Inmunolog a 72p 23/6/03 10:30 P gina 225 Revisión Inmunología Vol. 22 / Núm 2/ Abril-Junio 2003: 225-242 Vectores adenovirales de primera generación, el vector por excelencia en inmunoterapia génica del cáncer I. Narvaiza, G. Mazzolini, C. Qian, J. Prieto, I. Melero División de Terapia Génica. Centro de Investigación Médica Aplicada (CIMA). Clínica Universitaria y Facultad de Medicina. Universidad de Navarra, Pamplona (Navarra), España FIRST GENERATION ADENOVIRAL VECTORS, THE VECTOR PAR EXCELLENCE FOR IMMUNO-GENE THERAPY OF CANCER RESUMEN La terapia génica constituye una novedosa alternativa terapéutica para muchas enfermedades cuando las terapias habituales no tienen efecto. Básicamente la terapia génica consiste en la introducción de material genético en el interior de una célula diana con el objeto de producir en ella un cambio funcional que se traduzca en un efecto terapéutico. El intenso desarrollo de esta área de la biomedicina ha llevado a la puesta en marcha de numerosos protocolos clínicos de terapia génica para el tratamiento experimental de enfermedades de diverso origen: tumoral, infeccioso, autoinmune, degenerativo, genético. En la mayoría de los casos, es necesario recurrir al empleo de un vehículo, denominado vector, para introducir el material genético en las células. Éstos pueden provenir de virus modificados genéticamente (vectores virales) o pueden ser formulaciones fisicoquímicas (vectores no virales). Actualmente existe un amplio abanico de vectores para transferencia génica, sin embargo no se dispone del vector ideal que pueda ser tan versátil como para adaptarse a las numerosas situaciones experimentales o clínicas. Debido a las propiedades de los vectores adenovirales, tales como su alta eficacia de transducción, amplio tropismo, fácil construcción y producción, éstos han sido ampliamente utilizados y se cuenta con una amplia experiencia en campos como la terapia génica del cáncer. En este sentido, y a pesar de la corta duración de expresión del transgén debido a su alta inmunogenicidad, los adenovirus de primera generación han demostrado su eficacia tanto en estrategias de inmunoterapia en modelos tumorales experimentales como también en ensayos clínicos de fase I. En este trabajo se revisan críticamente los distintos vectores virales empleados en terapia génica profundizando en las características biológicas de los adenovirus, los distintos tipos de vectores adenovirales, los diferentes sistemas de construcción de adenovirus de primera generación así como su empleo en distintas aproximaciones de inmunoterapia génica del cáncer. ABSTRACT Gene therapy is a new promising therapeutic alternative for a number of diseases in which traditional treatments are unsuccessful. Basically, gene therapy consists in the introduction of genetic material into target cells with the purpose to produce a therapeutic benefit. Recent advances in this area of biomedicine have lead to the development of an ever-increasing list of gene therapy clinical trials for the treatment of different diseases, such us malignant, infectious, autoimmune, and genetic diseases. In most of the gene therapy approaches the use of a vehicle, called vector, to deliver the genetic material into the cells is required. Vectors can derive from genetically modified virus or can be of nonviral origin. In spite of a variety of vector systems developed, a universal vector adaptable to the diverse experimental or clinical conditions is not available. Due to their properties such as high transduction efficiency, wide cellular/ tissular tropism, easy handling and production, Adenoviral vectors have been extensively used in cancer therapy and an important amount of experience has been accumulated during the last decade. In spite of their high immunogenicity that limits transgene expression to a short period of time, first generation adenoviral vectors have demonstrated their efficacy in several immunotherapy strategies against experimental tumour models as well as in phase I clinical trials. This article reviews currently available viral vectors for gene therapy, biological properties of adenoviruses, the different versions of adenoviral vectors and methods to construct first generation adenoviral vectors with special emphasis in cancer immunotherapy approaches. KEY WORDS: Gene therapy / Viral vectors / Adenovirus/ Cytokines. PALABRAS CLAVE: Terapia génica / Adenovirus/ Citocinas / Cáncer. 225 Inmunolog a 72p 23/6/03 10:30 P gina 226 VECTORES ADENOVIRALES DE PRIMERA GENERACIÓN, EL VECTOR POR EXCELENCIA EN INMUNOTERAPIA GÉNICA DEL CÁNCER TERAPIA GÉNICA Definición La terapia génica podría definirse como la transferencia de material génico exógeno a tejidos u órganos para corregir un defecto genético o conferir una nueva función biológica con el propósito último de prevenir o tratar una enfermedad(1-3). Objetivos de la terapia génica El objetivo específico que se pretende alcanzar con la terapia génica puede ser muy diverso. Abarca desde la restauración o complementación de una función biológica alterada, a la expresión de proteínas antigénicas como procedimientos de vacunación génica, pasando por la introducción de genes que aporten o potencien nuevas funciones, el silenciamiento o inhibición de genes, o la introducción de genes o moléculas que permitan la monitorización de células. Células diana Todo tipo de célula somática es susceptible de ser modificada genéticamente. La modificación génica de la línea germinal en roedores y otros mamíferos ha sido crucial para entender la fisiología de múltiples sistemas(4). Sin embargo, no existe constancia de que se hayan realizado estudios de transferencia génica en la línea germinal humana con fines terapéuticos debido a las implicaciones éticas que conlleva(2, 5). Material génico transferible El material génico (transgén) que puede ser transferido al interior de la célula también puede ser de naturaleza muy diversa incluyendo: genes completos(6), cassettes de expresión artificiales(7), moléculas antisentido(8), ribozimas o siRNAs(9, 10). Terapia génica ex vivo o in vivo La terapia génica puede dividirse en dos grandes grupos desde el punto de vista metodológico: terapia génica ex vivo y terapia génica in vivo. La terapia génica ex vivo consiste en la extracción del organismo de las células diana y la consiguiente reintroducción de dichas células, de manera autóloga o heteróloga, después de ser transfectadas y seleccionadas; entendiendo la transfección como el proceso de transferencia génica y expresión del transgén realizado con éxito. Por el contrario, la terapia génica in vivo consiste en la transferencia de material génico directamente en el organismo. Los primeros ensayos clínicos de terapia génica consistieron en el marcaje de linfocitos infiltrados en tumores (TIL) ex vivo y su reinoculación en pacientes con la finalidad de demostrar la 226 VOL. 22 NUM. 2/ 2003 TABLA I. Propiedades que debería cumplir un vector ideal • Capacidad para transportar material génico de gran tamaño y protegerlo de su degradación antes de alcanzar a la célula. • Alta eficacia de internalización y transferencia del material génico. • Expresión alta, eficaz, estable y regulada del transgén. • Especificidad para el tipo celular o tejido diana. • Expresión específica del transgén en el tipo celular o tejido diana. • Baja o nula inmunogenicidad (en casos de vacunación génica, ésta supone una ventaja). • Baja toxicidad intrínseca. • Facilidad de manipulación y producción. • Alto grado de seguridad biológica, tanto para el paciente como para el entorno. • Bajo coste de producción. transferencia de un gen exógeno de forma segura y detectable(2). Otros ensayos iniciales, también ex vivo, consistieron en la modificación de linfocitos y hepatocitos mediante retrovirus con el fin de que fuesen capaces de producir adenosina deaminasa (ADA) y el receptor de lipoproteínas de baja densidad (LDL), respectivamente, y subsanar el déficit de dichas proteínas en los pacientes(1, 2). El primer ensayo clínico de terapia