ENZIMAS CATALIZADORAS DE REAÇÕES BIOLÓGICAS

ENZIMAS
FUNCIONAIS & NUTRACÊUTICOS
ENZIMAS CATALIZADORAS
DE REAÇÕES BIOLÓGICAS
Enzimas são um grupo de substâncias
orgânicas de natureza geralmente
protéica, com atividade intra ou
extracelular, que têm funções
catalisadoras, ou seja, catalisam reações
químicas que, sem a sua presença,
aconteceriam a uma velocidade
demasiado baixa. A capacidade catalítica
das enzimas torna-as adequadas para uso
na indústria de alimentos, entre outras.
História
A descoberta das enzimas data do século XVIII, quando se iniciaram os estudos sobre digestão dos alimentos.
Em 1831, o famoso químico sueco Jöns Jacob Berzelius
(1779-1848) constatou que certas substâncias continham
uma “força catalítica” que lhes permitia acelerar determinadas reações. Dois anos mais tarde, os químicos franceses Anselme Payen (1795-1871) e Jean-François Persoz
(1805-1868) encontraram uma substância termolábil no
precipitado do álcool, extrato de malte, que convertia
amido em açúcar, primeiramente, chamada de diastase
e, mais tarde, denominada amilase. A primeira teoria
sobre enzimas foi publicada em 1835 por Berzelius. O
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ENZIMAS
químico francês Louis Pasteur (18221895) concluiu que a fermentação do
açúcar em álcool pela levedura era
catalisada por fermentos, postulando
que esses fermentos (as enzimas)
eram inseparáveis da estrutura das
células vivas do levedo e estabeleceu
o conceito de que as enzimas eram
células vivas. Na mesma época, o
químico alemão Justus von Liebig
(1803-1873) afirmou que a fermentação era provocada por substâncias
químicas. A denominação enzima
[do grego énsimo (ενζυµο), formado
de én = em e simo = fermento ou
levedura] foi dada, em 1878, pelo
fisiologista alemão Alexander Friedrich Khune.
Em 1897, outro químico alemão,
Eduard Buchner (1860-1917), que
ganharia o prêmio Nobel de Química em 1907, acabou com a controvérsia entre Liebig e Pasteur, ao
mostrar a possibilidade da fermentação na ausência de células vivas.
Descobriu que os extratos de levedo
podiam fermentar o açúcar até
álcool e provou que as enzimas envolvidas na fermentação continua­
vam funcionando, mesmo quando
removidas das células vivas.
Em 1898, Pierre Émile Duclaux
(1840-1904), diretor do Institute
Pasteur, estabeleceu a convenção
de designar as enzimas pelo nome
do substrato no qual sua ação foi
primeiramente observada, seguida
pelo sufixo - ase.
Em 1900, o químico alemão
Hermann Emil Fischer (1852-1919)
descobriu a estéreo especificidade
Justus von Liebig (1803-1873)
das enzimas. Fischer ganhou, dois
anos mais tarde, o prêmio Nobel de
Química em reconhecimento ao seu
extraordinário trabalho no campo da
síntese dos açúcares e da purina.
Os trabalhos de purificação
de enzimas começaram depois
de 1920. Em 1926, o bioquímico
James Batcheller Sumner (18871955), da Cornell University, isolou
e cristalizou a urease e demonstrou
que os cristais de urease consistiam inteiramente de proteína,
postulando que todas as enzimas
são proteínas, mas esta idéia permaneceu controversa por algum
tempo. James Sumner ganhou o
prêmio Nobel de Química, em 1946,
junto com John Howard Northrop
(1891-1987) e Wendell Meredith
Stanley (1904-1971), ambos norteamericanos e professores/pesquisadores no Rockefeller Institute for
Medical Research Princeton, NJ.
Entre 1930 e 1936, John Northrop
e seus colegas cristalizaram a pepsi­
na, a quimotripsina e a tripsina
bovinas e descobriram que essas
moléculas também eram proteínas. Era assim confirmado que os
cristais eram proteinas, ou seja, a
natureza protéica das enzimas era
definitivamente estabelecida.
O biologista e geneticista inglês
John Burdon Sanderson Haldane
(1892-1964) escreveu, em 1930,
um tratado intitulado Enzymes, o
qual continha a notável sugestão de
que as interações por ligações fracas, entre a enzima e seu substrato,
poderiam ser usadas para distorcer
a molécula do substrato e catalisar
a reação.
A cristalização de enzimas purificadas permitiu que as suas
estruturas moleculares pudessem
ser examinadas por cristalografia
de ­r aios ­X , o que aconteceu primeiro, em 1965, com a lisozima,
uma enzima que existe na saliva,
lágrimas e na clara de ovo e destrói
a parede celular das bactérias. Começaram assim a bioquímica e biologia estruturais, que se esforçam
por compreender o funcionamento
das enzimas a nível atômico.
Definição
Enzimas são proteínas, polímeros
de cadeia longa com aminoácidos
sucessivamente ligados uns aos outros através de ligações peptídicas
em uma seqüência determinada
geneticamente, que apresentam
atividade catalítica.
As enzimas são catalisadores
das reações bioquímicas, isto é,
atuam tornando possível uma
nova reação com energia de ativação menor. Isso significa que
simplesmente com a sua presença
e sem serem consumidas durante
o processo, as enzimas conseguem
acelerar os processos bioquímicos.
A eficiência das enzimas como catalisadores é medida pelo número
de transformações moleculares,
que é explicada pelo número de
moléculas de substrato que uma
enzima converte por unidade de
tempo.
