Busqueda de puentes de hidrogeno

Busqueda de puentes de hidrogeno
• Un puente de hidrogeno (puente-H) permite que pedazos
del peptido relativamente distantes en la cadena queden
cerca uno de otro en el espacio. Son muy comunes en proteinas, y si se pudiese identificar donde estan (atomos dador y
aceptor), obtendriamos una restriccion estructural importante.
• En una proteina los puentes-H mas interesantes son aquellos
entre los protones NH y carbonilos del esqueleto peptidico,
como ser los que vemos en α-helices y hojas β. Tambien podemos verlos de grupos NH y CO en cadenas laterales (Asn,
Asp, Gln, Glu) a grupos CO y NH del esqueleto peptidico:
• Para ubicarlos estudiamos las velocidades de interecambio
de los protones NH. La idea es que protones labiles protegidos del solvente no intercambian tan rapido con protones del
solvente como aquellos que esten expuestos al medio.
Velocidad de intercambio de amidas
• Osea, si agregamos D2O a una solucion de nuestra proteina
en H2O y tomamos espectros a distintos tiempos vemos que
las señales de los NH desaparecen a distintas velocidades.
• Como en la region NH de un espectro 1H 1D hay mucho solapamiento, normalmente usamos un experimento 2D rapido,
como ser un COSY. Miramos las correlaciones NH-Hα a
distintos tiempos.
4.0
t = 0 (Sin D2O)
Agregado de
D2O
4.0
(Hαs)
t = t1
4.0
t = t2
8.0
(NHs)
7.0
Intercambio de amidas (continuado)
• Con estos datos podemos determinar que NH participan en
puentes-H fuertes y debiles, y cuales no participan. Como
tambien tenemos datos de NOE y acoples 3J podemos ver si
estas amidas pertenecen a regiones de la proteina con estructura secundaria definida (helices-α, hojas β, o bucles β).
• Si y SOLO si podemos hacer eso, podemos usar al puente-H
como una restriccion estructural en la generacion del
modelo 3D.
• ¿Porque el ‘SOLO’? Solo conocemos al dador del puente-H,
pero no hay, al menos hasta hace poco, forma de determinar
cual es el C=O aceptor. Si le erramos a esto, el resultado es
catastrofico: Como basicamente estamos ciclando el peptido
no hay forma de obtener la estructura correcta.
• Si decidimos que es razonable, podemos usar los puentes-H
en los calculos como una restriccion de distancias:
EHB = KHB * ( ri - rHB-ideal )2
• rPH-ideal es ~2.5 Å. Como los puentes-H tambien tienen una
componente angular (el angulo N-H…O tiene que estar entre
135 y -135), podemos hacer el termino EHB mas complejo
para incorporar esto tambien…
Gradientes de temperatura de amidas
• Las velocidades de intercambio andan bien en proteinas, ya
que los tiempos son relativamente largos. En peptidos mas
chicos esto no siempre es asi.
• Como son mas flexibles, tienen mucho mas contacto con el
solvente y todo se intercambia en tiempos mas cortos
(minutos en vez de horas). En el tiempo que nos lleva poner
D2O en el tubo, ir al laboratorio de RMN, ponerlo en el iman,
y ajustar el campo ya no tenemos NHs, sino que NDs…
• En peptidos, en vez de estudiar velocidades de intercambio
analizamos el cambio en el corrimiento de los protones NH
en funcion de la temperatura (gradientes de temperatura).
• Cuanto mas expuesto este el proton NH al solvente, mas
rapido sera su intercambio con los protones del agua, lo que
mueve su corrimiento quimico a campos altos (4.7 ppm…).
• Medimos los gradientes de T en partes por billon (ppb).
Valores por debajo de -2 indican que estamos protegidos del
solvente, entre -2 y -5 ppb que estamos parcialmente protegidos (tenemos puente-H parte del tiempo), y arriba de -6 que
el proton NH esta completamente expuesto al agua.
• Como en proteinas, no podemos determinar cual es el aceptor (que oxigeno). Osea, tenemos que tener cuidado si queremos usar esta informacion para imponer restricciones…
Gradientes de temperatura de amidas (…)
• Para el peptido Ala-Arg-Pro-Tyr-Asn-Aic-Cpa-Leu-NH2:
• El NH de la Leu esta en un puente-H parcial.
Uso de VIAs y GTAs
• Un problema de tener datos de puentes-H es saber que los
tenemos pero no poder usarlos con certeza.
• Si queremos hacerlo con cuidado, hacemos todos los calculos de las estructuras 3D con NOEs y 3Js, y despues descartamos las estructuras en las que NHs que sabemos que estan involucrados en puentes-H no aparezcan en puentes-H
(lease, lo usamos como una confirmacion).
