PLEGAMIENTO DE LAS PROTEINAS

BIOQUIMICA DE PROTEINAS 2009-UNSAM
PLEGAMIENTO DE LAS PROTEINAS
Julio Caramelo
Laboratorio de Biología Estructural y Celular
Fundación Instituto Leloir
jcaramelo@leloir.org.ar
1
BIBLIOGRAFIA:
1) Fersht, A. Structure and mechanism in protein science (1999)
Freeman Press.
Capitulos 1, 11, 17 y 18
2) Advances in Protein Chemistry (1995) Vol. 46.
Capitulo 3 (Free energy balance in protein folding)
3) Branden y Tooze. Introduction to Protein Structure (1999)
Garland Publishing, Inc.
4) Whitford, D. Proteins. Structure and function (2005)
Editorial John Wiley & Sons
5) Berg, Tymoczko y Stryer. Biochemistry (2006)
Editorial Freeman and Company
2
ESTRUCTURA DE PROTEÍNAS
Biología Estructural: ciencia que estudia la estructura y
función de las biomoléculas.
Biología
Biología Estructural
Física
Química
3
UNION PEPTÍDICA
H
3HN
+
R1
COO-
H
3HN
+
H
R2
R1
H
COO-
+
3HN
C
O
H
N
R2
+ H2 O
COO-
x Reacción endotérmica: 'H > 0
x Las proteínas son químicamente metaestables respecto de la hidrólisis
TYR
THR
N-terminal
C-terminal
ALA
LYS
4
1.33 Å (unión simple C-N: 1.45 Å)
R1
H
Las longitudes de enlace
no son las esperadas:
H
H3N+
H
N
C
R2
O
COO-
1.23 Å (más largo que un carbonilo típico)
R1
H
La unión peptídica es plana:
H
C
H3
C
N+
H
Estos 6 átomos está en un plano
N
C
O
R2
COOH
La unión peptídica tiene
carácter de doble enlace: H3N+
R1
H
C
O
H
R1
H
H
N
R2
COO-
H3N+
C
G- O
H
N
G+
R2
COO-
5
¾ En la cadena solo dos enlaces pueden rotar:
R1
H
H
C
H3N+
C
O
H
R2
N
H
C
phi psi
R3
H
C
N
C
COO-
M \O
CD-CO
CD-N
6
CDi
C
¿Qué es un ángulo diédrico?
N
CDi+1
La unión peptídica presenta solo dos posibles ángulos diédricos:
Trans: Z= 180 q
H
R1
H
3
HN+
C
O
C
N
H
N
R2
COO-
Cis: Z= 0 q
CDi
CDi+1
3HN
H
R1
H
+
C
N
O
H
R2
COO-
CDi+1
CDi
C
N
Por lo general la unión peptídica presenta configuración trans.
Repulsión de las cadenas laterales (en dipéptidos la forma trans es 1000
veces más abundante que la cis)
7
El trazado de la cadena se puede hacer sabiendo tres ángulos
diédricos para cada aminoácido
H
R1
H
H
N
C
\
O
O
M
3HN
H
+
H
C
N
M
H
C
N
O
N
H
R2
O
R2
Z
C
H
COO- R3
H
R1
H
H
R1
+
3HN
H
+
3HN
C
N
O
\
O
H
N
R2
O
R2
N
H
H
C
O
H
C
C
H
Z
N
H
COO- R3
COO- R3
8
Podemos graficar los pares de ángulos \,M de las proteínas que están cristalizadas
Gráfico de Ramachandran
Hoja E
M : entre - 80° y - 120°
: entre 120° y 170°
-helices M: entre -40° y ~ -100°
: entre -40° y -65°
Zona desfavorable
9
¾ La glicina posee una gran libertad conformacional:
10
Cisteína puede formar puentes disulfuro:
CISTINA
CISTEINA
2
+
-
-
+
+ H2 O
+
+ ½ O2
-OOC
+NH
3
SH
H
H
2
3
HN+
COO-
S
H
3HN
+
S
+ 2 H + + 2 e-
COO-
(OJO, esto es una reacción redox, NO una ácido/base)
11
¿Cómo se pliega una proteína que puede formar varios puentes disulfuro?
Supongamos que tenemos una proteína con 3 cisteínas:
SH
1
S-S (1-2)
SH
2
S
3
S
SH
SH
SH
SH
S-S (2-3)
NATIVA
E0S-S(2-3) E0S-S(2-3), E0S-S(2-3)
S S
S S
S-S (1-3)
…Y A MEDIDA QUE AUMENTA EL NUMERO DE CYS LA PROBABILIDAD DE
FORMAR LA COMBINACION ADECUADA DE PUENTES S-S ES MENOR.
12
x Prácticamente todas las uniones peptídicas son trans.
x Repulsión estérica de las cadenas laterales.
Prolina: excepción
LYS41-PRO42
Ribonucleasa: tiene 4 Prolinas
trans
ASN113-PRO114
cis
TYR92-PRO93
cis
VAL116-PRO117
trans
13
¿Porqué la prolina presenta más uniones cis que los demás aminoácidos?
aa z PRO
PRO
E
Ea ~ 80-100 kJ/mol
t1/2 ~ 10-100 seg
¡ LENTO !
E
cis
trans
trans
cis
En la unión X-Pro la
diferencia energética
entre cis y trans es
menor
~ 7% uniones X-PRO
43 % de las proteínas al
menos tienen una cis PRO
CD
CD
C
N
CD+1
O
trans
CD+1
C
N
O
cis
¿Tiene alguna consecuencia?
SI. Retarda mucho la velocidad de plegamiento.
In vitro una proteína con una unión cis-PRO por presenta al menos
dos fases cinéticas de pegamiento
14
Estructura terciaria
Son las biomoléculas que presentan mayor variación estructural
colicina
barnasa
fosfatasa
anticuerpo
colágeno
calnexina
hemaglutinina
porina
Virus del dengue
15
¿Tienen algo en común todas estas estructuras?