FUNCIONAIS & NUTRACÊUTICOS
Jöns Jacob Berzelius (1779-1848) Louis Pasteur (1822-1895)
A descoberta
das enzimas
data do século
XVIII, quando
se iniciaram os
estudos sobre
digestão dos
alimentos.
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FUNCIONAIS & NUTRACÊUTICOS
ENZIMAS
As enzimas são sintetizadas por
células vivas e atuam em quase
todas as reações químicas do metabolismo dos organismos vivos e,
portanto, também estão presentes
nos vários alimentos, atuando na
hidrólise do material alimentício
em compostos mais simples, por
exemplo, as lipases que hidrolisam
as gorduras sem glicerol e ácidos
graxos, e as amilases que hidrolisam amido em açúcares mais
simples.
As enzimas convertem uma
substância, chamada de substrato,
em outra denominada produto, e
são extremamente específicas para
a reação que catalisam. Isso signi­
fica que, em geral, uma enzima
catalisa um e só um tipo de reação
química. Conseqüentemente, o
tipo de enzima encontrado em uma
célula determina o tipo de metabolismo que a célula efetua.
A velocidade da reação catalisada por uma enzima é aumentada
devido ao abaixamento da energia
de ativação necessária para converter o substrato no produto. O
aceleramento da reação pode ser
da ordem de milhões de vezes; por
exemplo, a enzima orotidina-5’fosfato descarboxilase diminui o
tempo da reação por ela catalisada de 78 milhões de anos para ­25
­milissegundos.
Como são catalisadoras, as
enzimas não são consumidas na
reação e não alteram seu equilíbrio
químico.
A atividade enzimática pode
depender da presença de determinadas moléculas, genericamente
chamadas cofatores. A natureza
química dos cofatores é muito
variável, podendo ser, por exemplo, um ou mais íons metálicos
(como o ferro), ou uma molécula
orgânica (como a vitamina B 12).
Estes cofatores podem participar
ou não diretamente na reação
enzimática.Os cofatores podem
ser inorgânicos (íons metálicos
e complexos ferro-enxofre) ou
compostos orgânicos (flavina ou
heme). Os cofatores orgânicos (coenzimas) são normalmente grupos
prostéticos, que estão intimamente
ligados às enzimas a que eles prestam assistência. Os cofatores que
possuem ligação forte às enzimas
são distintos de outras coenzimas,
visto que não são liberados do sítio
ativo durante a reação catalisada.
Um exemplo de enzima que contém
um cofator é a anidrase carbônica.
Estas moléculas que possuem uma
ligação estreita com as enzimas são
normalmente encontradas no sítio
ativo e estão envolvidas na reação
catalítica. Por exemplo, a flavina
e grupos heme estão muitas vezes
envolvidos em reações de oxidaçãoredução. A parte da enzima que
se liga ao cofator é denominada
apoenzima. Uma apoenzima juntamente com os seus cofatores
são denominadas holoenzimas. A
maioria dos cofatores não se ligam
por covalência a uma enzima, mas
estabelecem ligações fortes. No
entanto, os grupos prostéticos orgânicos podem ligar-se de maneira
covalente. Um exemplo disso é a
ligação da tiamina pirofosfato à
enzima piruvato desidrogenase.
Determinadas substâncias podem inibir a atividade de algumas
enzimas, diminuindo-a ou eliminando-a totalmente; são os chamados inibidores enzimáticos.
A inibição enzimática pode ser
reversível ou irreversível. Existem
dois tipos de inibição enzimática
reversível: a competitiva e a nãocompetitiva.
A inibição enzimática reversível
competitiva ocorre quando o inibidor se liga reversivelmente ao mesmo sítio de ligação do substrato. O
efeito é revertido aumentando-se a
concentração de substrato. Este tipo
de inibição depende das concentrações de substrato e de inibidor.
A inibição enzimática reversível
não-competitiva ocorre quando o
inibidor liga-se reversivelmente
à enzima em um sítio próprio de
ligação, podendo estar ligado à
mesma ao mesmo tempo em que
o substrato. Este tipo de inibição
depende apenas da concentração
do inibidor. Na inibição enzimática
irreversível, há modificação covalente e definitiva no sítio de ligação
ou no sítio catalítico da enzima.
Classificação e
estrutura
As enzimas podem ser classificadas de acordo com vários critérios.
O mais importante foi estabelecido
pela União Internacional de Bioquímica (IUB), e estabelece seis
classes.
As oxidorredutases são enzimas
que catalisam reações de transferência de elétrons, ou seja, reações
de oxiredução. São as desidrogenases e as oxidases. Se uma molécula
se reduz, tem que haver outra que
se oxide.
As transferases são enzimas que
catalisam reações de transferência
de grupamentos funcionais, como
grupos amina, fosfato, acil, car­
boxil, etc. Como exemplo, temos as
quinases e as transaminases.
As hidrolases catalisam reações
de hidrólise de ligação covalente.
Um exemplo são as peptidases.
As liases catalisam a quebra de
ligações covalentes e a remoção de
moléculas de água, amônia e gás
carbônico. As dehidratases e as descarboxilases são bons exemplos.
As isomerases catalisam reações
de interconversão entre isômeros
ópticos ou geométricos. As epimerases são exemplos.
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ENZIMAS
CLASSES DE ENZIMAS
Classe 1
Oxirredutases
Catalisam reações de oxiredução, transferindo elétrons, hidretos (H-) ou protões (H+).
Classe 2
Transferases
Transferem grupos químicos entre moléculas.
