10.5 Anotar y registrar el pH junto con la temperatura de la muestra. 11.0 Prevención de la contaminación. 11.1 Enjuagar muy bien el electrodo con agua contaminación cruzada. y secar para evitar la 11.2 Mantener las soluciones amortiguadoras en refrigeración para evitar el crecimiento biológico. 11.3 Calibrar con soluciones amortiguadoras frescas. 439 1.0 Lavado de material para Daphnia Magna y nemátodo “Panagrellus redivivus. 1.1 Lavar con detergente neutro libre de fosfatos y enjuagar dos veces con agua de la llave. 1.2 Enjuagar el material con ácido nítrico (HNO3) al 30 % para eliminar residuos metálicos. Enjuagar con agua desionizada y escurrir. 1.3 Enjuagar con acetona (C3H6O) para eliminar residuos orgánicos. Enjuagar con agua desionizada. Dejar secar completamente. 1.4 Esta serie de lavados tienen que llevarse a cabo de 24 h a 48 h antes del bioensayo, proteger el material del polvo. 1.5 Antes de utilizar el material que va a contener a los organismos, enjuagarlo con agua reconstituida. 440 EXTRACCION DE CONSTITUYENTES TOXICOS ( PECT ) PARA LA PRUEBA DE TOXICIDAD CONTENIDO 1.0 Objetivo y Alcance. 2.0 Definiciones. 3.0 Referencias. 4.0 Equipos y materiales. 5.0 Reactivos 6.0 Preservación de muestras. 7.0 Control de Calidad. 8.0 Desarrollo. 441 1.0 Objetivo y Alcance 1.3 Objetivo. Establecer el procedimiento para llevar a cabo la extracción constituyentes tóxicos ( PECT ) para la prueba de Toxicidad. de 1.4 Alcance. Es aplicable a muestras con una concentración mayor a 0,5 % de sólidos a las que una vez extraídas se les realizará la prueba de toxicidad aguda o crónica. 2.0 Definiciones 2.1 Prueba de extracción. El procedimiento de laboratorio que permite determinar la movilidad de los constituyentes de un residuo, que lo hacen peligroso por su toxicidad al ambiente. 3.0 Referencias. 3.1 NOM-053-SEMARNAT- Que establece el procedimiento para llevar a cabo la prueba de extracción para determinar los constituyentes que hacen a un residuo peligroso por su toxicidad al ambiente. 3.2 USEPA METHOD 1311 Toxicity Characteristic Leaching Procedure Revisión 0 Julio 1992 4.0 Equipos y materiales. 4.1 Equipo de agitación rotatorio. El aparato de agitación debe ser capaz de hacer girar el vaso o recipiente de extracción a 30 ± 2 r.p.m. 4.2 Recipientes de extracción. Se necesitan frascos con suficiente capacidad para contener la muestra y el reactivo de extracción No es necesario que estos frascos queden completamente llenos, pueden ser de diferentes materiales como vidrio borosilicato o plástico politetrafluoroetileno ( PTFE ). 4.3 Equipo de filtración. Utilizar cualquier unidad de filtración capaz de sostener un filtro de fibra de vidrio y resistir la presión para llevar a cabo la separación. Estas unidades de filtración deben tener un volumen interno mínimo de 300 ml y deben estar 442 adaptadas para acomodar un filtro de 47 mm de diámetro como mínimo (se recomienda una unidad de filtración que tenga una capacidad interna de 1.5 L ó más y que estén equipados para dar cabida a filtros de 142 mm de diámetro). 4.3.1 Materiales de construcción. Los recipientes de extracción y los equipos de filtración deben estar hechos de materiales inertes que no lixivien o absorban los componentes del residuo. 4.4 Filtros. Los filtros deben de ser de fibra de vidrio, sin aglutinantes y tener un tamaño efectivo de poro de 0.6 a 0.8 µm ó equivalente. No deben utilizarse prefiltros Cuando se evalúa la movilidad de los metales, los filtros deben ser lavados con ácido nítrico 1.0 N y posteriormente realizar tres enjuagues consecutivos con agua (se recomienda un mínimo de 1L por enjuague). Los filtros de fibra de vidrio son frágiles manejar con cuidado. 4.5 Medidor de pH: El medidor deberá cubrir el intervalo de medición de 0 a 14 U de pH a 25 ºC. 4.6 Balanza Analítica con sensibilidad de 0.1 mg 4.7 Vasos de Precipitado ó Matraces Erlenmeyer de Vidrio de 500 ml. 4.8 Vidrio reloj de diámetro adecuado para cubrir el vaso de precipitado o el matraz Erlenmeyer. 4.9 Agitador magnético. 4.10 Parrilla con agitación / calentamiento. 