BA-13 (2010-11)-1 TEMA 13.- TOXICIDAD DE ORGANOCLORADOS: Disponibilidad de ATP y metabolismo. Acción de los plaguicidas organoclorados. Inhibidores y desacoplantes de la fosforilación oxidativa. Acción de herbicidas sobre la fotofosforilación. Disruptores endocrinos. 0.-Disponibilidad de ATP en las células y organismos Para la supervivencia, todas las células deben sintetizar moléculas endógenas, ensamblarlas hasta complejos macromoleculares, membranas, orgánulos, etc.; mantener el ambiente intracelular y producir la energía necesaria para su funcionamiento. La mayor parte de las funciones vitales en la célula (trabajo químico de síntesis, trabajo mecánico de contracción, trabajo de transporte de moléculas, transmisión de la información, etc) o en los organismos pluricelulares (donde se añaden los problemas de transporte, comunicación y coordinación) se realizan en base a la energía química en forma de ATP. En las mitocondrias (membrana interna) de organismos aerobios, la energía derivada del transporte de e- (C.T.E.M.), procedente de la oxidación de nutrientes (NADH, FADH2), se emplea en la formación de ATP (fosforilación oxidativa). En el cloroplasto (membrana tilacoidal) se aprovecha la energía luminosa para, a través de reacciones red-ox, es decir transporte de e-, obtener ATP (fotofosforilación). Los xenobióticos que interfieran con la producción de ATP o con su utilización, están afectando al mantenimiento interno de la célula y por lo tanto a su supervivencia, generando disfunciones que podrán expresarse bajo diferentes formas de toxicidad, tanto crónica como aguda, en función de la dosis y la biodisponibilidad. 1.0.- Recordatorio:TRASPORTE DE ELECTRONES Y FOSFORILACION OXIDATIVA: Componentes, estructura y mecanismo de funcionamiento.de la cadena mitocondrial .- La cadena de transporte de emitocondrial está formada por 4 complejos proteicos con componentes red-ox, que son los que soportan el transporte de e-. Transportadores en los complejos: [HemoA-Fe Cu] O2 NADH [FMN Fe-S] CoQ [Cit b Fe-S CitC1] Cit c Succinato [FAD Fe-S] Co Q Asociado con el T. E. se genera un gradiente electroquímico de membrana a cargo de las bombas de H+, que son parte de los complejos transportadores, y se produce un acúmulo de H+ (fuerza protónmotriz) en la cara externa. La hipótesis quimiosmótica de Mitchell propone que los H+ acumulados fuera,, entran desde la cara citosólica al interior mitocondrial a través de la ATPsintasa (complejo Fo-F1) que cataliza la esterificación del ADP con Pi para producir ATP. En la membrana interna mitocondrial hay transportadores de adenilatos (ATP y ADP). 1.1.- Alteraciones de la síntesis mitocondrial de ATP por xenobióticos.La energía química útil para la realización de las actividades celulares esta asociada al metabolismo del ATP, se desprende de su hidrólisis y se genera a partir del metabolismo oxidativo (NADH) para la refosforilación del ADP hasta ATP. Los efectos de los xenobióticos sobre estos procesos mitocondriales (T. E. y F. O.) se pueden comparar con los manifestados por otros agentes ya estudiados, clasificados en inhibidores o desacoplantes. En general los XBs se comportan produciendo interferencias en la membrana interna mitocondrial, interrumpiendo el paso de los e-, el gradiente de H+ o la actuación de la ATP-sintasa. En un sentido muy amplio, los compuestos químicos que interfieren con la síntesis de ATP mitocondrial se pueden asociar en cuatro grupos, según se recoge en el siguiente esquema: I.- Inhibidores del metabolismo oxidativo. II.- Inhibidores del transporte electrónico. III.- Inhibidores de la liberación de O2 a la C.T.E.M. IV.- Inhibidores de la fosforilación oxidativa. BA-13 (2005-06)-2 ADP Sustratos ATP NAD + NADH+H H+ e - + TEM O 2 H 2O ATPasa Inhibidores I II III IV I.