Classe 3
Hidrolases
Utilizam a água como receptor de grupos funcionais de outras moléculas.
Classe 4
Liases
Formam ou destroem ligações duplas, respectivamente, retirando ou adicionando grupos funcionais.
Classe 5
Isomerases
Transformam uma molécula em seu isômero.
Classe 6
Ligases
Formam ligações químicas por reações de condensação, consumindo energia sob a forma de ATP.
tais como especificidade de substrato, dependência da temperatura
e dependência do pH.
Especificidade
As enzimas são específicas,
isto é, hidrolisam e sintetizam um
composto em particular. Em alguns casos, sua ação está limitada
a ligações específicas dentro dos
compostos com os quais exercem
reação.
Esta especificidade é devido ao
sítio ativo, parte da enzima que a
difere da proteína, que é capaz de
se ligar a moléculas denominadas
substrato formando o complexo
enzima-substrato, como o explicado pela teoria da chave-fechadura,
demonstrada por Emil Fischer,
onde a chave, neste caso o substrato, deve-se ajustar à fechadura, no
caso a enzima, de modo que cada
enzima aja sobre um número muito
limitado de compostos.
Segundo a cinética da reação,
modelos proposto pelas pesquisadores Michaelis e Menten, a
enzima E reage com o substrato S
formando um composto intermediário conhecido como complexo
ativado instável enzima-substrato
ES, o qual se decompõe em enzima
E e o produto de reação P.
E + S ↔ ES → E + P
A quantidade de enzima exigida
no processo é pequena e não influi
na variação energética da reação.
A cinética da reação é influenciada pela concentração do substrato
e da enzima.
A velocidade da reação aumenta
com o aumento da concentração de
enzima para uma mesma concentração de substrato. Se a concentração
do substrato é baixa, temos uma
subutilização do sítio ativo da enzima e, conseqüentemente, pouco
produto é formado. Com o aumento
da concentração do substrato, a reação tende a atingir sua velocidade
máxima, isto é, produzir a máxima
quantidade de produto para uma
quantidade de enzima pré-determinada - temos assim, uma reação
saturada. A partir deste momento,
a quantidade de substrato adicionado não altera mais a velocidade
da reação.
Temperatura
A maioria das enzimas apresenta melhor desempenho em temperaturas que variam de 30°C a 70°C
e com valores de pH próximos à
neutralidade (pH ≅ 7). Em geral,
pode-se dizer que nenhuma enzima
resiste por muito tempo à temperaturas superiores a 100°C.
A velocidade das reações enzimáticas aumenta com o aumento
da temperatura de modo semelhante ao das reações químicas, isto
é, a velocidade da reação duplica
com o aumento de 10°C na temperatura da reação. Nas reações
enzimáticas, porém, a velocidade
aumenta com a temperatura, até
atingir uma velocidade máxima, a
partir da qual começa a decrescer.
Sob condições específicas, a temperatura ótima para cada reação
pode ser determinada.
O efeito da temperatura é muito complexo e pode ser devido a
várias causas. Inicialmente, com o
aumento da temperatura, a atividade molecular é aumentada, o que
FUNCIONAIS & NUTRACÊUTICOS
E, as ligases, que catalisam
reações de formação e novas moléculas a partir da ligação entre
duas já existentes, sempre à custa
de energia (ATP). Um exemplo são
as sintetases.
As enzimas, sendo proteínas
globulares de diversos tamanhos,
têm sua estrutura definida pelas
estruturas primária, secundária,
terciária e quaternária.
A estrutura primária refere-se
ao tipo de seqüência dos aminoácidos na molécula protéica.
A estrutura secundária representa a estrutura espacial,
tridimensional, que a molécula
assume. É formada pela associação
dos membros próximos da cadeia
polipeptídica e é mantida, principalmente, através de pontes de
hidrogênio. É também chamada de
estrutura helicoidal.
A estrutura terciária é a forma segundo a qual a estrutura
secundária se arranja, se dobra e
se enovela, formando estruturas
globulares rígidas. Essa estrutura é estabilizada por ligações de
diversos tipos, como pontes de
hidrogênio, hidrofóbicas, iônicas,
eletrostáticas e covalentes. Estas
últimas são representadas pelas
pontes de dissulfito ente os resíduos de cisteína.
A estrutura quaternária é a
forma como as diversas estruturas terciárias ou subunidades se
associam.
Uma enzima é uma proteína
que catalisa ou acelera uma reação biológica. Pode, portanto, ser
definida como um biocatalisador,
cuja natureza protéica determina
a presença de certas propriedades,
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amplia a formação do complexo
enzimático; no entanto, com o
aumento contínuo da temperatura,
pode ocorrer uma inativação gradativa da enzima, até a inativação
total, causada pela desnaturação
protéica pelo calor.
Em geral, as enzimas reagem
muito lentamente nas temperaturas de subcongelamento e sua
atividade aumenta com o aumento
da temperatura até atingir uma
atividade ótima em temperaturas
ao redor de 45°C, além das quais
começa a sua inativação.
TABELA I - PH ÓTIMO DE ALGUMAS ENZIMAS
Enzima
Origem
Substrato
pH ótimo
Pepsina
estômago
proteínas
2
Quimotripsina
pâncreas
proteínas
7,8
Papaína
planta tropical
proteínas
7-8
Lipase
microrganismo
azeite de oliva
5-8
α-glucosidase
microrganismo
maltose
6,6
β-amilase
malte
amido
5,2
Lipoxigenase I
soja
ácido linoléico
9,0
Lipoxigenase II
soja
ácido linoléico
6,5
pH
A ação catalítica de uma reação
enzimática é alcançada dentro
de limites muito estreitos de pH.