génica in vivo consistió en la transferencia mediante liposomas de un plásmido que codificaba HLA-B7 en células de melanoma(11). Actualmente, la mayoría de los protocolos de terapia génica buscan la aplicación in vivo debido a su mayor practicidad, comodidad para el paciente y menor coste económico. Sin embargo, existen diferentes protocolos de terapia génica ex vivo muy prometedores como la modificación génica de células madre CD34(12) o de células dendríticas para potenciar su efecto antitumoral(13). VECTORES PARA TERAPIA GÉNICA La transferencia de material génico exógeno puede realizarse empleando métodos diferentes, pero en la mayoría de los casos es necesario la utilización de un vehículo o vector que facilite la introducción de dicho material génico(1, 14). Las propiedades del vector ideal (Tabla I) pueden variar en función de las necesidades concretas pero, en cualquier caso, sus propiedades condicionarán enormemente el éxito del proceso de transferencia génica en cualquiera de sus etapas: 1) alcanzar la célula diana, 2) introducción y liberación del material génico en el interior celular y 3) expresión del transgén. Los vectores empleados en terapia génica se pueden clasificar en dos grandes grupos en función de su naturaleza: a) vectores virales (basados en virus modificados genéticamente) y b) vectores físicos o no virales (resto de los sistemas no basados en virus) (Tabla II). Inmunolog a 72p 23/6/03 10:30 P gina 227 I. NARVAIZA ET AL. INMUNOLOGÍA TABLA II. Propiedades de los vectores más empleados para transferencia génica Propiedades Vector No virales Retrovirus Lentivirus AAV Adenovirus Ad Gutless Amplio Células en división Amplio (Pseudotipaje) Amplio Amplio Amplio Construcción/producción Fácil Moderada Difícil Difícil Moderada Difícil Eficiencia de transducción Insuficiente Baja Muy alta Alta Capacidad de transgén Ilimitada < 4-5 Kb 8-9 Kb < 4-5 Kb 5-8 Kb < 37 Kb Títulos de producción Muy altos Bajos (105-107) Bajos (102-1010 ) Medios (109-1013) Altos (1011-1014) Medios (106-1010) Días Muy larga (integración) Muy larga (integración) Muy larga (integración) 7- 14 días Meses-años Baja Baja Muy alta Baja Alta Alta Tropismo celular Duración de la expresión Inmunogenicidad Seguridad Nula - Muy baja Baja Muy alta Baja (Mutagénesis insercional) Baja-moderada Moderada-alta Baja Media (Mutagénesis (Mutagénesis insercional-HIV) insercional) Las propiedades de los vectores no virales mostradas son propiedades generales y alguno de ellos en concreto pueden presentar variaciones. Los títulos de los vectores virales hacen referencia a iu/ml. Modificado de Wang Y et al. 2000 DDT (5) 1; 10-16. Vectores no virales Existen numerosos métodos de transferencia génica basados en vectores no virales. Todos ellos comparten una serie de propiedades como su simplicidad y facilidad de preparación, permiten transferir moléculas de gran tamaño, son poco inmunogénicos, su toxicidad suele ser baja y son muy seguros. Sin embargo, la eficacia de transferencia génica alcanzada con los vectores no virales suele ser baja y son poco específicos. Los vectores no virales más empleados son el DNA desnudo(15, 16), los liposomas(11, 17), la pistola génica(18, 19), los polímeros catiónicos (poliplejos)(20), los complejos DNA-proteína(21) y la electroporación(22, 23). A pesar de la baja eficacia de transferencia génica que ofrecen los vectores no virales, éstos han dado buenos resultados en ensayos de vacunación(24) y se están desarrollando nuevos vectores y nuevas técnicas que auguran un futuro prometedor para estos vectores(25, 26). Vectores virales Los virus constituyen, probablemente, la forma de vida más simple y representan el ente natural más evolucionado para transferir material génico exógeno al interior celular. Hasta el día de hoy, el ser humano no ha sido capaz de crear artificialmente un sistema que supere la eficiencia de transferencia génica que han alcanzado los virus tras millones de años de evolución. Este hecho ha llevado al empleo y manipulación de los virus como vectores para transferir material génico con fines experimentales y terapéuticos. Distintos tipos de virus han sido modificados para construir vectores para transferencia génica y terapia génica, cada uno de ellos con unas propiedades determinadas (Tabla II). Los métodos utilizados para construir los distintos vectores virales siguen un patrón similar. Las funciones codificadas por los virus pueden dividirse en elementos que actúan en cis o en trans. Las secuencias que actúan en cis, como los orígenes de replicación o la secuencia de encapsidación, deben encontrarse en el propio genoma del vector viral; mientras que los elementos que actúan en trans, como las proteínas estructurales y/o de la envuelta o la maquinaria necesaria para la replicación viral, no es necesario que sean codificados por el propio genoma viral y pueden ser suministradas por células transfectadas de forma estable con los genes que las codifican (células empaquetadoras), mediante plásmidos o virus «helper» (Fig. 1). El método general para la construcción de vectores virales consiste en la sustitución de elementos que actúan en trans, imprescindibles para la replicación, por el material génico que se desea transferir. De este modo se consiguen partículas virales no replicativas pero infectivas, y con capacidad para transferir el material génico terapéutico introducido en su genoma. El número de vectores virales disponibles es amplio y la elección del mismo dependerá de nuestro objetivo. Los retrovirus son los vectores más adecuados para la transferencia génica ex vivo y si se desea la expresión prolongada del 227 Inmunolog a 72p 23/6/03 10:30 P gina 228 VECTORES ADENOVIRALES DE PRIMERA GENERACIÓN, EL VECTOR POR EXCELENCIA EN INMUNOTERAPIA GÉNICA DEL CÁNCER Trans acting Viral genes Cis Proteína µ Cis Proteasa (B) Virus «helper» Transgén VOL. 22 NUM. 2/ 2003 Proteína IIIa Proteína VIII (A) DNA viral Hexon (C) Proteína IX Proteína VII Proteína terminal (D) Célula empaquetadora Figura 1. Método general de construcción de vectores adenovirales. Los métodos de construcción/producción de vectores virales siguen un patrón general: las células son transfectadas con un plásmido, DNA o RNA que contienen las secuencias virales que actúan en cis y el material génico que se desea transferir (transgén) (A); los genes virales que actúan en trans pueden aportarse en forma de plásmidos (B), DNA viral, virus «helper» (C) o/y por la propia célula transfectada (D). transgén (27, 28). Si se pretende modificar células madre hematopoyéticas o leucocitos, la elección más acertada serán los lentivirus(29, 30). En caso de una aproximación in vivo buscando la expresión prolongada del transgén nos decantaremos por los AAV(30, 31) o los adenovirus «gutless»(32), dependiendo del tamaño del mismo. Los adenovirus de primera generación son el vector viral más apropiado en aproximaciones de terapia génica del cáncer que requieren altos niveles de expresión del transgén deseado y no se necesita la expresión prolongada del mismo, como es el caso de la terapia génica con genes suicidas o la inmunoterapia génica. ADENOVIRUS Los adenovirus (Ad) pertenecen a la familia Adenoviridae. Se conocen casi 50 serotipos distintos de adenovirus humanos divididos en 6 subgrupos (A a F) en función de sus características inmunológicas, biológicas y secuencias genómicas(33). Los adenovirus humanos mejor caracterizados y más utilizados en terapia génica son los Ad tipo2 y Ad tipo5, ambos pertenecientes al subgrupo C(34). Estructura y organización genómica de la partícula adenoviral Los adenovirus son virus DNA cuyo genoma esta encerrado en una cubierta proteica de geometría icosahédrica, denominada cápside, de 70-100 nm de diámetro, sin envuelta(33). La cápside está formada por tres proteínas principales: el hexón, la base pentona y la fibra con una protuberancia terminal, además de otras proteínas menores VI, VIII, IX, IIIa y IVa2(34-36) (Fig. 2). El genoma viral es una molécula 228 Proteína V Proteína VI Base pentona Base pentona Knob Figura 2. Estructura de la partícula adenoviral. Sección esquemática de un adenovirión. La organización de las proteínas estructurales se basa en estudios publicados, excepto la localización de la proteína VIII y la organización espacial del genoma viral. Modificado a partir de Flint SJ, Adenoviruses (2001), Encyclopedia of Life Science. 