- Inhibición en la liberación de [H] a la cadena de transporte electrónico mitocondrial (CTEM) * Glucolisis: hipoglucemia, yodoacetato crítico en neuronas * B-oxidación: ácido 4-pentenoico crítico en músculo cardiaco * Piruvato Deshidrogenasa: arsenito, DCl-VinilCYS, p-benzoquinona ** aconitasa fluoroacetato, NO II.- Inhibición el transporte electrónico. * Inhibidores de los complejos del TE : *** I.- NADH-CoEQ reductasa: *** II.- succinato DesH: *** II.- Coenzima Q-Cit c reductasa: *** III.- Citocromo c oxidasa: *** IV.- Inhibidores múltiples: * Aceptores de electrones: rotenona, amital, MetPhPiridinium(DPP+) malonato, DCVC, PentaCl-ButDien-cys, 2Br-hidroquinona antimicina A, mixotiazol, PCBs CN-, SH, azida, fórmico dinitro-anilina, herbicidas difenil-eter, NO, PCBs CCl4, doxorrubicina, menadiona, DPP+ III.- Inhibición de la liberación de O2 a la CTEM. * Agentes que provocan parálisis respiratoria: * Agentes que causan isquemia: * Agentes que inhiben la oxigenación de la Hb: convulsivos, depresores del CNS alcaloides, cocaina CO, agentes oxidantes que forman meta-Hb(Fe3+) IV.- Inhibición de la fosforilación del ADP , se puede producir al nivel de: 1 ATP sintasa: oligomicina, DDT, clordecone 2 Transportador ADP/ATP (antiporte): atractilosido, DDT, Ac Grasos, lisopospolípidos 3 Transportador de fosfato: N-etil maleimida, p-benzoquinona 4 Agentes desacoplantes del potencial de membrana: * * Ionóforos: penta-Cl-fenol, dinitro-fenol, benzo-nitrilo, salicilato, valinomicina, gramicidina * * Agentes permebealizantes de la membrana interna mitocondrial: pentaCl-butadienil-CYS, clordecone. El daño sobre la fosforilación oxidativa que impide la refosforilación del ADP, produce la acumulación del ADP y de los productos de su hidrólisis, a la vez que una disminución en los niveles de ATP. Hepatocitos en cultivo expuestos a KCN y yodoacetato exhiben un rápido aumento de H+ y Mg+2 citosólicos, como resultado de la hidrólisis de las sales de ADP y AMP con Mg+2, al igual que la salida al medio de Pi y Mg+2. La caída en los niveles de ATP comprometen todas las operaciones que dependen de él. La pérdida de iones influye sobre el volumen celular, disminuyéndolo. BA-13 (2005-06)-3 GRUPOS DE INTERÉS: II y IV; EJEMPLOS.Grupo II.- Inhibidores del transporte electrónico. Interrumpen el flujo de e-, por combinarse con alguno de los portadores EN los complejos. Los inhibidores que actúan sobre los complejos provocan un descenso del potencial de membrana, ya que interrumpen el bombeo de H+ y en consecuencia tampoco se produce ATP. .amital (barbitúrico), rotenona (insecticida derivado de plantas), esteroides (hormonas), etc. Complejo I: Impiden la oxidación del malato y otros sustratos de las enzimas dependientes de NAD+, impidiendo la generación de gradiente de H+. La mayor parte de estos inhibidores se unen a las proteínas Fe-S (ferrosulfuradas) del complejo I. Complejo II: El malonato interfiere competitivamente con la oxidación del succinato por la SuccinatoDH. Algunos fungicidas producen inhibición a este nivel, al interaccionar con uno de los S de los centros Fe-S no hemo del Complejo II, bloqueando la transferencia de [H] desde FAD. Complejo III: El antibiótico ANTIMICINA A y su análogo sintético HOQNO, los PCBs, entre otros, afectan al complejo III. El lugar de interferencia de PCBs en el transporte electrónico se postula entre los citocromos b y c. Complejo IV: El CIANURO (CN-), la AZIDA y el CO se unen al Cu del complejo IV. Inhiben el paso final de los e- hacia el O2. Los dos primeros reaccionan con la forma oxidada del Fe3+ del cit aa3, mientras que el CO lo hace con la forma reducida. La muerte por CN- tiene lugar por asfixia tisular, especialmente del SNC. Si el envenenamiento no es letal, se puede tratar con nitritos que transforman la oxihemoglobina en metahemoglobina, la cual compite con el cit aa3 por el CN-, formando un complejo de metahemoglobina-cianuro, con la adición de tiosulfato se desactiva el sistema con la formación de tiocianato. Los plaguicidas o fármacos no son, en general, inhibidores PUROS del transporte