Cada reação tem um pH ótimo,
que para a maioria das enzimas
se situa entre 4,5 e 8,0, e no qual
a enzima apresenta sua atividade
máxima. O valor do pH ótimo varia
de acordo com as várias enzimas e
os diferentes substratos sobre os
quais atuam (veja Tabela I).
Valores baixos ou altos de pH
podem causar desnaturação protéica considerável e conseqüente
inativação enzimática. Por isso, é
muito útil saber em que faixa de
pH a enzima é mais estável, já que
o pH de máxima estabilidade nem
sempre coincide com o de máxima
atividade.
As enzimas podem ser inativadas, isto é, desnaturadas por
diversos fatores, como calor, ponto
isoelétrico, seqüestro de sais de
cálcio e agitação mecânica.
FUNCIONAIS & NUTRACÊUTICOS
Mecanismos
de ação
As enzimas atuam de diversas
formas:
- Baixando a energia de ativação, através da criação de um
ambiente no qual o estado de transição é estabilizado (por exemplo,
distorcendo a forma da molécula
do substrato) - a enzima distorce
o substrato, gastando energia, de
modo a baixar a energia do estado
de transição da reação catalisada,
resultando em uma diminuição
global da energia requerida para
completar a reação.
- Providenciando uma via alternativa, por exemplo, reagindo
com o substrato para formar um
complexo enzima-substrato, de
existência impossível sem a presença da enzima.
- Reduzindo a variação da entropia da reação ao orientar os
substratos de forma correta para
facilitar a reação. Na ausência da
enzima, as moléculas colidem em
todas as direções possíveis de forma aleatória, um processo menos
eficiente do que na presença da
enzima.
Pesquisas recentes apresentaram novos conhecimentos sobre a
ligação entre a dinâmica interna
de uma enzima e o seu mecanismo
de catálise. A dinâmica interna
de uma enzima é descrita como
o movimento de partes internas
(como aminoácidos individuais,
grupos de aminoácidos, um laço da
cadeia, uma hélice alfa, folhas beta
vizinhas ou até domínios protéicos
inteiros) destas biomoléculas, que
podem ocorrer a diversas escalas
de tempo, desde femtossegundos
a segundos. Redes de resíduos de
aminoácidos de uma estrutura
podem contribuir para a catálise
através de movimentos dinâmicos.
Os movimentos em proteínas são
importantes para diversas enzimas,
mas o tipo de reação que elas catalisam é que determina que tipos de
movimento são mais importantes:
pequenas e rápidas vibrações ou
lentas e significativas alterações
conformacionais. Estes estudos
têm conseqüências na compreensão dos efeitos alostéricos, na
produção industrial de enzimas
e no desenvolvimento de novos
fármacos.
Mecanismo geral de catálise
As enzimas aceleram a velocidade
de uma reação por diminuir a energia livre de ativação da mesma, sem
alterar a termodinâmica da reação,
ou seja, a energia dos reagentes e
produtos da reação enzimática e
de sua equivalente não enzimática
são idênticas.
Para se superar a energia de
ativação de uma reação, passase pela formação de um estado
intermediário chamado “Estado
de Transição”, sempre um composto instável e de alta energia,
representado por “Ts”, ligado com
altíssima afinidade ao sítio catalítico. Nas reações enzimáticas, este
composto de transição “Ts” não
pode ser isolado ou mesmo considerado um intermediário, uma vez
que não é liberado para o meio de
reação; sua formação ocorre no
sítio catalítico da enzima. Como a
afinidade do “Ts” ao sítio catalítico
é muito maior que a afinidade do
substrato com o mesmo, a pequena
quantidade de moléculas em “Ts”
será rapidamente convertida em
produto. Assim, todo o fator que
leva a um aumento do número
de moléculas em “Ts” aumenta a
velocidade da reação.
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ENZIMAS
Funções
biológicas
As enzimas exercem uma grande variedade de funções nos organismos vivos. São indispensáveis
para a transdução de sinais, na
regulação celular, muitas vezes
por ação de cinases e fosfatases.
Através da sua ação, podem gerar
movimento, como no caso da miosina que hidroliza ATP, gerando
contrações musculares. Também
movimentam carga através da célula, pela ação do citoesqueleto.
Algumas enzimas são ATPases (funcionam como bombas iônicas), que
se localizam na membrana celular,
estando envolvidas do processo de
transporte ativo. Algumas funçõe
s mais oxóticas são operadas por
enzimas, como é o caso da luciferase que gera luz nos pirilampos.
Os vírus podem conter enzimas
que auxiliam na infecção de células
(HIV - integrase e transcriptase
reversa) ou na libertação celular
de vírus (neuraminidase no vírus
influenza).
Uma importante função das
enzimas tem lugar no sistema digestivo dos animais. Enzimas como
as amilases e proteases quebram
grandes moléculas, como o amido
e proteínas, respectivamente, em
moléculas de menores dimensões,
de maneira que estas possam ser
absorvidas no intestino. O amido
não é absorvível no intestino, mas
as enzimas hidrolizam as cadeias de
amido em moléculas menores, tais
como a maltose e a glucose, podendo desta maneira serem absor­vidas.
Diferentes enzimas atuam sobre
diferentes tipos de alimentos. Nos
ruminantes, que possuem uma dieta herbívora, bactérias no sistema
digestivo produzem uma enzima
denominada celulase, que quebra
as paredes celulares das células
vegetais.
