ESPECTROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA MOLECULAR Introducción Principios teóricos Instrumentación Aplicaciones Introducción: Fenómenos luminiscentes moleculares emisión de radiación por parte de determinadas sustancias que se encuentran en un estado electrónico excitado Fotoluminiscencia Quimioluminiscencia Bioluminiscencia Termoluminiscencia Radioluminiscencia Triboluminiscencia Emisi ón de prE exEmisión citado Ede o procedente •Fluo s por cedente de rescende E procedente radia nivele moléculas, una Emisión ción de cia: Aproducto UV-V s b s o r is c reacción química ión una moléculas, producto de •Fosfo 1 y -2 0 e m -10 -9 s rescen e isión en t reacción en sistema n cia:un e d Apbrsoocre Emeisnibiológico ciónpyor te > E e 1 nd 0d-de e2 sE-Eip s eden nóón emisi pr aoc ó i d s r isi i o s Em a e n Em molélcaus exc temacned te ón a s l a as u ad s éc culaesxexcit olé cióncitadas mol m medfirainctde alta partículas e cal orenergía Fotoluminiscencia Se divide en dos categorías: fluorescencia y fosforescencia dependiendo de la naturaleza del estado excitado. Emisión luminiscente ESPÍN DEL ELECTRÓN: SINGLETES Y TRIPLETES Moléculas en estado fundamental OM con 2 e- espines opuestos e- en nivel energético superior con espines opuestos SINGLETE h SINGLETE e- en nivel energético superior con espines paralelos TRIPLETE Fluorescencia y fosforescencia Transición PERMITIDA FLUORESCENCIA Estado excitado SINGLETE Rápido retorno al estado fundamental Transición PROHIBIDA Tiempo de vida 10 ns FOSFORESCENCIA Estado excitado TRIPLETE Velocidad de emisión lenta Tiempo de vida ms a s Diagrama de Jablonski Diagrama típico de los niveles energéticos para una molécula luminiscente Excitación Tiempo requerido para el proceso de absorción del fotón: 10-15 – 10-14 s Molécula h Molécula Relajación vibracional y Conversión interna y externa Conversión interna: Relajación vibracional: Pérdida de E vibracional excesiva en forma de choques entre la especie excitada y otras (ΔT mínimo) Muy rápido (10-10 – 10-13 s) Ocurre siempre. Todos los procesos pueden considerarse originados desde el nivel vibracional más bajo de un estado electrónico excitado La emisión fluorescente se produce a > excitación Nivel vibracional inferior de un estado electrónico excitado Nivel vibracional superior de un estado electrónico de E inferior (Sin emisión de radiación) Conversión interna Espectros de excitación y emisión de quinina Fluorescencia Nivel vibracional inferior SINGLETE Estado fundamental h excitado Proceso inverso a la absorción Relación inversa entre y tiempo de vida del estado excitado = 103 -105 tiempo de vida de S* = 10-7 -10-9 s < 103 tiempo de vida de S* = 10-5 -10-4 s Cruce entre sistemas Nivel vibracional inferior de singlete excitado Nivel vibracional superior de un triplete (Sin emisión de radiación) (Seguido de relajación vibracional) Cruce entre sistemas Cambio en el spin del eVelocidad < C.I. Espectros de excitación y emisión Espectros de excitación y emisión Espectro de excitación Espectro de emisión Variación de IF al variar la exc. a una em = cte Eficacia de las diferentes exc. para producir fluorescencia Variación de IF al variar la em a una exc = cte Intensidad de la radiación emitida a diferentes Factores que afectan a la fluorescencia Del compuesto: Rendimiento cuántico Estructura molecular Del entorno químico: Disolvente Temperatura pH Presencia de O2 Rendimiento cuántico (0 < F < 1) No. fotones emitidos como fluorescencia F No. fotones absorbidos Función de la velocidad del proceso de desactivación por emisión/velocidad de otros procesos de desactivación KF F K F K CI K CS ... Estructura molecular Estructura molecular: Transiciones electrónicas * anti-enlazante Energía n n * * * antienlazante * * * * n no-enlazante -enlazante -enlazante ➝ * mayor rendimiento cuántico > fluorescencia Tiempos de vida media más cortos (mayor KF) Menor probabilidad de cruce entre sistemas (menor KIC) Estructura molecular: Aromaticidad No presentan fluorescencia Presentan fluorescencia