2001 Nature Publishing Group. www.els.net. lineal de DNA de doble hebra de unas 36 Kb con una proteína terminal (TP) unida covalentemente a cada uno de sus extremos 5’. En ambos extremos del genoma viral se definen unas secuencias cortas denominadas ITRs que constituyen el origen de replicación del DNA. A continuación del ITR izquierdo (con relación al mapa del genoma adenoviral establecido por convención, Fig. 2) se localiza la secuencia de empaquetamiento (Ψ), requerida para la encapsidación del genoma y que actúa en cis. El DNA viral esta íntimamente asociado con una proteína muy básica (VII) y con un pequeño péptido denominado µ. Otra proteína, denominada V, está empaquetada con este complejo DNA-proteína y parece que constituye una unión estructural con la cápside, a través de la proteína VI. El virus contiene, además, una proteasa codificada por el genoma viral (Pr) que es necesaria para el procesamiento de algunas proteínas estructurales y para producir virus infecciosos maduros(34). Ciclo infectivo del adenovirus El ciclo infectivo de los adenovirus puede diferenciarse en dos fases(37). La primera fase o fase temprana incluye la entrada del virus en la célula huésped, el transporte del genoma viral al núcleo y la transcripción y traducción selectiva de los genes tempranos(34). Los sucesos tempranos modulan las funciones de la célula facilitando la replicación del genoma viral y la transcripción y traducción de los genes virales tardíos. Los procesos posteriores a la replicación constituyen la segunda fase o fase tardía y terminan con el ensamblaje de las proteínas estructurales y la maduración del virus infectivo en el núcleo. La infección adenoviral Inmunolog a 72p 23/6/03 10:30 P gina 229 I. NARVAIZA ET AL. INMUNOLOGÍA MLP 55Kd, 19Kd L1 243R E1B 289R E1A 0 10 20 30 IX IV 100Kd, 33Kd, L5 pVI, II, Pr L4 pVIII L3 III.pVII, V 12,5Kd, 6,7Kd, L2 gp19Kd, ADP IIIa RIDαβ, 17,7Kd E3 VA RNAs I-II 40 IVa2 60 70 DBP 80 90 100 mu E2A orf 1-6/7 E4 pTP Pol 50 E2B Figura 3. Organización transcripcional del genoma del adenovirus tipo 2. Los transcritos tempranos aparecen en negro (flechas negras) y los tardíos en gris (flechas blancas). Las flechas indican la dirección de la transcripción. En cursiva aparecen las proteínas codificadas por cada región transcripcional; (mu: unidades de mapa). finaliza con la lisis celular y liberación de nuevas partículas adenovirales. La primera fase suele requerir, en células permisivas, entre 6-8 h, mientras que la fase tardía suele ser más rápida liberando partículas virales en 4-6 horas. El genoma adenoviral se puede dividir en dos regiones, dependiendo de que su transcripción sea anterior o posterior a la replicación del mismo. Las regiones de transcripción temprana se denominan regiones tempranas E1, E2, E3 y E4 y las regiones transcritas durante la fase tardía L1 a L5 (Fig. 3). La adsorción del virus a la célula diana está mediada por la unión entre la protuberancia de la fibra adenoviral y receptores situados en la superficie de la membrana celular. El principal receptor para el subgrupo C de adenovirus es el receptor del Virus Coxsakie B/Adenovirus (CAR)(38). CAR es una proteína de membrana que pertenece a la super familia de las inmunoglobulinas y que consta de un dominio extracelular, un dominio transmembrana y otro citoplasmático, siendo el dominio extracelular suficiente para la unión del virus(39). La presencia del CAR condiciona la susceptibilidad a la infección por adenovirus y su ausencia en la membrana de determinados tipos celulares explica la resistencia de los mismos a la infección por adenovirus(40). Además de CAR, el dominio α2 de la cadena pesada de las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad de clase I (MHCI) también se ha descrito como un correceptor para la adsorción del adenovirus(41). Después de la interacción de la fibra adenoviral con sus receptores, tiene lugar la internalización de la partícula viral por un proceso de endocitosis mediada por receptor. El proceso de internalización está promovido por la interacción directa entre un motivo RGD (arginina-glicina-ácido aspártico), que queda expuesto en la base pentona del adenovirus, y las integrinas celulares que contienen la cadena αV, principalmente αVβ3 y a Vβ5(42, 43), que actúan como receptores de internalización. La interacción del virus con la membrana plasmática induce numerosas vías de señalización como la vía de la kinasa de fosfoinositido-3-ol (PI-3K) que dispara la familia de GTPasas Rho y la polimerización y reorganización de la actina para facilitar la endocitosis mediada por vesículas recubiertas de clatrina(44-47). Una vez en el interior del endosoma, en un proceso mediado por la base pentona y el bajo pH, la membrana endosomal se degrada y el endosoma se lisa liberando su contenido al citosol(48). El virión es desarmado por etapas durante el proceso de internalización y transporte al núcleo(49, 50). Parece que la proteasa codificada por el virus permite la desorganización de la cápside adenoviral por proteolisis de la proteína estructural VI. El virión, parcialmente desorganizado, es transportado hasta la membrana nuclear y el genoma viral es introducido en el núcleo a través del poro nuclear; este proceso estaría mediado por la asociación del «core» viral (genoma más TP, VII, V y µ) con la proteína celular p32 y requiere la participación de dineína y microtúbulos(51, 52). La transcripción, replicación y encapsidación del genoma del adenovirus tienen lugar en el núcleo de la célula infectada y comienza con la transcripción de los genes tempranos (Fig. 3)(53). Los productos del gen E1 se pueden dividir en E1A y E1B. La unidad de transcripción E1A es la primera en ser transcrita y da lugar a dos proteínas que comparten su secuencia, 289R y 243R, involucradas en la regulación de la transcripción viral e imprescindibles para la replicación viral. Estas proteínas tienen como función principal modular el metabolismo celular para hacer a la célula susceptible a la replicación viral(37). E1B genera por procesos de splicing alternativo dos proteínas, 19k y 55k, que son necesarias para bloquear el transporte de RNA mensajero celular, estimular el transporte de RNA mensajeros adenovirales, favorecer la replicación viral y bloquear la inducción de apoptosis (dependiente principalmente de p53) por efecto de las funciones de E1A(37). La región E2 codifica proteínas necesarias para la replicación viral y se puede dividir en 2 subregiones, E2a y E2b, que comparten el mismo promotor. E2a codifica la proteína de unión al DNA de 72kD (DBP) y E2b codifica la polimerasa de DNA viral (Pol) y el precursor de la proteína terminal (pTP)(54). La región E3 da lugar a numerosas proteínas involucradas, principalmente, en la evasión de la respuesta inmunitaria generada contra el adenovirus(55). La proteína gp19k se une 229 Inmunolog a 72p 23/6/03 10:30 P gina 230 VECTORES ADENOVIRALES DE PRIMERA GENERACIÓN, EL VECTOR POR EXCELENCIA EN INMUNOTERAPIA GÉNICA DEL CÁNCER a la cadena pesada del MHC-I, la retiene en el retículo endoplasmático (RE) e impide la expresión del MHC-I en la superficie celular(56). La proteína 14,7k y el complejo RID (10.4/14,5k) inhiben la apoptosis y la inflamación inducida por el TNF(34). Aunque E3 no es imprescindible para la replicación y la producción de virus in vitro, codifica para una proteína de 11,6 kDa denominada adenovirus death protein (ADP) necesaria para la liberación eficiente de los viriones del núcleo y la lisis de la célula(57, 58). La región E4(59) codifica al menos 6 proteínas (ORF 16/7) que facilitan el metabolismo del RNA mensajero viral, promueven la replicación del DNA viral, la expresión de genes