As enzimas podem trabalhar em
conjunto, seguindo uma ordem de
atuação específica. Desta maneira
podem formar vias metabólicas.
Nestas vias, uma enzima processa
o produto da ação de outra enzima,
como o seu substrato. Após a reação catalítica, o produto é entregue a outra enzima. Por vezes, mais
do que uma enzima pode catalisar
a mesma reação, em paralelo.
As enzimas determinam os
passos que ocorrem nessas vias
metabólicas. Sem a presença de
enzimas, o metabolismo não progride através dos mesmos passos,
nem é suficientemente rápido para
que sirva as necessidades da célula.
De fato, uma via metabólica tão
importante como a glicólise não
poderia existir sem a presença de
enzimas. A glucose, por exemplo,
pode reagir diretamente com o
ATP para dar origem a um produto
fosforilado em um ou mais carbonos. Na ausência de enzimas, este
processo é tão lento que se torna
insignificante. No entanto, se a
enzima hexocinase for adicionada,
estas reações lentas continuam a
ser efetuadas, mas a fosforilação
do carbono número 6 ocorre de maneira tão rápida que, se a mistura
for testada pouco tempo depois, a
glicose-6-fosfato é o único produto
significativo. Conseqüentemente,
pode-se dizer que a rede de vias
metabólicas existentes dentro de
cada célula depende do conjunto
de enzimas funcionais que estão
presentes.
As enzimas e a
indústria de
alimentos
A indústria alimentícia é hoje
uma das principais beneficiárias
das enzimas, que podem tornar os
alimentos mais saborosos, nutritivos, digestivos e até mais bonitos
(veja tabela II).
A enzima amilase maltogênica,
por exemplo, permite a fabricação
de pães mais macios e volumosos
com sabor e aroma mais agradáveis e que permanecem frescos por
muito mais tempo.
A enzima quimosina permite
a coagulação do leite para a produção dos mais variados tipos de
queijo, e a enzima beta-glicanase
dá um tom mais atrativo à cerveja,
deixando-a mais clara, com um
tom dourado.
Em geral, as enzimas são consideradas como auxiliares no processamento de alimentos. Embora
possam permanecer no produto
final, não exercem uma função
tecnológica neste. Portanto, não
são consideradas como aditivos
alimentares, ao contrário de
adoçantes, espessantes, antioxidantes, etc.
O interesse no uso de enzimas
para o processamento de alimentos se deve a diversos fatores, entre eles a especificidade de ação,
ação rápida e eficiente em baixas
concentrações, atividade em condições brandas de pH, temperatura e pressão, fácil controle da
reação e pequena toxicidade.
De acordo com a sua origem, as
enzimas podem ser classificadas em
enzimas microbianas, enzimas de
origem animal e enzimas de origem
vegetal. Com o desenvolvimento da
tecnologia do DNA recombinante, o
uso de células microbianas como fonte
de enzimas foi largamente implemen-
FUNCIONAIS & NUTRACÊUTICOS
São quatro os mecanismos principais através dos quais as enzimas
aceleram uma reação, aumentando
a formação de moléculas de substrato em “Ts” e incluem a catálise ácido-base, que ocorre com a
participação de aminoácidos com
cadeias laterais ionizáveis, capazes
de doar ou liberar prótons durante a
catálise; a torção de substrato, que
depende da torção do substrato induzida pela ligação do mesmo com
o sítio de ligação da enzima, alcançando o estado de transição e estimulando sua conversão em produto;
a catálise covalente, que resulta do
ataque nucleofílico ou eletrofílico
de um radical do sítio catalítico
sobre o substrato, ligando-o covalentemente à enzima e induzindo
a sua transformação em produto,
envolvendo com freqüên­cia a participação de coenzimas; e o efeito
de diminuição da entropia, onde as
enzimas ajudam no posicionamento
e na definição da estequiometria
correta da reação, facilitando os
mecanismos anteriores.
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ENZIMAS
FUNCIONAIS & NUTRACÊUTICOS
TABELA II - PRODUÇÃO DE ENZIMAS: ORIGEM E APLICAÇÃO
Enzimas
Origem
Indústria
Aplicação
Amilase
Aspergillus niger, A. oryzae,
Bacillus subtilis, Rhizophus spp,
Mucor rouxii
Panificação
Suplemento de farinha, preparação de
massa, alimentos pré-cozidos,
elaboração de xaropes.
Celulase
Aspergillus niger,Trichoderma
viride
Cerveja
Preparação de concentrados líquidos de
café, clarificação de sucos.
Dextrano-sacarose
Leuconostoc mens.
Alimentar
Dextrano para diversos usos.
Glucosioxidase
Aspergillus niger
Alimentar
Eliminação da glicose dos sólidos
do ovo.
Invertase
Sacharomyces cereviase
Alimentar
Mel artificial.
Lactase
Sacharomyces fragilis
Láctea
Hidrólise da lactose.
Lipase
Aspergillus niger, Rhizophus spp,
Mucor spp
Láctea
Sabor ao queijo.
Pectinase
Aspergillus niger, Rhizophus spp,
Penicillium
Alimentar
Clarificação de vinho e de sucos
de frutas.
Protease
Aspergillus oryzae, Bacillus subtilis
Cerveja, Panificação,
Alimentar
Impede que a cerveja se enturve ao
esfriar, abranda as carnes.
Enzimas parecidas à renina
Mucor
Alimentar
Coalhada do leite para fabricação
de queijo.
tado em escala industrial, permitindo
não só o aumento na produção de
enzimas já obtidas por outros processos, mas também a produção de
novas enzimas de interesse comercial.
