teoría del envejecimiento por reducción de gradientes de ph

TEORÍA DEL ENVEJECIMIENTO POR REDUCCIÓN DE GRADIENTES DE PH.
(PROTONÓFOROS ENDÓGENOS COMO CAUSA PRIMARIA).
INTRODUCCIÓN
El tema del envejecimiento empieza a estar de moda, tratándose con
frecuencia en periódicos y revistas de gran tirada. Incluso laboratorios
farmacéuticos importantes, conocedores de la buena prensa que van a
conseguir, hacen propaganda sobre los estudios que pretenden llevar a
cabo sobre el tema.
Actualmente existen más de 300 teorías sobre el envejecimiento que
merecen haber sido publicadas, y este número aumenta día a día. La teoría
que yo expongo se basa en unos cambios que nuestras células sufren con la
edad.
No puedo asegurar que la teoría sea original, pero en los artículos que
he leído no he encontrad ningún indicio que permita pensar que sea una
idea conocida.
Las principales teorías sobre el envejecimiento han surgido de hipótesis,
y las investigaciones que les han seguido han dado siempre resultados
contradictorios (36). No hay ninguna teoría que tenga pruebas
concluyentes, y todas tienen datos en contra (49,23,58).
Sobre la acumulación de toxinas como causa del envejecimiento se ha
escrito bastante, pero no se ha experimentado exhaustivamente su
búsqueda, ni se ha dado una explicación convincente de porqué no son
eliminadas como hace el cuerpo con otros metabolitos sobrantes, ni como
actúan sobre las funciones celulares llevándolas a la pérdida de la
homeostasis original (23).
En esta teoría doy por supuesto que los efectos que provocan las
sustancias lisosomotrópicas, los protonóforos y los ionóforos monensina y
nigericina (intercambian cationes por protones (104)) se deben a la
reducción de los gradientes de pH (88), y que otros efectos son de menor
importancia (93). Me baso en que en los experimentos que han comparado
los efectos de estas sustancias, los resultados son muy similares, y que
todos ellos tienen en común su capacidad de reducir los gradientes de pH.
La teoría que propongo cumple el criterio de Strehler (1977) (49) para
considerar la causa del envejecimiento aceptable:
a) Universal
b) Intrínseca
c) Progresiva
d) Perjudicial para el individuo
e) Primaria, es decir, no se puede deber a otra causa anterior.
Voy a exponer los siguientes puntos:
a)
b)
c)
d)
Teoría.
Originalidad de la idea.
Datos experimentales que apoyan la teoría.
Algunos datos que pueden tener relación con la teoría.
e)
f)
g)
h)
Conocimientos necesarios para confirmar o rechazar la teoría.
Metodología experimental.
Utilidad de los resultados.
Bibliografía.
TEORIA
La pérdida de gradientes de pH que presento como hipótesis puede ocurrir
de diversas formas. Unas dependen de la alteración del efecto Donnan y
otras de la disminución de la actividad de las bombas de protones.
El efecto Donnan puede modificarse por:
a) Acumulación de metales impermeables a la membrana lisosomal (Fe, Cu,
Zn, Ca, Pb, Hg, etc.) (57).
b) Alteración de la concentración de grupos ácidos de las proteínas
responsables del efecto Donnan (-COOH,-SO3H y -PO3H2).
La acción de la bomba de protones puede verse afectada por:
c) Disminución de la concentración de ATP (35,58).
d) Reducción de la densidad superficial de bombas de protones activas.
e) Presencia de inhibidores de la bomba.
f) Disminución del pH citosólico, lo cual reduce toda
actividad
ATPásica.
g) Aumento de la permeabilidad general de la membrana por cambio de
composición o cualquier otra causa.
h) Acumulación de toxinas protonóforas.
Los puntos b),f) y g) se pueden explicar por la teoría de los radicales
libres. El punto a) no es intrínseco. c) y d) no pueden ser causas
primarias. El punto e) es muy difícil que se produzca, puesto que hay
diferentes bombas en cada célula, que requieren un tipo de inhibidores
específicos para cada una. Además cada ser vivo puede tener bombas con
propiedades diferentes.
Aunque parece bien probado que los radicales libres participan en la
destrucción de todos los componentes celulares, no son la única causa, y
el hecho de que se acumulen proteínas desnaturalizadas por esas otras
causas, en proporciones de incluso el 30 % en ancianos, me hace pensar
que lo que falla son los mecanismos de degradación del material
deteriorado.
La acumulación de metales se puede explicar por la previa reducción de
acidez en los lisosomas: por el mismo mecanismo que actúan las resinas de
intercambio catiónico, absorbiendo cationes a pH cercano a la neutralidad
y liberándolos a pH más ácido. Si estos metales estuvieran en forma de
cationes libres, serían excretados por el sistema de vesículas que
continuamente se desprenden de los lisosomas y de los endosomas, y que se
funden con la membrana celular, donde segregan su contenido al exterior.
Un aumento de permeabilidad de la membrana por cambio de composición o
por deterioro, aparte de no ser una causa primaria, difícilmente dará
lugar a un aumento tan grande que no pudiera ser compensado por la acción
de las bombas de protones.
Creo que sólo el punto h) puede calificarse de causa primaria que cumple
los criterios de Strehler.
Hipótesis: El envejecimiento celular de los mamíferos es causado por la
reducción de los gradientes de pH celulares a causa del aumento de
permeabilidad de las membranas a los protones, debida la acción de unas
toxinas protonóforas endógenas que se acumularían progresivamente con la
edad.
La suposición de la acumulación de toxinas protonóforas se basa en:
 La incapacidad de las células para eliminar todos los tipos de
residuos.
 En la alta probabilidad de que una molécula sea protonófora (Un
protonóforo es un ácido débil lipofílico con su carga deslocalizada por
dobles enlaces y átomos electrófilos (N, O), por lo que puede atravesar
una membrana biológica tanto en su forma protonada como en la forma
iónica (81,104)).
 En la baja concentración a la que actúan: 0,01 mM (Una molécula de
protonóforo es capaz de desacoplar completamente 5 cadenas
respiratorias de mitocondria)(81).
 En la posibilidad de que se formen un tipo de protonóforos derivados de
las bases del ADN y de los ARN, comunes a todos los seres vivos. Estas
toxinas protonóforas se pueden formar por condensación entre bases
púricas y pirimidínicas a través de sus grupos amino (82) (ver esquemas
más adelante). Serían difíciles de eliminar porque a pesar de ser
sustancias liposolubles, tendrían una cierta solubilidad en agua, con
la que mantendrían un coeficiente de partición muy favorable a la
solubilidad en lípidos (para la Valinomicina es de 400/1). Cualquier
protonóforo que llegase a la sangre sería reabsorbido por las LDL y por
los leucocitos, que por ser de nueva síntesis no estarán saturados en
origen, volviendo a descargar las toxinas en las células que asimilen
estas LDL o que degraden a los leucocitos. Las proteínas del suero
también podrían participar de este reciclaje de las toxinas, debido a
su capacidad de absorción superficial. Todo ello impediría que las
toxinas protonóforas sean eliminadas a través de la orina. Del mismo
modo, células que se dividen lentamente adsorberían los protonóforos
del plasma, pudiendo llegar a alcanzar concentraciones cercanas a las
de las células postmitóticas. Este podría ser el caso del hígado,
riñón, timo, páncreas, piel, etc.
Por último, existe la posibilidad de que estas sustancias, cuando aún se
encuentran a bajas concentraciones, actúen como moduladores de enzimas y
de receptores en las membranas celulares. Serían como un reloj de arena,
que iría señalando la edad por la concentración que progresivamente van
alcanzando, activando y desactivando funciones al alcanzar un nivel
crítico para cada enzima o receptor. De este modo regularían el
crecimiento, el desarrollo y el envejecimiento. Téngase en cuenta que
puede haber docenas de estas toxinas, cada una acumulándose a diferente
velocidad; que los receptores de superficie modulan la expresión genética
en muchos casos; y que estas "toxinas", por ser ácidos, pueden
esterificarse con colesterol, con inositol y con glicerol, por lo que
pueden quedar fijadas a las membranas. En apoyo de esta hipótesis están
los siguientes hechos:

Hay una estrecha relación entre la edad a la que una especie llega
a la madurez sexual y su longevidad (51).
 El único experimento que ha conseguido aumentar la longevidad en
animales de experimentación, (la restricción alimenticia) también
ha aumentado proporcionalmente la edad a la que se alcanza la
madurez sexual. Si la teoría es correcta, estos protonóforos se
acumularían en la grasa corporal, a la que llegarían disueltos en
los LDL. No podrían escapar de allí puesto que los lípidos salen de
estos depósitos en forma de ácidos grasos libres y no en forma de
gotitas o de LDL.
Por su estructura estas moléculas deben tener un color intenso. Sería
curioso comprobar si la grasa de animales viejos es más oscura que la de
los jóvenes.