tardíos y el shut off de la síntesis de proteínas celulares. Los productos del ORF 3 y ORF 6 facilitan el crecimiento viral incrementando la estabilidad de los transcritos virales tardíos en el núcleo. Además, la proteína generada por el ORF 6 forma complejos con la proteína E1B de 55 kDa para promover el transporte de RNAs virales fuera del núcleo. El producto del ORF 6/7 se une al factor de transcripción celular E2F activando la región E2 para incrementar la expresión de proteínas involucradas en la replicación viral. La replicación del DNA viral comienza 8 horas después de la infección. Se inicia en ambos extremos del genoma viral empleando los ITRs y la TP como molde para la síntesis de DNA catalizada por la polimerasa adenoviral (Pol). La síntesis continúa a lo largo de todo el genoma mediante un mecanismo de desplazamiento que requiere de DNABP, Pol y distintos factores celulares(34, 54). Después de la replicación comienza la fase de transcripción tardía. En ese momento prácticamente todas las proteínas expresadas en la célula infectada son de origen viral debido a la actividad de los productos de E1 y E4. La transcripción tardía esta controlada por el MLP (de Mayor Late Promoter) y da lugar a 5 transcritos (L1-L5) por procesos de splicing complejos. L1-L5 codifican las proteínas estructurales y las proteínas necesarias para la encapsidación del genoma viral y para la maduración de los viriones. En la fase tardía se transcriben una serie de RNAs que no son traducidos, denominados VA RNAs, requeridos para la traducción de los transcritos virales tardíos y la inhibición de proteínas antivirales inducidas por interferón(37); también se expresa la proteína IX que contribuye a la estabilidad térmica del adenovirus y a la eficiencia de encapsidación del genoma viral completo. El proceso de encapsidación esta dirigido por la presencia en el genoma adenoviral de la señal de empaquetamiento situada en el extremo izquierdo (Ψ) y que consiste en una serie secuencias ricas en A-T(60). La producción de viriones continúa durante 40 horas tras la internalización, está acompañada de importantes cambios en la infraestructura y la permeabilidad nuclear, facilitando 230 VOL. 22 NUM. 2/ 2003 la salida del virus al citoplasma y finaliza con la lisis celular liberando más de 104 partículas virales por célula(57, 61). VECTORES ADENOVIRALES Los adenovirus son los vectores virales más empleados actualmente en terapia génica in vivo, y debido a sus propiedades es uno de los mejores vectores para la terapia génica del cáncer y más concretamente para la inmunoterapia génica. Las propiedades de los vectores adenovirales son: 1) un tropismo muy amplio, infectando numerosos tipos celulares; 2) infectan tanto células quiescentes como células en divisió; 3) muy alta eficacia de transducción; expresan cantidades altas del transgén; 4) no requieren de integración en su ciclo infectivo y el material génico se expresa de forma episomal; 5) son muy inmunogénicos; 6) su construcción, manipulación y producción son relativamente sencillas, son virus estables y se obtienen títulos altos (1011-1015 pfu/ml); 7) no se han descrito patologías graves asociadas al adenovirus salvaje; 8) su toxicidad como vector es baja y su bioseguridad es alta. Los adenovirus pueden encapsidar moléculas de hasta 105% el tamaño del genoma natural, es decir, aceptarían insertos de 1 Kb. Como se comentó anteriormente, para poder introducir material génico exógeno en el adenovirus se recurre a la deleción de regiones del virus para dejar espacio y sustituirlas por el material exógeno. Se han descrito decenas de métodos para construir adenovirus recombinantes defectivos y para mejorar sus propiedades como vectores para terapia génica (62). Básicamente los adenovirus recombinantes defectivos empleados como vectores pueden dividirse en tres clases (Fig. 4): I) Adenovirus de primera generación, II) Adenovirus de segunda-tercera generación y III) Adenovirus gutless(30, 63). Los adenovirus de primera generación son, hasta el día de hoy, los más empleados en terapia génica y están basados en la substitución de las regiones E1 y/o E3 por el material génico que se desea transferir. Dado que las proteínas expresadas por la región E1 son imprescindibles para la expresión de otros genes virales y la replicación del adenovirus, la producción de los virus recombinantes se realiza en células transformadas con la región E1 del adenovirus, la línea celular empaquetadora más utilizada es la línea celular 293 (64). La deleción de E1 implica que el adenovirus recombinante sea defectivo para su replicación impidiendo que pueda replicarse y amplificarse tras su administración y añade un elemento de seguridad. La región E3 codifica proteínas que no son imprescindibles para la replicación viral por lo que no es necesario que la línea celular empaquetadora las aporte. Sin embargo, es interesante que el vector recombinante exprese la proteína ADP, que facilita Inmunolog a 72p 23/6/03 10:30 P gina 231 I. NARVAIZA ET AL. INMUNOLOGÍA Adenovirus de 1ª Generación Ψ ∆ E1 (3.2 Kb) ± ∆ E3 (3.1 Kb) Adenovirus de 2ª y 3ª Generación Ψ ∆ E1 ± ∆ E2B (1.8 Kb) ± ∆ E2 ± ∆ E3 ± ∆ E4 (1.6 Kb) (2.4 Kb) Adenovirus Gutless Ψ Figura 4. Distintos tipos de vectores adenovirales. Representación del genoma de las distintas generaciones de vectores adenovirales con cada una de las regiones delecionadas (entre paréntesis se indica el tamaño máximo de cada deleción). Las flechas representan los ITRs y Ψ la secuencia de encapsidación. Los adenovirus de 1ª generación aceptan insertos de hasta 8 Kb, los de 2 y 3ª insertos de hasta 14 Kb y los adenovirus «gutless» tienen una capacidad superior a las 36 Kb (la línea punteada representa secuencias no adenovirales). Modificado a partir de X Daanthine and MJ Imperiale, Gene Ther 2000; 7: 1707. la liberación de partículas al exterior de la célula infectada, o la gp19k. Los adenovirus delecionados en E1 admiten transgenes de hasta 5,1 Kb y los delecionados en E1 y E3 insertos de hasta 8,2 Kb. Los adenovirus de primera generación son muy inmunogénicos y su introducción en el organismo dispara una respuesta inmunitaria potente, tanto contra la propia cápside viral como frente a las proteínas virales que se expresan durante la infección(65-67). La respuesta inmunitaria que se genera es, en un primer termino, innata y está mediada principalmente por macrófagos. En el caso de la administración sistémica en ratones las células de Kupffer son responsables de la eliminación del 90% del adenovirus. Posteriormente se genera una respuesta inmunitaria adaptativa celular y humoral(67). La respuesta celular se debe al procesamiento de las proteínas virales y su expresión en el contexto del MHC-I y II que activa las respuestas mediadas por linfocitos T helper y citotóxicos y que conlleva a la eliminación de las células transducidas(68, 69). La respuesta humoral induce la producción de anticuerpos neutralizantes frente a la cápside viral(70). La inmunogenicidad de los adenovirus constituye un gran inconveniente para su uso como vectores en terapia génica de larga expresión ya que limita la expresión del transgén a 7–14 días(71), debido a la destrucción inmunitaria de las células transducidas, e impide la administración repetida del adenovirus debido al efecto neutralizante de los anticuerpos contra la cápside viral generados con la primera administración. Para solucionar el inconveniente de la inmunogenicidad generada por la expresión de proteínas virales y aumentar la capacidad de clonaje de los adenovirus de primera generación, se han desarrollado vectores delecionados de otras regiones virales, además de E1, como E2a, E2b o/y E4(72). Sin embargo, estos vectores no han dado los resultados esperados y su aplicación ha sido muy limitada(73-76). Los adenovirus denominados gutless, helper dependent o fully deleted constituyen el último tipo de vectores adenovirales desarrollados hasta hoy. El genoma de estos vectores carece de todos los genes virales y sólo conservan las secuencias que