Como resultado, o mercado global de
enzimas industriais saltou de US$ 300
milhões na década de 80 para a impressionante cifra de US$ 1,6 bilhões
no final da década de 90.
As principais vantagens de se utilizar células microbianas como fontes
de enzimas são a obtenção de elevadas
concentrações de enzimas através de
manipulação genética e ajuste das
condições de cultivo, fácil e rápida
triagem de microrganismos super
produtores, ciclos de fermentação
curtos, uso de meios de fermentação
de baixo custo, e diversidade de enzimas que catalisam a mesma reação,
possibilitando flexibilidade nas condições de uso.
Principais enzimas
envolvidas no
processamento de
alimentos
As principais enzimas envolvidas no processamento de ali-
mentos são as oxidoredutases e
as hidrolases. As oxidoredutases
são enzimas relacionadas com
as reações de óxido-redução em
sistemas biológicos e, portanto,
com os processos de respiração e
fermentação. Dentro desta classe
de enzimas pode-se destacar a
glucoseoxidase, catalase e lipoxigenase.
As hidrolases são enzimas de
baixa especificidade, como esterase e tioesterases, que hidrolisam um número muito grande de
ésteres e tioésteres, embora com
velocidades diferentes, e enzimas
de especificidade muito alta, como
as glicosilfosfatases (enzimas glicosílicas) e as peptidases (enzimas
proteolíticas). Pertencem também
à classe das hidrolases, as fosfatases e as pirofosfatases.
Dentro dessa classe destacam-se
as proteases, amilases (alfa e betaamilase, glucoamilase, isoamilase
ou pululanase), alfa-D -galactosidase, beta-D -galactosidase ou
lactase, invertase, enzimas pectinolíticas, celulases, hemicelulases
e dextranase. Veja as propriedades
gerais das amilases industriais na
Tabela III.
As oxidoredutases
• Glucoseoxidase
Esta enzima é produzida por diversas cepas de fungos, como Aspergillus niger e Penicillium ­notatum. A
glucoseoxidase catalisa a oxidação de
glicose a partir do consumo de oxigênio, como descrito a seguir:
glucose
β-D-glucose + O2 ↔ δ-D-glucanolactona + H2O2
oxidase
O peróxido de hidrogênio formado pode servir com agente oxidante,
mas normalmente é destruído pela
adição de catalase.
Possíveis aplicações: eliminação
de glicose na preparação de produtos à base de ovo em pó, evitando-se
assim a reação de Maillard. Usos
similares podem ser encontrados
em produtos a base de carne e/ou
batatas.
• Catalase
Esta enzima pode ser obtida a partir de microrganismos e/ou do fígado,
tem importância como enzima auxiliar
na destruição de H2O2 :
2 H2O2
↔
2 H2O + O2
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ENZIMAS
TABELA III – PROPRIEDADES GERAIS DAS AMILASES INDUSTRIAIS
Fonte
Fúngica
(A. oryzae)
Bacteriana
(B. subtilis)
Malte
Malte
Fúngica
(A. niger)
bacteriana
(E. aerogenes)
tipo de amilase
α-amilase
α-amilase
α-amilase
β-amilase
gluco amilase
pululanase
pH ótimo
4,8-5,8
5,0-7,0
4,0-5,8
5,0-5,5
4,0-4,5
5-5
pH estabilidade
5,5-8,5
4,8-8,5
4,9-9,1
4,5-8,0
3,5-5,0
5-7
T ótima
45-55°C
60-70°C
50-65°C
40-50°C
55-60°C
45-55°C
T inativação
> 60°C
> 90°C
> 70°C
> 55°C
> 70°C
> 60°C
As hidrolases
• Proteases
As proteases hidrolisam as
ligações peptídicas das proteínas
levando à formação de grupos
amina (NH2) e carboxila (COOH),
originando polipeptídeos de menor
peso molecular e/ou aminoácidos
livres.
As proteases são específicas,
ou seja, não hidrolisam moléculas
de proteína em qualquer ligação
peptídica, mas apenas em ligações
entre certos aminoácidos específicos. Se tais ligações existirem
abundantemente na proteína,
pode-se esperar uma considerável
degradação protéica. Por outro
lado, existem proteases que não são
específicas quanto à composição
dos aminoácidos e podem, portanto, hidrolisar a proteína em vários
fragmentos menores.
As proteases podem ser classificadas de acordo com a sua origem
(animal, vegetal e microbiana) e a
natureza do seu sítio catalítico.
Do ponto de vista tecnológico,
considera-se satisfatório classificar proteases em exopeptidases e
endopeptidases, sendo que as endopeptidases são as mais utilizadas
nos processamentos de alimentos,
e em alguns casos sua ação é complementada com exopeptidases.
As exopeptidases atuam nos
extremos da cadeia protéica liberando aminoácidos finais. Sua
eficácia na transformação das
características reológicas das
proteínas é limitada, devido à mudanças relativamente pequenas no
comprimento da cadeia.
As endopeptidases atuam em
vários sítios ao longo da cadeia protéica, liberando grandes fragmetos
moleculares.
As quatro maiores classes de
endopeptidases são a serina protease, cisteína protease, aspártico
protease e metaloprotease.
As serinas protease têm máximo de atividade em pH alcalino,
a cisteína protease geralmente
apresenta máxima atividade em pH
próximo do neutro, e a aspártico
protease tem uma atividade catalítica máxima a pH ácido.