4.11 Estufa con control de temperatura para trabajar de 100 +/- 5 ºC 4.12 Termómetro de 0 - 100 ºC 5.0 Reactivos. 5.1 Reactivos. Los productos químicos utilizados son grado reactivo analítico a menos que se indique otro grado. El agua utilizada debe entenderse que es agua desionizada. 5.1.1 Acido Clorhídrico ( HCl) 1.0 N 5.1.2 Acido Nítrico ( HNO3) 1.0 N 5.1.3 Hidróxido de sodio (NaOH ) 1.0 N 5.1.4 Acido Acético Glacial ( CH3CH2COOH ). 443 5.2 Fluido de Extracción. 5.2.1 Fluido de Extracción # 1: Adicionar 5.7 ml de Acido Acético Glacial (CH3CH2COOH) a 500 ml de agua, adicionar 64.3 ml de NaOH 1.0 N y llevar a un volumen de un litro en matraz aforado. Cuando esta solución esta correctamente preparada, el pH es 4.93 ± 0.05. 5.2.2 Fluido de Extracción # 2: Diluir 5.7 ml de Acido Acético Glacial (CH3CH2COOH) en agua a un volumen de 1L. Cuando ésta solución está correctamente preparada, el pH es de 2.88 ±0.05. Los reactivos de extracción deben ser verificados frecuentemente. El pH debe verificarse antes de utilizar el reactivo para asegurar que sea el correcto. Si se encuentran impurezas o el pH no está dentro de los límites, se debe desechar el reactivo y prepara uno nuevo. 6.0 Preservación de muestras. 6.1Las muestras y los extractos obtenidos deben ser preparados para el análisis tan pronto como sea posible. Mantener en refrigeración a 4 ºC. Los extractos del PECT deben prepararse para el análisis y analizarse tan pronto como sea posible después de que se ha finalizado la extracción. Los extractos para las determinaciones de toxicología se guardan en frascos de vidrio o polietileno y se mantienen en refrigeración hasta su análisis. 7.0 Control de Calidad. 7.1 Se debe de preparar un blanco del fluido de extracción utilizado y tratarlo igual que una muestra, para monitorear posible contaminación. 7.2 Se debe de analizar una muestra por duplicado por cada lote de muestras o cada 20 muestras. 8.0 Desarrollo. 8.1 Evaluaciones preliminares. Realizar las evaluaciones preliminares del PECT en una alícuota de la muestra del residuo de un mínimo de 100 gramos de desechos. Esta alícuota se emplea únicamente para las evaluaciones preliminares que incluyen: 8.1.1 Determinación preliminar del porcentaje de sólidos. Si el residuo no produce líquido cuando está sujeto a la presión de filtración (es decir es 100 % sólido) continuar con el Inciso 8.1.3. 444 8.1.2 Si la muestra es líquida o polifásica, se requiere la separación sólido-líquido para hacer la determinación preliminar del % de sólidos. Esto involucra el equipo de filtración mencionado en el Inciso 8.3. 8.1.2.1 Pesar el filtro y el recipiente que recibirá el filtrado. 8.1.2.2 Ensamblar el porta filtros y colocar el filtro sobre el soporte y asegurarlo. 8.1.2.3 Pesar una parte de la muestra del residuo (mínimo 100 g) y registrar el peso. 8.1.2.4 Los residuos que sedimentan lentamente pueden centrifugarse antes de la filtración. La centrifugación se utilizará como una ayuda de la filtración. Si ésta es utilizada primero, el líquido debe ser decantado y filtrado continuando con la filtración de la porción sólida. 8.1.2.5 Transferir cuantitativamente la muestra del residuo al equipo de filtración. Verter la muestra en forma uniforme sobre la superficie del filtro. Si la filtración de la muestra a 4 ºC reduce la cantidad de líquido extraído sobre lo que debe ser extraído a temperatura ambiente, entonces dejar que la muestra se estabilice a temperatura ambiente en el aparato antes de ser filtrada. Si más 1 % del peso de la muestra se ha adherido al recipiente utilizado para transferir la muestra al aparato de filtración, determinar el peso de este residuo y restarlo del peso de la muestra determinado en el inciso 8.1.2.3 para conocer el peso efectivo del residuo que se filtró. Aplicar gradualmente la presión a través del filtro. Incrementar la presión lentamente de 10 psi hasta 50 psi para que todo el líquido pase hasta que el flujo del líquido haya cesado. 