Téngase en cuenta que la grasa puede acumular lipocromos. Estas son
sustancias de origen vegetal asimiladas con los alimentos, y son de color
amarillo.
Los gradientes de pH los encontramos en: los lisosomas, endosomas,
vacuolas autofágicas, fagosomas, vesículas revestidas, vesículas trans
del aparato de Golgi, vesículas excretoras de hormonas polipeptídicas,
vesículas de sinapsis nerviosas y por último entre el citosol y el
exterior celular.
Los lisosomas son el principal centro de degradación de material celular
y extracelular. Necesitan un pH ácido para el correcto funcionamiento de
sus hidrolasas y para poder fusionarse con otras vacuolas. (Su pH está
comprendido entre de 4,8 y 5,5).
Los endosomas transportan material a los lisosomas. La acidez es
necesaria, entre otras cosas, para la correcta disociación entre los
ligandos (LDL, Fe III, Vitamina B12, Albúmina, etc.) y los receptores
endocitados, permitiendo que sean reciclados a la membrana celular
(88,89).
Las vacuolas autofágicas y los fagosomas se unen a los lisosomas
secundarios por un mecanismo dependiente de pH ácido.
Las vesículas del aparato de Golgi encuentran su destino en los lisosomas
o la superficie celular dependiendo de su pH. Además, las células que
excretan proteínas al exterior celular necesitan un medio ácido adecuado
para la correcta actividad de peptidasas que convierten las pre-proteínas
en su forma activa. Este mecanismo de maduración ocurre con la albúmina
(89), las inmunoglobulinas, el colágeno y la fibronectina, entre muchas
otras proteínas.
Lo mismo aplica a las hormonas polipeptídicas como la insulina y la ACTH,
que sufren proteólisis (94) y acondicionamiento dentro de las vesículas
secretoras para convertirse en su forma activa (94,83). Esto se consigue
por unas peptidasas que actúan en medio ácido. (pH óptimo:5,5) (83).
Los neurotransmisores que son aminas (acetilcolina, epinefrina,
norepinefrina, dopamina, serotonina, etc.) entran dentro de las vesículas
secretoras gracias a unos transportadores de membrana que aprovechan el
gradiente de protones como fuerza motriz (103,79,77,83,84,90,92). Además
en algunos casos el último proceso biosintético se produce dentro de las
vesículas por enzimas que necesitan un medio ácido (pH: 5.3 / 5.7).
A pH extracelular de 7.4 el pH intracelular de equilibrio es 6.4 (77,95).
Esto es así por el efecto Donnan y por el potencial eléctrico negativo
del interior celular. Para poder mantener el pH a su valor fisiológico
medio de 7.1 la membrana contiene una proteína de contraporte de Na+/H+
que aprovecha el gradiente de Na+ como fuerza motriz. Paralelamente una
bomba de Na+/K+ devuelve los iones sodio al exterior. El equilibrio se
mantiene en su estado ideal gracias a que la membrana es impermeable a
los protones. Hay otros mecanismos de regulación del pH intracelular,
pero son menos activos o son específicos de actividades y órganos muy
concretos (99,95,77).
Disminuciones mínimas de pH en el citosol provocan cambios dramáticos en
toda una serie de componentes y actividades celulares (77,78,95,96,A22):
La glucólisis se reduce, las estructuras de filamentos se descomponen,
los microtúbulos quedan ensamblados (descomponen al alcalinizar), los
enzimas pierden actividad, los valores de Ca++ libre disminuyen, los de
cAMP aumentan, los músculos pierden fuerza y excitabilidad, la síntesis
de proteínas se reduce, los lisosomas se acumulan en la periferia (cerca
de la membrana) y su capacidad para fusionarse se reduce. Probablemente
También afecte a la capacidad de transcripción de los genes, al actuar
sobre la fuerza de unión de las Histonas con el ADN.
Es importante el hecho de que para dividirse las células necesitan
aumentar su pH en cerca de 0.3 unidades (87,85,86), que todavía está más
lejos del valor de equilibrio 6.4, aumentado la efectividad de los
protonóforos. Esta alcalinización es indispensable para la replicación
del ADN (86).
Efectos de los protonóforos:
Reducen la acidez interna de los lisosomas (18,37 pág.529) y de cualquier
vacuola que tenga un gradiente de pH diferente del que corresponde al
efecto Donnan (81).
Causan despilfarro de energía al cortocircuitar la bomba de protones (H+
ATPasa) (16,37 pág. 529) y cualquier otro medio de bombeo de protones con
consumo de ATP.
La reducción de acidez en los lisosomas disminuye la actividad
hidrolítica de la mayoría de sus enzimas (5,15,26), por tanto, la
renovación de las proteínas, de las membranas y de los orgánulos se verá
reducida (9,16,26). También saldrá perjudicada la renovación del material
extracelular (75) y de los huesos.
Pueden reducir la presentación de antígenos (93).
Por su efecto en el aparato de Golgi, el procesamiento y la distribución
de proteínas a sus diferentes destinos celulares se vera afectada: por
ejemplo los enzimas lisosomales, los receptores de la superficie de la
membrana y las proteínas de transporte (bombas de Na+,K+,H+;
transportadores de aminoácidos; transportadores glucosa; etc )
(89,93,100,101). Además, enzimas dirigidos a los lisosomas serán
desviados al exterior celular (93,100,101), donde pueden crear problemas
de artrosis y de autoinmunidad.
El reciclado de receptores de la membrana celular por los endosomas se
reducirá, disminuyendo su concentración. Esto dejara a las células con
menor sensibilidad a los estímulos hormonales y con menor capacidad para
captar metabolitos del exterior como las LDL (88,101), hierro, etc;
creando problemas como aumento de colesterol.
Hormonas de gran importancia verán perturbada su procesamiento final así
como su secreción (91). Sobre todo se reducirá la capacidad de respuesta
de las glándulas a un aumento de la demanda (insulina, ACTH, etc.).
(83,93)
Disminuirá la secreción de proteínas como la albúmina y las globulinas.
(89,100)
La concentración de neurotransmisores que se alcanza dentro de una
vesícula de almacenamiento es dependiente de su gradiente de protones
(77,79, 83, 84, 90, 92, 103).(Por ejemplo, el FCCP 4 uM reduce la
concentración de acetilcolina intravesicular a un 23 % de su valor normal
(83)). A cada impulso nervioso le seguirá una descarga de neurotransmisor
en la sinapsis inferior a lo normal. En consecuencia el sistema nervioso,
los sentidos, la estimulación simpática y parasimpática, y la actividad
muscular se verán afectados.
Los protonóforos reducen el pH citoplasmático (96). Con un cambio de pH
de 0.1 unidades, un enzima pasa de la máxima actividad a ser
completamente inactivo (78). Este es un caso extremo, pero lo que es
seguro es que los enzimas son muy sensibles a pequeños cambios de pH, de
ahí se deduce que los protonóforos pueden afectar gravemente la actividad
metabólica celular.
Ejemplos: en extractos de huevos de L. Pictus la síntesis proteica es
entre 10 y 20 veces más elevada a pH 7.4 que a pH 6.9; el estado de
latencia de diversos organismos se consigue por la reducción del pH en
aproximadamente una unidad (78); la glucólisis se reduce tanto con el pH
que llega a desaparecer a pH 6.1 (77); al disminuir el pH citoplasmático
la permeabilidad al Na+ y K+ se reduce abruptamente en neuronas (y
posiblemente en el retículo sarcoplasmático muscular, pues comparten la
misma Na+/K+ ATPasa y los mismos canales de Na+ y de K+), y a la vez que
aumenta la permeabilidad al Cl- (77); al reducir el pH de 7.2 a 6.5 ya no
se producen potenciales de acción de Ca++; el crecimiento de células de
mamífero en cultivo es máximo a pH citosólico comprendido entre 8.0 y 8.3
(86); la energía que se puede obtener del ATP se reduce con el pH; etc.
Las células con capacidad para dividirse, pero que normalmente no lo
hacen, como los hepatocitos, perderán poco a poco esta facultad debido a
que no podrán conseguir el pH alcalino necesario para iniciar la
replicación del ADN (78). En cambio las células que sufren mitosis con
regularidad conservarán su potencial intrínseco de duplicación
(fibroblastos, células endoteliales, enterocitos, células sanguíneas),
pues al dividirse diluyen la toxina protonófora. Digo intrínseco porque
la mitosis necesita del estímulo previo de hormonas que se encuentran
en el suero, como los factores de crecimiento y la insulina, las cuales
son polipéptidos procesados y secretados por vesículas dependientes de un
medio ácido, por tanto sensibles a la afectividad de los protonóforos.