actúan en cis, es decir, los ITRs y la secuencia de encapsidación. Estos virus podrían transportar material génico exógeno de hasta 37 Kb, por ejemplo varios transgenes distintos o genes completos (incluyendo las secuencias reguladoras, intrones y exones). Se ha demostrado que con el empleo de estos adenovirus se detecta la expresión del transgén dos años después de su administración en animales, no inducen una respuesta inmune significativa y permiten la administración repetida del mismo vector a lo largo del tiempo(6, 32, 77, 78). Sin embargo, la construcción y producción de estos adenovirus requiere el uso de un adenovirus helper que aporte todos los elementos que actúan en trans, y todavía no es posible conseguir una producción final de adenovirus gutless libre de contaminación por partículas helper. Además, su producción es costosa y muy laboriosa, es difícil producir títulos altos de virus y su genoma es, a menudo, inestable. En un capítulo aparte cabe destacar los adenovirus selectivos en replicación capaces de replicarse específicamente en células tumorales p53–, que si bien no son vectores para tansferencia génica, son también utilizados en terapia génica del cáncer (79). Un ejemplo de estos adenovirus son los adenovirus que contienen una deleción en el gen E1B por lo que son incapaces de inhibir la apoptosis mediada por p53 e inducida por la acción de E1A. Sin embargo, estos adenovirus son capaces de replicarse activamente en células que carecen de p53 funcional, amplificándose, infectando las células vecinas y causando lisis celular. Parte del efecto antitumoral observado con estos adenovirus in vivo se debe, posiblemente, a sus propiedades para inducir una respuesta inmunitaria en el tejido maligno(80). Estos agentes se han probado en ensayos clínicos demostrando un perfil de seguridad aceptable y efectos sinérgicos con quimioterapia convencional(81). Otros factores a considerar en un vector adenoviral de primera generación Un factor clave a la hora de diseñar un adenovirus recombinante reside en la elección del promotor que va a dirigir la expresión del transgén. En función del promotor 231 Inmunolog a 72p 23/6/03 10:30 P gina 232 VECTORES ADENOVIRALES DE PRIMERA GENERACIÓN, EL VECTOR POR EXCELENCIA EN INMUNOTERAPIA GÉNICA DEL CÁNCER elegido, la expresión del transgén será más o menos intensa y más o menos prolongada en el tiempo. En este sentido se puede diferenciar entre promotores universales y promotores específicos de tejido o tipo celular. I) Los promotores universales son generalmente de origen viral, y permiten la expresión del transgén en prácticamente todos los tipos celulares y tejidos. De entre todos los promotores universales empleados hasta la fecha en transferencia génica, el promotor temprano del citomegalovirus humano (CMV) ha demostrado ser el más eficaz(63, 82, 83). Sin embargo, el empleo del promotor CMV empieza a cuestionarse porque trabajos recientes sugieren el silenciamiento de la expresión del transgén debido a modificaciones del promotor por la célula(71, 84) y/o la inducción de expresión de NF-kB(85, 86). II) Los promotores específicos permiten la expresión restringida del transgén a determinados tejidos o tipos celulares, como el promotor de la α-fetoproteína en células de hepatocarcinoma. Si bien actualmente se están haciendo grandes esfuerzos en la búsqueda de nuevos promotores específicos, todavía queda un largo trabajo por desarrollar(37, 87, 88). Otra aproximación interesante es el empleo de promotores regulables, como los promotores Tet-on y Tet-off que activan la expresión del transgén en respuesta a la administración o supresión de tetraciclina respectivamente(89). Este tipo de promotores permite regular la expresión del transgén a voluntad, pero todavía se requiere su optimización para ser utilizados en aproximaciones in vivo. En contraposición o como complemento al uso de promotores regulables o específicos de tejido, se están realizando numerosos esfuerzos para modificar el tropismo natural de los adenovirus de manera que infecten de forma específica un determinado tipo celular o tisular(90). El tropismo específico del adenovirus evitaría, además, la transducción no deseada de otros tejidos cuando el vector es administrado de forma sistémica. Las aproximaciones desarrolladas en este sentido van desde la modificación genética de la fibra del adenovirus hasta el empleo de anticuerpos biespecíficos fibra–molécula diana(91, 92). La producción de estos vectores adenovirales con tropismo modificado es poco eficaz y muy costosa lo que ha limitado su utilización. Construcción de vectores adenovirales de primera generación Como se comentó anteriormente, existen numerosos métodos para la construcción de adenovirus de primera generación(62). El método clásico y más empleado hasta hace pocos años fue ideado por el grupo de F.L. Graham(93, 94). Este método se basa en la recombinación homóloga, en células 293, entre un plásmido que contiene el genoma del Ad 5 con una inserción en la región E1 (pJM17 ) y un plásmido (p∆E1Sp1) que contiene el cassette de expresión con el 232 VOL. 22 NUM. 2/ 2003 transgén deseado en lugar de la región E1 (Fig. 5A)(95). Si bien este sistema ha sido muy empleado hasta la fecha y la mayoría de los adenovirus recombinantes generados en muchos laboratorios han sido construidos con este método, la eficiencia de la recombinación homóloga es muy baja y se requieren entre 14 y 21 días para observar la formación de virus recombinante. A finales de los años 90, se desarrolló un nuevo método para construir adenovirus recombinantes de primera generación y gutless mediante un sistema basado en la recombinasa Cre del fago P1(96, 97) (Fig. 5B). Este sistema consiste en la co-transfección de células CRE (células 293 que expresan la recombinasa Cre del fago P1 de forma estable) con el DNA de un adenovirus recombinante defectivo en E1 y E3 (Ψ5) cuya secuencia de encapsidación está flanqueada por dos secuencias LoxP, y un plásmido shuttle (pAdLox) que contiene el extremo izquierdo del genoma de Ad5 seguida de un cassette de expresión donde se puede clonar el gen deseado y un sitio LoxP (Fig. 5B). La principal ventaja del sistema Cre-Lox reside en la eficiencia de recombinación dirigida por Cre que generará en el nuevo genoma adenoviral, ya que una semana después de la cotransfección se sabrá si el proceso ha tenido éxito(62). A la hora de elegir un método para construir adenovirus recombinantes hay otra serie de puntos que se deben considerar: 1) la laboriosidad del método, 2) el tiempo que se requiere para obtener el nuevo adenovirus recombinante, 3) la posibilidad de que se produzcan modificaciones difíciles de detectar en el genoma adenoviral y 4) la formación de adenovirus con capacidad replicativa. En los últimos años han aparecido nuevos métodos, más o menos eficaces y laboriosos, para la construcción de adenovirus de primera generación basados en la recombinación in vitro en E. coli rec+ o el empleo de cósmidos(62, 98). Así, frente a los sistemas basados en la recombinación en células de mamífero, existen otros métodos basados en la recombinación en E. coli rec+ antes de la transfección en las células empaquetadoras con el genoma del nuevo virus recombinante(99). La principal ventaja que ofrece este tipo de método es el ahorro de tiempo y la ausencia de virus helper o parental contaminante en la preparación adenoviral. Esto supondría que, en principio, no fuera necesario la selección de una sola partícula viral. El mayor inconveniente de estos sistemas, y de todos los que emplean el genoma viral en forma de plásmido, es la inestabilidad de los plásmidos que contienen el genoma adenoviral. Esta inestabilidad es consecuencia de su gran tamaño, que a menudo hacen complicada su manipulación y producción, y de recombinaciones favorecidas por la presencia de secuencias palindrómicas (ITRs). A diferencia de otros vectores virales como los AAV o Inmunolog a 72p 23/6/03 10:30 P gina 233 I. NARVAIZA ET AL. INMUNOLOGÍA Ori Amp A (0 mu) ∆E1 (1.0-9.8 