• Tambien los podemos usar directamente si tenemos datos
de NOE y 3Js complementatios, como ser en casos que tengamos helices-α y hojas β bien definidos. El problema son
los bucles β, donde vemos puentes-H pero no NOEs/3Js.
• O podemos hacer algo mas complicado, que es probar todos
los aceptores razonables posibles en simulaciones independientes y ver cuales son los que nos dan menor energia:
O
O
O
H
O
H
O
E1
O
O
O
O
H
O
E3
O
H
O
E2
Marcado isotopico
• En principio, los unicos nucleos que podemos ver por RMN
en una proteina son los 1Hs. En proteinas chicas (~ 10 KDa,
~ 80 aminoacidos) esto no es problema. Podemos identificar
todos los residuos, determinar todos los NOEs, y medir la
mayoria de los acoples 3J con TOCSYs, COSYs, y NOESYs.
• En moleculas mas grandes (> 10 KDa), el solapamiento se
torna problematico. Muchos residuos quedan sin identificar,
y no podemos asignar partes del esqueleto peptidico.
• Lo que necesitamos son mas nucleos con actividad de RMN.
De esa forma podriamos editar los espectros en base a ellos,
o agregar una tercera (y talvez cuarta) dimension.
• Para poder hacer esto necesitamos varias cosas:
- Hay que conocer el gen responsible de la sintesis de la proteina que nos interesa.
- Neceitamos a un biologo molecular que prepare un plasmido con el gen, si es posible usando E. coli como vector,
que crezca en medio minimo, de manera que cualquier
estudiante en el laboratorio pueda sobreexpresarlo.
- La proteina sobreexpresada tiene que ser funcional. El 85%
de las veces la proteina se sobreexpresa pero precipita…
- Un protocolo bueno/bonito/barato de purificacion.
Marcado isotopico (continuado)
• 10 a 1 que uno de estos requerimientos falla en la vida real.
Problemas de sobreexpresion, purificacion, y precipitacion
tienen arreglo. Conseguir el gen es mas complicado…
• Habiendo resuelto todos estos problemas, hacemos crecer
al vector con el plasmido en medio enriquecido isotopicamente. Generalmente, medio M9 (minimo), que solo tiene NH4Ac
y glucosa como fuentes de N y C. No podemos usar extractos de levadura, etc., etc.
• Si queremos proteina marcada con 15N, usamos 15NH4Ac (es
barato). La glucosa-U-13C es mas cara, pero necesaria en algunos casos cuando 15N solo no alcanza.
• Asi obtenemos proteina marcada parcial o totalmente, en
que parte (15N) o todos (13C=O, 13Cα, and 15Ns) los nucleos
del esqueleto peptidico tienen actividad de RMN.
H
15
N
O
13
13
C
AA1
C
AA2
13
15
N
H
C
H
15
13
C
O
N
O
13
13
C
C
AA3
• Ademas ahora tenemos constantes de acople 3J ‘nuevos’
que nos dan informacion sobre otros diedros, H-C-C-15N y
H-N-C-13C, cada una con sus propios paramteros de Karplus.
Marcado isotopico (…)
• Uno de los experimentos mas comunes en proteinas marcadas con 15N es una correlacion heteronuclear 1H-15N. En
vez de hacer un HETCOR, que detectaria 15N (baja sensibilidad), hacemos un HSQC o HMQC, que nos da la misma informacion pero detecta 1H.
• El experimento es barbaro, porque nos sirve para desparramar señales de la proteina en base al corrimiento quimico del
15N (que es grande):
7.0
1H
8.0
“0”
185.0
15N
δ
165.0
• Ideal para varias cosas. Una es medir velocidades de intercambio de amidas.
• Tambien es util en la identificacion de sistemas de espines:
Si no tenemos buena resolucion en el COSY/TOCSY y hay
señales solapadas, podemos usar una correlacion 1H-15N
para expandir el 2D a una tercera dimension…
δ
Espectroscopia RMN 3D
• …lo que nos trae a la espectroscopia 3D. Nada de que asustarse. Los principios de la espectroscopia 3D son los mismos
que los de la 2D.
• Lo podemos pensar de esta manera: De la misma forma que
el tiempo de evolucion t1 nos da la segunda dimension f1,
podemos agregar otro tiempo de evolucion y obtener un tercer eje de frecuencia luego de una TF (3D):
• Para un 2D teniamos:
Preparacion
Evolucion
Adquisicion
Mezcla
(t1)
(t2)
f1
f2
• En un 3D tenemos:
Preparacion
Evolucion Mezcla Evolucion Mezcla Adquisicion
(t1)
(1)
(t2)
(2)
(t3)
f1
f2
f3
• Como en los 2D, dependiendo del tipo de mezclado que usemos en cada pedazo, el tipo de datos que obtenemos…
Espectroscopia RMN 3D (continuado)
• No vamos a ir pulso por pulso detallando como funcionan,
pero si voy a describir (y escribir) algunas de las secuencias
y como las analizamos.