La entrada masiva de protones al citoplasma por la acción de los
protonóforos, implica un incremento de concentración citosólico de Na+ y
de K+ debido a la respuesta del cotransportador de Na+/H+ y de la bomba de
Na+/K+. Estos aumentos de Na+ y de K+ probablemente tengan efectos
negativos en la actividad celular, que se sumarán a los causados por el
aumento de concentración de H+. Por ejemplo se sabe que el aumento de la
concentración de Na+ intracelular inhibe el intercambio de Na+ por
protones,(seguramente como mecanismo de protección que impide un excesivo
aumento de Na+ (99) ) situando el umbral de activación de la proteína
intercambiadora a valores de pH más ácidos (97,98). Hay otros mecanismos
de regulación del pH que son menos activos o que no se encuentran más que
en células muy especializadas (99,95,77). El sistema Cl-/HCO3-, si no va
asociado a la entrada de Na+, sólo puede transportar protones de fuera a
dentro (95), por lo que no puede sustituir al sistema Na+/H+. Es posible
que el potencial electroquímico intermembrana disminuya por la entrada
neta de cationes, en consecuencia el umbral de estímulo muscular y
neuronal se reducirá, así como la velocidad de despolarización y
repolarización de las neuronas y retículo sarcoplasmático.
Podría pensarse que el aumento de concentración de K+ y de Na+ citosólicos
podría provocar la entrada de agua para compensar el aumento de presión
osmótica. No es así, puesto que otro efecto de los protonóforos es
reducir la velocidad de recambio proteico, por lo que se acumulan
proteínas entrecruzadas (42) y oxidadas (mayor número de grupos carboxilo
por gramo de proteína (65)) disminuyendo la osmolalidad y aumentando el
número de cargas negativas que neutralizan a los cationes. Además el
aumento de grupos carboxilo acidificará el citosol por efecto Donnan. Los
siguientes datos del artículo de Zs. Nagy,I.(42) confirman lo dicho: en
neuronas de ratón hay un 50% de pérdida de permeabilidad para K+; 30-40%
incremento de contenido de K+; el contenido de agua se reduce del 80% al
70-73% y la presión osmótica coloidal se reduce de 810 a 596 mm Hg. Para
el hígado se obtienen resultados parecidos.
Casi todos los trastornos que pueden provocar los protonóforos se
observan en la vejez. En otro apartado expondré algunos ejemplos.
Un efecto inducido por la inhibición de los lisosomas es el aumento de
la actividad proteolítica del sistema enzimático citosólico dependiente
de la ubiquitina, cuyos sustratos preferentes son los enzimas de rápida
renovación (y también las proteínas oxidadas), que por otra parte son los
enzimas clave que regulan el metabolismo celular. A consecuencia de ello
la concentración de estos enzimas disminuirá, afectando las principales
funciones del metabolismo celular (1,16,43). Por otra parte se ha
comprobado que los lisosomas no sólo se encargan de la degradación de las
proteínas de larga vida media, sino también de algunas de muy corta vida
(A2).
Al reducirse la velocidad de renovador de la mayor parte de los
componentes celulares, tienen más probabilidades de verse modificados por
cualquiera de los mecanismos de degradación que existen y por tanto, de
quedar inutilizados (1,47,A7,66,67). Parece que eso es lo que ocurre en
las células viejas (12,58,66,67).
Se sabe que las proteínas y metabolitos ejercen una acción activadora o
inhibitoria sobre la expresión de ciertos genes (1), lo cual pienso que
puede confundirse con un programa ordenado desde el núcleo.
Se ha demostrado que al envejecer la concentración de ATP disminuye
(35,58). Esto repercute en todos los procesos celulares ATP dependientes
incluida la degradación proteica (4). Esta falta de ATP no se debe al
envejecimiento de las mitocondrias, sino a la falta de ciertos
metabolitos de procedencia citosólica. La causa de esta falta de
metabolitos puede ser la disminución en la actividad de ciertos enzimas
clave (33,A20,66), probablemente porque son degradadas demasiado
rápidamente por las hidrolasas citosólicas ubiquitina-dependientes, o
porque su actividad se encuentra reducida por el envejecimiento (66) o
por aumento de acidez del citosol.
Los protonóforos no afectarán a las mitocondrias por varias razones:
 Por la composición de su membrana los protonóforos son 10 veces menos
efectivos en reducir el gradiente de pH de las mitocondrias que por
ejemplo, el gradiente de una vesícula presináptica (79).
 El gradiente de pH está establecido entre niveles más altos de pH
(7.1 el citosol y 7.6 la mitocondria) (77) lo que repercute en el
grado de ionización y saturación del protonóforo (81) disminuyendo su
efectividad (83 fig.8).
 Por último, la membrana mitocondrial es la única membrana en toda la
célula que no está en contacto con las demás, (físicamente o por
medio de intercambio de vesículas) pues sus componentes le llegan por
difusión libre o por proteínas de transporte, de modo que una toxina
poco soluble en agua sólo podría llegar a concentrarse en ellas en un
tiempo muy largo, y esto no es posible, puesto que las mitocondrias
se renuevan con rapidez.
Se conoce un conjunto de enzimas llamados sistema MOS, cuya misión es
marcar a determinadas proteínas oxidando ciertos restos de aminoácidos
para que sean reconocidas por los sistemas de degradación (12,65). Además
hay otros mecanismos de desnaturalización que ocurren espontáneamente y
que afectan a cada proteína según su susceptibilidad y que dan cuenta de
un tanto por ciento muy elevado de los defectos proteicos encontrados con
la vejez: desaminación, oxidación, glicosilación, racemización y sobre
todo cambios de conformación espacial (58,66,67,68). Por tanto no hace
falta recurrir a la teoría de los radicales libres para explicar por qué
aparecen tantas proteínas inactivas y oxidadas con la vejez celular (47,
58, 1). Otra consecuencia de la reducción de actividad lisosómica, y que
también se observa en la vejez, es el aumento de la concentración de
proteína total en el citosol (16,42,47), lo cual por si sólo ya reduce en
gran medida la actividad de los enzimas catalíticos (42).
Los materiales defectuosos indigeribles acumulados dentro de los
lisosomas se van oxidando lentamente dando lugar a la lipofuscina (39).
Los teóricos piensan que la muerte es un hecho imprescindible para que
exista evolución, y por tanto para la supervivencia de la especie (51)
(23).
La evolución selecciona a los individuos que llegan en plenas facultades
a la edad de reproducción. A partir de este punto lo que suceda afecta
poco a la evolución (52). Se piensa que los animales gregarios como los
primates, que viven muchos años después de la reproducción, han
evolucionado así para poder defender a la progenie de los depredadores y
de la competencia externa por el alimento (51).
La acumulación de toxinas debe ser un hecho lento, que no afecta las
capacidades del individuo hasta pasada la edad de reproducción. De no ser
así el organismo habría desarrollado los mecanismos detoxificadores
apropiados (según se deduce de la lectura de (52)). Esta idea está
apoyada por el hecho de que la lipofuscina empieza a acumularse a partir
de la madurez sexual en los mamíferos.(A19)
Las toxinas protonóforas no sólo se pueden formar a partir de Adenina,
Guanina y Citosina. Se conocen al menos 40 bases minoritarias, producidas
por alquilación, sulfuración y por hidroxilación de las 4 bases
mayoritarias, y que forman parte de los tARN del citosol y de las
mitocondrias (37 pág. 318). Todos estos tARN acaban en los lisosomas
(58), donde son hidrolizados liberando los nucleósidos correspondientes.
Combinando las bases minoritarias calculo que se pueden formar unas 900
toxinas diferentes, muchas con estructura de protonóforos.
Otro aspecto de las bases minoritarias es que si llegan al citosol,
tanto ellas como sus productos de oxidación podrían ser incluidas en el
ADN y causar problemas de mutaciones y/o de activación/inhibición
genética.
No siempre es beneficioso metabolizar rápidamente una toxina. Se ha
estudiado el ejemplo del citocromo P448 que hidroxila en dos posiciones a
ciertas moléculas aromáticas policíclicas. Los productos de oxidación son
altamente mutagénicos y se ha comprobado que la concentración del P448 es
menor en los animales más longevos, siendo inexistente en fibroblastos
humanos (21).
No es de extrañar que a la célula le puede ser más beneficioso almacenar
algunos residuos en las membranas que dejarlos llegar al citosol. A este
respecto es interesante que los hongos tienen un enzima lisosomal capaz
de romper el enlace iminopropeno de la lipofuscina (71, pág.90). ¿Por qué
no lo tienen los demás organismos?
En resumen, estas toxinas habrán llegado a acumularse por tres razones:
 Porque actúan a muy baja concentración (0.01 uM).
 Porque no alcanzan una concentración perniciosa hasta bastante
después de acabada la edad de reproducción, cuando los mecanismos
de selección natural ya no actúan para desarrollar las correcciones
adecuadas.
 Porque pueden tener un rol importante en el control cronológico del
desarrollo y crecimiento.
 Porque para eliminar las toxinas más rápidamente de lo que se forman
habría que aumentar su solubilidad por hidroxilación y conjugación.