8.1.2.6 El material retenido en el filtro se define como la fase sólida del residuo y el filtrado como la fase liquida. Determinar el peso de la fase líquida restando el peso del recipiente vacío, del peso total del recipiente con el filtrado. Determinar el peso de la fase sólida de la muestra restando el peso de la fase líquida del peso total de la muestra, según inciso 8.1.2.3 u 8.1.2.5. Calcular el por ciento de sólidos como sigue: Peso de sólido (8.1.2.6) % de sólidos = ------------------------------------x 100 Peso Total de los desechos (8.1.2.3 o 8.1.2.5) 8.1.2.7 Si el porcentaje de sólidos determinado en el Inciso 8.1.2.6 es ≥ 0.5 %, entonces continuar ya sea con el Inciso 8.2 para determinar si el material sólido requiere reducción de tamaño de partícula o con el Inciso 8.1.3 8.1.2.8 Si el por ciento de sólidos determinado es menor que 0.5 % continuar con 8.4.10 445 8.1.3 Determinación del por ciento de sólidos secos. 8.1.3.1 Quitar del aparato de filtración la fase sólida y el filtro. 8.1.3.2 Secar el filtro y la fase sólida a 100 ± 5 ºC, hasta que después de ser pesados dos veces consecutivas no varíen en +/- 1.0%. Registrar el peso final. 8.1.3.3 Calcular el porcentaje de sólidos secos de la siguiente manera: (Peso del residuo seco + filtro) - Peso del filtro % Sólidos = ---------------------------------------------- ---------------------x 100 Secos Peso inicial del residuo (8.1.2.3 o 8.1.2.5) 8.1.3.3 Si el por ciento de sólidos secos es < 0.5 % continuar con 8.4.10. Si el % de sólidos secos es ≥ 0.5 %, tomar una porción fresca del residuo, determinar si la reducción de tamaño de la partícula es necesaria y seleccionar el fluido de extracción adecuado ver 8.3 8.2 Determinar si el residuo requiere reducción de tamaño de partícula. Evaluar el sólido para determinar el tamaño de la partícula. A menos que el área superficial del sólido sea por gramo de material igual o mayor que 3.1 cm2 ó menor que 1,0 cm en su dimensión más angosta, se requiere la reducción del tamaño de la partícula, debe ser capaz de pasar a través de una malla estándar de 9,5 mm o 0.375 pulgadas si el área superficial es menor o el tamaño de la partícula es más grande de lo señalado anteriormente, preparar la porción sólida de los desechos para la extracción, comprimiendo, cortando o triturando los desechos hasta obtener un área superficial o tamaño de la partícula igual a la descrita anteriormente. 8.3 Determinación del fluido de extracción adecuado: 8.3.1 Pesar una fracción de la fase sólida, reducir si es necesario a un tamaño de partícula de aprox. 1 mm de diámetro o menos y transferir 5 g a un matraz erlenmeyer de 250 mL o un vaso de precipitados. 8.3.2 Añadir 96,5 mL de agua, cubrir con un vidrio de reloj y agitar por cinco minutos en una parrilla de agitación magnética, sacar y dejar sedimentar, medir el pH, si es < 5 utilizar el fluido de extracción 1. 8.3.3 Si el pH es > 5 adicionar 3,5 ml de HCl 0,1 N, mezclar y cubrir con un vidrio de reloj, calentar a 50 ºC y mantener la temperatura por 10 min. 8.3.4 Dejar la solución enfriar a temperatura ambiente y medir el pH, si es < 5 utilizar el fluido de extracción 1 y si es > 5 utilizar el fluido de extracción 2. 8.4 Determinación de constituyentes tóxicos. 446 8.4.1 Se recomienda un tamaño mínimo de muestra de 100 g. 8.4.2 Si el residuo no produce líquido, cuando se somete a filtración (100% sólido) pesar una porción de la muestra (100 g ) y continuar con 8.1 8.4.3 Si la muestra es líquida o multifásica, se requiere una separación líquido- sólido. Esto involucra el equipo de filtración descrito en 4.3.2 y continuar con 8.3 8.4.4 Pesar el recipiente que recibirá el filtrado. 8.4.5 Ensamblar el portafiltro y colocar el filtro en el soporte y asegurarlo. 8.4.6 Pesar una fracción de muestra (100 g mínimo) Si el residuo contiene menos del 0.5 % de sólidos secos, la porción líquida del residuo, después de la filtración, se define como el extracto PECT. Por lo tanto, se debe filtrar suficiente muestra para que la cantidad de líquido filtrado alcance para realizar todos los análisis requeridos. Para residuos que contienen más del 0.5 % de sólidos secos, utilizar la información del % de sólidos obtenidos conforme 8.1.1, para determinar el tamaño óptimo de la muestra ( 100 g mínimo ) que se llevará a filtración. 