Rojo: hidrofílico
Amarillo: hidrofóbico
Naranja: P, G, H
16
Estructura terciaria: disposición espacial de los residuos
(si uno conoce la estructura terciaria con una resolución menor a 4-5 Å
también sabe la secundaria)
¾ AL PLEGARSE UNA PROTEINA LOS RESIDUOS OCULTAN UNA
PROPORCIÓN DIFERENTE DE SU SUPERFICIE:
hidrofílicos
Área del residuo
aislado
hidrofóbicos
Área oculta al
plegarse la proteína
17
Plegamiento
N
Proteína nativa
Conjunto discreto de confórmeros
muy parecidos entre sí.
U
Proteína desnaturalizada
Colección heterogénea de conformaciones
con grado variable de compactación.
Rápida velocidad de interconversión
18
¾ ¿Qué determina la estructura terciaria de una proteína?
¾ ¿Existe un “código de plegamiento”?
C26-C84
C58-C110
C64-C72
Christian Anfinsen
Premio Nobel de Química 1972
C40-C95
Ribonucleasa A (pdb: 1AFK)
19
Experimento de Anfinsen:
HO
C
H2
H2 Betamercaptoetanol
C
SH
S
SH
S
SH
H2
C
HO
S
C
H2
HS
26
72 65
95
110
HS
Actividad
enzimática
HS
Urea 8 M
58 Betamercaptoetanol
OH
C
H2
SH
84
40
S
H2
C
HS
HS
Diálisis
O2
40
SH
26
72 65
84
95
110
SH
NO hay actividad
enzimática
58
Actividad
enzimática
20
Conclusiones de Anfinsen:
¾ La información necesaria para especificar la estructura está en la
secuencia (las chaperonas complicaron un poco, pero se sigue manteniendo)
¾ “Hipótesis termodinámica”: el estado nativo es la conformación de mínima
energía libre (hay que considerar todo: solvente, ligandos, etc…)
G
Confórmero
Confomación nativa
¾ En principio se podría calcular cual es la conformación de mínima energía.
Hay dos problemas:
x No conocemos la función potencial con suficiente precisión
x El número de conformaciones posibles es MUY grande
¾ Las predicciones con proteínas chicas están dando cada vez mejor
21
Desplegamiento de una proteína
N
U
El estado nativo es estable en un rango muy reducido de condiciones
(temperatura, pH, co-solventes)
¿Como desnaturalizamos una proteína?
¾ Aumento de temperatura (desnaturalización térmica)
¾ Cambios de pH
O
NH2
¾ Agentes químicos:
+ ClC
H2N
UREA
C
NH2
H2N
NH2
Cloruro de guanidinio
¾ Disminución de temperatura (suena raro, pero pasa)
22
Le estabilidad de una proteína se mide con el 'G de unfolding:
G
G
U
UREA
N
N
U
Coordenada de plegamiento
Coordenada de plegamiento
GN < GU
'GU = GU – GN > 0
GN > GU
'GU = GU – GN < 0
GU
GN
[UREA]
23
¾ La desnaturalización es un proceso cooperativo:
Ku =
[D]
[N]
Fracción desnaturalizada: fu =
N
U
Fracción nativa: fn =
fu + fn = 1
En [UREA]50:
fu = fn = 0.5
fu
[N] = [U]
Ku =
[D]
[N] + [D]
[N]
[N] + [D]
fu
fn
=
fu
1 - fu
GU
GN
Ku = 1
'GU = -RT ln(Ku) = 0
[UREA]50
0
[UREA]
8
[UREA]50
'GU = 0
24
x Químicamente una proteína es una entidad metaestable (hidrólisis)
x Se puede usar el formalismo de la termodinámica de sistemas en equilibrio
¿Qué significa que una mutación desestabiliza un proteína?
Silvestre
N
K folding
Mutante
U
U*
N*
= Kf = [N] / [U]
K* folding
= Kf* = [N*] / [U*]
K unfolding = Ku = [U] / [N]
K* unfolding = Ku* = [U*] / [N*]
'Gu = -RTln(Ku)
'Gu* = -RTln(Ku*)
G
G
'Gu‡
'Gu*
N*
U
'Gu
U*
N
Coordenada de plegamiento
Coordenada de plegamiento
25
En el estado nativo de una proteína se forman cientos interacciones
¿Cuan estable es el plegamiento de una proteínas?
Los 'Gu típicamente caen en el rango de 20-60 kJ/mol
x Esto es muy bajo !!! Del orden de 3 a 10 puentes hidrógeno
x El estado nativo es marginalmente estable
¿Como puede ser?
26
Durante el plegamiento hay que tomar en cuenta TODAS las interacciones:
x Proteína – proteína (p-p)
x Proteína – solvente (p-s)
x Solvente – solvente (s-s)
Y debemos tener en cuenta las contribuciones entálpicas y entrópicas al 'G
27
Se forman: x intracatenarias ('Hp-p < 0)
x entre moléculas de solvente ('Hs-s < 0)
ENTALPIA: 'H
Se rompen: x proteína-solvente ('Hp-s > 0)
Valores enormes (varios miles de kJ/mol), pero similares en magnitud y
de signo opuesto.
Los grupos que forman puentes hidrógeno intracatenarios en el estado N
se encontraban formando puentes hidrógeno con el solvente en el estado
U. El balance entálpico es ligeramente favorable.
Disminución de la movilidad de la cadena ('Sp < 0)
ENTROPIA: 'S
Liberación de moléculas de solvente ('Ss > 0)
28
¿Por qué una proteína se pliega?
Por el mismo motivo que se forma una micela o una bicapa lipídica
Porque está rodeada de agua
Si sumergimos una proteína en solvente orgánico lo más probable es que se desnaturalice
Polar
No lineal
29
¿Por qué los compuestos no polares son hidrofóbicos?
?
30
EFECTO HIDROFOBICO
x La interpretación ha generado fuertes controversias.
Veamos la interpretación clásica:
¾ La presencia de una superficie no polar impide que las moléculas de agua
formen todos los puentes hidrógenos
¾ El solvente se orientan formando clatratos ordenados (“icebergs”)
¾ Costo entrópico muy alto
¾ Al plegarse una proteína disminuye el área hidrofóbica expuesta, se liberan
moléculas de agua. El aumento de entropía del solvente compensa por la pérdida
de entropía al disminuir la movilidad la cadena
Acido graso en agua
Cluster de agua
fluctuantes en el
seno del solvente
Moléculas de agua altamente
ordenadas formando una “jaula”
que rodea la cadena alquílica
31
Formación de bicapas y micelas
Disminuye el área hidrofóbica expuesta.