Esto haría que sus concentraciones en el citosol fueran
peligrosamente altas, pues pueden tener efectos mutagénicos por ser
compuestos derivados de bases del ADN y ARN.
Aunque no existan estos hipotéticos protonóforos, es muy posible que sí
se produzcan las reducciones de gradientes de pH, por todo lo dicho con
anterioridad y porque prácticamente cualquier parámetro que se ha
comparado entre células viejas y jóvenes varía con la edad (58).
ORIGINALIDAD DE LA IDEA
Ya en 1904 Metchnikoff propuso que el envejecimiento era causado por la
acumulación de toxinas originadas en el intestino por determinada flora.
Propuso como solución tomar mucho yogurt, cuyas bacterias lactófilas
desplazarían a las bacterias perjudiciales (23).
En 1914 Ribbert y Mullman (48) consideraron que con el tiempo, productos
del metabolismo normal se podrían acumular en y entre los espacios
celulares, y producir degeneración senil y atrofia. Indicaron que los
órganos más sensibles Serían el cerebro y el corazón. Pero debido a la
falta de conocimientos de la época, sólo tuvieron en cuenta la
lipofuscina.
En 1956 Korenchevsky (48) anunció su teoría de envejecimiento por
acumulación de productos normales del metabolismo celular y de la
putrefacción intestinal. Se basaba en experimentos de sobredosis de
metabolitos normales (aminoácidos, ATP, Adenosina, Guanosina y sus metil
y dimetil derivados, histamina, colina, acetilcolina, glutation, indol y
escatol) en los que comprobó que producían efectos fisiológicos
perjudiciales. Luego extrapoló y propuso que a dosis normales estos
metabolitos tendrían efectos nocivos por el largo tiempo que han estado
en contacto con las células (desde el nacimiento hasta la muerte). Yo
supongo que en 1956 no se sabía que todos los metabolitos en exceso son
perjudiciales: el agua, las sales, la glucosa, colesterol, amoníaco,
urea, ácido úrico, oxígeno, vitaminas, etc.
En 1974 Sheldrake (8) publicó su teoría de envejecimiento causada por
intoxicación por sustancias producidas en la propia célula. Sheldrake
propone que se pueden producir por efecto de los radicales libres sobre
las membranas celulares y que se acumularían tanto en el citosol como en
las membranas, y da una serie de razones bien fundamentadas que apoyan su
teoría.
Reiss y Rothstein (1974) proponen que el envejecimiento se podría deber
a una acumulación de proteínas de conformación defectuosa a causa de la
reducción de su "turnover" (66).
Fred Dice publica en 1989 un artículo (1) en el que propone que la causa
de que las células pierdan progresivamente la capacidad de dividirse
sería por la probada reducción del ritmo de degradación de las proteínas
en los lisosomas. Según el autor los lisosomas no pierden capacidad de
digestión, puesto que parece haber demostrado que la velocidad de
degradación de proteínas endocitadas no disminuye con la edad (54). Lo
que si demuestra que disminuye es la capacidad de internalización de
proteínas en los lisosomas. Concretamente estudia un mecanismo de
transporte individual facilitado por una proteína, que en la senescencia
prácticamente desaparece. Pero el autor parece no tener en cuenta que
este mecanismo de internalización proteica es bastante raro, en el
sentido de que sólo existe en los órganos menos importantes para el
mantenimiento de la vida, (músculos esqueléticos, fibroblastos, piel,
hígado y poco más ), sólo afecta a un 30 % de las proteínas citosólicas,
cuando los lisosomas se encargan del 70-80 % de la proteólisis total
(A15,A16,A17), y sobretodo, solamente se activa cuando la célula se ve
sometida a ayuno prolongado, lo cual no es un caso frecuente ni general
en la vida. Tampoco parece tener en cuenta lo que se conoce sobre la
anatomía de los lisosomas al envejecer, ni que los fibroblastos son
células que en la práctica no llegan a envejecer en el cuerpo humano,
pues no les da tiempo (53). Por otra parte hay dudas razonables sobre si
la senescencia de los fibroblastos son un modelo aceptable de
envejecimiento celular. La causa primaria del hecho explicado por Dice
habría que buscarla en modificaciones de la expresión genética que
afectarían la funcionalidad de los lisosomas.
En un artículo de Agosto de 1990 Medvedev clasifica la mayora de las
teorías publicadas sobre el envejecimiento, que son más de 300 y entre
ellas sólo las antes anunciadas tienen que ver con la mía (23).
En un artículo sobre lisosomas y envejecimiento publicado en 1984 no se
relaciona la reducción de la capacidad lisosómica con la acumulación de
toxinas ni reducción de su acidez (27). Cabe decir que el autor de la
revisión dice que la actividad lisosómica aumenta con la vejez celular.
Con un dato tan equivocado es difícil pensar en los lisosomas como causa
del envejecimiento.
De Duve (7) considera que los lisosomas pueden ser la causa de la muerte
celular por rotura de su membrana y posterior lisis por los enzimas
liberados. Considera que el proceso desencadenante puede ser una orden
genética o la acumulación de metales pesados. Todos los experimentos al
respecto contradijeron su teoría.
Algunos autores han propuesto que la reducción de la capacidad de los
lisosomas se podría deber a la falta de enzimas lisosómicos o a la
presencia de algún inhibidor enzimático (A6,58).
En un interesante artículo Anderson y Orci proponen que el estudio en
vivo del pH de diferentes partes de los sistemas acídicos de las células,
permitiría descubrir la causa de algunas enfermedades (11).
Según todo lo visto, la teoría que yo expongo tiene de original la
propuesta que la reducción de actividad lisosómica y las perturbaciones
en las otras funciones y compartimentos acídicos, podrían ser causados
por la pérdida del gradiente de pH, debido a la presencia de protonóforos
y que ésta sería la causa primaria del envejecimiento.
DATOS EXPERIMENTALES QUE APOYAN LA TEORÍA
Ciertos autores que trabajan en la teoría de los radicales libres
subrayan que con la edad debe producirse algún deterioro en los
mecanismos de renovación intracelulares (lisosomas) para explicar por qué
los organismos jóvenes no acumulan productos de oxidación por radicales
libres (45,44). Las proteínas inactivadas por otros mecanismos también se
acumulan con la edad y se supone que la causa es un fallo en los
lisosomas (58). Parece demostrado que la sobrecarga de los lisosomas es
la causa de la acumulación de “cuerpos residuales”, que con el tiempo se
convierten en lipofuscina debido a la falta de enzimas antioxidantes y a
la acumulación de hierro dentro de los lisosomas (70).
La sobrecarga de los lisosomas viejos no se debe a un aumento del
"turnover" del material celular, pues este, por el contrario, disminuye.
Tampoco se debe a la falta de enzimas, pues en general aumentan con la
edad. La otra posibilidad que queda es la disminución de su acidez, lo
cual reduce enormemente la capacidad hidrolítica de sus enzimas.
Está comprobado que la reducción de acidez y, por tanto, de actividad
hidrolítica en los lisosomas, provoca un aumento de proteasas tanto
lisosomales (26,16) como citosólicas (16,47); mientras que la fosfatasa
ácida no varía y las demás hidrolasas aumentan o disminuyen sin ningún
orden concreto (16,47). Esto mismo es lo que se encuentra con la vejez
celular (27, A3,A4, A8, A9,A10). Creo que la diferente susceptibilidad de
las hidrolasas a la desnaturalización y degradación, en las condiciones
internas de los lisosomas viejos, tiene mucho que ver con el aumento de
actividad de una u otra enzima. También se sabe que no todos los enzimas
llegan a los lisosomas por el mismo camino. Algunas lo hacen
transportadas por vesículas que provienen del aparato de Gogi trans; y se
ha demostrado que el envío de estos enzimas se altera por la acción de
sustancias que alcalinizan los orgánulos ácidos. También se cree que los
enzimas dirigidos a los lisosomas por el grupo manosa-6-fosfato ven
perturbada su fijación a los receptores cuando el pH lisosomal aumenta.
En enfermedades de carencias de algún enzima de lisosomas se observa un
aumento de todos los demás enzimas. Probablemente haya algún mecanismo de
retroalimentación que detecta la acumulación de residuos en los lisosomas
( 7, 16).
La reducción de la acidez lisosomal mediante sustancias lisosomotrópicas
reduce la capacidad de los autofagosomas para fusionarse con los
lisosomas secundarios (20,9,17), siendo éste el principal medio de
transporte de material citosólico a su lugar de degradación(4,14). Esto
explicaría el aumento de vacuolas autofágicas en las células viejas (27,
A6), hecho que está en contradicción con la conocida reducción de la
actividad global de sus lisosomas (1,60,42,A6).
También la reducción de la acidez lisosomal provoca la acumulación de
productos residuales, los cuales, sino se restauran pronto las
condiciones ideales, se transforman en sustancias no degradables de
características muy semejantes a la lipofuscina (39), que es el pigmento
lisosómico residual característico de la vejez (27,36,39,41,47).
