PRÁCTICA 5.1 Aislamiento de Microorganismos

PRÁCTICA 5.1
Aislamiento de Microorganismos
Objetivos
Al finalizar esta práctica el alumno será capaz de:
 Explicar el fundamento de diferentes medios de cultivo y condiciones de incubación
para el aislamiento de microorganismos con características específicas.
 Aplicar diferentes técnicas para el aislamiento de microorganismos.
 Comparar con cepas de referencia la eficiencia de las técnicas de siembra, medios de
cultivo y condiciones de incubación empleadas para el aislamiento de
microorganismos.
 Obtener y comprobar la pureza de los cultivos aislados.
 Aplicar una técnica de conservación de corto o mediano plazo a los cultivos puros
obtenidos.
Introducción
En todos los ambientes naturales habitan múltiples microorganismos de diversos tipos y
actividad fisiológica. Para efectuar el estudio de un organismo particular es necesario
separarlo de la población mixta en la que se encuentra. Para tal fin se emplean técnicas
de aislamiento que conduzcan a la obtención de un cultivo puro.
De manera general los métodos de aislamiento incluyen:
1. Separación física de los microorganismos mediante:
a) Diluciones seriadas y siembra por vertido en placa.
b) Siembra por agotamiento.
2. Utilización de medios de cultivo selectivos y diferenciales.
3. Aprovechamiento de características particulares de los microorganismos, tales
como la formación de esporas, el metabolismo anaerobio y/ o facultativo, la
capacidad para utilizar sustratos poco comunes, etc.
Para facilitar el proceso de aislamiento y obtener mejores resultados, frecuentemente se
emplean combinaciones de las técnicas anteriores.
Materiales
Cultivos puros de los siguientes microorganismos:
Bacillus sp. (esporulado)
Saccharomyces cerevisiae
Escherichia coli
Rhodotorula sp.
Micrococcus luteus
Aspergillus niger
Pseudomonas aeruginosa
Penicillium sp..
Serratia marcescens
Staphylococcus epidermidis
Staphylococcus aureus
Streptomyces griseus
Muestras
Lodo o suelo o agua o verdura fresca o fibra dietética o columna de Winogradsky o
muestra mixta de cultivos puros.
Material por grupo:
Baño María a 50ºC
Incubadora a 28 y 37°C
Tubo con solución de estreptomicina (3000 µg/ mL) estéril.
Material por equipo:
Balanza granataria
Espátula o cuchara de acero inoxidable
Tripie
Vaso de precipitados de 250 mL
Matraz Erlenmeyer (250 mL) con 90 mL de solución salina isotónica estéril (SSIE) o
solución amortiguadora de fosfatos 0.1 M pH 7.2
Varilla de vidrio en “L”
Tubos de ensayo de 22x175 con 15 mL de los siguientes medios:
Medio general (gelosa nutritiva, TSA o BHI)
Eosina azul de metileno (EMB)
Manitol sal agar (MSA)
YPMD
Sabouraud Rosa de Bengala (SRB)
Tubos de ensayo de 16x150 con 9.0 mL de SSI estéril
Cajas de Petri con 15 mL de los siguientes medios: TSA o BHI, EMB, MSA, YPDM y
TSA+MnSO4.
Material que deben tener los alumnos:
Mecheros
Asas
Gradilla
Pipetas graduadas de 1.0 mL estériles
Cajas de Petri de plástico estériles desechables
Metodología
1. Rotular todo el material indicando dilución, o técnica de siembra, medios de cultivo
(Figura 7).
Figura 7. Técnicas de aislamiento de microorganismos.
a) Dilución de la muestra.
1. Pesar 10 g o medir 10 mL de la muestra natural y en condiciones asépticas vaciar
en un matraz Erlenmeyer con 90 mL de SSI estéril, ó tomar 1 mL de una muestra
mixta de cultivos puros y en condiciones asépticas transferir a un tubo con 9 mL de
SSI estéril ó transferir 3 a 5 asadas de esporas de un alimento con desarrollo
visible de hongos a un tubo con SSI estéril.