El número de agua forzadas a ordenarse
disminuye. Aumenta la entropía
32
¾ Una proteína en su estado nativo es como una micela muy venida a más.
¾ Al formarse el core hidrofóbico disminuye la superficie accesible al
solvente (ASA), liberándo moléculas de agua
HO
-
+
OH
- +
-
OH
+ -
OH +
Folding:
'ASA < 0
-
+
OH
+
OH
+
HO
+
OH
-
¾ El cambio de ASA ('ASA) en el plegamiento explica porqué la capacidad
calorífica del estado desplegado es mayor que la del estado nativo (CpU >
CpN). En unfolding: 'Cp = (CpU – CpN) es positivo
¾ Por esto las proteínas se pueden desnaturalizar a bajas temperaturas
(“cold denaturation”)
33
¿Cómo medimos 'Gu?
GN-U = -RT ln (KN-U) = -RT ln ([U]/[N])
x
Debemos cuantificar [U] y [N]
x
Usamos algún método que los diferencie:
1) Absorbancia
2) Fluorescencia
3) Dicroismo circular
34
PARA PODER RACIONALIZAR EL EFECTO DE UNA MUTACION HAY
QUE VER COMO CAMBIA LA ESTABILIDAD RELATIVA DE N Y D
EJEMPLOS:
1) GLICINA: EN GENERAL DISMINUYE LA ESTABILIDAD ¿PORQUE?
AUMENTA LA ENTROPIA DEL ESTADO D (ver Ramachandran)
2) PUENTES S-S: EN GENERAL AUMENTAN LA ESTABILIDAD ¿PORQUE?
DISMINUYE LA ENTROPIA DEL ESTADO D
CADA PUENTE PUEDEN CONTRIBUIR HASTA 4 kcal/mol
35
¾ Se puede jugar mucho más con los loops y residuos
expuestos que con el “core” hidrofóbico.
En el caso de mutar residuos del core, se tolera la generacion
de cavidades (ej ILE -> ALA), pero muy difícilmente lo inverso
(ALA -> ILE)
¿PORQUE?
El grado de empaquetamiento del core es muy alto, similar a
un cristal orgánico. Muy probablemente se generen choques.
¿COMO PODRIAN EVITAR ESTO?
Realizando dos cambios que se compensen
36
Caminos de plegamiento y paisajes de energía
Sintetizamos una proteína de 100 aminoácidos con una secuencia al azar.
¿Cuan probable es que adopte una estructura “nativa”?
Apliquemos el método inductivo:
x La mayor parte de las proteínas que conocemos adoptan una conformación
nativa, entonces nuestra proteína debería plegarse correctamente.
¿Vale este razonamiento?
x Las proteínas que hay en la naturaleza ¿Son una muestra representativa?
¿Cuántas posibles proteínas de 100 residuos se podrían hacer ?
20100 = 1.3 x 10130
(número de protones y neutrones del universo a1076)
¿Cuántas proteínas hay en la naturaleza?
xSupongamos 10.000 x 106 especies y que cada genoma codifica para
30.000 genes (exageración supina).
Entonces tendríamos 3 x 1020 proteínas
(muchas están repetidas).
37
Secuencias posibles= 1.3 x10130
Secuencias en la naturaleza: como mucho 3 x 1020
Por cada secuencia seleccionada por la evolución hay 4.3 x 10109 secuencias
que no aparecieron
Volvamos a nuestra pregunta inicial:
Sintetizamos una proteína de 100 aminoácidos con una secuencia al azar.
¿Cuan probable es que adopte una estructura “nativa”?
En principio no podemos decir nada.
Seguro que luego de miles de millones de años de evolución nos llegó un
muestreo ínfimo de todas las proteínas posibles.
¿Cuáles fueron las proteínas que nos llegaron?
¡¡¡Casualmente aquellas que se plegaron correctamente!!!
38
Las proteínas que SI nos llegaron, ¿siguen un camino al “azar” al plegarse?
Azar: la cadena va probando todas las conformaciones hasta llegar a N
¿Cuánto tiempo demandaría este proceso?
x Imaginemos que cada aminoácido puede adoptar tres conformaciones posibles
(D, E y L)
x Cada conformación se puede interconvertir en 1 ps (10-12 seg)
x Una cadena de 100 residuos puede adoptar 3100 = 5.2 x 1047 conformaciones
EXPLORAR TODAS LAS CONFORMACIONES REQUERIRIA:
10-12 seg * 5.2 1047 = 5.2 1035 seg (1.7 1028 AÑOS !)
(si supemos que en cada paso de busqueda los 100 residuos cambian, tardaría 1.7 1026 años)
PERO, LA MAYOR PARTE SE PLIEGA EN 0.1 - 1000 seg !!!
PARADOJA DE LEVINTHAL (1968)
39
Entonces ¿Es el plegamiento un proceso al azar?
NO
¿COMO PUEDE SER?
x No hace una busqueda al azar de la conformación de mínima G.
x Necesariamente deben existir “caminos” favorecidos que restrigen la
búsqueda.
x La evolución cumplió un papel fundamental.
x Se seleccionaron aquellas secuencias cuya velocidad de plegamiento es
compatible con la vida.
40
Caminos de plegamiento
Imaginemos que tenemos dos proteinas con los estos espacios conformacionales:
G U
G
U
N
coordenada
N
coordenada
¿Cuál creen que se pliega con más eficiencia?
En el primer caso el plegamiento se verá “fustrado” mucho más
veces (trampas cinéticas)
La evolución seleccionó aquellas secuencias que presentan
espacios conformacionales “lisos”, con pocos mínimos locales.