mu) Promotor TrasngénpA (100/0 mu) (3.7 mu) B (16.1 mu) p∆E1sp1 Ψ5 LoxP Tet Amp LoxP Ψ ITR ITR Recombinasa CRE LoxP Ori Ψ (3.7 mu) + LoxP ITR ∆Ψ/Ψ5 ITR (16.1 mu) ITR pJM17 Ψ Promotor Transgén An ITR LoxP pAdlox Recombinasa CRE ITR Ψ Promotor LoxP Transgén An Nuevo Adenovirus ITR + LoxP ITR ITR Nuevo Adenovirus ITR Promotor Transgén An ITR Figura 5. Recombinación homóloga frente al sistema Cre-LoxP. Esquema representativo de 2 métodos empleados para la construcción de adenovirus recombinantes. A) El método clásico consiste en la cotransfección de células 293 con dos plásmidos, uno que contiene el genoma del adenovirus tipo 5 con una inserción en la región E1 que hace que el tamaño de dicho DNA exceda la capacidad empaquetadora de la cápside adenoviral, impidiendo su empaquetamiento y que se puedan generar partículas virales (pJM17); y otro plásmido que contiene el extremo izquierdo del genoma adenoviral (0-16,1 mu) con una deleción del gen E1 (1.09.8 mu) en el que se puede introducir un cassette de expresión con el gen deseado (p∆E1Sp1A). La recombinación homóloga entre las regiones adenovirales de ambos plásmidos da lugar a un genoma de adenovirus defectivo en E1 que contiene el cassette de expresión con el gen de interés en su lugar. Dado que la línea 293 tiene integrada la región E1 del genoma de adenovirus en su propio genoma y expresa los genes contenidos en dicha región, ésta complementará las funciones que requieren los adenovirus defectivos en E1. El nuevo genoma formado tras la recombinación de los plásmidos se replicará y encapsidará en las células 293 dando lugar a nuevas partículas adenovirales recombinantes defectivas en E1 y con capacidad para expresar el transgén elegido. B) Método basado en la recombinasa Cre. La recombinasa Cre cataliza la escisión de la secuencia de empaquetación (ψ) del Ψ5 a nivel de los sitios LoxP; a continuación, la recombinasa Cre dirige la recombinación entre el sitio LoxP que queda en el genoma de Ψ5∆ψ y el sitio LoxP del plásmido pAdLox, previamente linearizado, que contiene el extremo izquierdo del genoma de Ad5 con el ITR, la secuencia de encapsidación del Ad5 con el gen de interés situado a continuación del promotor CMV y un sitio LoxP. Una vez introducido el DNA viral en la célula, la recombinasa Cre es capaz de escindir la secuencia de encapsidación del DNA viral (Ψ5) flanqueada por dos secuencias LoxP y dirigir la recombinación entre el sitio LoxP remanente y la región LoxP del plásmido «shuttle». Como resultado de este proceso el DNA adenoviral (Ψ5/∆Ψ) no podrá encapsidarse a no ser que se haya recombinado con el plásmido pAdLox generando un adenovirus recombinante defectivo que contendría el transgén de interés con capacidad para replicarse y encapsidarse. Este proceso requiere entre 7 y 10 días (109). La eficiencia de la recombinasa Cre no es del 100% por lo que será necesario realizar una serie de pasos sucesivos de amplificación (infección) en células CRE+ para eliminar la contaminación por virus Ψ5 residual; además es muy recomendable la purificación de una sola partícula adenoviral recombinante infectiva a partir de la cual producir a gran escala el nuevo adenovirus. los adenovirus gutless, los adenovirus de primera generación se pueden autorreplicar en células empaquetadoras. Por esta razón, la producción de altas cantidades del vector no supone un problema y su escalabilidad es relativamente sencilla. El mayor inconveniente que nos encontramos cuando queremos escalar la producción de adenovirus, para su utilización en ensayos in vivo o en protocolos clínicos, es la generación de adenovirus con capacidad replicativa (RCAs)(79). Los RCAs se forman por recombinación entre el genoma adenoviral recombinante y las secuencias adenovirales homólogas presentes en el genoma de la célula empaquetadora. La recombinación entre dichas regiones puede dar lugar a adenovirus recombinantes con capacidad replicativa por adquisición de la región E1 presente en la célula empaquetadora. La probabilidad de que se produzca este fenómeno es pequeña pero se incrementa con el número de pases. Para solucionar este inconveniente se han generado nuevas líneas de células empaquetadoras (como las células PER.C6(100)) y nuevos genomas adenovirales que no comparten secuencias homólogas solapantes. Es muy conveniente controlar la presencia de RCAs para evitar la toxicidad de los mismos y la interpretación errónea de los resultados 233 Inmunolog a 72p 23/6/03 10:30 P gina 234 VECTORES ADENOVIRALES DE PRIMERA GENERACIÓN, EL VECTOR POR EXCELENCIA EN INMUNOTERAPIA GÉNICA DEL CÁNCER obtenidos. Actualmente, el límite de RCAs en lotes adenovirales para ensayos clínicos se sitúa en 1 RCA por 108 partículas físicas (pp) según el Recombinant DNA Advisory Comittee (RAC). Toxicidad de los vectores adenovirales Desde un punto de vista teórico, los vectores adenovirales pueden resultar tóxicos por cuatro razones: 1) Porque contengan cantidades apreciables de adenovirus con capacidad replicativa, generados durante la producción por recombinación entre secuencias del vector y secuencias homólogas de las células permisivas(100); 2) Porque contengan cantidades apreciables de proteínas virales no eliminadas durante el proceso de purificación; 3) Por la respuesta inmunológica innata(67) y específica(101) generada contra antígenos virales o contra el transgén(102), que puede generar un síndrome de hipercitoquinemia comparable al shock endotóxico; 4) Por la acción del producto de la expresión del transgén o de proteínas virales(103). En roedores, la administración sistémica de un adenovirus portador del gen de la α-1-antitripsina humana(104) produjo dos efectos apreciables: trombocitopenia transitoria, dependiente de dosis, de aparición precoz; y una lesión hepática, dependiente de dosis, de aparición inmediata (24 horas) y progresión persistente, caracterizada por hipertransaminasemia severa y consistente en degeneración hepatocitaria, necrosis focal e inflamación portal y lobulillar. La dosis letal mínima fue de 9·1013 partículas/kg. Otros estudios (Wivel N et al, datos no publicados) han confirmado que la administración sistémica de un vector no terapéutico (AdLacZ) produce en roedores y primates toxicidad dependiente de dosis. En este caso, y también en ratones, la dosis máxima tolerada fue superior a 5·1011 pfu/kg y la dosis sin efecto observable fue de 5·10 9 pfu/kg, circunscribiéndose la toxicidad a hepatitis transitoria. En primates Macaca mulata, la dosis mínima letal fue de 5·1011 pfu/kg y la dosis sin efecto observable fue de 2.5·109 pfu/kg, circunscribiéndose la toxicidad a hepatitis transitoria. La posibilidad de transferir involuntariamente el transgén a células germinales de forma estable ha sido estudiada recientemente, habiéndose demostrado la presencia universal y transitoria del vector en las gónadas y la ausencia de transmisión a la progenie(105). Ensayos en fase I del tratamiento de tumores de cabeza y cuello y carcinoma de pulmón no microcítico mediante la administración intratumoral de un vector adenoviral con el gen del p53 han mostrado datos farmacocinéticos y toxicológicos importantes(106), como son: 1) que el vector no es detectable en la sangre más allá de las 24 horas y en el esputo más allá de los 7 días de la administración (y esto 234 VOL. 22 NUM. 2/ 2003 teniendo en cuenta que la administración intratumoral permite, en este caso, el paso directo del vector al tracto respiratorio); 2) que no se detectaron adenovirus con capacidad replicativa en ningún tejido; 3) que no se observó toxicidad limitante de dosis, aunque la fiebre y los fenómenos locales de inflamación en el lugar de la punción fueron frecuentes; y 4) que la expresión del gen persiste en sucesivas administraciones a pesar del desarrollo de anticuerpos desde la primera hora del tratamiento. En otro ensayo en fase I del tratamiento de carcinoma de pulmón no microcítico mediante la administración intratumoral de un vector adenoviral con el gen del p53(107), los efectos secundarios observados fueron fiebre