2. Homogeneizar y a partir de esta suspensión preparar 2 diluciones decimales mas
(10-2 y 10-3), para ello emplear dos tubos con 9 mL de SSI estéril c/u. En el caso de
la muestra de alimento contaminado con hongos únicamente se realizan dos
diluciones.
b) Siembra por vertido en placa con medio selectivo Sabouraud-rosa de bengala
1. Fundir el medio de cultivo contenido en tubos de ensayo de 22x175 y mantenerlos
a 45ºC.
2. Preparar la zona aséptica.
3. A partir de la última dilución y con una pipeta estéril transferir 0.1 mL a una caja de
Petri vacía y estéril.
4. Colocar la pipeta después de su uso en un pipetero que contenga una solución
sanitizante y lavar posteriormente.
5. Agregar al medio fundido de SRB la estreptomicina estéril a una concentración de
3000 µg/ mL (0.15 mL/ 15 mL del medio para una concentración final de 30 µg/ mL).
Mezclar e inmediatamente agregar a la caja estéril.
6. Mezclar suavemente el inóculo con el medio. Para ello colocar la caja sobre la
mesa y girar 5 veces en el sentido de las manecillas del reloj, 5 veces en sentido
inverso, 5 veces hacía delante y atrás y 5 en sentido horizontal.
7. Dejar solidificar.
8. Cuando el medio haya solidificado, invertir la caja..
9. Incubar de acuerdo a las indicaciones del Cuadro 8.
c) Siembra por agotamiento en medios selectivos y diferenciales.
1. A partir de la última dilución y con el asa bacteriológica sembrar por la técnica de
cuadrante radial cada una de las siguientes placas MSA, EMB, YPMD.
2. Invertir las cajas ya inoculadas..
3. Incubar de acuerdo a las indicaciones del Cuadro 8.
d) Aislamiento de bacilos esporulados.
1. Colocar el tubo de la segunda dilución en un baño de agua a ebullición y
mantenerlo durante 10 minutos.
2. A partir del tubo anterior, con el asa bacteriológica sembrar por cuadrante radial
una placa de TSA+MnSO4.
3. Invertir la caja e incubar en las condiciones que se indican en el Cuadro 8.
Cuadro 8. Condiciones de incubación para el desarrollo de microorganismos.
Medio de cultivo
Temperatura (° C)
Tiempo
MSA
37
1 a 2 días
EMB
YPMD
28
3 a 5 días
SRB
TSA+MnSO4
Precauciones generales


Las estrías hechas para la siembra por agotamiento deben ser cerradas y
trazadas rápidamente.
Etiquetar perfectamente el material a sembrar.
Disposición de desechos
1. Esterilizar el matraz y tubos en los que se prepararon las diluciones y
posteriormente lavarlos.
2. Escurrir el exceso de sanitizante del pipetero donde se depositaron las pipetas,
lavarlas, secarlas, envolverlas y esterilizarlas.
a) Aislamiento de la bacteria problema
Materiales
Material por equipo:
Microscopio
Reactivos para tinción de Gram
Material que deben tener los alumnos:
Mecheros
Asas bacteriológicas
Portaobjetos
Charola para tinción
Piseta
Puente de vidrio
Pinzas de madera para ropa
Material para profesores:
Placas con TSA, EMB, MSA, TSA+MnSO4.
Metodología
a) Comparación de la diversidad de las colonias desarrolladas en los diferentes medios de
cultivo y condiciones de incubación.
En las placas con TSA, EMB, MSA, SRB y TSA+MnSO4 proceder a:
1. Determinar la abundancia, separación y diversidad de las colonias desarrolladas en las
cajas sembradas por placa vertida y por agotamiento.