As metaloproteases contêm
um metal essencial, usualmente
zinco, e têm ótima atividade em
pH próximo do neutro. Íons de
cálcio estabilizam estas enzimas,
e agentes quelantes, como EDTA,
as inibem. A Tabela IV apresenta as
proteases utilizadas na tecnologia
de alimentos.
Principais aplicações:
Biscoitaria: como possível substituinte de agentes redutores.
Panificação: a partir de farinha
dura, isto é, com alto teor de proteína de glúten.
Laticínios: hidrólise da caseína
para a fabricação de queijos, pro-
dução de queijos enzimaticamente
modificados (sabores).
Cervejaria: hidrólise da proteína
do malte (complementação e/ou
substituição do malte de cevada),
solubilização das proteínas para o
lêvedo, prevenção da turbidez da
cerveja.
Carnes e rações: amaciamento
da carne e ração.
• Alfa-amilase
A alfa-amilase é uma endoenzima que hidrolisa ligações
α-1,4-glicosídicas de moléculas
de amido, glicogênio e outros
α-1,4-glucanos, liberando, primeiramente, oligossacarídeos de
6-7 unidades de glicose e, posteriormente, açúcares redutores
(principalmente, maltose).
Esta enzima pode ser de origem
cereal, bacteriana e fúngica; sendo
que apresenta algumas características em comum, como relativa
estabilidade térmica (70°C - 15
minutos), labilidade ácida (todas
são inativadas a pH 3,6 por curto
tempo), e aumento da estabilidade
na presença de íons de cálcio.
A viscosidade de uma solução
de amido diminui rapidamente
com a hidrólise pela alfa-amilase
– liquefação do amido.
A atividade da enzima decresce
rapidamente com o menor grau de
polimerização do substrato.
O processo de catálise é acelerado quando se tem amido gelatinizado.
Principais aplicações:
Produção de xaropes de amido
e açúcares.
Panificação: complementação
da farinha; alfa-amilase fúngica
FUNCIONAIS & NUTRACÊUTICOS
• Lipoxigenase
A lipoxigenase é uma enzima encontrada em diversas plantas e também nos eritrócitos e leucócitos. Ela
catalisa a adição de uma molécula de
oxigênio à ácidos graxos insaturados
formando peróxidos.
Apresenta aplicação em produtos
de panificação, como no branquea­
mento de farinhas e melhora das
propriedades reológicas da massa
do pão (oferecendo resultados semelhantes aos obtidos pelos reforçadores de massa).
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ENZIMAS
quando combinada com amiloglucosidase assegura a quantidade
suficiente de açúcares fermentáveis para o lêvedo, auxiliando
dessa maneira na produção de
massas refrigeradas e congeladas;
alfa-amilase bacteriana ou, ainda,
uma alfa-amilase com estabilidade
térmica intermediária promove
retardamento do processso de envelhecimento dos pães e produtos
similares.
Cervejaria: substituição e/ou
complementação das enzimas do
malte, auxilia na liquefação dos
agregados.
Produção de sucos de frutas
com alto teor de amido: por exemplo, maçã, maracujá.
FUNCIONAIS & NUTRACÊUTICOS
• Beta-amilase
A beta-amilase é uma exoenzima
que catalisa a hidrólise alternada
de ligações α-1,4-glicosídicas de
polissacarídeos (como o amido),
liberando moléculas de maltose
a partir da extremidade não redutora. A ação da enzima é interrompida nas regiões com ligações
α-1,6-glicosídicas.
Uma das mais importantes propriedades das beta-amilases é a sua
relativa labilidade térmica quando
comparada à alfa-amilase.
Principal aplicação
Sacarificação do amido.
• Gluco-amilase ou exo-α-1,4D-glucosidade
É uma exoenzima que hidrolisa
ligações α-1,4-glicosídicas e também, embora mais lentamente,
ligações α-1,6-glicosídicas de moléculas de amido, liberando unidades
de β-D-glucose, uma a uma, a partir
da extremidade não redutora.
Pode ser de origem bacteriana
e/ou fúngica.
Principais aplicações:
Panificação: assegura a produção de açúcares fermentáveis em
quantidades suficientes para o
lêvedo.
Sacarificação e liquefação do amido.
• Iso-amilase ou pululanase
A pululanase hidrolisa ligações
α-1,6-D-glicosídicas de polissacarí­
deos ramificados (amilopectina,
glicogênio e pululano)
A partir da amilopectina se produz cadeias mais ou menos curtas
de amilose.
Esta enzima é produzida pelo
Aerobacter aerogenes.
Principais aplicações:
Cervejaria: produção de cervejas com baixo teor de calorias, a
partir da hidrólise de açúcares não
fermentáveis.
Hidrólise de amido.
• α-D-galacrosidade
Esta enzima hidrolisa di-, oligo-,
e polissacarídeos a partir de suas
extremidades não redutoras. Seus
preparados enzimáticos podem ser
obtidos pela Mortiella vinacea.
Principais aplicações:
Durante a refinação do açúcar
de beterraba, a α-D-galactosidase
hidrolisa a rafinose em sacarose e
galactose. Também pode ser usada
no processamento de produtos de
legumes, especialmente produtos
de soja, os quais são ricos em
galacto-oligossacarídeos. Estes
compostos causam flatulência e
distúrbios gástricos quando ingeridos e podem ser degradados por suplementos de α-D-galactosidase.
• β-D-galactosidade ou lactase
A lactase hidrolisa moléculas de
lactose formando glicose e galactose, que são dois monossacarídeos
mais doces, mais digestivos e mais
solúveis do que a lactose.