de e- . Algunos HERBICIDAS como la di-NO2-ANILINA que actúan como inhibidores del T.E. en diversos puntos. Grupo IV.AGENTES DESACOPLANTES de la fuerza H+-motriz e INHIBIDORES de la síntesis de ATP 4A - AGENTES DESACOPLANTES.Previenen la fosforilación del ADP sin interferir en el transporte de e- . Cualquier compuesto que promueve la disipación de la fuerza protón-motriz ∆[H+] generada por el T.E. se considera un agente desacoplante. En condiciones in vitro, cuando se añaden agentes desacoplantes a mitocondrias respirando, se estimula el consumo de O2 por eliminación de la influencia reguladora del Pi y ADP. El T.E. y el consumo de O2 se aceleran pero no se forma el ATP correspondiente. La F.O. y el T.E. están desacoplados. La explicación más admitida para este mecanismo es un colapso, disminución o pérdida del gradiente de H+ a través de membrana con los desacoplantes actuando como H+-óforos o ION-óforos. Plaguicidas: PENTACLOROFENOL (PCP) un disolvente contaminado con TCDD y TCDF, 2,4-DINITROFENOL (DNP); HCB, hexaclorobenceno, fungicida muy tóxico para humanos: Son desacoplantes y se usaron como plaguicidas. El gradiente de H+ lógicamente genera un gradiente de pH entre las dos caras de la membrana, lo que hace que muchos derivados fenólicos puedan protonarse en la cara externa, atravesar la membrana en forma molecular y una vez en el interior (pH más alto) pierdan el H+, contribuyendo así a rebajar el gradiente de H+ y de potencial consiguiente. Muchos plaguicidas sufren biotransformaciones consistentes en hidroxilaciones por enzimas microsomales que introducen grupos -OH en sus anillos fenólicos. Mientras que la molécula patrón no podía actuar como desacoplante, la forma hidroxilada sí puede hacerlo si no es rápidamente conjugada con glucósidos o glucurónidos. 4B - INHIBIDORES DE LA ATPasa. Bloquean la secuencia de fosforilación del ADP hasta ATP. Se unen al complejo F0 - F1. OLIGOMICINA, diciclohexilcarbodiimida (-DCCD), 4-Cl-7-NO2-benzofurano: Todos ellos interfieren con alguna de las subunidades proteicas de la ATPasa. La oligomicina se une a una de las proteinas del complejo F0 y bloquea el paso de H+ a través del canal F0 , inhibiendo la síntesis de ATP. COMPORTAMIENTO DE MUCHOS PLAGUICIDAS ORGANOCLORADOS No son desacoplantes puros ni inhibidores estrictos. En [ ] molares BAJAS, la mayoría de ellos satisfacen las condiciones de desacoplantes, pero en [ ] molares ALTAS actúan como inhibidores del T.E. Los herbicidas desacoplantes inhibidores afectan a varios lugares del T.E.M. Los HERBICIDAS pueden separase en dos grupos, en función de la relación dosis-respuesta para interferir en el potencial de membrana y para el consumo de O2. 1º) Tipo DINOSEB (diNO2fenoles, benzimidazoles, benzonitrilos): Desacoplan la fosforilación y colapsan el potencial de membrana antes de que la utilización del O2 sea inhibida. Poseen protones disociables y pueden actuar como protonóforos ( H+-óforos). 2º) Tipo DICRILOS (acilanilida, diNO2anilidas, difenileters): Colapsan el potencial de membrana a la vez que desacoplan la Pi-lación y provocan la inhibición del consumo de O2. La fosforilación es afectada en mayor medida que la respiración. BA-13 (2005-06)-4 3º) DDT e insecticidas ciclodiénicos (aldrín, dieldrín): Inducen un complicado conjunto de alteraciones en la actividad mitocondrial incluyendo la interacción con el factor de acoplamiento de las subunidades F0 - F1 de la ATPasa. Dependiendo de cómo se realicen los ensayos, estos insecticidas organoclorados muestran efectos diversos, siempre en el sentido de disminuir la obtención de ATP. El DDT altera las propiedades de permeabilidad selectiva de la membrana interna mitocondrial. Los electrofisiologistas le consideran neurotóxico. Los bioquímicos postulan que la reducción en la disponibilidad del ATP , a causa de las interferencias en el T.E.M. y la F.O., limita la disponibilidad de energía requerida para las bombas de iones en las neuronas. Las propiedades de permeabilidad de la membrana interna son alteradas por DDT y sus análogos, como lo demuestran una serie de experimentos: la inhibición del hinchamiento inducido por valinomicina (ionóforo), inducción del hinchamiento pasivo, oxidación del NADH exógeno y rotura de la matriz mitocondrial que conlleva la liberación de las enzimas internas. . Los PCBs interfieren el transporte E- y disminuyen el consumo de O2. 