levemoderada (9/15), síndrome gripal (1/15), artralgias (1/15), disnea (1/15), hipertensión (1/15) y taquicardia (1/15). La excreción del vector por esputo, orina, heces e hisopado rectal fue estudiada a diario y sólo en un paciente se demostró la presencia del virus defectivo en el esputo el 2º día después del tratamiento. Todos los pacientes tenían anticuerpos antiadenovirus antes del tratamiento, cuyos títulos aumentaron significativamente tras él, y que no impidieron la transferencia eficaz del vector por vía intratumoral. En un ensayo de fase I, desarrollado en la Universidad de Pennsylvania, para el tratamiento de pacientes con déficit de ornitin-transcarbamilasa (OTC) mediante la inyección intra-arterial de un adenovirus de segunda generación capaz de expresar OTC se registró el fallecimiento de un paciente asintomático y para quien no se esperaba un efecto terapéutico neto (108). Dicho acontecimiento letal se produjo como consecuencia de un síndrome de fracaso multiorgánico debido a la hiperproducción a la circulación sistémica de múltiples citoquinas (fundamentalmente IL-6)(109). Este lamentable caso, en el que se habían contravenido las reglas impuestas por las autoridades regulatorias (FDA y RAC), ha permitido intensificar la regulación y estudiar mejor preclínicamente el uso de vectores adenovirales, que por otras vías y dosis han demostrado un perfil de seguridad envidiable en humanos(110). VECTORES ADENOVIRALES DE PRIMERA GENERACIÓN EN INMUNOTERAPIA DEL CÁNCER La aplicación de adenovirus para el tratamiento del cáncer se remonta al año 1956, cuando un adenovirus salvaje fue utilizado como terapia contra el cáncer de cervix(111). En los últimos años, el uso de los adenovirus ha centrado la atención en la terapia génica del cáncer debido a su gran capacidad para clonar genes en su interior, por su facilidad en el manejo y producción, y por su poder infectivo e inmunogenicidad. Sin embargo conviene recordar que estos Inmunolog a 72p 23/6/03 10:30 P gina 235 I. NARVAIZA ET AL. INMUNOLOGÍA Terapia génica ex vivo { Terapia génica in vivo Antígenos tumorales Antígenos tumorales Citocinas Citocinas Moléculas de coestímulo Quimiocinas Moléculas de coestímulo { Figura 6. Empleo de los vectores adenovirales en inmunoterapia génica del cáncer. Aproximaciones de inmunoterapia génica del cáncer ex vivo e in vivo empleando vectores adenovirales de primera generación. vectores no son eficientes cuando se necesita reintroducirlos en el organismo, debido al desarrollo de respuesta inmunitaria humoral (anticuerpos neutralizantes) y celular que dificultan, al menos parcialmente, su administración repetida(65, 112, 113). La inmunoterapia tiene como objetivo disparar y potenciar los mecanismos inmunológicos que desencadenen una respuesta efectora eficaz contra las células tumorales. La inmunoterapia se basa en los mecanismos y condiciones de presentación de antígenos tumorales para que estos sean realmente inmunogénicos, y en la optimización de las condiciones para que se de una activación eficaz de la respuesta antitumoral. Existen tres aproximaciones metodológicas distintas para abordar la inmunoterapia del cáncer mediante transferencia génica y que recurren al uso de los adenovirus de primera generación (Fig 6). I) Introducción de proteínas potencialmente inmunogénicas de origen tumoral por procedimientos de vacunación génica. En este sentido se ha demostrado que la administración de adenovirus capaces de expresar antígenos asociados a tumores (AAT)(114, 115) de melanoma como gp100, MART-1 ó gp75 induce la generación de CTLs específicos frente a dichos antígenos(116, 117). II) Una segunda aproximación consiste en la manipulación ex vivo de las células presentadoras de antígeno profesionales (APCs) de forma que expresen péptidos antigénicos, moléculas de coestímulo o citocinas para que sus propiedades presentadora e inmunoestimuladora sean más efectivas(118). La infección de células dendríticas con adenovirus no alterara sus propiedades inmunoactivadoras(119, 120), y la modificación de DCs con adenovirus que expresan AAT como MART-1 ha demostrado ser efectiva para generar CTLs específicos frente a dicho antígeno(121). También se ha demostrado que la modificación de DCs con un adenovirus que expresa la interleucina-12 (IL-12) aumenta la eficacia antitumoral de la administración de DCs en el tratamiento de distintos modelos de adenocarcinoma de colon en ratones Balb/c y C57BL/6(13, 122, 123). III) La tercera estrategia que se sirve de los adenovirus es la modificación de las células tumorales mediante transferencia de genes de citocinas, quimiocinas o moléculas de coestímulo con la finalidad de crear las condiciones óptimas para una respuesta inmunitaria efectiva(124, 125). Esta aproximación puede realizarse tanto de forma ex vivo como in vivo(126). Las citocinas han demostrado su eficacia antitumoral tanto mediante su administración en forma de proteína recombinante, como empleando distintos métodos de transferencia génica en diversos modelos de tumores experimentales: IL-2(127), IL-4 (128), IL-6(129), IL-7(130), IL-12(131, 132) , IFN-γ (133) , TNF-α (134) o GM-CSF (135) . Sin embargo, la administración sistémica de citocinas recombinantes como la IL-2 o la IL-12 ha sido descartada por los efectos tóxicos observados en distintos ensayos clínicos(136-138). En estos casos, la terapia génica in vivo, y más concretamente con adenovirus, se presenta como una forma eficaz y segura de localizar en el microambiente tumoral la producción de altas cantidades de la citocina deseada potenciando la respuesta inmune y reduciendo los riesgos de toxicidad. La administración del vector puede realizarse de forma sistémica o de forma local, pero dado que los vectores disponibles actualmente no permiten la transducción selectiva y específica de las células tumorales, la administración sistémica supone la transducción de tejidos y tipos celulares no deseados que conllevan a la toxicidad(139). Por lo tanto, la forma más segura y eficaz de transferencia de genes de citocinas es la administración intratumoral directa en la masa tumoral. La interleucina 2 (IL-2) es una potente citocina con importantes propiedades inmunoestimuladoras, como lo refleja su capacidad para incrementar la actividad de los CTLs(127), células NK/LAK y TILs(140, 141). Aunque la aplicación sistémica de IL-2 ha inducido inmunidad antitumoral en muchos modelos animales, los efectos tóxicos que produce su aplicación en altas concentraciones limitan claramente su aplicación en la clínica(136). Para evitar los efectos tóxicos, se han diseñado estrategias de tratamiento que permiten generar elevadas concentraciones de la citocina localmente en el tumor(133, 142, 143). En este sentido, Addison y col., describen el empleo de un adenovirus que expresa el gen de la IL-2 para el tratamiento de animales transgénicos portadores de adenocarcinoma mamario. En este trabajo concluyen que el tratamiento aplicado era capaz de inducir remisiones tumorales y de desarrollar memoria inmunológica(144). Posteriormente, el mismo grupo de investigadores, empleando un modelo tumoral idéntico, aplicaron un vector adenoviral que expresaba el gen del TNF-α mutado, observando en algunos casos remisiones tumorales parciales, y en otros, respuestas completas, eliminando con el uso de este vector los efectos tóxicos que induce el adenovirus 235 Inmunolog a 72p 23/6/03 10:30 P gina 236 VECTORES ADENOVIRALES DE PRIMERA GENERACIÓN, EL VECTOR POR EXCELENCIA EN INMUNOTERAPIA GÉNICA DEL CÁNCER que expresa la forma wild type del TNF-α(145). También se ha comunicado el empleo de combinaciones de citocinas con genes suicidas para el tratamiento de las metástasis hepáticas del CC, es el caso del grupo de Woo y col., que mediante inyección simultánea de adenovirus que expresan el gen de la HSV-tk con el gen de la IL-2(146), o la combinación de los dos anteriores con el gen del Factor Estimulante del Crecimiento de Granulocitos y Macrófagos (GM-CSF) (147). Estos investigadores obtienen en estos