41
Tres modelos de plegamiento proteico
U
I
I
I
Colapso-hidrofóbico
Difusión-condensación
1) Estructura 2ria
2) Chocan entre si para
formar la 3ria
Ejemplo: barnasa
N
1) Aglutinación del core
hidrofóbico
2) La 3ria se propaga
desde allí
Nucleación-condensación
1) Un elemento de
estructura 2ria
2) La 3ria se propaga
desde allí
Ejemplo: CI2
42
El embudo de plegamiento (“folding funnel”)
¾El mecanismo de plegamiento no es
análogo a una reacción de moléculas
chicas (pocos enlaces de alta energía).
¾ Es una búsqueda sesgada en una
superficie de energía chata (muchas
conformaciones con energía similar).
¾ Superficie característica de un
número muy grande de interacciones de
baja energía.
43
44
Análisis de la superficie de energía libre
Lenta
“Chiche bombón”
“Lenta y peligrosa”
No tan mala
“¿ Funcional ?”
45
El sesgo proviene porque en promedio aquellas conformaciones que
presentan más contactos “nativos” entre residuos son más
estables.
¿Como “sabe” la proteína que un contacto es “correcto”?
No lo sabe. Aquellas estructuras que no presentaban este
comportamiento no fueron seleccionadas.
¿Que ocurriría si sintetizamos una proteína con una secuencia
cualquiera? Que no fue “filtrada” por millones de años de
evolución. ¿Se plegaría con una estructura “única”?
Lo más probable es que no se pliegue.
46
Un mono secretario…
47
DESNATURALIZACION POR AGENTES QUIMICOS
UREA o GUANIDINIO:
¾ ALTERAN LA ESTRUCTURA DEL AGUA
¾ INTERACCIONAN CON GRUPOS DE LA PROTEINA ( aromáticos, amidas)
'G DE TRANSFERENCIA DE UN AMINOACIDO DESDE AGUA A UNA SOLUCION
DE DESNATURALIZANTE ES PROPORCIONAL A LA CONCENTRACION DE
DESNATURALIZANTE
COMO EL ESTADO D ES MAS EXPUESTO QUE EL N, ENTONCES D ES
ESTABILIZADO POR EL DESNATURALIZANTE
'GD-N = 'GD-N(H2O) - mD-N [desnaturalizante]
1
fu
NH2+
O
0.8
0.6
H2N
0.4
0.2
C
UREA
0
0
2
4
[UREA]
6
NH2
H2N
C
NH2
GUANIDINIO
8
48
DIFERENCIAS DE ESTABILIDAD
> estabilidad
'GD-N = 'GD-N(H2O) - mD-N [desnaturalizante]
m: medida de 'ASA (superficie accesible al solvente) durante el desplegado
'ASA
m
49
Transiciones de dos estados
La transición medida por diversas técnicas debe ser idéntica (UV, fluorescencia, CD, etc)
Idealmente debería haber puntos isosbésticos e isodicroicos (¿PORQUE?)
'G = 0
G
nearUV CD
TRP
señal
D
farUV CD
N
[desnaturalizante]
nearUV CD
[desnaturalizante]
TRP
señal
D
N
¿Qué ocurrió acá?
farUV CD
N
D
[desnaturalizante]
50
¿Cómo seguimos el desplegado de una proteína?
Gel con gradiente de urea:
N
Migración
U
! tamaño
0 M
UREA
8 M
51
Dicroísmo circular (CD)
52
Espectroscopía de fluorescencia
Desplegada OEX 292
nm
Desplegada OEX 275 nm
Nativa OEX 292 nm
xCasi siempre el espectro de U aparece
corrido hacia el rojo
xLa intensidad puede aumentar o disminuir
53
Atrapado de intermediarios de plegamiento ligados por puentes disulfuro:
¾La proteína completamente desplegada y reducida se vuelve a plegar si
se elimina el desnaturalizante y los puentes disulfuro se forman por
oxidación con O2.
¾ Se pueden atrapar los intermediarios con diferentes puentes disulfuro
ya formados, de dos maneras principales:
bajando el pH o por
modificación covalente (Iodoacetato):
SH
HS
SH
SH
SH
ICH2COO-
O2
SCH2COOSCH2COO-
SH
S-S
S-S
¾ Una de las pocas técnicas para ver folding in vivo
54
Inhibidor de tripsina de páncreas bovino (BPTI)
55
56
¿COMO CALCULAMOS 'GD-N?
Partimos de una señal espectroscópica a distintas
[UREA].
F
! [UREA]
Mezcla de las señales de N y D, pesadas por su
concentración:
S =SN fN + SD fD = SN (1-fD) + SU fD
Con esto podemos calcular fU:
fD = (S – SN) / (SD-SN)
Long. Onda (nm)
El cual se relaciona con KD-N = [D]/[N] = fD / (1-fD)
Podemos calcular KD-N para cada [UREA]
¿Por qué KD-N depende de urea?
¿Cómo calculamos KD-N en ausencia de urea?
1
fu
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0
2
4
[UREA]
6
8
Con KD-N podemos calcular 'GD-N para cada [UREA] y
podemos extrapolar los valores en ausencia de urea:
'GD-N = 'GD-N(H2O) + m [UREA]
57
Para el caso de oligómeros 'GD-N depende de la concentración total de proteína
¿Porqué?
'GD-N
'G1
'GD-N = 'G1 + 'G2
'G2
Depende de [PROT]
En las curvas de desnaturalización pueden observarse dos
tipos de comportamiento:
fD
fD
! [PROT]
[Desnaturalizante]
! [PROT]
[Desnaturalizante]
¿Cómo están acopladas las estructuras
terciaria y cuaternaria en cada caso?