2. Registrar los resultados en el Cuadro 9.
3. Seleccionar de cada placa 2 colonias diferentes.
4. Identificar con una clave las colonias seleccionadas y de cada una hacer una tinción de
Gram (tener cuidado de no arrastrar toda la colonia) y efectuar la observación
microscópica.
5. Registrar los resultados en el Cuadro 10.
Cuadro 9. Abundancia y diversidad (número y tipo) de colonias desarrolladas en placas
sembradas por diferentes técnicas de aislamiento.
Placa vertida
Medios de cultivo /
Técnica de siembra
EMB
MSA
YPDA
SRB
TSA+MnSO4 (28º C)
Número
aproximado
de colonias
ND
ND
ND
ND
Número de
colonias
diferentes
ND
ND
ND
Agotamiento
Presencia de
colonias
aisladas
Número de
colonias
diferentes
ND
ND
ND
ND=no determinado
b) Aislamiento primario.
1. Identifique las colonias en las que observó un solo tipo de morfología y Gram.
2. Con base en sus resultados y las instrucciones del profesor proceda a aislar:





3.
4.
5.
Una bacteria Gram negativa o
Una bacteria Gram positiva o
Un bacilo esporulado (realizar la confirmación de esporulación después de
incubar un mínimo de 5 días) o
Una actinobacteria o
Un hongo filamentoso ( o uno levaduriforme)
A partir de la colonia seleccionada inocular por agotamiento ( o por picadura en el
caso de un hongo filamentoso) una placa que contenga el medio de procedencia
(1ª resiembra).
Incubar 24 horas a una temperatura que debe ser acorde con la procedencia de la
colonia.
Guardar en refrigeración las cajas a partir de las cuales realizó el aislamiento.
Precauciones generales


Marca y rotula perfectamente las colonias seleccionadas para realizar el
aislamiento primario.
Guarda en refrigeración las placas de las cuales se seleccionó la colonia para el
aislamiento primario.
Disposición de desechos
1. Verter los desechos de colorantes en los contenedores dispuestos en los
laboratorios.
2. Después de observar las preparaciones, sumergir los portaobjetos en una solución
sanitizante durante 10 minutos, lavar con detergente, enjuagarlos y colocarlos en un
frasco con alcohol al 95%.
3. En el caso de ruptura de las preparaciones, envolver los fragmentos con papel,
esterilizar el paquete en autoclave y después desecharlos en el contenedor de vidrio
roto.
1. Sellar con maskin-tape las cajas de Petri no seleccionadas y colocarlas en el
contenedor ubicado en el laboratorio 1A.
Guía para redactar la discusión de resultados
1. ¿Qué técnica de aislamiento te resultó más efectiva para obtener colonias
separadas?
2. ¿En qué medio de cultivo se presentó el mayor número y diversidad de colonias
microbianas? ¿A qué lo atribuyes?
3. ¿La metodología a seguir para el aislamiento de bacterias esporuladas es
efectiva? ¿Por qué?
4. ¿Qué otra técnica conoces para aislar bacterias esporuladas?
a) Continuación del aislamiento de la bacteria problema (2ª resiembra)
b) Resultados. Crecimiento de actinobacterias y hongos.
Materiales
Material por equipo:
Microscopio
Colorantes para tinción de Gram
Asas micológicas
Tripié
Charola de metal
Vaso de precipitados de 250 mL
Frasco gotero con verde malaquita (5%), safranina (0.5%) y lactofenol azul de algodón
Placas de TSA
Incubadoras a 28 y 37°C
Material que deben tener los alumnos:
Mecheros
Asas bacteriológicas
Portaobjetos
Cubreobjetos
Charola para tinción
Puente de vidrio para tinción
Pinzas largas de punta roma
Pinzas de madera para ropa
Piseta
Metodología
a) Continuación del aislamiento de la bacteria problema.
1. Seleccionar tres colonias que estén separadas e identificarlas con una clave en el
reverso de la caja.