• Las tenemos que separar en dos categorias dependiendo
del tipo de mezclado:
• Espectros 3D de separacion: Tomamos el sistema de
espines y separamos distintos parametros (corrimientos
quimicos, acoples) en distintas dimensiones. Un ejemplo
seria una version 3D del HOMO2DJ. Eso no es tan comun en proteinas/ADN.
• Espectros 3D de transferencia: En estos tenemos un
proceso de transferencia, como ser acoples-J o NOE,
para pasar informacion entre las distintas dimensiones.
Son una extension de los experimentos 2D que hemos
visto, y los que se usan mas comunmente.
• La manera en que los armamos es basicamente poniendo
dos experimentos 2D uno atras del otro (al menos es facil de
entender de esta manera).
• Dependiendo de esto, vamos a tener cosas como TOCSYHSQC, NOESY-HSQC, COSY-COSY, COSY-NOESY,
TOCSY-NOESY, etc., etc.
• Vamos a ver cual es la idea con un ejemplo simple, y despues como funcionan algunos de los mas comunes.
Espectroscopia RMN 3D (…)
• Digamos que podemos exitar selectivamente solo a ciertos
protones NH de la muestra (hoy vamos a ver un poco mas
sobre pulso selectivos). Solo los protones acoplados con estos protones nos darian cross-peaks:
90
90s
t1
90
tm
• Osea, hacemos esta exitacion selectiva seguida por un experimento TOCSY 2D. Nuestro 2D solo va a tener una franja
que corresponde a la amida que elejimos. Para una Leu:
NH
Hα
Hβ
Hγ
Hδ
• Si cambiamos gradualmente la frecuencia del puso selectivo
a la de otro NH veriamos el TOCSY de otros aminoacido…
Espectroscopia RMN 3D (…)
• Ahora podriamos poner todos los espectros 2D apilados y
cada plano tendria uncamente las conectividades de un
sistema de espines aislado:
Frecuencias de
NHs resueltas
Frecuencias de 1H alifaticas
• Esto seria un ‘seudo’ experimento 3D. El problema es como
hicimos la seleccion de los NH. En general, aislamos los NHs
(o lo que queramos) con un experimento 2D que los resuelva.
• Por lo que hemos visto, una correlacion 1H-15N es ideal para
esto, porque la mayoria de los cross-peaks estan bien resueltos en la dimension de 15N.
• Es mas, la forma en que adquirimos un 3D no involucra tomar un monton de 2Ds y ‘apilarlos’ para obtener el 3D, sino
que obtener datos en t1, t2, t3 y hacer una TF 3D…
Espectroscopia RMN 3D (…)
• Es mas, cross-peaks que aparecen en el cubo son debidos a
transferencia de polarizacion entre los nucleos que tenemos
en las 3 dimensiones.
• Un 3D que combine a una correlacion 15N-1H y a un TOCSY
tendria esta apariencia (hacer el dibujito me costo un triunfo):
1H
1H
15N
δ
δ
δ
• Con suerte, tenemos cada una de las lineas de cross-peaks
separadas unas de otras, empezando cada una en la correlacion 15N-1H. Los δs de 1H estan separados por los δs de 15N.
• Mirar este cubo es dificil con 200 amidas. En general solo
miramos planos a distintas frecuencias de 15N.
Espectroscopia RMN 3D (…)
• Dependiendo de la franja (plano) que consideremos, vamos
a tener espectros TOCSY correspondientes a distintos NHs:
Secuencia de pulsos TOCSY-HSQC
• El experimento que usamos en este ejemplo es uno de los
mas usados cuando hacemos espectroscopia 3D. La secuencia de pulsos es esta:
90
13C
15N
Δ
{X}
90
t2
Δ
{X}
:
90
90
t1
1H:
90
180
DIPSI
t3
• En breve, el primer pedazo es un TOCSY en 1H, donde tenemos que saturar 13C o 15N (porque lo hacemos en proteina
marcada). Aca tenemos t1 (f1), osea que tenemos un TOCSY
1H-1H en esta dimension.
• La segunda parte es un HETCOR detectado inversamente
(un HSQC), donde vamos a tener frecuencias de 1H en un
eje (f1) y de 13C or 15N en el otro (f2).
• Al final, como la deteccion en el periodo t3 es en 1H, tenemos
corrimientos quimicos y acoples espin-espin de 1H en f3.