58
La presencia de un ligando aumenta la estabilidad:
Ejemplo: calreticulina r Ca2+ r Glc1Man9GlcNAc2
> Glc1Man9GlcNAc2
Estabilidad térmica
seguida por far-UV CD:
> [Calcio]
> Glc1Man9GlcNAc2
Glc1Man9GlcNAc2
calcio
59
Fluorescencia de TRP:
> [Calcio]
+ Glc1Man9GlcNAc2
+ Glc1Man9GlcNAc2
+ Glc1Man9GlcNAc2
'GD-N
'G1
'G2
'GD-N = 'G1 + 'G2
Binding Unfolding
60
Denaturalización de proteínas oligoméricas:
SOYBEAN AGGLUTININ (SBA)
61
Tratamiento de SBA con urea
(en presencia de EDTA)
TRP
TRP
ANS
ANS
SEC
62
CD UV lejano
CD UV cercano
2 TRANSICIONES
ANS
63
¾La desnaturalización de una proteína oligomérica puede ser más de 1 estado:
Terciaria
La detección del monómero va a depender del grado de cooperación
entre estructura terciaria y cuaternaria
fu
fu
Urea
Urea
64
¾ El 'Gu de una proteína oligomérica depende de
la concentración total de proteína:
fu
fu
> concentración
> concentración
Urea
Urea
65
PLEGAMIENTO IN VIVO DE PROTEINAS
A1) Problemas a resolver: x
x
x
x
x
interacciones hidrofóbicas
puentes disulfuro
isomerización de prolinas
adquisición de la estructura cuaternaria
traslocación de membranas
A2) Familias de chaperonas:
x HSP70
x HSP40
x HSP60
x HSP10
x HSP90
x small HSP (sHSP)
x HSP100
x CRT/CNX
x PPIases
x PDI
x chaperonas intramoleculares
A3) Acción secuencial de chaperonas
66
PROBLEMAS A RESOLVER: INTERACCIONES HIDROFOBICAS
ESTRUCTURA 3D MUY
BASICA DE UNA
PROTEINA
HO
+
OH
-
+
+
UNA MICELA VENIDA
MUY A MAS
HO
+
OH
-
PROBLEMA:
x SINTESIS PROTEICA Y TRASLOCACION DE MEMBRANAS ES
LINEAL
xLOS RESIDUOS HIDROFÓBICOS INTERACTUAN
INESPECIFICAMENTE
x LA VELOCIDAD DE SINTESIS MUCHAS VECES ES MENOR QUE
EL TIEMPO PARA EL PLEGAMIENTO
+ OH
- OH+
-+
OH
- OH +
67
PROBLEMAS A RESOLVER: PUENTES DISULFURO
SH
1
S-S (12)
SH
2
S
S
3
SH
SH
SH
SH
S-S (23)
NATIVA
S S
E0S-S(2-3) E0S-S(2-3),
E0S-S(2-3)
S S
S-S (13)
68
PROBLEMAS A RESOLVER: ISOMERIZACION DE PROLINAS
TRANS
CIS
69
PROBLEMA ADICIONAL
EL MEDIO INTRACELULAR TIENE UNA
CONCENTRACION ESCANDALOSAMENTE
ALTA DE PROTEINAS !!!
E.coli ~ 150 mg/ml
Célula de mamífero ~ 180 mg/ml
PREVENIR LA SEGURA AGREGACION DE
PROTEINAS, SU CORRECTO PLEGADO Y
ENSAMBLADO
CHAPERONAS
70
PLEGAMIENTO IN VIVO DE PROTEINAS
x
x
x
x
x
x
Secundaria
Terciaria
Cuaternaria
Puentes disulfuro
Isomerizacion de prolinas
Modificaciones postraduccionales
“VIA TERMODINAMICA”
“VIA CINETICA”
Reacción de molecularidad alta.
Velocidad muy dependiente de
concentración
71
CHAPERONAS: proteínas que ayudan a otros polipéptidos a adquirir la
conformación apropiada o la localización celular adecuada sin formar
parte de la estructura final.
CLASIFICACION FUNCIONAL:
1) INTERACCIONAN CON RESIDUOS HIDROFOBICOS (previniendo agregación
inespecífica durante la síntesis y la traslocación de membranas):
x HSP70 (DnaK)
x HSP40 (DnaJ)
x HSP60 (GroEL)
x HSP10 (GroES)
x HSP90
x small HSP (sHSP)
x HSP100
x chaperonas intramoleculares
2) CATALIZAN LA CORRECTA FORMACION DE PUENTES DISULFURO:
x PDI: protein disulfuro isomerasas
3) CATALIZAN LA ISOMERIZACION DE PROLINAS:
x PPIases: peptidilprolil isomerasas
4) INTERACCIONAN CON HIDRATOS DE CARBONO (lectinas):
x CRT/CNX: calreticulina / calnexina
72
CHAPERONAS
Algunas cosas generales:
¾ EN GENERAL NO ACELERAN LA VELOCIDAD DE PLEGAMIENTO.
AUMENTAN LA EFICIENCIA DEL PROCESO AL EVITAR LA AGREGACION
INESPECIFICA Y RESCATAR PROTEINAS QUE ENTRARON A VIAS
MUERTAS
¾ DURANTE EL PLEGAMIENTO IN VIVO SOLO UNA PEQUEÑA
PROPORCION DE UNA PROTEINA PARTICULAR INTERACCIONA CON LOS
SISTEMAS DE CHAPERONAS
¾ LAS PROTEINAS PUEDEN SEGUIR MAS DE UNA VIA DE PLEGAMIENTO
IN VIVO. AL ELIMINARSE LA INTERACCION CON UNA CHAPERONA
OTRAS TOMAN SU LUGAR
73
HSP70 (DnaK) - HSP40 (DnaJ)
¾ PRESENTES EN CITOSOL Y ORGANELAS
FUNCIONES:
¾ PARTICIPAN EN LA SINTESIS PROTEICA (previenen agregación,
ayudan en la adquisición de la estructura nativa, rompen agregados)
¾ TRANSLOCACION DE MEMBRANAS
¾ CONTROL DE PROTEINAS REGULATORIAS: receptores nucleares,
quinasas (Raf, eIF2D-quinase), factores de transcripción (HSF, V32, etc)
¾ RECONOCEN SEGMENTOS HIDROFOBICOS DE PROTEINAS EN
CONFORMACIONES EXTENDIDAS.
74
HSP70 (DnaK) - HSP40 (DnaJ)
DnaK
GrpE
ATP
ATP
DnaJ
ATP
ADP
+ Pi
ADP
ATP
+
75
GrpE
DnaK (ATP binding domain)
DnaK (substrate
binding domain)
76
HSP60 (GroEL) - HSP10 (GroES)
(CHAPERONINAS)
Presente en Eubacteria, Cloroplasto y
Mitocondria.