2. A partir de cada colonia realizar un frotis y teñir con Gram para verficar la pureza
3. En el caso de las colonias aisladas a partir de TSA+MnSO4 hacer un frote y tinción
de esporas (pag. 16), recuerda que para ello:
a) Cubrir la preparación con un papel filtro y saturarlo con verde de malaquita al 5 %,
calentar la preparación sobre un vaso de precipitado con emisión de vapores de
agua. Dejar actuar el colorante durante 10 minutos, procurando que no se seque la
preparación.
b) Retirar el papel filtro (con unas pinzas largas), lavar la preparación con agua
abundante (hasta que el efluente no salga verde)
c) Teñir con el colorante de contraste (safranina 0.5%) durante 2 minutos.
d) Lavar abundantemente con agua.
4. Registrar en el Cuadro 10 las características de las colonias desarrolladas.
5. A partir de las observaciones, seleccionar una colonia que microscópicamente muestre un
solo tipo de morfología y Gram.
6. Resembrar la colonia por agotamiento en dos placas de TSA e incubar a 37°C durante 24
horas.
Cuadro 10. Características de colonias seleccionadas para el aislamiento y de las
colonias obtenidas en resiembras subsecuentes.
Medio Clave de
Características
Características
de
la
microscópicas
macroscópicas*
cultivo
colonia
(incluir esquema)
Características
iniciales
1ª resiembra
2ª resiembra
3ª resiembra
* Describir las colonias de acuerdo con las características revisadas en la Práctica 3.1 Técnicas de Siembra.
b) Resultados del crecimiento de actinobacterias y hongos.
1. Observar y comparar las características macroscópicas de los microorganismos
desarrollados en YPMD y SRB.
2. Registrar la cantidad de colonias desarrolladas en los dos medios (Cuadro 9) y las
características de las colonias (Cuadro 11).
3. Seleccionar de cada medio 2 a 3 colonias que se encuentren separadas y sean
diferentes.
4. Marcar las colonias con clave al reverso de la caja.
5. Hacer un frote y tinción de Gram a partir de las colonias seleccionadas en YPMD.
6. Observar al microscopio y registrar los resultados en el Cuadro 11.
7. Hacer preparaciones húmedas con lactofenol azul de algodón a partir de las
colonias seleccionadas en SRB.
8. Observar al microscopio y registrar los resultados en el Cuadro 11.
Cuadro 11. Resultados del crecimiento de actinobacterias y hongos.
Características
Medio de
Características
Colonia
microscópicas
cultivo
macroscópicas*
(incluir esquema**)
1
YPMD
2
3
1
SRB
2
3
* Describir las colonias de acuerdo con las características revisadas en la Práctica 3.1 Técnicas de
Siembra. **Dibuja el campo microscópico con las observaciones microscópicas a color.
Precauciones generales

Algunas colonias de bacterias filamentosas son muy secas y duras, para realizar
un frote de éstas frota suavemente la colonia con el asa bacteriológica y
resuspende en una pequeña gota de agua sobre un portaobjetos.
Disposición de desechos
1. Verter los desechos de colorantes en los contenedores dispuestos en los
laboratorios.
2. Después de observar las preparaciones, sumergir los portaobjetos en una
solución sanitizante durante 10 minutos, lavar con detergente, enjuagarlos y
colocarlos en un frasco con alcohol al 95%.
3. En el caso de ruptura de las preparaciones, envolver los fragmentos con papel,
esterilizar el paquete en autoclave y después desecharlos en el contenedor de
vidrio roto.
4. Sellar con maskin tape las cajas de Petri que contengan los cultivos de
actinomicetos y hongos y colocar en el contenedor ubicado en el laboratorio 1A
Guía para redactar la discusión de resultados
1. ¿La cantidad de colonias bacterianas es mayor o menor a la de colonias de
hongos filamentosos? ¿A qué lo atribuyes?
2. ¿Qué criterios seguiste para seleccionar la colonia para realizar el aislamiento
primario?