De momento tengo conocimiento de dos tipos de células en las que se ha
detectado un pH intralisosomal anormalmente alto. Se trata de células con
lisosomas hipertrofiados por sobrecarga (A14) y un tipo de fibroblastos
de ratón transformados malignamente por virus (A21).
En un artículo en el que parece que se usan lisosomas de células viejas
(según se desprende de la sección "Materiales y métodos"), (19)se
describe una relativamente alta permeabilidad de la membrana a los
protones, así como un pH que sólo se debe al efecto Donnan; mientras que
otros investigadores dan cuenta de la poca permeabilidad de los lisosomas
respecto de los protones y que han de añadir protonóforos al medio para
que el pH de los lisosomas quede reducido al causado por efecto Donnan
(26).
Las células pueden escapar de la senescencia si son capaces de proliferar
(27,44). Esto yo lo explicaría por el efecto dilución de toxinas que
implica el crecimiento y división celular.
Las mitocondrias se renuevan a una velocidad independiente de la edad de
la célula (60,22,30), mientras que se observa que al envejecer el número
de mitocondrias que están en proceso de degradación está aumentado (lo
deduzco de 55). Esto sólo se puede explicar considerando que la capacidad
de captación de mitocondrias por los lisosomas no cambia con la edad,
mientras que la capacidad de digestión está disminuida. Por otra parte
hay evidencias de que un camino alternativo para degradar las
mitocondrias es mediante su fusión directa con lisosomas primarios, los
cuales se cree que son diferentes a los que se fusionan con los lisosomas
secundarios (55).
Se sabe que la concentración de ATP disminuye en la vejez (58,35), y que
el proceso de digestión lisosómica es muy dependiente del nivel de ATP,
sobretodo la auto fagocitosis y en menor medida el pH intralisosomal
(4,17). La disminución de capacidad hidrolítica de los lisosomas podría
deberse a esta reducción de ATP, pero los experimentos demuestran que lo
que más se reduciría sería el número de vacuolas autofágicas (4) y por
tanto no le llegaría material a los lisosomas para ser digerido, mientras
que la observación al microscopio muestra un aumento de vacuolas
autofágicas y de material en proceso de digestión (55). Por tanto, la
falta de ATP no es lo que limita la digestión de material en los
lisosomas.
Otra cosa que tienen en común la senescencia celular y la reducción de
actividad lisosómica es que la concentración de proteínas citosólicas
aumenta mucho, hasta un 40% en las células viejas (16,42).
Hay algunas enfermedades genéticas en las que se halla ausente un sólo
enzima lisosómico y cuyas consecuencias son catastróficas: disminuciones
físicas y mentales y muerte prematura (47).
En la Progeria y el síndrome de Werner (síndromes de envejecimiento
precoz) hay una gran proporción de proteínas desnaturalizadas por falta
de renovación (58,65), aunque en estos casos se cree que la causa podría
ser la falta de Catepsina B (58), yo pienso que también se podría deber a
un defecto genético en los mecanismos de mantenimiento de gradientes de
pH (léase bombas de protones).
Parece que crecer conlleva no envejecer. No hay síntomas de
envejecimiento mientras se crece. Peces y reptiles que crecen
indefinidamente alcanzan edades extraordinarias (51). Una explicación,
como he comentado antes, sería la dilución de toxinas por crecimiento.
Las células de hígado, riñones y piel, entre otras, tienen una gran
capacidad de proliferación, pero no se dividen si no es necesario. A
medida que el órgano envejece sus células pierden esa capacidad (51). No
pueden alcanzar su potencial innato de duplicaciones. Esto se puede
explicar por las toxinas que acumulan, asimiladas del medio exterior
junto a las LDL y a complejos proteína-toxina, las cuales interferirían
en el proceso de alcalinización necesario para la replicación del ADN.
La administración de venenos, drogas y toxinas en pequeñas dosis
prolonga la vida de animales de experimentación (51). Esto puede tener
relación con la inducción de enzimas detoxificadores provocada por
substancias extrañas a la célula. Estos mismos enzimas tendrían capacidad
para eliminar toxinas endógenas.
La inhibición de proteasas sensibles a la leupeptina produce efectos
semejantes a la vejez en ratas.
La reducción en el gradiente de pH lisosomal reduce la permeabilidad de
su membrana a ciertas moléculas producidas durante la hidrólisis
intralisosomal (69). Esto explicara en parte por qué se inflan los
lisosomas con la vejez.
Es bien conocida la pérdida de capacidad mental y de los sentidos al
envejecer, que se explicaría por la reducción de la concentración de
neurotransmisores dentro de las vesículas presinápticas, situación que
puede ser causada por protonóforos.
Se sabe que la mayoría de hormonas sufren cambios de concentración al
envejecer y las que mantienen unos niveles normales son incapaces de
actuar adecuadamente frente a los aumentos de demanda (insulina, ACTH,
cortisol y adrenalina ) (102, 50 Vol.20 Pág.437).
Se ha comprobado que los receptores de membrana para el factor de
crecimiento epitelial EGF y para las LDL disminuyen mucho con la edad.
Este hecho se puede explicar por un defecto en la distribución por el
aparato de Golgi y en el gran aumento del volumen de los endosomas. Esto
se puede provocar artificialmente por disipadores de gradientes de pH
(como los ionóforos).
Es interesante el caso de la albúmina, cuya concentración en sangre
disminuye al envejecer. Su síntesis se encuentra reducida a nivel de
traducción del mRNA por un mecanismo desconocido. Los niveles
citoplasmáticos de mRNA son más altos de lo normal y su traducción se
produce adecuadamente en lisados de reticulocitos, pero no en la célula
intacta (49 Pág.78). Yo creo que el punto del bloqueo puede estar entre
el aparato de Golgi y las vesículas de secreción (89), donde se produce
la maduración de la proalbúmina y el empaquetamiento para su secreción.
Estos dos procesos finales son muy dependientes del pH. También puede
influir el pH y las concentraciones de K+ y Na+ a ambos lados del retículo
endoplasmático, que según la teoría varían al envejecer.
En neuronas de organismos viejos se encuentra una concentración de K+ que
es un 30-40% más elevada que en los mismos organismos jóvenes, a la vez
que la permeabilidad de la membrana para el mismo catión también se
reduce en un 40 % (42). En condiciones normales la permeabilidad pasiva
de la membrana de las neuronas es muy elevada para el K+, de modo que hay
equilibrio entre el interior y exterior. Pero según mi teoría, el pH del
citoplasma disminuye con la edad, y se sabe que la permeabilidad de la
membrana al K+ y al Na+ se reduce mucho al disminuir el pH citosólico (77
pág. 408). La relación es sigmoidal y con puntos de inflexión en 6.9 y
6.6 respectivamente. Por otra parte si el pH interno de las neuronas
disminuye respecto al valor ideal, el cotransporte de Na+/H+ se activa, el
influjo de Na+ se acoplar a la bomba de 3Na+/2K+ y el resultado final será
que el aumento de permeabilidad a los protones puede producir la elevada
concentración de K+ intracelular. En muchas células la permeabilidad del
H+ es 1000 veces mayor que para K+, mientras que la concentración de K+
intracelular es de 140 mM y la de H+ extracelular es de 4x10-8. De aquí se
deduce que la capacidad de flujo para un mismo gradiente es 3.500 veces
mayor para el K+ que para el H+. Esta deducción es para demostrar que en
condiciones normales el influjo pasivo de H+ no puede provocar una
acumulación intracelular de K+. Pero la situación cambia si se reduce la
permeabilidad a los K+ y a la vez se aumenta para los protones, puesto que
no se conoce ningún mecanismo que permita la fuga de un exceso de K+,
excepto la difusión pasiva, de modo que se comprueba que cuando la bomba
de Na+/K+ se activa, se acumula K+ (78 pág. 421).
Se ha comprobado que el problema principal de los músculos del corazón
al envejecer se debe al retículo sarcoplasmático que le impide secretar y
recaptar Ca++ a la velocidad normal (35). Teniendo en cuenta el efecto de
una reducción del pH sobre la permeabilidad de la membrana a los
cationes, sobre la concentración de Ca++ libre, sobre la distribución de
cationes en los diferentes espacios celulares y sobre la actividad
enzimática, no es de extrañar que haya problemas con el tráfico de Ca++ a
través de la membrana del sarcoplasma. El autor del artículo cree que el
problema tiene que ver con la Na+/K+ ATPasa.
La excitabilidad del músculo por las catecolaminas disminuye con la
edad. Por otra parte, la descarga de Ca++ por el sarcoplasma ante un mismo
estímulo es menor en organismos viejos (35).
La concentración de catecolaminas en el músculo cardíaco se reduce al
envejecer. Ello se debe tanto a la menor síntesis como a la menor
reabsorción en las terminaciones nerviosas (35).