Dominio apical: expone parches
hidrofobicos
Reconoce preferentemente
intermediarios avanzados de
plegamiento
En E. coli aprox. 10-15 % de las
proteinas sintetizadas inteactua con
GroEL-GroES.
77
HSP60 (GroEL) - HSP10 (GroES)
CICLO CATALITICO
7 ADP
: unfolded
protein
: folded protein
7 ATP
ADP
ATP
ADP
ATP
ADP
ADP
ATP
ATP
7 ATP
7 ADP
UNION DEL
POLIPEPTIDO
ENCAPSULAMIENT
O DEL
POLIPEPTIDO
UNION DEL
LIBERACION DE LA
POLIPEPTIDO
TRANS
CAVIDAD CIS
Dominio apical: expone parches hidrofóbicos. Luego de unirse el sustrato y GroES
este dominio gira 90 grados y se ocultan los residuos hidrofóbicos. Se genera una
cavidad hidrofílica (caja de Anfinsen) capaz de contener ligandos de hasta 60 kDa.
78
FORMACION DE PUENTES DISULFURO: PDI
MAQUINARIA DE RECICLADO
PDI
PDI
PDI
S
S
S
SH
SH
SH
SH
SH
S
SH
S
S
PROTEÍNA
PROTEÍNA
CITOSOL:
[GSH] : [GSSG] = 30:1 A 100:
RETICULO ENDOPLASMICO:
[GSH] : [GSSG] = 1:1 A 1:3
PROTEÍNA
LA PDI “NO SABE” SI UN PUENTE
DISULFURO ES CORRECTO. HAY U
JUEGO ENTRE ESTABILIDAD Y
CINETICA.
79
Las PDIs cumplen varias funciones:
HS
S
E
HS
S
S
HS
OXIDO-REDUCCION
OXIDO-REDUCCION
SH HS
E
S
S
S
HS
S
SH
E
SH
S
HS
SH
S
E
ISOMERIZACION
SH
HS
S
S
S
Y están altamente especializadas a determinados sustratos.
En el RE hay unas 18 PDIs distintas.
80
D7
E7
E7
D7
PROTEASOMA
2.5 Mda, PORO INTERNO 5 nm
26S: 20S (CATALITICA) + 19S (REGULATORIA)
UBICUO Y ESENCIAL EN EUCARIOTAS. UBICUO Y NO ESENCIAL EN
ARQUEA. RARO Y NO ESENCIAL EN BACTERIAS
FUNCIONES: DEGRADACION DE PROTEINAS DAÑADAS O MAL PLEGADAS.
CONTROL DE LA VIDA MEDIA DE PROTEINAS REGULATORIAS (Péptidos para
MHC !!!)
81
E ES LA SUBUNIDAD CATALITICA. SE SINTETIZA CON UN
PROPEPTIDO QUE SE CLIVA AUTOCATALTICAMENTE EN PARALELO
CON EL ENSAMBLADO. ¿CUAL SERIA LA VENTAJA DE ESTO?
MECANISMO PROCESIVO. GENERA PEPTIDOS DE 6-10 RESIDUOS.
80-90% DE LA DEGRADACION PROTEICA ES VIA PROTEASOMA
¿CUAN GENERAL ES LA DEGRADACION PROTEICA?
DEPENDE DE CADA PROTEINA.
Ej.: CFTR MAS DEL 90 % SE DEGRADA VIA PROTEASOMA,
PARA EL CASO DE LA MUTANTE'F508 LA PROPORCION ES
MUCHO MAYOR
82
ACCION SECUENCIAL DE CHAPERONAS
SINTESIS PROTEICA EN E. coli
TF: trigger factor.
Miembro de la
familia FNBP
TF
DnaK
Dna
J
+ GroEL
+ ATP
+ GroES
PROTEINA
NATIVA
83
ACCION SECUENCIAL DE CHAPERONAS
SINTESIS PROTEICA EN EUCARIOTES
Sis1
p
Ssb1p/
2p
NAC
Hdj1
+ TRiC
+ ATP
PROTEINA
NATIVA
84
EN EL RE TENEMOS DOS GRUPOS MEDIANAMENTE
DEFINIDOS DE CHAPERONAS:
BAP (Grep)
BIP (Hsp70)
GRP94 (Hsp90)
EL CLAN DE BIP
ERdj3 (DnaJ)
PDI
GRp170
ERp72
GT
LA PATOTA DE CNX/CRT
GII
CNX
CRT
ERp57
85
IMPORTE Y PLEGADO DE PROTEINAS EN EL RE
SRP: signal recognition particle (7S RNA + proteínas de 9, 14, 19, 54,
68 y 72 kDa). Frena la elongación si detecta un PS.
SR: membrana ER. Reconoce SRP. Dos subunidades (SRD y SRE).
Libera SRP y forma un complejo entre el ribosoma y el traslocón.
Existen homólogos bacterianos de SRP ySR para las proteínas
periplásmicas.
SRP
ATP
OT
Sec61
SR
Sec63
BiP
PEPTIDASA
péptido señal
GRp94
CRT/CNX
Sec62
Sec71
Sec72
PROTEINA
NATIVA
86
PLEGAMIENTO DE PROTEINAS EN EL RE
BIP
BIP
CNX/CRT
BIP/CNX/CRT
CNX/CRT
OBSERVACIONES MÁS O MENOS GENERALES:
CNX/CRT
BIP
• LOS SISTEMAS SON REDUNDANTES
• AL ELIMINAR UNA CHAPERONA SE SOBREEXPRESAN
OTRAS (ej. GT-/- tiene BiP aumentada 2-3 X)
• AL AFECTAR LA UNIÓN A UNA CHAPERONA
AUMENTA LA VELOCIDAD DE CIRCULACIÓN A TRAVES
DE LA VÍA SECRETORIA PERO DISMINUYE LA
EFICIENCIA
87
CONTROL DE CALIDAD DE PLEGAMIENTO DE
GLICOPROTEINAS EN EL RE
GLUCOSIDADA II
D-1,3
D-1,3 D-1,3 D-1,2 D-1,2
D-1,3
D-1,2
GLUCOSIDADA I
E-1,4
E-1,4
ASN
D-1,3
D-1,6
D-1,6
MANOSIDASA
D-1,2
GLUCOSA
MANOSA
N-ACETILGLUCOSAMINA
88
¿PORQUE LAS PROTEINAS SE GLICOSILAN?