A lactase quando produzida por
fungos (Aspergillus niger) e leveduras, tem grande importância para
a indústria de laticínios.
Lactases comerciais são usadas
na indústria no desenvolvimento de
novos produtos derivados de leite.
Transformam soro de queijo em
xarope doce usado em alimentos
como um componente de baixa
fermentação, podendo servir para
reposição dos xaropes de milho
ou sacarose da cevada. Quando
adicionadas em iogurte, coalhadas
e manteiga de leite, as lactases
melhoram o sabor sem aumentar
o conteúdo calórico.
Também são usadas para reduzir a cristalização da lactose em
produtos de leite. Na fabricação de
iogurte, a adição de lactase acelera
o aumento da acidez, aumenta a
doçura, a viscosidade e a vida de
prateleira.
O tratamento enzimático promove maior firmeza e maior elasticidade no requeijão e reduz o seu
tempo de ajuste. No caso de queijos
maturados, a suplementação com
lactase envolve a redução do tempo
de maturação e consequente redução dos custos.
• Invertase
A invertase converte a sacarose
em frutose e glicose.
Principais aplicações:
Fabricação de xaropes, sobremesas e mel artificial.
Na produção industrial, a invertase é importante para a produção
de fondants, cobertura de chocolate e balas cobertas de chocolate
com o centro macio
• Enzimas pectinolíticas
As enzimas pectinolíticas, mais
freqüentemente chamadas de
pectinases, correspondem a uma
mistura de enziams que atuam
nas substâncias pécticas (polissacarídeos vegetais que mantém a
integridade da parede celular ou
lamela média).
Principais aplicações:
Misturas de pectinases fúngicas
são usadas para remover as substâncias péticas, ajudando desta
forma no processo de extração de
suco de frutas e clarificação.
• Celulase e hemicelulases
Estas enzimas são responsáveis
pela decomposição dos polissacarídeos não amido - compostos
fibrosos insolúveis, como celulose
e hemiceluloses.
As celulases fúngicas são usadas sozinhas ou em conjunto com
pecti­nase, beta-glucanase e enzimas que degradam amido na cervejaria, processamento de suco de
frutas, fermentação de alimentos,
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ENZIMAS
TABELA IV - PROTEASES UTILIZADAS NA TECNOLOGIA DE ALIMENTOS
Nome
Procedência
pH ótimo
Faixa de pH de estabilidade ótima
proteases animais
protease pancreática
a
b
pâncreas
9,0
3-5
pepsina
mucosa estomacal
2
5,5 - 6,0
quimosina
mucosa estomacal
6-7
5,5 - 6,0
4,5 - 6,5
proteases vegetais
papaína
Carica papaya
7-8
bromelina
Ananas comosus
7-8
ficina
Ficus carica
7-8
proteases bacterianas
protease alcalina
lisina
Bacillus subtilis
7 - 11
7,5 - 9,5
protease neutra
termolisina
Bacillus thermoproteolyticus
6-9
6-8
c
pronasa
Sterptom. griseus
proteases fúngicas
protease neutra
protease alcalina
Aspergillus oryzae
Aspergillus oryzae
Aspergillus oryzae
d
3,0 - 4,0
d
5,5 - 7,5
d
6,0 - 9,5
protease
Mucor pusillus
3,5 - 4,5
protease
Rhi. chinensis
5
produção de vinho e fermentação
de álcool. Também têm sido usadas
para melhorar a palatabilidade
de vegetais de baixa qualidade,
aumentar o flavor de cogumelos e
alterar a textura de alimentos.
As hemicelulases fúngicas (glucanase, pentosanase, xilanase, galactanase e manase) são as mais em
processamento de alimentos em
geral; enquanto as bacterianas são
empregadas para reduzir o nível
de glucanos na cevada, composto
indesejável no processamento da
cerveja (possibilita melhor filtração, além de complementar e/ou
substituir o malte de cevada).
Em panificação, encontra-se uma
pequena porcentagem de pentosanas nas farinhas de trigo e centeio.
As pentosanas impedem o desenvol-
d
vimento do glúten, que é de importância vital na formação da estrutura
do pão. Hidrolisando as pentosanas,
através de uma pentosanase, a massa
fica mais fácil de manusear e o pão
fica mais volumoso, com melhor
estrutura de miolo.
• Dextranase
Durante a produção de açúcar,
espécies de Leuconostoc podem
contaminar o suco de açúcar
de cana ou suco de beterraba,
resultando no aparecimento de
dextranas. Este polissacarídeo interfere na refinação do açúcar de
beterraba e reduz a eficiência da
fabricação. O aumento da viscosidade do suco contaminado é associada com o lento aquecimento, a
redução da taxa de cristalização da
5
7
7-8
3-6
3,8 - 6,5
sacarose, alta turbidez, filtração
lenta e presença de longos cristais
de açúcar. A aplicação de dextranase fúngica durante a refinação
de açúcar reduz sensivelmente
estas dificuldades.
* Este artigo foi desenvolvido
com a rica colaboração da Prozyn
Indústria e Comércio, empresa
especializada na tecnologia de
enzimas e outros ingredientes
naturais para o desenvolvimento
de soluções para a indústria
de alimentos, atuando nos
segmentos de panificação,
moinhos de trigo, melhoradores,
biscoitarias, indústrias de
massas, cervejarias, produtos
cárneos, laticínios, entre outros.
FUNCIONAIS & NUTRACÊUTICOS
protease ácida
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