8.4.7 Dejar sedimentar la fase sólida, los residuos que sedimenten lentamente pueden centrifugarse antes de la filtración. 8.4.8 Transferir cuantitativamente la muestra del residuo ( fase líquida y sólida ) al equipo de filtración, verter la muestra en forma uniforme sobre la superficie del filtro, continuar como se indica en 8.1.2.5 8.4.9 El material en el portafiltro se define como la fase sólida del residuo, el filtrado como la fase líquida, pesar el filtrado. 8.4.10 Si el residuo contiene menos del 0.5 % de sólidos secos continuar con 8.7. Si el residuo contiene más del 0.5 de sólidos secos y fue necesaria la reducción de tamaño de partícula, continuar con 8.4.11. Si el residuo pasa un tamiz de 9.5 mm, transferir cuantitativamente el material sólido a un frasco de extracción junto con el filtro (usado para separar la fase líquida inicial de la fase sólida ) y continuar con 8.5 8.4.11 Preparar la porción sólida del residuo para extracción, como se describe en 8.10.4.Cuando el tamaño de la partícula esté preparado adecuadamente, transferir cuantitativamente el material sólido a un frasco de extracción. Incluir el filtro utilizado para separar el líquido inicial de la fase sólida. 8.5 Determinar la cantidad del fluido de extracción necesario como sigue: 447 Peso del fluido = 20 x % Sólidos x Peso de la muestra filtrada. 100 Agregar lentamente esta cantidad de fluido de extracción calculado al recipiente extractor. Cerrar bien el vaso extractor (se recomienda utilizar cinta de teflón para asegurar un sello hermético), asegurar el recipiente en el aparato de agitación rotatorio y hacer girar a 30 ± 2 r.p.m. por 18 ± 2 horas. La temperatura ambiente debe mantenerse a 23 ± 2 ºC durante el periodo de extracción. Conforme continúa la agitación, la presión puede incrementarse dentro del frasco extractor para algunos tipos de residuos (por ejemplo el carbonato de calcio o residuos que contengan calcio, pueden permitir gases tales como el dióxido de carbono). Para descargar el exceso de presión el frasco extractor puede abrirse periódicamente (Por ejemplo; después de 15, 30 y 60 minutos) y ventearse en una campana. 8.6 Después de las 18 ±2 horas de extracción, separar el material en el recipiente extractor en sus fases líquida y sólida, filtrando a través de un filtro de fibra de vidrio nuevo. Para la filtración final del extracto PECT, si es necesario cambiar el filtro de fibra de vidrio, para facilitar la extracción. El filtrado obtenido es la muestra para evaluar toxicidad. 8.7 Preparación del extracto obtenido. 8.7.1 Si el residuo no contiene fase líquida fase inicial, el líquido filtrado obtenido se define como el extracto PECT, y continuar con 8.8 8.7.2 Si los líquidos son compatibles, combinar el líquido filtrado con el líquido inicial del residuo obtenido en 8.6. Este líquido combinado se define como el extracto PECT y continuar con 8.8 8.7.3 Si la fase líquida inicial del residuo, obtenida en 8.4.8 no es o no puede ser compatible con el líquido filtrado resultante en 8.6 no combinar los líquidos, analizar por separado cada uno y combinar los resultados matemáticamente, como se describe en 8.8.2 8.8 Después de colectar el extracto PECT, medir el pH y preservar el extracto para análisis 8.8.2 Si las fases individuales van a ser analizadas separadamente, determinar el volumen de la fase individual ( +/- 0.5 % ) realizar los análisis requeridos y combinar los resultados matemáticamente, utilizando un promedio volumen-peso, como se indica: 448 (V1) (C1) + (V2) (C2) Concentración Final del Analito = -------------------------------V1 + V2 Donde: V1= Volumen del primer extracto (L). C1= La concentración del analito de interés en el primer extracto (mg/L). V2= El volumen del segundo extracto (L). C2= La concentración del analito de interés en el segundo extracto (mg/L). 449