experimentos remisiones tumorales parciales, escaso incremento en la supervivencia en algunos de los animales tratados y un elevado índice de recurrencias posteriores. No observaron efecto terapéutico destacable con el uso por separado de los vectores mencionados. Otra de las estrategias consiste en el empleo de moléculas coestimuladoras con el fin de alcanzar una activación efectiva de los linfocitos T. En un sistema murino de melanoma, la introducción de la molécula de B7-1 (CD80)(148) en tumores, fue capaz de incrementar la inmunidad antitumoral y erradicar tumores(149). Dessureault y col., diseñaron un vector adenoviral para infectar células humanas de una línea tumoral con B7-1, observando que posteriormente las células expresaban la molécula en su superficie (150). Graham y col., desarrollaron un adenovirus que expresa de manera simultánea los genes de la IL-12 y de B7-1 para tratar mediante inyección i.t. directa el adenocarcinoma de mama. Observaron la regresión tumoral completa en el 70% de los tumores tratados, efecto que fue claramente superior al alcanzado tras la aplicación de cada uno de los genes por separado(151). Más tarde, el grupo de Gauldie y cols., comunicaron el empleo de un vector adenoviral que expresaba los genes B7-1/B7-2 murino y de la IL-2 humana para el tratamiento del cáncer mamario(152). En estos experimentos se obtuvo un 100% de remisiones tumorales completas, aunque esta respuesta se asoció al desarrollo de fenómenos tóxicos. El adenovirus que expresa el gen B-7.1 también ha sido aplicado experimentalmente por otro grupo de investigadores para incrementar la inmunogenicidad de células de adenocarcinoma de ovario y cervix humanos(153). El ligando del CD40 (CD40L), expresado principalmente en APCs, es esencial para la iniciación de la respuesta específica de las células T. Distintos grupos han recurrido a un vector adenoviral que expresa CD40-L para tratar tumores experimentales de diversa estirpe en roedores, entre ellos B16, CT26 y MCH-7777, observando la regresión de un 60% de los mismos(154, 155). Otras de las citocinas con potentes efectos inmunoestimuladores que ha sido utilizada para el tratamiento del cáncer usando vectores adenovirales es la IL-12(122, 156). De manera similar a la rIL-2, la rIL-12 también es capaz de producir efectos tóxicos relacionados con la dosis y con la vía de administración (137). La IL-12 (157, 158) es producida 236 VOL. 22 NUM. 2/ 2003 principalmente por células fagocitarias y APCs (159, 160) en respuesta a distintos estímulos por diversos mecanismos: a) independientes de células T(159), y b) dependientes de células T(161, 162). La IL-12 favorece la generación de respuestas Th1(163), aumenta la generación y actividad de linfocitos T citotóxicos, la actividad citolítica de las células NK y activa las células NKT(159, 163). La transferencia del gen de la IL-12 mediante adenovirus ha demostrado ser eficaz en el tratamiento de distintos modelos tumorales(144, 164-171). Mazzolini et al. demostraron que la transferencia génica de IL-12 mediante adenovirus (AdIL-12) en un modelo de tumores subcutáneos e intrahepáticos de células de adenocarcinoma de colon CT26 en ratones Balb/c tiene un potente efecto antitumoral(7). La administración intratumoral (i.t.) de AdIL-12 indujo el rechazo completo de los tumores en el 70% de los ratones así tratados. El mecanismo de acción incluye una respuesta antitumoral totalmente dependiente de células CD8+. La inyección i.t. de AdIL-12 no sólo permitió la erradicación de los nódulos tumorales tratados, sino también la eliminación de tumores distantes no tratados y la protección a largo plazo frente a nuevas reinoculaciones de células CT 26. El tratamiento i.t. con AdIL-12 induce una potente activación y generación de CTLs específicos de células CT26, lo cual ha permitido obtener cultivos de linfocitos antitumorales (LAT) con actividad citolítica específica frente a células CT26 para su empleo en terapia celular adoptiva. La transferencia adoptiva de dichos LAT ha demostrado una escasa eficacia antitumoral frente a tumores establecidos ya desarrollados. Sin embargo, la administración i.t. de AdIL-12 en un nódulo subcutáneo junto con la transferencia adoptiva de LAT vía sistémica demostró una potente sinergia en la actividad antitumoral frente a tumores intrahepáticos no tratados(172). Posteriormente, se demostró que la transferencia génica de IL-12 induce cambios en el endotelio tumoral, especialmente el aumento de la expresión de VCAM-1 que favorece la eficacia de la terapia adoptiva con LAT. Barajas y cols. demostraron que la respuesta antitumoral generada por el tratamiento con AdIL-12 en un modelo de hepatocarcinoma en ratas Búfalo es dependiente de células NK(170). Pese a que la terapia génica con adenovirus que expresan IL-12 reduce la toxicidad del tratamiento antitumoral con IL-12 recombinante, se siguen observando efectos tóxicos asociados a la hiperproducción de IFN-γ por altas dosis de AdIL-12(173). Otro de los mecanismos fundamentales responsables de la actividad antitumoral de la IL-12 es la inhibición de la neovascularización tumoral(170, 174). Este efecto angiostático no es efecto directo de la IL-12 sino que es debido, fundamentalmente, a la quimiocina IP-10. La IP-10 es una quimiocina α que se secreta en respuesta a IFN-γ con efectos Inmunolog a 72p 23/6/03 10:30 P gina 237 INMUNOLOGÍA angiostáticos, y su neutralización reduce significativamente el efecto antitumoral de la IL-12(170, 175-179). Estos resultados han llevado al inicio de un ensayo clínico de fase I para evaluar la toxicidad de la transferencia génica de la IL-12 humana mediante adenovirus de primera generación para el tratamiento de tumores hepáticos y gastrointestinales (Mazzolini et al., manuscrito en preparación). También se ha analizado la eficacia antitumoral de la transferencia génica de distintos genes de quimiocinas pero, a pesar de inducir un infiltrado leucocitario en el tejido maligno, su eficacia ha resultado escasa en la mayoría de los casos(180-183). Sin embargo, la transferencia de genes de quimiocinas combinada con la transferencia génica de genes de citocinas o genes de moléculas de coestímulo que favorecen la activación linfocitaria, de acuerdo con la teoría de la activación–atracción(183, 184), ha dado buenos resultados en el tratamiento de distintos modelos experimentales de cáncer(180, 182, 183, 185). CONCLUSIONES Pese a que no son perfectos y todavía se requiere su optimización, los adenovirus de primera generación son, y probablemente seguirán siendo, una herramienta muy útil para la transferencia de genes. En particular, son el vector viral por excelencia en aproximaciones de terapia génica del cáncer que requieren altos niveles de expresión del transgén deseado, no necesitan la expresión prolongada del mismo y la respuesta inmune que inducen no es un inconveniente o incluso puede suponer una ventaja. Éste es el caso de la vacunación génica o la inmunoterapia del cáncer. CORRESPONDENCIA: Ignacio Melero Bermejo División de Hepatología y Terapia génica, CIMA-Universidad de Navarra C/Irunlarrea s/n. 31008 Pamplona (Navarra) España Tel: +34 948425668 Fax: +34 948425700 E-mail: imelero@unav.es BIBLIOGRAFÍA 1. Miller AD. Human gene therapy comes of age. Nature 1992; 357: 455-460. 2. Anderson WF. Human gene therapy. Science 1992; 256:808-813. 3. Mulligan RC. The basic science of gene therapy. Science 1993; 260: 926-932. 4. Van Dyke T, Jacks T. Cancer modeling in the modern era: progress and challenges. Cell 2002; 108: 135-144. 5. Resnik D. Debunking the slippery slope argument against human germ-line gene therapy. J Med Philos 1994; 19: 23-40. I. NARVAIZA ET AL. 6. Schiedner G, Morral N, Parks RJ, Wu Y, Koopmans SC, Langston C, et al. Genomic DNA transfer with a high-capacity adenovirus vector results in improved in vivo gene expression and decreased toxicity. Nat Genet 1998; 18: 180-183. 7. Mazzolini G, Qian C, Xie X, Sun Y, Lasarte JJ, Drozdzik M, et al. 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