2.- FOTOFOSFORILACION Y FOTOSINTESIS De forma análoga a como ocurre en la mitocondria, pueden producirse efectos adversos sobre las funciones del transporte de e- y de la fotofosforilación en las membranas tilacoidales de los cloroplastos. Las plantas superiores y los microorganismos clorofilicos convierten la energía luminosa (hn) en energía química (ATP) y poder reductor (NADPH). Ello tiene lugar en los cloroplastos, que al igual que las mitocondrias, contienen su propio ADN y ARN y sintetizan proteínas especificas. La fotofosforilación está acoplada al flujo electrónico en la membrana tilacoidal mediante un gradiente de protones que, acumulados en el interior del tilacoide, generan una fuerza protomotriz. Esta fuerza se encarga de activar a la ATP-sintetasa de la membrana tilacoildal de los cloroplastos para producir ATP. 2A.-ALTERACIONES EN EL T.E. TILACOIDAL Y EN LA FOTOFOSFORILACIÓN a) INHIBIDORES DEL T. E. Muchos HERBICIDAS actúan interaccionando con el complejo proteico QB del fotosistema (PS) II o P680. Como consecuencia, se inhiben las reacciones en las que está implicado este complejo, como el transporte básico de electrones desde el agua. Ello impide la formación del gradiente de protones a través de la membrana tilacoidal requerida para la síntesis de ATP. Reacciones parciales no dependientes del PS II o P680, tales como la fosforilación cíclica o la fotorreducción de NADP+ , con un dador electrónico que evite el P680, no son inhibidos o lo son de forma muy leve. Estos herbicidas no inhiben fúertemente la fosforilación oxidativa mitocondrial. EJEMPLOS Herbicidas derivados de urea: monouron, diuron (3-(3,4-diclorofenil)-1, 1-dimetilurea), se unen de forma no covalente a una proteína del PS II (32 kD), y se postula que desplazan el grupo redox prostético PQ. El herbicida se une a una parte externa de la proteína, localizada sobre el lado del estroma de la membrana tilacoidal. Herbicidas de este tipo son los derivados de urea (fenilureas doradas), s-triazinas doradas, uracilos sustituidos, piridazonas, benzonitrilos, acilanilidas, aril-carbamatos, que inhiben el T.E. en los fotosistemas de una forma más específica que otros inhibidores del T.E. en general. (ver tabla de herbicidas ). . Las ureas, junto a las triazinas son los inhibidores del T.E. fotosintético más específicos y que afectan menos al T.E. mitocondrial. HERBICIDAS QUÍMICOS: CLASES, NOMBRES Y TOXICIDAD AGUDA Especie química Nombre DL50 (mg/kg) Amidas DiNitroAnilinas Nitrilos Ureas Propanil Trifluoralin Diclobenil Monuron, 10 000 270 3 000 Triazinas Benzonitrilos Atrazina 1 000 Acetanilidas Carbamatos Alaclor,metolaclor Profam 1 200 5 000 Mecanismo de acción *Interrupción del transporte de e- asociado a los fotosistemas o inhibición de las reacciones luminosas, por lo que la fotosíntesis resulta inhibida Dinitrofenoles Halofenoles *Desacoplantes del T.E. - F.O. *Inhibidores del T.E. Ac. Benzoicos “Auxinas” y Cl-fenoxiaceticos 2,3-D,2,3,4-T,Dicamba Hidrazinas Derivados de bipiridilo Diquat,paraquat b) AGENTES DESACOPLANTES Estimulantes del crecimiento “ “ “ “ “ “ “ Inhib. de la síntesis de carotenos agentes no selectivos de contacto BA-13 (2005-06)-5 Disocian el transpone electrónico y la fotofosforilación. El gradiente de protones establecido a través de la membrana tilacoidal durante el transporte electrónico es abolido (es decir, aumenta la permeabilidad de la membrana a los protones). La fosforilación cíclica y la no cíclica son interrumpidas pero el