3. ¿Cuáles han sido las dificultades a las que te has enfrentado para purificar tu
cultivo microbiano?
a) Continuación del aislamiento de la bacteria problema
Materiales
Material por equipo:
Microscopio
Colorantes para tinción de Gram
Tubos de ensayo de 13x100 con TSA inclinado
Incubadoras a 28 y 37°C
Material que deben tener los alumnos:
Mecheros
Asas
Portaobjetos
Charola para tición
Puente de vidrio para tinción
Pinzas de madera para ropa
Piseta
Material para profesores:
Placas con TSA
Metodología
a) Continuación del aislamiento de la bacteria problema.
1. Seleccionar tres colonias que estén separadas e identificarlas con una clave en el
reverso de la caja.
2. A partir de cada colonia realizar un frotis y teñir con Gram para verificar la pureza.
3. Observar las características coloniales y microscópicas y registrar en el Cuadro
10.
4. En el caso de observar cultivos mixtos repetir la resiembra en 2 placas de TSA,
incubar y repetir los incisos 1 a 3.
b) Conservación del cultivo puro.
1. Una vez confirmada la pureza de las colonias, proceda a resembrar en dos
tubos de ensaye de 13x100 con TSA inclinado (estría ondulada), debidamente
etiquetados e incubar a 35°C durante 24 horas. En el caso de los hongos,
sembrar en agar Sabouraud inclinado por estría ondulada (levaduras) o por
picadura (hongos filamentosos) e incubar a 28° C, durante 1 a 5 días.
2. Al término de la incubación sellar con plástico ParafilmMR (pedir en ventanilla
con el laboratorista) y guardar en refrigeración.
Precauciones generales

Para asegurar la obtención de la pureza de tu cultivo, procura en cada resiembra
la obtención de colonias aisladas, realizar buenas tinciones y observaciones
microscópicas, y respetar los tiempos de incubación de acuerdo al tipo de
microorganismo a aislar.
Disposición de desechos
1. Verter los desechos de colorantes en los contenedores dispuestos en los
laboratorios.
2. Después de observar las preparaciones, sumergir los portaobjetos en una
solución sanitizante durante 10 minutos, lavar con detergente, enjuagarlos y
colocarlos en un frasco con alcohol al 95%.
3. En caso de ruptura de las preparaciones, envolver los fragmentos con papel,
esterilizar el paquete en autoclave y después desecharlos en el contenedor de
vidrio roto.
Guía para redactar la discusión de resultados
1. Comparar la eficiencia de técnicas de separación empleadas.
2. Con base en sus observaciones microscópicas, la abundancia y la diversidad de las
colonias desarrolladas, discutir si se comprobó la función de los medios selectivos y
diferenciales.
3. Comparar las principales diferencias de crecimiento de bacterias no
filamentosas, bacterias filamentosas (actinobacterias) y hongos, y su relación
con la técnica de siembra y medio selectivo empleados para su aislamiento.
4. Analizar la diversidad microbiana en la muestra estudiada.
Literatura de consulta




Madigan, M. T., J. M. Martinko y J. Parker. 2003. Brock. Biología de los microorganismos. 10ª Ed.
Prentice Hall Iberia. España.
Ramírez-Gama, R. M., B. Luna Millán, O. Velásquez Madrazo, L. Vierna García, A. Mejía Chávez, G.
Tsuzuki Reyes, L. Hernández Gómez, I. Müggenburg, A. Camacho Cruz y M del C. Urzúa
Hernández. 2006. Manual de Prácticas de Microbiología General. 5ª edición. Facultad de Química,
UNAM. México.
Tortora Gerard J., Fonke Beidell R. y Case Christine L. 1995. Microbiology an Introduction. 5a. ed.
The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. 801 pp
Vullo, D., M. Wachsman, L. Alche. 2000. Microbiología en Práctica. Manual de laboratorio para la
enseñanza de Microbiología básica y aplicada. 1ª edición. Atlante S. R. L. Argentina