x DEBIDO A SU NATURALEZA HIDROFILICA AUMENTAN LA SOLUBILIDAD DE
LAS PROTEINAS
x POR SU GRAN VOLUMEN REDUCEN LA EXPOSICION SUPERFICIAL DE LA
PROTEINA, DISMINUYENDO LOS CONTACTOS INESPECIFICOS ENTRE
PROTEINAS
x LOS OLIGOSACARIDOS POR LO GENERAL ESTABILIZAN EL BACKBONE
x SE USAN COMO UN CODIGO DE BARRAS PARA INDICAR EL ESTADO
CONFORMACIONAL DE LA PROTEINAS
x los oligosacáridos participan en una gran variedad de procesos de reconocimiento
89
GT
OT
GT
GI
GII
GII
GII
SECRETORY
PATHWAY
CNX
ERp57
ERp57
CNX
90
CALNEXINA - CALRETICULINA
DOMINIO P
LECTINA EXCLUSIVA PARA Glc1Man9NAcGlcN2
SE DESCONOCE SI RECONOCE LA PARTE PROTEICA
91
Que ocurre cuando la maquinaria de plegamiento es superada?
En RE:
1) ATENUAR SINTESIS DE PROTEINAS
UPR
2) SINTETIZAR MAS CHAPERONAS
3) DEGRADAR PROTEINAS MAL PLEGADAS
ERAD
4) APOPTOSIS
92
ERAD: ER associated degradation
MECANISMO GENERAL
proteína mal plegada
Ub
SEC61
BiP
BiP
PROTEASOMA 26S
toxina
93
DEGRADACION DE
GLICOPROTEINAS
Man9NAcGlcN2
EDEM
GT
MANOSIDASA
Man8NAcGlcN2
GII
7
p5
ER
X
CN
PEPTIDIL N-GLICANASA
PROTEASOMA 26S
94
¿Qué ocurre cuando una proteína no puede
plegarse correctamente y no es degradada?
ENFERMEDADES DE PLEGAMIENTO
MAL DE ALZHEIMER (2.000.000 EN USA)
MAL DE PARKINSON (500.000 EN USA)
ENFERMEDADES POR POLIGLUTAMINAS (HUNTINGTON, KENNEDY, ATAXIA, ETC)
MAL DE LA VACA LOCA (BSE)
OBSERVACION EN CEREBROS CON BSE:
DEPOSITOS FIBRILARES: AMILOIDES
95
ENFERMEDADES DE PLEGAMIENTO
ENFERMEDAD
COMPONENTE PRINCIPAL DEL AGREGADO
Alzheimer’s disease
A peptides (plaques); tau protein (tangles)
Spongiform encephalopathies
Prion (whole or fragments)
Parkinson’s disease
-synuclein (wt or mutant)
Primary systemic amyloidosis
Ig light chains (whole or fragments)
Secondary systemic amyloidosis
Serum amyloid A (whole or 76-residue fragment)
Fronto-temporal dementias
Tau (wt or mutant)
Senile systemic amyloidosis
Transthyretin (whole or fragments)
Familial amyloid polyneuropathy I
Transthyretin (over 45 mutants)
Hereditary cerebral amyloid angiopathy
Cystatin C (minus a 10-residue fragment)
Haemodialysis-related amyloidosis
2-microglobulin
Familial amyloid polyneuropathy III
Apolipoprotein AI (fragments)
Finnish hereditary systemic amyloidosis
Gelsolin (71 amino acid fragment)
Type II diabetes
Amylin (fragment)
Medullary carcinoma of the thyroid
Calcitonin (fragment)
Atrial amyloidosis
Atrial natriuretic factor
Hereditary non-neuropathic systemic amyloidosis
Lysozyme (whole or fragments)
Injection-localised amyloidosis
Hereditary renal amyloidosis
Insulin
Fibrinogen -A chain, transthyretin, apolipoprotein AI, apolipoprotein AII,
lysozyme, gelsolin, cystatin C
Amyotrophic lateral sclerosis
Superoxide dismutase 1 (wt or mutant)
Huntington’s disease
Huntingtin
Spinal and bulbar muscular atrophy
Androgen receptor [whole or poly(Q) fragments]
Spinocerebellar ataxias
Ataxins [whole or poly(Q) fragments]
Spinocerebellar ataxia 17
TATA box-binding protein [whole or poly(Q) fragments]
96
¿ QUE OCURRE CUANDO UNA PROTEINA MAL PLEGADA
NO ES DEGRADADA ?
EJEMPLO: MAL DE LA VACA LOCA (BSE)
….en los 80s
CASOS BSE
40000
30000
20000
10000
94
93
92
91
90
89
88
87
86
85
0
AÑO
CASOS vCJD
12
10
8
….y a mediados de los 90s
6
4
2
97
96
0
95
NUEVA VARIANTE DE LA ENFERMEDAD DE
CREUTZFELDT-JAKOB (vCJD)
AÑO
97
PRION (PrP)
• SE ENCUENTRA NORMALMENTE EN MUCHOS TEJIDOS
• FUNCION: DESCONOCIDA (!)
• LOCALIZACION: EN LA MEMBRANA CELULAR, DEL LADO EXTERNO
PROBLEMA: NO DA AMILOIDES !!!
98
(SIN EMBARGO NO ES TAN SIMPLE)
LA DOBLE VIDA DE PrP
(“El extraño caso del Dr. Jekyll y Mr. Hyde” R.L. Stevenson)
PrPC
PrPSc
AMILOIDE
99
UN MODELO POSIBLE PARA LA GENERACION DE AMILOIDES
Stanley Prusiner
Premio Nobel de Medicina 1997
100
MODELO DE PRUSINER
CONVERSION
PrPC
INDUCCION
PrPSc
INFORMACION “NO
GENETICA”
INDUCCION
CONFORMACIONAL
PROPAGACION
AMILOIDE
101
¿PORQUE APARECIO LA vCJD AHORA?