transporte electrónico puede no afectarse o estimularse. El único herbicida identificado hasta la fecha como un desacoplante puro a pH 8 es la perfluidona. Otros compuestos que desacoplan la fotofosforilación tambien desacoplan la fosforilación oxidativa mitocondrial. Halofenoles y dinitrofenoles. RESUMEN DE INTERES: Todos los plaguicidas / herbicidas que inhiben o desacoplan el TE. mitocondrial interfieren con el T.E. y/o fosforilación en los cloroplastos. Sin embargo a la inversa no se cumple, muchos herbicidas como diuron y s-triazinas tienen un ligero efecto sobre el T.E.M. pero solo a concentraciones relativamente altas. DISRUPTORES ENDOCRINOS Los disruptores endocrinos (EDCs) son compuestos que interfieren con el normal funcionamiento de las hormonas, éstas son los mensajeros responsables de transportar las señales que coordinan las funciones propias de los sistemas vivos, incluyendo reproducción, desarrollo y conducta. Los estrógenos son las hormonas sexuales femeninas y los andrógenos las masculinas. Existen otros compuestos naturales con actividad estrogénica, los fitoestrógenos (genisteina, cumestrol), etc. También se vienen empleando desde los 1940`s en terapia compuestos sintéticos con actividad estrogénica fuerte, dietil stilbestrol (DES). Desde los años 1970`s se viene describiendo que muchos de los XBs contaminantes afectan a la capacidad reproductiva de muchas poblaciones y es en los años 1990’s cuando se les definen como disruptores endocrinos (EDCs), que presentan afinidad y/o interfieren con los receptores de las hormonas sexuales y generan mal funciones y malformaciones. Dado que los XBs atraviesan la barrera placentaria, estos problemas son especialmente serios si la exposición tiene lugar en el desarrollo fetal, crecimiento temprano o maduración sexual. El aporte de estrógenos naturales no suele tener consecuencias, pero el aporte de compuestos sintéticos, persistentes y bioacumulables si pueden generar respuestas anormales. TCDD son agonistas del AhR; pp’-DDE es un antagonista androgénico, PLAGUICIDAS con comportamiento de EDCs: DICOFOL, VINCLOZOLIN, CLORDECON, 2.4-D, 2,4,5-T, ATRAZINA, DIELDRIN, HEPTACLORO, MIREX, CLORDANO, DDT y sus metabolitos, PARATION, METOXICLORO, LINDANO, ENDOSULFAN, CLORPIRIFOS, MALATION, DIAZINON, CARBARIL y algunos piretroides sistéticos. El resultado de su acción es una perturbación del sistema hormonal que es crítico para mantener el desarrollo del cuerpo tal como ha sido seleccionado a través de generaciones. Estas perturbaciones no son mutaciones genéticas sino que alteran el sistema de mensajes químicos que controla cómo y cuando se expresan los genes. Esquema del mecanismo de acción (ver con mayor precisión en la presentación corrrespondiente) Plaguicidas DDT Endosulfan Vinclozolin Malathion Compuestos Industriales PCB Compuestos Naturales 17 ß-Estradiol BA-13 (2005-06)-6 El Diagrama esquemático que representa los pasos por los que una hormona esteroidea puede ser sensible a la disrupcion por XBs ambientales, comprende las siguiente fases: 1.- Las H esteroideas (EA) tales como E2, tetosterona, y progesterona se sintetizan en las gónadas. Los inhibidores o inductores de las enzimas Cit P450, incluyendo plaguicidas y drogas, actúan al nivel de su síntesis. 2.- Las hormonas (H) son secretadas en la sangre, donde están libres o unidas a SHBG, y están disponibles para las células. El grado de unión está mediado por varios factores, pero la H es capaz de liberarse de SHBG a una velocidad dependiente de su afinidad en la unión. Los XBs pueden alterar los niveles de SHBG, se ha comprobado que algunas H sintéticas no se unen a SHBG como las H naturales, dejándolas mas disponibles para las células blanco y para el metabolismo hepático. 3.- Las H esteroideas difunden dentro de la célula y difunden en la región perinuclear, donde están localizados sus receptores (R) libres. 4.