Estructura molecular: Aromaticidad Estructura molecular: Sustituciones en el anillo aromático INFLUYE SOBRE carácter aceptor de e- Longitud de onda de excitación (exc) Longitud de onda de emisión (em) Rendimiento cuántico de fluorescencia (ΦF) carácter donor de e- Estructura molecular Rigidez estructural Reduce el grado de interacción con el medio Aumenta F en quelatos Factores que afectan a la fluorescencia: Entorno químico Efecto del solvente Viscosidad y polaridad Efecto de la temperatura Variación de la viscosidad y el número de colisiones Efecto del pH Longitud de onda e intensidad diferenciada para la forma ácida y básica Presencia de oxígeno disuelto Amortiguación de la señal fluorescente Efecto del solvente En general, un aumento de la viscosidad, aumenta F Aumento de la polaridad, Transiciones ➝* Desplazamiento de (máx)em hacia el rojo Transiciones n ➝* Desplazamiento de (máx)em hacia el azul Efecto del átomo pesado F disminuye Solventes con átomos pesados Favorecen tripletes Solutos con átomos pesados Efecto del solvente Fotografía y espectros de fluorescencia del 4dimetilamino-4'nitroestilbeno (DNS) en solventes de polaridad creciente. H, hexano; CH, ciclohexano; T, tolueno; EA, acetato de etilo; Bu, n-butanol. Temperatura Aumento de temperatura Disminuye F Colisiones entre moléculas Procesos de desactivación no radiativos Efecto del pH Afecta a F y a (máx)em de compuestos con sustituyentes ácidos o básicos El pH del medio afecta la carga y las formas resonantes del fluoróforo Oxígeno disuelto Oxidación del fluoróforo Disminuye F Carácter paramagnético del O2 Cruce entre sistemas Análisis Cuantitativo: Efecto de la concentración Relación entre IF y concentración Base de las aplicaciones analíticas I F K F I 0 I I0 = intensidad incidente I = intensidad transmitida K = cte. de proporcionalidad (depende del instrumento) F = rendimiento cuántico de fluorescencia ec. 1 Análisis Cuantitativo: Efecto de la concentración De acuerdo a la ley de Beer: Reemplazando en la ec. 1: I I 0 10 bc I F K F I 0 ( 1 10 bc ) Desarrollando en serie: n bc ( bc )2 n ( bc ) I F K F I 0 2.3bc 1 ... ( 1 ) 2 ! 3 ! ( n 1 )! A bajas concentraciones bc < 1 y es posible despreciar todos los términos frente a 1: I F K F I 0 2.3bc Análisis Cuantitativo: Efecto de la concentración Análisis Cuantitativo: Efecto de la concentración Instrumentación Instrumentación Fuente de energía: lámpara de Xe Monocromadores de red de difracción Detectores: tubos fotomultiplicadores Cubetas de cuarzo con las 4 caras transparentes a la radiación Aplicaciones de la fluorescencia Análisis cualitativo y estructural Campo de aplicación Análisis cuantitativo Auxiliar en otras técnicas Métodos analíticos Fluorescencia directa Analito fluorescente Fluorescencia indirecta Analito no fluorescente Análisis cualitativo y estructural Identificación de sustancias con espectros de emisión muy característicos Hidrocarburos aromáticos y compuestos heterocíclicos Identificación de iones inorgánicos Con fluorescencia nativa (sales de uranio y tierras raras) No fluorescentes por formación de quelatos fluorescentes Análisis cuantitativo Muy útil en la determinación de trazas de iones inorgánicos y compuestos orgánicos Límite de detección: ppb Determinación de iones inorgánicos Formación de quelatos luminiscentes con reactivos orgánicos no luminiscentes Formación de complejos luminiscentes con reactivos inorgánicos (HCl, HBr) Fluorescencia del propio ión (tierras raras, U(VI)) Determinación de compuestos orgánicos y biológicos Por fluorescencia directa (PAH´s, hormonas, etc.) Por fluorescencia inducida por reacción química (N-metilcarbamato) Auxiliar en otras técnicas Indicadores fluorescentes en volumetrías Detección fluorescente en cromatografía Bibliografía BÁSICA “Principios de Análisis Instrumental”, D. Skoog, F. Holler, T. Nieman. “Fundamentos de Química Analítica”, D. Skoog, D. West, F. Holler, S. Crouch. AVANZADA “Photoluminiscence of solutions”, C. Parker. “Principles of fluorescence spectroscopy”, J. Lakowicz