¿ES NUEVA? SIMILAR AL KURU
GRUPO LINGUISTICO “FORE” DE PAPUA NUEVA GUINEA
POR CANIBALISMO
OVEJA
SCRAPIE (200 años)
VACA
HUMANO
CARNIVORA !!!
102
ALGUNAS COSAS IMPORTANTES
AGREGACION
EVOLUCION TEMPORAL DE LA FORMACION DE AGREGADOS:
TIEMPO
SIEMBRA
FASE LAG
FASE DE ELONGACION
CAMBIO
CONFORMACIONAL
LENTO
RAPIDO
103
Y EN BASE A ESTO PODEMOS ENTENDER ALGUNAS COSAS:
¿POR QUE MUTACIONES QUE DISMINUYE LA ESTABILIDAD DE UNA
PROTEINA PUEDEN FACILITAR LA FORMACION DE AMILOIDES? CJD
¿COMO SE PRODUJO LA vCJD?
Y ACA HAY DOS MODELOS CINETICOS MUY DIFICILES DE DISCRIMINAR:
x EFECTO “INDUCTIVO”
x EFECTO RESERVORIO
Ambos dan cinéticas similares
104
MAS COSAS IMPORTANTES:
xEN PRINCIPIO LA FORMACION DE AMILOIDES ES UNA PROPIEDAD
INTRINSECA DE TODAS LAS PROTEÍNAS. ES UN PROCESO INEVITABLE
DADA LAS CARACTERISTICAS FISICAS Y QUIMICAS DE UNA CADENA DE
ALFA-AMINOACIDOS (Dobson)
SIMPLIFICANDO LAS COSAS: LAS CADENAS LATERALES CODIFICAN LA
INFORMACION PARA LA ESTRUCTURA TERCIARIA, Y EL BACKBONE
CODIFICA LA INFORMACION PARA AMILOIDES
x SI EN UN CULTIVO SE EXPRESA UNA PROTEINA QUE FORMA AMILOIDES
NO RELACIONADA A NINGUNA PATOLOGIA CONOCIDA, POR LO COMUN
RESULTA DELETEREA
x HAY UNA RELACION BASTANTE DIRECTA ENTRE ESTABILIDAD
CONFORMACIONAL Y TENDENCIA A FORMAR AMILOIDES
105
¿CUAL ES LA ESPECIE TOXICA?
EN UN PRINCIPIO SE CREYO QUE LA ESPECIE TOXICA ERAN LOS AMILOIDES. SIN EMBARGO LUEGO SE
VIO QUE NO HAY UNA CORRELACION ENTRE EL NIVE DE DAÑO CELULAR Y LA FORMACION DE AMILOIDES.
INTERMEDIARIOS
AVANZADOS
ENSAMBLADOS
GLOBULARES
(HSP´)
AGREGADOS
TEMPRANOS
EN FORMA
DE PORO
FIBRA MADURA
PORO DE
MEMBRANA
106
SI LAS ESPECIES TOXICAS SON LOS AGREGADOS PREVIOS AL AMILOIDE,
¿SE IMAGINAN QUE HUBIERA PASADO DE HABERSE APLICADO TERAPIAS
TENDIENTES A DESTRUIR LOS AMILOIDES?
DE HECHO HAY UN CONSENSO CADA VEZ MAYOR DE QUE EN ALGUNOS
CASOS LOS AMILOIDES SERIAN UNA FORMA DE RESPUESTA PROTECTIVA
¿PORQUE ES TOXICA?
ACA HAY DEMASIADAS TEORIAS Y POCAS RESPUESTAS:
1)
2)
3)
POROS
TEORIA DE SECUESTRO
INHIBICION DEL PROTEASOMA
107
CUERPOS DE INCLUSION (IB: INCLUSION BODIES)
xProblema muy común al expresar proteínas recombinantes.
xAl expresar proteínas humanas en E. coli:
- SOLUBLES: 15-20 %
- CUERPOS DE INCLUSION 20-40 %
- el resto no se expresa!!! (se degradan)
x Masas amorfas densamente empaquetadas, formadas por proteína
mal plegada (en general un 70 % o más corresponde a la proteína
recombinante, siendo el resto proteínas bacterianas).
108
x En E. coli se observa en general uno solo por célula, con un
tamaño en el orden de 0.2 a 1.5 Pm. Pueden llegar a
distorsionar la pared celular.
¿Porqué
se
forman?
xMaquinaria inadecuada o insuficiente de
chaperonas
xFalta de modificaciones postraduccionales (ej.
glicosilación)
xSíntesis demasiado rápida para la cinética de
plegamiento de la proteína
109
¿Como lo evitamos?
x Bajar la temperatura (28ºC)
xUsar niveles de expresión más bajos: menos inductor, medios de cultivo
menos ricos o cambio de vector.
xA veces se puede co-expresar una chaperona ausente en el sistema
heterólogo
¿Se puede recuperar la proteína de un IB de forma funcional?
x Muchas veces sí:
1) Limpiar los IB (urea a baja cc, tritón X-100, NaCl, etc. Todo a
baja T). A veces se puede tener la proteína con una pureza mayor del
90 %.
2) Resuspenderlos (urea 6-8 M, guanidinio-HCl 6 M, con o sin DTT)
3) Plegar la proteína:
-diálisis de a poco
-dilución brusca
-unida a una columna (ej. IMAC)
4) Caracterizar la proteína: dicroísmo far-UV y near-UV, actividad
biológica, etc
110
UNA VISION GOBAL DEL PLEGAMIENTO DE LAS PROTEINAS:
AGREGADO
DESORDENADO
HETEROCOMPLEJO
(IB)
INTERMEDIARIOS
AVANZADOS
SINTESIS
CRISTAL
NATIVA
OLIGOMERO
INTERMEDIARIOS
TEMPRANOS
(HSP)
(HSP´)
DEGRADACION
PROTEASOMAL
AGREGADO
ORDENADO
PREFIBRILAR
DIMEROS
TRIMEROS
FIBRAS
FIBRA
AMILOIDE
111