- La H se une al receptor (ER). Muchos XBs pueden unirse a ER o a AR. A veces la sustancia secretada en sangre es una preH que es transformada en la célula, a H activa. La tetosterona es transformada en algunos tejidos por la aromatasa a E2, mientras que en otros, la 5α-reductasa la transforma a DHT. En músculo la T es una H activa. Algunos EDCs inhiben la activación de la preH en el tejido blanco. 5.- El receptor R, unido a una H natural o sintética, sufre un cambio conformacional, exponiendo lugares de unión de la proteina y formando homodímeros. 6.- Los homodímeros acumulan factores transcripcionales (tf), formando un complejo de transcripción, que se une a una secuencia específica sobre el DNA de los genes dependientes de la H, conocidos como elementos de respuesta a la H (HRE). El complejo transcripcional inicia la síntesis del mRNA. Algunas anti-H interfieren con la unión al DNA. 7.- El mRNA es transportado fuera del núcleo al citoplasma y con los AA transportados por sus tRNAs y los ribosomas se sintetizan las proteinas desde el molde del mRNA. 8.- La proteina, un marcador de la acción endocrina, puede ser una E, una H o un factor de crecimiento (citoquina), o un componente estructural de la célula. Un ejemplo de una H marcadora es la vitelogenina, una proteina sensible a estrógenos producida por los vertebrados ovíparos. 9.- En algunos casos, los XBs interrumpen la función endocrina por alteraciones en la función hepática, incrementando o decreciendo el metabolismo de la H, así como los niveles en suero. Por ejemplo, algunos PCBs estimulan el metabolismo de T4, reduciendo dramáticamente los niveles de T4 en suero. Varios plaguicidas han mostrado capacidad de estimular el hígado y reducir los niveles de H esteroideas en suero. •Agonistas, actúan como hormonas naturales por unión a los receptores y promueven las respuestas celulares. •Antagonistas, se unen y bloquean los receptores, por lo tanto dejan a los mecanismos reguladores no disponibles a las señales de los mensajeros producidos normalmente por las hormonas. •Alteran las concentraciones de las hormonas naturales promoviendo o interfiriendo en el tratamiento de las hormonas por las enzimas hepáticas. • Alterando el número de receptores en el desarrollo de tejidos, predisponiendo a estos tejidos a posteriores respuestas anormales. La discutida Neurotoxicidad de los organoclorados Efectos tóxicos de los PCDF y PCDD (situados en la parte alta del 10 % de los compuestos más tóxicos) No se ha descrito relación entre estos compuestos y la transmisión nerviosa, aunque si se ha señalado que la exposición a altas dosis afecta a la conducta y al aprendizaje de los niños como consecuencia de daños sobre el sistema nervioso. Los experimentos con animales de laboratorio indican que la toxicidad de estos compuestos se relaciona fundamentalmente con el cáncer, disfunciones hepáticas y del sistema inmune, inducción enzimática, alteraciones en la reproducción. La toxicidad de los PCBs se viene centrando en su actuación como disruptores endocrinos. Exposición por largos periodos de tiempo, puede llegar a inducir cáncer y defectos en el nacimiento por afectar al sistema reproductor; exposiciones a altas dosis pueden dañar el sistema nervioso, causando adormilamiento, debilidad y hormigueo en los brazos y piernas. Los efectos tóxicos de los plaguicidas organoclorados se centran en la alteración de la función hormonal como disruptores endocrinos. No obstante, algunos insecticidas como el DDT afectan al sistema nervioso. Su ingestión causa excitabilidad, temblores, ataques, confusión, convulsiones y parálisis de la lengua y labios. Su principal metabolito el DDE es un potente inhibidor de las hormonas masculinas, andrógenos; se le relaciona con los problemas reproductores que están apareciendo en la población humana y en la fauna salvaje. Estos dos organoclorados están descritos experimentalmente como cancerígenos, y como distorsionadores de la capacidad reproductora.