La duración del potencial de acción es mayor en la vejez, tanto para la
despolarización como para la repolarización, lo que probablemente sea
causado por la mayor lentitud en descargar y readsorber el Ca++ (35). Hay
que tener en cuenta que la Ca++/ATPasa, que bombea protones al retículo
sarcoplasmático, puede ser muy sensible al cambio de pH del citoplasma,
tal como ocurre con la ATPasa miofibrilar (77).
Con la edad también disminuye la actividad de la ATPasa miofibrilar (35).
El envejecimiento y la hipertrofia muscular se producen de igual forma
aunque el corazón no produzca trabajo. Un corazón de ratón trasplantado
al abdomen de otro ratón, a los 24 meses presenta los mismos síntomas de
vejez que si hubiera estado bombeando sangre toda la vida (35).
Los anteriores datos no sólo son teóricos, ya que se ha comprobado el
efecto que la acidosis produce sobre las características de los músculos
(77), habiendo una asombrosa coincidencia con la vejez (35).
Por ejemplo se ha comprobado que: la máxima tensión muscular para una
determinada concentración de Ca++ disminuye al disminuir el pH; para el
corazón, una ligera disminución de pH produce insensibilización de los
miofilamentos al Ca++ y la descarga de Ca++ por el retículo
sarcoplasmático se hace más lenta; y que la actividad ATPasa miofibrilar
decrece con el pH (77).
ALGUNOS DATOS QUE TIENEN RELACION CON LA TEORIA
Según Fred Dice (1) la capacidad hidrolítica de los lisosomas no
disminuye con la edad, y se basa en las siguientes referencias: Lee(1982)
(en ninguna parte del artículo se afirma que la capacidad de los
lisosomas permanece constante con la edad); Philips and Cristofalo (1987)
en el que sólo se dice que el factor de crecimiento GFE es metabolizado
por la célula sin dificultades en la vejez (según otro trabajo de 1982).
En una publicación en colaboración con Gurley (1988) (54), Dice demuestra
que la capacidad proteolítica de los lisosomas de los fibroblastos
permanece constante con “el pasaje” (número de divisiones acumuladas por
las células), considerándose células senescentes las que llevan
efectuadas unas 50 divisiones.
En mi opinión esto no es aplicable a las células postmitóticas por dos
razones.
 En primer lugar los fibroblastos de donantes de más de 90 años
todavía tienen la capacidad de dividirse unas 30 veces sobre un
total de más de 50, por lo que sus fibroblastos aún son jóvenes
(53). Así que los síntomas de vejez hay que estudiarlos en células
postmitóticas (Martin 1970) (36).
 En segundo lugar se ha comprobado que los fibroblastos sufren un
aumento de la proteólisis celular en los últimos pasajes (A5),
exactamente lo contrario que ocurre en las células no divisibles. En
un experimento sobre la proporción de una proteína que se encuentra
desnaturalizada en relación con la edad del donante, las muestras de
fibroblastos difieren poco con la edad, mientras que para el resto
de tejidos examinados se pasa de valores de 0 % de defectos a 51.8 %
(58). Esto lo interpreto como una prueba de que los fibroblastos de
un donante joven y de uno viejo difieren poco. Además el
envejecimiento en placa de cultivo no se puede equiparar al sufrido
en vivo (53), por la sencilla razón que en vivo los fibroblastos
humanos se dividen unas 20 veces en 90 años, mientras que en
laboratorio se consuman las 50 divisiones posibles en un tiempo que
supongo (no he encontrado ninguna publicación que lo indique) que no
superará los dos años. En este sentido es remarcable el hecho de que
el nivel de oxidación de las proteínas es independiente del número
de divisiones celulares, mientras que los niveles de oxidación en
células de donantes viejos y de enfermos de Progeria son más
elevados que en jóvenes sanos (65).
Aunque hubiera estudios que demostraran que el sistema ligando/receptor
no se ve afectado con la senescencia celular, esto no descartaría un
descenso de la máxima acidez lisosomal, ya que se ha comprobado que los
ligandos no llegan a los lisosomas más ácidos, sino que se quedan en los
endosomas que tienen pH intermedios (31).
Es bien conocido el efecto de los corticoides sobre la actividad
lisosómica y que éstas hormonas tienen un ciclo circadiano con notables
oscilaciones (62 pág. 1124). Es posible que los estudios que se hacen
sobre los lisosomas y el catabolismo proteico no lo tengan en cuenta y,
por tanto, puede alterar los resultados obtenidos con cultivos celulares,
con órganos y con animales.
Cuando se hacen extractos con disolventes orgánicos de células viejas
enteras, se obtiene un par de bandas de color azul que no aparecen en los
extractos de los gránulos de lipofuscina de las mismas células (40). Ya
que son pigmentos lipófilos y no se encuentran en la lipofuscina, deben
estar disueltos en las membranas de la célula. Estas bandas no siempre
aparecen, por lo que el autor piensa que debe tratarse de metabolitos de
medicamentos tomados durante la vida del donante (40). Lo que está claro
es que las células no siempre pueden metabolizar las toxinas, pero
también podemos pensar que el autor no efectuaba las extracciones en unas
condiciones suficientemente reproducibles. Los mismos investigadores de
la lipofuscina se quejan de que los datos que aporta cada autor no son lo
coherentes que sería de esperar (71). En vista de los heterogéneos
resultados que se han obtenido en los extractos de órganos enteros, en
comparación con los extractos de gránulos de lipofuscina aislados, se
cree que algunos de los pigmentos obtenidos pueden proceder de las
membranas de los orgánulos celulares (71, pag.207). El autor trabajó con
cromatografías sobre placa (TLC). Pienso que el mismo experimento usando
HPLC daría resultados más precisos e interesantes.
Varios autores proponen que los lisosomas deben tener un rol importante
en la teoría de los radicales libres, puesto que es donde se degradan la
mayor parte de los componentes celulares antes de ser regenerados
(44,45,70). Un fallo en los lisosomas explicara porqué los individuos
jóvenes no acumulan lipofuscina a pesar de que tienen un mayor consumo
específico de oxígeno (42).
Los invertebrados que viven pocos días también pierden capacidad de
renovación de estructuras celulares (turnover). En este caso se encuentra
que la concentración de enzimas proteolíticos disminuye hasta la décima
parte en algunos casos (A12). Esto es lo contrario de lo que ocurre en
los mamíferos, donde la concentración de enzimas proteolíticos aumenta
varias veces (27,A8,A10,A3,A4), mientras que la actividad proteolítica
disminuye a la mitad aproximadamente (1). En ningún lugar he encontrado
explicación a esta paradoja.
Si los lisosomas de organismos viejos estuvieran vacíos (A6,A9,A11) se
podría pensar que hay un impedimento en la fusión lisosoma-endosoma. Si
hubiera pocos autofagosomas se pensaría en ellos como la causa de la
reducción de degradación proteica. Pero al contrario, se observa un
aumento con la edad. Por tanto, queda la posibilidad que los lisosomas
estén inhibidos.
Parece que no toda las personas tienen la misma capacidad de metabolizar
sustancias extrañas al organismo, puesto que el conjunto de citocromos
P450 vara mucho entre individuos (A18). Pero hay que considerar que lo
que yo propongo son toxinas endógenas, no exógenas.
El producto antienvejecimiento ASLAVITAL ejerce un efecto positivo sobre
la capacidad proteolítica de los lisosomas, dejándola aumentada por un
período de varios meses después de la administración del tratamiento
(A13). ASLAVITAL contiene procaína, la cual es un anestésico que posee
efecto lisosomotrópico, por lo que produce una alcalinización del
citoplasma (78) y de los lisosomas (la procaína atraviesa la membrana
celular en forma neutra, y una vez dentro se une a un protón, por lo que
alcaliniza el citosol). Como consecuencia de la alcalinización se debería
producir un aumento de la actividad celular (77), con incremento de
síntesis proteica y de ADN, entre otros (78). También se puede esperar un
aumento de la concentración general de hidrolasas lisosomales, pues es
uno de los efectos secundarios de la inhibición de la actividad de los
lisosomas.
Las citocininas son unas hormonas vegetales que promueven el crecimiento
y la división celular (50 Vol.14 pag.917). Son derivados por alquilación
de la adenina y también se encuentran como bases minoritarias en los
tRNAs de las células de diferente procedencia, incluidos los animales,
(63,37 pag.318). Se conocían más de 40 de estas bases a mediados de los
años 70 (37 pág. 318) y hoy día todavía se siguen descubriendo de nuevas
(A1). Estas bases podrían afectar la actividad de las células animales.
Apoyan esta hipótesis el hecho que la 3-metiladenina sea un potente
inhibidor de la autofagia (4) y que las metilxantinas (25) (cafeína,
teobromina y teofilina) activan la fusión de los lisosomas con las
vacuolas autofágicas.
Se han detectado en la orina productos de oxidación de bases como el
hidroximetiluracilo (38), el cual es una base minoritaria de los tRNAs
(37 pág. 318). En el ratón se encuentran en su orina de 10 a 15 veces más
bases oxidadas que en el hombre (38). Esto puede indicar que hay mucha
más oxidación de los ácidos nucleicos por radicales libres, pero también
puede que se deba al metabolismo mucho más acelerado de los tRNAs, por lo
que la acumulación y/o excreción de bases minoritarias debe ser mayor.
La investigación de la acumulación de bases minoritarias en las células
sería un buen tema de estudio, junto a la acumulación de productos de
condensación de bases normales, pero es importante tener en cuenta que la
permeabilidad de la membrana lisosomal a las bases y a sus nucleósidos es
muy elevada,(59,64) por lo que no hay posibilidad de que se acumulen como
tales en los lisosomas.
Uno de los hechos más intrigantes es el conjunto de pruebas que indican
que todos los organismos tienen asignada una cantidad de calorías a
consumir desde el momento del nacimiento y que marcan el límite de su
longevidad (36,51). El experimento más sobresaliente es el de aumentar al
doble la longevidad por la restricción del alimento (36,44).
La teoría de los radicales libres argumenta con lógica que el consumo de
calorías es paralelo al consumo de oxígeno, y que la producción de
radicales libres y otros oxidantes es proporcional a su consumo.
Otra explicación que propongo es que el consumo de oxígeno va asociado a
la oxidación de las mitocondrias y demás material celular. Cuanto más
rápido se consuma el oxígeno más rápido deberán renovarse las
mitocondrias y por tanto antes se llegan a acumular las bases que pueden
ser tóxicas o que por oxidación producen los protonóforos.
El aumento de colesterol en la sangre es progresivo con la edad. Se cree
que se debe a la reducción del número de receptores celulares para las
LDL (53). Esto se puede explicar según la teoría de los protonóforos. Si
se reduce la acidez intralisosomal, los LDL tendrán dificultades para
separarse de sus receptores, no podrían ser completamente reciclados
(88), y se acumularán en los endosomas o serán degradados
(56,15,31,32,11).
La conocida intolerancia a la glucosa por los ancianos también puede
explicarse. Se ha demostrado que la proinsulina necesita de un
procesamiento con proteasas que actúan a pH ácido dentro de las vesículas
secretoras. También la cristalización y la exocitosis se cree que
necesitan de un medio ácido adecuado para poder llevarse a cabo (74).
Además, a los receptores celulares de Insulina les puede ocurrir lo mismo
que a los receptores de LDL.
Los osteoclastos necesitan secretar ácido junto a las proteasas para
disolver el hueso. El pH que podrán conseguir en su medio externo puede
verse afectado por la presencia de protonóforos. Simultáneamente los
osteoblastos (que se encargan de regenerar el hueso) seguramente
empaquetan las proteínas a secretar en vesículas ácidas, del mismo modo
que se hace con la insulina, la fibronectina (74), la albúmina, el
colágeno, etc.
Con la edad también se pierde capacidad para secretar ácido Clorhídrico
por el estómago (50 Vol.20 pg.437)
CONOCIMIENTOS QUE SON NECESARIOS PARA CONFIRMAR LA TEORIA
Para comprobar o descartar esta teoría sólo hacen falta tres cosas. Que
al envejecer:
 Los gradientes de pH celulares se reducen.
 Las membranas aumentan su permeabilidad a los protones.
 Se acumulan toxinas protonóforas.
La metodología para medir el pH de cualquier orgánulo celular en vivo es
relativamente compleja y basada en técnicas que combinan tratamientos con
bases lisosomotrópicas, fijación, anticuerpos contra esas bases y
recuento por microscopía electrónica (11,26). Este método tiene la
ventaja de permitirnos conocer el pH de cada orgánulo individual. Esto es
positivo en el sentido de que el pH varía no sólo entre diferentes
células de un mismo organismo, sino también en una misma célula según su
estado de actividad y según el compartimento estudiado (69,11).
El método más usado y exacto hace uso de bases lisosomotrópicas marcadas
con Carbono 14,( cloroquina 1 uM o metilamina 10 uM ): lisosomas aislados
y libres de otros orgánulos se ponen en contacto con una disolución de la
base, luego se centrifuga o filtra y se compara la radiactividad de los
lisosomas con la del medio remanente. Mediante glucosa y sacarosa
marcadas isotópicamente se determina la relación volumétrica entre los
lisosomas y el medio. Con estos datos y una fórmula matemática se deduce
el pH intralisosomal. En (31) hay bibliografía sobre esta metodología.
Un método muy ingenioso, que da resultados muy exactos y que no requiere
una gran pureza en los preparados de lisosomas es el método de Ohkuma
(73). Este se basa en el uso de fluoresceína isotiocianato unida a
moléculas de dextrano (FITCdex), que penetra en los lisosomas por
endocitosis después de inyectarlo al animal de experimentación. En los
lisosomas aislados se mide la fluorescencia a determinadas longitudes de
onda y por medio de unas tablas de deduce el pH. En METODOLOGIA resumo
este método.
También propongo métodos para comprobar la permeabilidad de las membranas
lisosomales y citoplasmáticas con la edad y si ésta se debe a la
acumulación de transportadores de protones (protonóforos).
En caso de comprobar afirmativamente que los lisosomas de animales
viejos tienen un pH menso ácido que los de los jóvenes, y que existen
protonóforos, se procedería a su aislamiento y caracterización. Teniendo
en cuenta que estos protonóforos se concentrarán en los tejidos grasos,
sería fácil conseguir una cantidad suficiente de ellos para su estudio.
También se puede determinar fácilmente si el pH citoplasmático de las
células viejas es más ácido que en las células jóvenes, lo cual, según la
teoría, puede ocurrir.
El estudio de los pigmentos en células viejas es una práctica que se
lleva a cabo desde hace tiempo, pero se centra en la lipofuscina y otros
pigmentos que se encuentran en grandes cantidades, y la metodología no
está estandarizada (71).
Yo propongo el estudio sistemático de la acumulación de pigmentos
mediante la extracción de diferentes órganos (depósitos de grasa,
cerebro, hígado y corazón) con varios disolventes, su posterior
separación por cromatografía liquida, y comparación de los resultados
obtenidos con animales de diferente edad.
Al mismo tiempo se experimentaría el tratamiento de nucleosidos y bases
con diversos medios oxidantes. Los productos obtenidos se usarían como
patrones internos en las cromatografías de extractos de órganos.
Hay que tener en cuenta que los protonóforos pueden tener efecto sobre el
pH a concentraciones de sólo 0,01 uM para el inonóforo S13 a pH externo
7,4 y a 25ºC en vesículas de acetilcolina (79).
El trabajo se podría continuar con la resolución de la fórmula de las
sustancias obtenidas y la comprobación de sus efectos fisiológicos sobre
animales de experimentación y sobre células.
METODOLOGIA
En este apartado voy a exponer una idea aproximada de la experimentación
que propongo para comprobar las hipótesis de la teoría.
a) Medida del pH interno de los lisosomas
Hay varias maneras de introducir un colorante sensible al pH en el
interior de los lisosomas. Algunas son muy simples, pero tienen sus
inconvenientes (73).
Según el método de ohkuma (80,73) se inyectara FITC-dextrano comercial a
ratas (20 mg/150 gr peso corporal). A las 12-24 horas se sacrifican y se
les extrae el hígado y/o riñones, de los cuales se aislarán y
purificarán los lisosomas por gradiente de Percoll, siguiendo un
procedimiento estándar.
En este momento tenemos lisosomas cargados con un colorante cuya
fluorescencia varía con el pH.
Ponemos la suspensión en un espectrógrafo de fluorescencia, usando las
frecuencias 450 y 495 nm para excitación y 519 nm para emisión. El
cociente de los valores de excitación permite deducir el pH (usando una
gráfica), de una forma independiente de la concentración de colorante o
de cualquier otra variable.
Debido a que siempre aparece una pequeña cantidad de colorante en el
exterior de los lisosomas hay que aplicar una sencilla corrección. Para
ello sólo hay que provocar un cambio rápido de pH en el medio. El cambio
de excitación a 495 nm nos permitir calcular la fluorescencia total del
medio externo. Luego, para calcular el verdadero pH de los lisosomas,
sencillamente hay que restar la fluorescencia externa de la interna.
Para saber la contribución del efecto Donnan y de la bomba de protones
en el pH interno de los lisosomas, procederemos como sigue: primero
enfriaremos la suspensión de lisosomas a 0ºC durante 1 hora en un medio
osmóticamente parecido al citoplasma (150 mM KCl y 150 mM sacarosa). A
esta temperatura la membrana es permeable a los protones, por lo que se
establecerá un gradiente de pH debido al efecto Donnan. Seguidamente
calentaremos a 37ºC y tomaremos los datos de excitación a 495 y 450 nm. A
continuación añadiremos MgCl2 1 mM y ATP 1 mM, por lo que empezará a
actuar la bomba de protones. Registraremos el cambio de fluorescencia a
495 nm hasta que se estabilice, momento en que también mediremos la
fluorescencia a 450 nm. A continuación provocaremos el cambio de pH en el
medio externo que nos permitir corregir los datos; restituimos el pH
inicial e inhibimos la H+/ATPasa con NEM 1mM, registrando el cambio de
fluorescencia que se produce por la lenta difusión de protones.
Los lisosomas viejos son de mayor tamaño que los jóvenes, por lo que a
una misma densidad de flujo de protones a través de la membrana le
corresponderá un menor cambio de pH. También el efecto tampón puede ser
diferente. Para saber como afecta un flujo de protones determinado al pH
de los lisosomas, efectuaremos el siguiente experimento. A una suspensión
de lisosomas le añadimos una determinada concentración de protonóforo.
Dejamos un tiempo para que se equilibren el exterior con el interior.
Añadimos un tampón que cambie el pH aproximadamente en una unidad y con
el espectrógrafo medimos el tiempo que tarda en llegar a un nuevo
equilibrio. Este tiempo será directamente proporcional al tamaño de los
lisosomas y a su capacidad tampón, puesto que la densidad de flujo será
siempre la misma, pues trabajaremos con una concentración de protonóforo
y un gradiente inicial de pH iguales en cada experimento.
Efectuaremos los experimentos con animales jóvenes y con viejos.
Con los datos obtenidos podremos comparar la contribución del efecto
Donnan y de la bomba de protones al pH intralisosomal en función de la
edad.
De las gráficas de aumento y disminución de pH por H+/ATPasa y por
difusión, rectificados con los datos del experimento con protonóforo,
podremos saber la capacidad de la bomba de protones y la permeabilidad de
la membrana en relación con la edad.
b) Medida pH intracelular a diferente edad
El método más sencillo pero menos exacto de medida del pH intracelular
es midiendo con un pHmetro el homogeneizado de un órgano (77). Para ello
introducimos el órgano recién extraído en unos 100 volúmenes de agua con
hielo y lo homogeneizamos. El error de pH por dilución es despreciable a
pH cercano a 7, puesto que las células tienen un poder de tampón superior
a 25 mM por unidad de pH. Para nuestro propósito no interesan los valores
exactos, sino los valores relativos entre un órgano viejo y uno joven,
para ello supondremos que si repetimos el experimento siempre de la misma
forma los errores serán los mismos y se anularán al hacer la diferencia.
Una diferencia de pH entre órganos jóvenes y viejos, de 0.1 unidades
justificará el experimento. (Los instrumentos normales de laboratorio
miden variaciones de 0.01 unidades).
c) Permeabilidad de la membrana y presencia de protonóforos.
Experimento A:
Un órgano fresco se introduce en una solución tamponada a pH 5 durante
varias horas. Se lava y homogeneiza. Se mide el pH. El pH será
proporcional a las reacciones metabólicas que se hayan producido y a la
difusión de los protones a través de la membrana celular. Comparando los
valores obtenidos en las mismas condiciones para órganos viejos y para
jóvenes, tendremos una idea de si varía la permeabilidad de la membrana
con la edad. Yo estimo que la permeabilidad de la membrana a los protones
al envejecer debe aumentar del orden de 1000 veces para que se produzcan
efectos fisiológicos significativos, podemos pensar que el resultado
experimento no se verá influido por los errores que puedan inducir otras
variables en las propiedades fisicoquímicas de los órganos.
Experimento B:
Se disuelven membranas en un disolvente apropiado (cloroformo,
hexano,..). Se le añade Nonactina la cual interactúa poco con los
protonóforos (81). Se deposita una gota en el poro de una cámara de
medición de permeabilidad (un recipiente con un tabique de teflón que
separa dos cámaras. (El tabique tiene un poro de 1 mm2), se deja evaporar
el disolvente y se llena de solución de KCl 150 mM. El K+ con la nonactina
eliminarán los potenciales eléctricos.
Una de las cubetas se lleva a pH 9 (A) y la otra a pH 5 (B). El cambio
de pH que mediremos en A ser proporcional al flujo de protones a través
de la membrana que hemos colocado en el poro, mientras que el pH de B
será constante, ya que la concentración de protones en B es 104 veces
mayor. Al ser el pH de A tan alto, un mínimo flujo de protones a través
de la membrana provocará un notable cambio de pH.
Repitiendo el experimento y comparando la permeabilidad a los protones de
membranas de lisosomas jóvenes y viejos podremos saber si se acumulan
protonóforos con la edad.
Para confirmar la existencia de protonóforos se pueden hacer experimentos
a diferentes pHs de B, para averiguar si el transportador se satura. Esta
es la prueba para distinguir entre la difusión simple y el transporte
facilitado (37 pag.794,62 pag.51,76). El transporte facilitado obedece
las leyes de Mikaelis Menten de reacciones enzima-sustrato.
También se puede medir la conductividad eléctrica de la membrana a
diferente pH y comprobar si los datos siguen las leyes del transportador
simple. Se han hecho estudios sobre sobre el tema.
Debe tenerse en cuenta que las membranas reconstituidas a partir de
disoluciones, contienen pequeñas cantidades de disolvente que afectan
enormemente la permeabilidad provocada por protonóforos (de 10 a 100
veces) (81).
Experimento C:
Los protonóforos endógenos que propongo, por su estructura de múltiples
enlaces dobles conjugados, y por su parecido con la fluoresceína, deben
tener unas buenas cualidades para ser detectados por espectroscopia de
fluorescencia, la cual es muy apropiada por su altísima resolución (una
parte en mil millones).
La misma Adenina y Guanina poseen fluorescencia. Mucha más tendrá sus
derivados con enlaces dobles conjugados.
Como los protonóforos son ácidos débiles, su fluorescencia aumentar con
el pH y su pico máximo se desplazará al rojo. Si detectamos estos cambios
al jugar con el pH de los homogeneizados de órganos de animales jóvenes y
de viejos, tendríamos un indicio de la presencia de protonóforos antes de
efectuar los experimentos más complejos.
c) Extracción de protonóforos.
Se tratara de extraer diversos órganos de ratones viejos con disolventes
orgánicos y purificar las substancias pigmentadas, separándolas en sus
componentes. Se repetiría el experimento con animales jóvenes. Comparando
los resultados sabríamos si se acumula algún tipo de pigmento con la
edad. De ser así, se estudiarían las propiedades protonóforas de estos
pigmentos.
UTILIDAD DE LOS RESULTADOS
Si el resultado de la experimentación demuestra que los gradientes de pH
se reducen con la edad, tendríamos una explicación a muchos de los
problemas que acompañan al envejecimiento, y una vez conocidas las
causas, se pueden buscar las soluciones.
Si la causa es la presencia de protonóforos se podría:
 Probar sustancias que estimulen respuestas detoxificadoras de
citocromos P450 específicos que eliminen esos protonóforos.
 Implantar resinas para absorberlos.
Otras medidas independientes de la causa de la reducción de los
gradientes de pH podrían ser:
 Probar drogas que activen los mecanismos celulares propios de
regulación de pH. Por ejemplo el ácido Indolacético aumenta la
actividad de H+/ATPasas de la membrana celular en los vegetales.
 Sintetizar sustancias que por efecto lisosomotrópico o por efecto
Donnan produzcan variaciones en el pH de orgánulos y del
citoplasma, de tal manera que sus funciones se recuperen. Por
ejemplo, los ésteres fosfóricos traspasarían las membranas
celulares entrando en los lisosomas, donde serían hidrolizados,
liberando ácido fosfórico que aumentaría la acidez. Lo mismo se
conseguiría con anhídridos de ácidos. Para aumentar el pH
citoplasmático se podrían utilizar bases lisosomotrópicas
(procaína, cloroquina). Lo ideal sería una base con carga positiva
permanente, que se acumulara por la fuerza del potencial eléctrico
negativo del interior celular, de este modo no afectaría a los
orgánulos ácidos, los cuales por ser eléctricamente positivos
repelerán a tales bases.
Con referencia a la actividad de los lisosomas es interesante el estudio
llevado a cabo en Valencia, mediante liposomas se ha conseguido
introducir proteasas lisosomales de células de ratón en lisosomas de
células humanas en cultivo, logrando un notable incremento de la
actividad de los lisosomas (2).
Sea cual sea la causa de la reducción de gradientes de pH, se abre una
puerta al estudio de tratamientos que pueden aliviar algunos los
problemas de la vejez. Teniendo en cuenta que el pH óptimo para la
actividad metabólica es próximo a 8, cualquier aumento de pH
citoplasmático puede ser positivo para las funciones celulares. El
resultado debe ser un aumento de la energía disponible y del bien estar
general, tanto en ancianos como en jóvenes.
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Francesc Borrell Borrell
Escrito en 1991
Revisión finalizada el 05-09-12