Combinacion NOESY-HSQC
• De manera similar se puede combinar un NOESY con el
HSQC. La secuencia es esta:
90
13C
15N
Δ
{X}
90
t2
Δ
{X}
:
90
90
t1
1H:
90
180
tm
t3
• Ahora, en vez de un TOCSY en la primera parte tenemos un
NOESY. La segunda parte es identica al anterior.
• En el 3D vamos a tener una correlacion 1H-15N (o 13C) en el
plano f1-f2, y espectros NOESY en los planos f1-f3. Cada uno
de estos espectros NOESY tendran unos pocos protons. Si la
resolution es buena, cada NH tendra su prop plano f1-f3.
• De forma similar podemos combinar cualquier tipo de espectro 2D para obtener un experimento 3D. Estos dos son los
mas usados en proteinas, que son las macromoleculas para
las cuales se hace mas RMN 3D…
Espectroscopia RMN 3D (…)
• Con datos reales:
3D
Proyeccion
• Este NOESY-HSQC es de un mutante dimerico de GpA
(tomado de http://bioc.rice.edu/~mev/spectra3.html)
Pulsos selectivos
• Muchas de estas secuencias 3D se usan para determinar
sistemas de espin al principio del proceso de asignacion. La
mayoria hacen uso de algun tipo de exitacion selectiva que
actua solo en parte de los espines del peptido:
• Por ejemplo, puede ser que solo queramos ver que esta enlazado a Hαs pero no a NHs. Es mas, luego de marcar la
proteina con 15N y 13C tenemos que poder controlar la transferencia de polarizacion dentro del esqueleto peptidico.
• Para hacer todo esto necesitamos pulsos selectivos, los cuales hemos mencionado antes pero nunca descrito en detalle.
• Un puslo no selectivo es corto y rectangular, lo que le da un
ancho de banda amplio centrado en la portadora (esto ya lo
vimos en detalle…). Para mejorar la selectividad podemos
hacer el tiempo de pulso mucho mas largo, lo que nos da un
rango de frecuencias mas estrecho:
Tiempo:
Frecuencia:
ωo
ωo
Pulsos selectivos (…)
• El problema de usar pulsos selectivos rectangulares son las
bandas laterales (hay que acordarse de la TF del pulso rectangular). Por lo tanto, tendriamos exitacion de frecuencias
no deseadas.
• Lo que neceitamos es un pulso en el dominio de los tiempos
que afecte exclusivamente ciertas frecuencias. Osea, el pulso no puede tener un perfil de intensidad contra tiempo rectangular, y debe tener forma (i.e., intensidad modulada).
• Un metodo aproximado para determinar cual seria la forma
de un pulso es ver como queremos que sea la exitacion en el
dominio de frecuencias y hacer una TF inversa (TF-1) para
obtener la forma necesaria en el dominio del tiempo :
Δω
TF-1
Δt
ω
t
• Para hacerlo bien se debe hacer un analisis completo de las
ecuaciones de Bloch. Las formas de pulso mas comunes son
la gausiana y la gausiana al cuadrado. Cambiando ya sea
la forma, la potencia, o largo del pulso podemos seleccionar,
por ejemplo, a los Hα, NH, 13Cα, o 13C=O de la muestra…
Experimentos 3D con pulsos selectivos
• …lo que nos trae de vuelta al uso de pulsos selectivos en espestroscopia 3D. Ahora podemos ajustar aun mas lo que
queremos ver con nuestro 3D. En vez de, por ejemplo, exitar
todos los nucleos 13C en la molecula, podemos exitar solo los
13Cα del esqueleto peptidico. De esta forma solo tenemos
transferencia de polarizacion que involucre a estos carbonos.
• Esto es muy util porque nos permite seguir atomos a lo largo
del esqueleto peptidico de manera selectiva. Estos experimentos se nombran de acuerdo a como se transfiere la polarizacion de un nucleo a otro. Por ejemplo, el ‘HNCA’:
Experimentos 3D con pulsos selectivos (…)
• Aca estamos transfiriendo polarizacion de 1H a 15N (estamos
mejorando la señal de 15N y a su vez obteniendo una correlacion entre los dos nucleos), despues pasandola solo a los
nucleos 13Cα (usamos pulsos π / 2 y π selectivos).
• Osea, terminamos teniendo transferencia de polarizacion
de los 1Hs a los 13Cα a travez de 15N, y por lo tanto los 13Cα
quedan marcados con informacion de δs de 1H y 15N.
• Al final obtenemos un correlacion (cross-peak) a la frecuencia de 15N-1H-13Cα (una pelota en el espacio a estas coordenadas. Usando otros pulsos selectivos podemos ver otras
correlaciones. Por ejemplo, el HCA(CO)N ‘salta’ los 13C=O: