ANAEROBIOS

ANAEROBIOS
ORIGEN Y DEFINICION
La presencia de una atmósfera terrestre rica en O2 ha
permitido que los seres vivos hayan evolucionado
desarrollando un metabolismo aeróbico, el cual se
caracteriza por ser una forma muy eficiente de obtención
de energía. A nivel bacteriano las bacterias anaerobias
precedieron largamente a las aeróbicas y sin duda
predominaron largamente en un mundo vivo que
comenzaba a desarrollarse.
Los anaerobios generalmente poseen un metabolismo
de tipo fermentativo en el cual sustancias orgánicas son
los aceptores finales de electrones. Las formas
vegetativas mueren cuando son expuestos al O2
molecular libre en la atmósfera, aunque el grado de
resistencia bajo estas condiciones es variable
(AEROTOLERANCIA); Los esporos bacterianos no son
afectados por tratarse de formas biológicas
metabólicamente inertes y con muy escasa proporción de
agua en su composición.
En consecuencia una definición simple de las
bacterias anaerobias sería: anaerobios son aquellos
gérmenes que sólo pueden desarrollarse en ausencia de
cantidades significativas de Oxígeno (O2) y bajo
condiciones de potenciales REDOX (Eh) muy reducidos.
En el mundo microbiano existen especies capaces de
alternar con sistemas metabólicos diferentes para crecer
y multiplicarse en muy diferentes condiciones de
aerobiosis, total, reducida o ausente. Son gérmenes
facultativos. Otros solamente subsisten en rangos
estrictos de gases tales como el O2 y el CO2
(microaerófilos). Los anaerobios son poseedores de
sistemas enzimáticos que solamente funcionan en
ausencia de O2 por tanto son estrictos en cuanto a sus
exigencias de Medio Ambiente.
De ahora en más el término Anaerobios se aplicará
solamente para este tipo de gérmenes.
El conocimiento de estas bacterias es poco y
relativamente reciente ya que para poder lograr
condiciones de anaerobiosis en el Laboratorio se
necesitaban, hasta los años 60, equipos costosos y
técnicas bacteriológicas muy dificultosas. A partir de la
introducción de sistemas simples para producir
anaerobiosis con equipos y reactivos de bajo costo el
conocimiento de los anaerobios se desarrolla
intensamente. Aun así, no hay un gran número de
Microbiólogos que se dediquen al Tema, la taxonomía
está en permanente revisión e infinidad de aspectos se
mantienen oscuros.
MORFOLOGIA Y TINCION
Como en casi toda la bacteriología, la morfología de
los anaerobios se basa en la tinción de Gram. Un
Rivas
problema adicional se plantea por la tendencia a tornarse
Gram negativos, sea por la poca estabilidad frente a la
decoloración (se prefiere el uso de alcohol a la mezcla
alcohol-acetona) lo que los convierte en Gram inestables
al examen directo de los materiales, sea porque existe
una variación tintorial en los cultivos bacteriológicos.
Dos aspectos a tener en cuenta en la tinción de Gram
son:
a. efectuar la decoloración solamente
con alcohol etílico prescindiendo de la acetona,
y
b. prolongar el tiempo de contacto con
Lugol hasta 1 minuto.
La morfología celular, sobre las bases del Gram,
permite distinguir formas variadas que incluyen toda la
gama: Cocos Gram positivos, cocos Gram negativos,
diplococos, estreptococos; bacilos Gram negativos,
cocobacilos, fusiformes, bacilos rectos o curvos; bacilos
Gram positivos, esporulados o no esporulados,
espiroquetas, etc.
EL METABOLISMO DE LOS ANAEROBIOS
OXIGENO SENSIBILIDAD
Los anaerobios estrictos crecen y se multiplican en
ausencia total de Oxígeno molecular (O2) logrando
obtener energía libre y sintetizar todos sus componentes
estructurales sin la ayuda del O2. Todos sabemos que la
vía anaerobia posee un menor rendimiento energético y
está sujeta a potenciales REDOX bajos (algunas enzimas
solamente operan en estas condiciones) y sin la presencia
de elementos que interfieran el flujo normal de
electrones.
Si bien el O2 es potencialmente tóxico para cualquier
forma de vida, los anaerobios son intolerantes al mismo
aunque en diferentes grados. Existe un espectro que va
desde los extremadamente intolerantes (aerointolerantes)
hasta los aerotolerantes moderados los cuales pueden
sobrevivir a la presencia de O2 durante breves períodos.
Varias son las causas de la Oxígeno toxicidad. En 1er
lugar el Oxígeno es un poderoso oxidante, es decir, un
ávido receptor de electrones, por lo tanto su presencia en
solución es incompatible con potenciales REDOX bajos.
En esta situación el flujo de electrones se ve interferido
por un receptor extraño al usual de los gérmenes
provocando shunts letales. En segundo lugar el Oxígeno
puede interactuar directamente con enzimas o cofactores
causando inactivaciones irreversibles. En tercer lugar y
aparentemente, la causa más importante de la Ox.
toxicidad se atribuye a la producción de sustancias
tóxicas derivadas de la reducción parcial de la molécula
O2. Simplificando se pueden dar las siguientes
reacciones químicas:
1
O2 + 4H + 4e- --> H2O (reducción completa)
O2 + 2H + 2e- --> H2O2 (reducción parcial)
O2 + e-
--> O2.-
antibioticoterapia empírica racional y al microbiólogo
para seleccionar los Medios de Cultivo más apropiados
al aislamiento e identificación bacterianos.
La TABLA 1 muestra el predominio de las especies
más comunes como flora normal humana según
diferentes localizaciones.
La formación de Peróxidos de Hidrógeno (H2O2)
puede ser catalizada por varias enzimas y su letalidad
para las bacterias está fehacientemente comprobada. Por
otra parte el anión Superóxido (O2.-) es altamente tóxico
por su participación en la producción de hidroxilos libres
(HO.-) agentes letales para los microorganismos.
Aquellos anaerobios aerotolerantes poseen enzimas
como Catalasas y peroxidasas que descomponen los
H2O2 en H2O + O; otros poseen Superóxido-dismutasas
(SOD) que actúan eliminando los O2.-; más aun las SOD
han sido postuladas como factores de virulencia en los
anaerobios ya que estas enzimas permitirían la sobrevida
de las bacterias en tejidos oxigenados hasta que el
consumo de Oxígeno creará el ambiente adecuado para
la multiplicación y desarrollo.
POTENCIALES REDOX
El potencial de Oxido Reducción (Eh) de una pareja
REDOX es la medida en VOLTIOS de la tendencia
espontánea a donar o recibir electrones por parte de uno
de los integrantes de la pareja (flujo de electrones). Una
pareja REDOX posee una forma reducida (dador de
electrones) y una forma oxidante (receptor de electrones)
Reductor <---> oxidante + electrones. En consecuencia
cuanto menor sea la cantidad de formas oxidantes menor
o más bajo será el potencial REDOX. La presencia de O2
en los cultivos o en el medio natural debe ser eliminada
imprescindiblemente del microclima de desarrollo (O2
atmosférico y en solución. Aún mas el descenso de los
Eh debe afirmarse con la presencia en el medio de
sustancias reductoras que superen en gran número a las
oxidantes.
FLORA NORMAL ANAEROBIA
El hombre conjuntamente con los animales
(mamíferos, aves, peces) es hospedero en sus epitelios,
mucosas y aparatos de un gran número de Especies y de
un gran número de individuos anaeróbicos. Estos son
miembros de una FLORA NORMAL beneficiosa y hasta
en algunos casos esencial para la vida. El conocimiento
de esta flora normal es importante desde varios ángulos.
Si pensamos que muchas infecciones anaeróbicas se
desarrollan en la vecindad de las superficies mucosas en
las cuales estos gérmenes predominan como flora
autóctona, el conocimiento de la misma se presenta de
gran utilidad para sospechar quienes estarían
involucrados en los procesos infecciosos. Esta
información ayuda al Clínico para establecer una
2
TABLA 1
Piel
V.R.S.(#)
0
0
Boca
Intestino
Genitales
externos
Uretra
Vagina
Bacilos Gram
(+) esporulados
Clostridia
1
3-4
0
1
1
Bacilos Gram
(+) no esporulados
0
0
1
0
3-4
2
0
1
0
2
2
2
2
2
1
1
1
3-4
2
1
0
0
d
0
d
0
0
d
1
0
0
2
1
3-4
2
Bacteroides
Fusobact.
0
0
2
2
3-4
3-4
2
2
2
2
2
2
2
1
Cocos G (+)
2
2
3-4
3-4
2
1
2
Cocos G (-)
0
2
3-4
2
0
d
2
Actinomyces
Bifidobact.
Eubacterium
Lactobac. (*)
Propionibact.
Bacilos Gram
(-) no esporulados
(#) Vías Respiratorias Superiores; incluye vías nasales, nasofaringe, orofaringe y amígdalas.
(*) Incluye anaerobios, facultativos y microaerófilos.
(d = desconocido) (0 = no encontrados o raros) (1 = hallazgo irregular) (2 = habitualmente presentes) (3-4 presentes
en gran número).
ESPOROS
Algunas especies de anaerobios (bacilos Gram
positivos del Género Clostridium) poseen la capacidad
de esporular, esto es, producir esporos. Se trata de
estructuras biológicas genéticamente iguales a su
antecesor vegetativo, metabólicamente inactivos y
altamente resistentes a condiciones medioambientales
adversas (Temperatura, humedad, radiaciones UV,
agentes químicos).
La germinación de los esporos conduce a la forma
vegetativa de la bacteria y puede suceder, en algunos
casos luego de varios años. La resistencia de los esporos
a altas temperaturas -120ºC hasta 15 minutosdesecación, falta de nutrientes, presencia de sustancias
químicas antisépticas, radiaciones. La resistencia al calor
se explica por los escasos porcentajes de H2O en su
constitución (proceso de desecación paulatino del esporo
en la maduración) y la presencia de Calcio y ácido
dipicolínico como agentes quelantes, mientras que la
resistencia a los otros agentes físico/químicos estaría
dada por lo menos en parte por la presencia de proteínas
de superficie ricas en cisteína.
Esta propiedad de esporular le confiere a las especies
que la poseen una singular resistencia frente los agentes
físicos y químicos habitualmente usados para la
desinfección y una permanencia prolongada en el medio
ambiente. Sin duda la ubicuidad y la peligrosidad de
estos gérmenes son resaltables y su permanencia en la
ecología microbiana está por demás asegurada.
El proceso de esporulación comienza durante la fase
de desarrollo estacionario luego de la falta de ciertos
nutrientes, una vez que se inicia el proceso este es
irreversible y una enorme cantidad de cambios
metabólicos comienzan dentro de la célula con la
producción y almacenamiento de enzimas y proteínas
distintas a las de la forma vegetativa, que luego formarán
parte del esporo.
El factor desencadenante está constituido por la
carencia de fuentes de Carbono y Nitrógeno,
concretamente la falta de concentraciones adecuadas de
trifosfato de guanosina (GPT) intracelulares inicia la
esporulación y se sabe que todas las deficiencias
nutricionales que conducen a una disminución del pool
3
de GPT desencadenan la esporulación. Dos tipos de
carencias son conocidas como responsables de la
disminución del GPT:
1.
Disminución del precursor purínico Pribosil-PP, que ocurre cuando hay carencias de
Carbono.
2.
La carencia de aminoácidos la cual se
relaciona con el aumento de nucleótidos fosforilados
de guanina, ppGpp y pppGpp.
La germinación de los esporos comprende 3 etapas:
a. ACTIVACIÓN:
La activación es esencial para el proceso de la
germinación y un esporo activado germina en forma
irreversible. Activan los esporos el calor y algunos
estímulos químicos.
b. GERMINACION:
Esta etapa comienza cuando los esporos activados
son estimulados por variados elementos nutritivos y no
nutritivos (l-alanina, el más común,) glucosa, otros
aminoácidos.
Cambios morfológicos y fisiológicos muy
interesantes se producen cuando finaliza el estado
latente; el esporo se hincha, pierde su refringencia,
pierde su resistencia a los agentes físico-químicos y
comienza a observarse actividad metabólica.
c. CRECIMIENTO:
En esta etapa se produce la síntesis proteica y de los
componentes estructurales de la futura forma vegetativa.
La membrana del 'core' del esporo se irá convirtiendo en
pared celular y la actividad proteica se irá intensificando.
En este momento toda esta actividad puede anularse o
interferirse por Antibióticos, o carencias de nutrientes.
Por su especial constitución los esporos no se tiñen
con el Gram aunque existen técnicas especiales que
permiten ponerlos en evidencia. Si se tiñe una bacteria
esporulando mostrará el esporo en su interior (debemos
recordar que cuando el esporo finaliza su maduración la
forma vegetativa se desintegra) como una imagen en
negativo -ausencia de colorante-.
La ubicación de los esporos dentro de los bacilos así
como su tamaño contribuyen a la identificación
bacteriana. De esta manera podemos distinguir a los
esporulados según:
Ubicación:
esporos medianos, subterminales,
terminales.
Tamaño : con deformación o no del cuerpo
bacteriano.
FACTORES DE VIRULENCIA
Se pueden separar en 2 categorías según su
importancia. Por un lado existen las poderosas toxinas
producidas por los Clostridios; por otro, una serie de
estructuras y sustancias de mucho menor poder patógeno
que se observan en varias especies de no esporulados. Se
conocen los lipopolisacáridos de superficie en varias
especies de Fusobacterium, Veillonella y Bacteroides.
Estas sustancias tienen una actividad "endotoxina"
similar a las de los bacilos Gram negativos facultativos.
Su actividad es algo menos potente pero se ha
demostrado su capacidad (en Bacteroides) de participar
en la producción de abscesos y de causar
hipercoagulabilidad. El polisacárido capsular de los
Bacteroides del grupo fragilis es otro factor de
virulencia importante, ya que se comporta en forma
similar a las Cápsulas de otras bacterias, es decir, le
confiere al germen "la lanza y el escudo" en cuanto
favorece su poder invasivo y dificulta la acción defensiva
de los leucocitos polinucleares. Aun más, está claramente
demostrada su participación en la formación de abscesos
causados por Bacteroides.
Diversas enzimas de los anaerobios deben
considerarse como factores de virulencia: colagenasa,
hialuronidasa, DNAsa, elastasa, heparinasa, son las
principales. También deben incluirse aquellas enzimas
que protegen contra la acción letal del O2 tales como
Catalasa y Superóxidodismutasa en cuanto permiten la
sobrevida del germen en ambiente no apropiado hasta
que se presenten las condiciones favorables. Estos
factores de virulencia no deben considerarse como
"toxinas".
LAS TOXINAS
Corresponde a las potentes exotoxinas producidas
por los Clostridios las cuales serán analizadas con estos
microorganismos.
GENETICA
DE
INTERES
EN
LOS
ANAEROBIOS
Elementos extra cromosómicos: Plásmidos.
Los Plásmidos están ampliamente difundidos entre
los anaerobios especialmente a nivel de especies de
Clostridium y Bacteroides. Un muy buen porcentaje de
estos elementos no han demostrado funciones
específicas. Entre los Plásmidos funcionalmente
conocidos encontramos:
a. Plásmidos que codifican la produción
de Bacteriocinas.
Similares a las Colicinas estas
sustancias las poseen especies de Clostridium y
Bacteroides.
b. Plásmidos toxigénicos.
Ampliamente distribuidos entre las
especies de Clostridium productoras de
exotoxinas (toxigénicas). La correlación
fehaciente entre plásmido y producción de
toxina no se ha podido establecer en muchos
casos. El caso con más evidencias de la relación
plásmido-toxina para Clostridium tetanii donde
puede afirmarse que la producción genética de
toxina tetánica está codificada por un Plásmido.
4
c.
Plásmidos que codifican la resistencia
a los ATB.
Existen evidencias de que entre
diferentes especies de Clostridium, Bacteroides
y Cocos anaerobios existen plásmidos de
diferente tamaño que codifican la resistencia a
Macrólidos
(Clindamicina,
Eritromicina)
Tetraciclinas y Cloramfenicol.
RECOLECCION DE MUESTRAS
Teniendo en cuenta que los anaerobios pueden causar
o contribuir a la infección de cualquier tipo y en
cualquier lugar del organismo, parece claro que se debe
procurar siempre una muestra libre de contaminación
con Flora Normal para tener resultados verdaderamente
positivos. Las muestras siguientes habitualmente están
contaminadas con anaerobios de la Flora Normal y por
lo tanto no deben ser cultivadas en anaerobiosis.
Exudados de garganta, nasofaríngeos, bucales.
Esputo tosido o aspirado vía oral/nasal.
Contenido gástrico e intestinal (salvo excepciones).
Materias fecales (salvo excepciones).
Orina obtenida por sonda o espontáneamente.
Exudados vaginales y cervicales.
Una recolección de muestra adecuada debe evitar
siempre la más mínima contaminación con flora normal
(donde en algunos casos la proporción de individuos
anaerobios es de 1000 a 1 por aerobio). Los métodos de
recolección más adecuados se pueden resumir de la
siguiente manera:
EL POR QUE DE LA INUTILIDAD DE
ALGUNAS MUESTRAS
La expectoración no sirve porque el esputo se
contamina con la flora anaerobia normal de la faringe y
la boca en su pasaje al exterior; igualmente pasa con el
esputo obtenido por fibroscopía o los aspirados
nasotraqueales ya que el tubo arrastra en su introducción
flora normal en su extremo distal.
La orina emitida espontáneamente o con sonda se
contamina por la colonización natural de la porción
distal de la uretra y el meato o por la colonización de la
sonda. Si existen catéteres suprapúbicos o renales
pueden utilizarse para tomar la muestra con resultados
aceptables.
La endometritis presenta serias dificultades. En estos
casos los anaerobios casi constantemente están
involucrados en la etiología de estas infecciones y estos
gérmenes como siempre sucede son los mismos de la
flora normal (vaginal o cervical). Como la mayoría de las
endometritis suceden al nacimiento o a los abortos se
encuentran en el endometrio cantidades significativas de
anaerobios.
PULMON
Punción Transtraqueal (PTT)
percutánea.
Punción Pulmonar Transparietal
(PPTP).
Lavado Bronquial con Cepillo
Protegido.
PLEURA
Toracocentesis.
TRACTO
URINARIO
Punción Suprapúbica (PSP) percutánea.
ABCESOS
Aspiración con aguja y jeringa en abs.
cerrados. Igual en abiertos; evitar
hisopados de material al aire, puncionar
lateralmente.
GENITAL
FEMENINO
Obtención por culdocentesis previa
desifección vaginal con yodoforos.
Cepillo protegido de uso bronquial.
TRANSPORTE DE MUESTRAS
Otro factor crucial para el éxito en el aislamiento de
anaerobios es el transporte de muestras. Se debe proteger
a los microorganismos de los efectos del O2 durante el
tiempo que transcurre entre la extracción y la siembra
anaeróbica. El primer y más efectivo sistema es "correr"
ya que en ninguna otra ocasión como esta el envío
inmediato al Laboratorio es tan fundamental. Las
muestras deben ser colocadas en un sistema de transporte
que asegure la anaerobiosis. Existen tubos,
comercialmente disponibles en los que se ha sustituido
de aire por otro gas ("Tubos gaseados") y que contienen
un indicador de anaerobiosis. En casos de extracción de
material con aguja y jeringa, si la demora no supera los
30 minutos puede enviarse el material en la misma
jeringa expulsando el aire residual y obturando la aguja
con un tapón de goma.
Existen para períodos prolongados tubos con medios
de transporte adecuados o bolsas plásticas con sistemas
de anaerobiosis química. Los líquidos purulentos espesos
(Abscesos, Empiemas) se comportan como medios de
transporte 'per se' por su propia constitución y hemos
podido recuperar anaerobios hasta 24-48 después de
realizada la extracción.
TRACTO
SINUSAL
Aspiración con jeringas y catéter
plástico previa desinfección, curetajes,
biopsias.
METODOS DE CULTIVO
Los cultivos incluyen el uso de Jarras anaeróbicas,
bolsas plásticas, el método PRAS de Hungate y la
LUGAR
Procedimiento
5
Cámara de anaerobiosis o "cámara de guantes". Los dos
últimos métodos son muy caros, requieren equipamiento
complejo, son lentos y se usan para estudios de Flora
Normal y en laboratorios altamente especializados.
Desde el punto de vista práctico las Jarras pequeñas y los
sobres o bolsas son equiparables en rendimiento a los
más sofisticados y son aceptables para los estudios de
anaerobios de interés médico. Con estos sistemas son
posibles los cultivos en medios sólidos para la obtención
de aislamientos que permitan la identificación bacteriana.
El uso de medios líquidos en forma exclusiva no es
recomendable (salvo para hemocultivos) ya que la
mayoría de las infecciones por anaerobios son
polimicrobianas
incluyendo
facultativos
o
microaerófilos.
Medios líquidos (sólo para hemocultivos)
Existen varios medios comercialmente disponibles.
Algunos contienen (SPS) sodium polyanetol sulfonate el
cual estimula el desarrollo de los anaerobios, aunque al
parecer sería inhibidor para Peptococcus anaerobius.
Se trata de frascos de 100 ml, al vacío, con el agregado
de CO2, una base nutritiva (digerido tríptico de soja o
peptonas) y un agente reductor (thiol o thioglicolato). El
por-centjae de sangre a inocular es del 5 al 10 % v/v. Los
frascos se examinan diariamente buscando turbidez,
hemólisis o gas; se consideran negativos definitivamente
a los 10 días de incubación previos subcultivo final.
Jarras de Anaerobiosis
Existen varias marcas comerciales de jarras con
performance aceptable para generar atmósfera de
anaerobiosis. El fundamento del sistema más utilizado
(Gas Pak)- se basa en:
1. La generación de H2 y CO2 por medio
de una reacción química cuyos sustratos se
encuentran separados en un sobre al cual se le
agrega agua, desencadenando la reacción.
2. La combinación del H2 y el O del aire
para formar agua generan la anaerobiosis, esta
reacción se cataliza utilizando granallas de Zinc
recubiertas de Paladio las cuales se encuentran
depositadas en una canastilla dentro de la jarra.
Una tirilla de papel impregnada en Azul de
metileno (azul en presencia de O2, incoloro en
ausencia) introducida en la Jarra es el indicador
de Anaerobiosis.
Sobres de Anaerobiosis
El sistema BioBag consiste en una bolsa plástica
transparente, gas impermeable, una ampolla de indicador
de anaerobiosis (resarzurina) y una ampolla generadora
de anaerobiosis. Una o 2 placas de Petri pueden
introducirse antes de sellar la bolsa mediante un sellador
plástico por calor. Luego se rompen las ampollas de
indicador y generador. Los gérmenes crecen y se
mantienen viables por lo menos una semana. Este
sistema tiene las ventajas de su economía y practicidad,
además de poder observar directamente si existe
crecimiento sin abrir el Sistema; también se puede
utilizar para los sistemas de identificación tipo API-20A.
SUSCEPTIBILIDAD A LOS ANTIBIÓTICOS
La antibioticoterapia de las infecciones por
anaerobios es habitualmente empírica ya que los cultivos
y el aislamiento son lentos y dificultosos. Por otra parte,
las pruebas de sensibilidad realizadas en los laboratorios
Clínicos no dan resultados confiables. De manera pues,
que nos debemos guiar por las pruebas realizadas en los
laboratorios de Referencia Internacionales que aportan
datos sobre sensibilidad que permiten predecir con un
nivel razonable de seguridad cuales son los Antibióticos
de elección para cada germen. Las pruebas de
sensibilidad se realizan de forma similar a las de
gérmenes aerobios. Existe una prueba de dilución en
Caldo que permite establecer CMI y CMB; el Test de
Dilución en Agar (muy útil para realizar estudios de
varias Cepas) en donde el Antibiótico se incorpora al
Agar en diluciones sucesivas en placas de Petri.
IDENTIFICACION DE LOS ANAEROBIOS
Los anaerobios se presentan corrientemente en
cultivos mixtos con otras especies sea anaerobias,
micoraerófilas o facultativas. El primer paso es pues, la
observación de las colonias y su correspondiente Gram
para establecer distintas especies las cuales serán
subcultivadas para establecer aerotolerancia "aire, CO2 y
anaerobiosis". Información complementaria puede
obtenerse observando las placas de Petri bajo luz UV
para determinar la fluorescencia de las colonias. En las
placas de Subcultivos (con medios ricos, selectivos y/o
diferenciales) según la sospecha de Género pueden
agregarse Discos de Vancomicina 5 µg, Kanamicina
1000 µg, Coilistin 10 µg , SPS y NO3, los cuales aportan
datos para la identificación preliminar. En el diagrama
siguiente se esquematizan los pasos a seguir:
Registrar:
!
!
!
!
!
!
!
Cultivo en placa
Realizar:
Morfología de colonias !
!
Pigmento
!
Hemólisis
Fluorescencia
!
Susceptibilidad a:
Vancomicina
Kanamicina
Colistin
SPS
Actividad lipasa
Actividad lecitinasa
Gram
Indol
Catalasa
Test de NO3
6
La mayoría de los Laboratorios deben conformarse
con la realización de los Tests de Identificación
preliminares. La identificación final queda reservada
para los laboratorios de Referencia y comprende:
Estudios de fermentación de azúcares y estudio de los
productos finales del metabolismo los cuales pueden
agruparse en:
Ácidos grasos volátiles y alcoholes.
Metabolitos no volátiles.
Ácido fórmico.
Producción de Hidrógeno.
Estos estudios se realizan utilizando la Cromatografía
Gas-líquida.
ANAEROBIOS NO ESPORULADOS DE
INTERES MEDICO
Bacilos Gram negativos
Bacteroides
fragilis
vulgatus
ovatus
thetaiotamicron
distasonis
ureolyticus
gracilis
Bacteroides
Estas
especies
del
género
(fundamentalmente fragilis, de alta proporción en flora
intestinal) se asocian con infecciones anaerobias
subdiafragmáticas y genitales (por su vecindad con la
porción final del aparato digestivo y región perineal), y
con las sepsis al punto de partida de estas infecciones.
Todos los miembros del género son resistentes a
Penicilinas (por Betalactamasas) y Cefalosporinas -con
alguna excepción-. La morfología es de coco-bacilos
pleomórficos, pequeños, Gram negativos. En los cultivos
se presentan como colonias pequeñas, bajas, brillantes.
El desarrollo se estimula por la adición de Bilis a los
medios, lo cual permite el aislamiento selectivo para
estos gérmenes. Poseen antígenos proteicos y
lipopolisacarídicos pero lo característico es la Cápsula.
Su poder patógeno radica en la actividad endotoxina
símil de sus Ag. de membrana y del polisacárido
capsular. Existen descripciones de cepas productoras de
enterotoxinas capaces de dar enfermedades diarreicas en
el hombre y animales.
Prevotella
melaninogénica
buccae
oris
bivia
corporis
dentícola
intermedia
Estos bacilos de similares características a los
Bacteroides se ha reclasificado, ya que anteriormente se
agrupaban como Bacteroides y subespecies de los
mismos. Las cepas con producción de pigmento negro a
marrón en los medios de cultivo son fácilmente
identificables y son miembros de flora normal de boca y
vías respiratorias superiores y partes blandas
subyacentes. Algunas cepas (menos del 20 %) son
productoras de penicilinasas, pero en general son
sensibles a este antibiótico.
La Prevotella bivia prevalece en flora vaginal y
produce vaginosis e infecciones de origen obstétrico.
Porphiromonas
asacarolítica
gingivalis
endodontalis
Flora normal de boca y encías (gingivalis y
endodontalis) y flora intestinal (asacarolítica) producen
infecciones relacionadas con su habitat. Su morfología
varía desde los cocobacilos hasta formas alargadas. Las
colonias son convexas, lisas y pigmentan con el tiempo,
algunas veces se observa beta hemólisis. La vitamina K
estimula el desarrollo de estos gérmenes.
Fusobacterium
mortiferum
nucleatum
necrophorum
Miembros de flora normal de bucofaringe
(nucleatum) y flora intestinal su morfología es
característica; bacilos largos con extremos acintados o
filamentos delgados. Algunos (necrophorum) pueden ser
más abultados en su sector medio. Producen alfa y beta
hemólisis en los cultivos y las colonias son translúcidas
de forma varias a veces irregulares. Fusobacterium
nucleatum es el más común en infecciones del aparato
respiratorio, mientras que necrophorum se lo aísla de
infecciones subdiafragmáticas. Son habitualmente
sensibles a las Penicilinas y su poder patógeno se
establece por la presencia de lipasa y leucotoxinas.
Bacilos Gram positivos
Actinomyces
israelii
naeslundii
bovis
odontolyticus
viscosus
Se trata de bacilos Gram positivos largos y
ramificados, delgados y delicados, bajo ciertas
circunstancias, frotis o cultivos pueden fragmentarse
simulando bacilos del tipo difteroides.
De variada aerotolerancia, israelii (el patógeno de
interés médico más importante) y bovis son los menos
7
tolerantes al Oxígeno; aunque las cinco especies crecen
mejor en presencia de CO2, las otras especies deben
considerarse facultativos.
Miembro de flora normal bucal (Actimomyces
israelii) se relaciona con una entidad Clínica conocida
como Actinomicosis la cual tiene varias manifestaciones
clínicas que veremos más adelante.
El poder patógeno no está determinado con claridad;
las infecciones se ven favorecidas por un traumatismo o
por alguna otra disminución de las barreras defensivas
locales.
ACTINOMICOSIS CERVICOFACIAL
Constituye aproximadamente el 50% de los casos de
actinomicosis. Secundario a caries o enfermedades
odonto-periodontales el germen atraviesa (por
traumatismo) la mucosa bucal intacta conduciendo en su
forma típica a un proceso inflamatorio de región maxilar
inferior con compromiso óseo (osteomielitis maxilar). Si
la enfermedad progresa se abre una fístula al exterior
evacuándose el pus al exterior. El diagnóstico etiológico
se realiza evidenciando la presencia de "gránulos de
azufre", material granulomatoso con colonias de
microorganismos y filamentos ramificados al Gram.
ACTINOMICOSIS TORACICA
Por aspiración del agente o por extensión de lesiones
cérvicofaciales puede producirse enfermedad pulmonar
de tipo subagudo, febril, con tos y expectoración
purulenta. La progresión de la enfermedad conduce a
cavitación pulmonar, con fistulización al exterior a través
de la pared torácica pudiendo interesar costillas y
vértebras.
ACTINOMICOSIS ABDOMINAL
Como consecuencia de una perforación intestinal, la
enfermedad se desarrolla lentamente generando signos y
síntomas según el órgano abdominal afectado. Es posible
la extensión vertebral y la fistulización al exterior.
ACTIMOMICOSIS GENITAL
Se ha descrito infección en mujeres que utilizan
dispositivos intrauterinos con sintomatología escasa y sin
presencia de gránulos.
Principales
características
bioquímicas
de
Actinomyces israelii.
Req. de Oxígeno: Anaerobio
Eubacterium
lentun
nodatum
timidum
brachy
De lento desarrollo en cultivos y aerotolerancia muy
amplia, estos pequeños bacilos tienen su hábitat en boca
y vías respiratorias superiores, E. lentum forma parte de
la flora intestinal. Las infecciones están relacionadas con
la vecindad de su hábitat produciendo infecciones
odontológicas, de cabeza y cuello, y aparato genital
femenino.
Propionobacterium
acnes
granulosum
Integrantes
de
flora
normal
de
piel,
fundamentalmente, de escaso poder patógeno se los aísla
como contaminantes de hemocultivos y procesos de piel.
P. acnes deben su nombre al relacionarlo con el Acné.
Bacilos, a veces ramificados, pueden confundirse con
Actinomyces, a veces pleomórficos y cortos se los
confunde con Difteroides.
Lactobacillus
Múltiples especies asociadas con la flora normal de
boca y en gran cantidad en flora vaginal, poseen un
poder patógeno mínimo; se trata de bacilos largos, Gram
positivos netos, de bordes paralelos y extremos
rectangulares.
Mobiluncus
mulieris
curtisii
Estas especies de bacilos Gram positivos inestables,
eran conocidos como Bacilos Anaerobios curvos que se
aíslan de vaginitis inespecífica; de lento crecimiento son
difíciles de cultivar y su participación en infecciones se
puede sospechar por una buena microscopía.
Bifidobacterium
Miembros de flora normal de boca y
tractogastrointestinal, hay varias especies; de escaso
poder patógeno deben su nombre a la morfología del
Gram que les de su nombre.
Cocos Gram positivos
Peptoestreptococos
anaerobius
magnus
asaccharoliticus
tetradius
prevotti
A pesar del nombre del Género la morfología de
estos gérmenes incluye formas en pares, tétradas,
racimos, y cadenas. Un estudio microscópico cuidadoso
muestra a estos cocos con tamaño irregular y alguna
decoloración parcial, lo que permite diferenciarlos de sus
similares aerobios. Forman parte de la flora de la boca,
intestino y genitales. Se encuentran involucrados en
infecciones pleuropulmonares, abscesos, infecciones
ginecológicas, sinusitis. Casi constantemente son
8
sensibles a los betalactámicos.
Cocos Gram Negativos
Veillonella parvula
Pequeños cocos Gram negativos en diplos o cadenas
cortas y racimos, miembros de flora bucal intestinal y
genital, se aísla de materiales Clínicos, pero es dudoso y
desconocido su poder patógeno.
BACILOS GRAM POSTIVOS ESPORULADOS
Los Clostridium son bacilos Gram positivos,
esporulados, anaerobios estrictos, salvo alguna especie
con mayor aerotolerancia. Los patógenos son
productores de poderosas exotoxinas las cuales por sí
mismas provocan todos los síntomas y signos de las
infecciones. Dentro del Género podemos separar 4
grandes grupos.
1. Clostridios histotóxicos
(especies más comunes) Clostridium
perfringens
septicum
histoliticum
novyi
sordelli
fallax
bifermentans
Dentro de este grupo la especie más importante es
perfringens, (80 a 90%) por lo que nos referiremos
fundamentalmente a esta especie.
Este grupo de gérmenes causa infecciones muy
severas caracterizada por una mionecrosis, infección
clásicamente conocida como gangrena gaseosa;
(debemos tener en cuenta que la presencia de gas en
infecciones de partes blandas no siempre significa
mionecrosis. Todos estos clostridios producen
exotoxinas de diferente potencia que veremos más
adelante.
El clostridio más frecuente (C. perfringens) posee
cinco tipos diferentes, del A al E, los cuales producen 4
tipos de toxinas letales clasificadas como: alfa, beta,
epsilón y theta. El tipo más común de interés médico es
el tipo A que produce la alfatoxina y algunas otras toxina
de menor poder (omega, kappa, micrón). C. perfringens
tipo A se halla como flora normal del hombre y los
animales aunque en estos no es frecuente causa de
enfermedad. Lo contrario sucede con los otros tipos de
clostridios.
Morfología y tinción
Bacilo netamente Gram positivo corto y grueso de
bordes redondeados, con formas hasta cocoides. De los
frotis directos de muestras clínicas destacamos que no se
observan esporos y que la células que componen un
frotis de material clínico se encuentran ausentes (debido
a la intensa citólisis tóxica). Cuando en cultivos vemos
formas esporulando, los esporos medianos o
subterminales no deforman el soma vegetativo.
Fisiología y cultivo
Anaerobio aerotolerante, de fácil recuperación, de
crecimiento rápido en Agar sangre, es el único inmóvil
de los clostridios patógenos, no esporula en medios
comunes, desarrolla en pH variable y temperaturas de 20
a 50 grados. En 24 horas de incubación produce colonias
de 2 a 4 mm con formas lisas a rugosas. Se puede ver
una hemólisis doble, una estrecha betahemólisis
producida por la alfa toxina y una zona más amplia de
hemólisis incompleta producida por la toxina omega.
Desarrolla abundantemente en medios con glucosa y
carne picada o medios con leche, produciendo abundante
gas e intensa fermentación (ferment. lactosa >acidificación ->coagulación de la caseína ->rotura del
coágulo por la producción de gas). La producción de
alfa-toxina se puede realizar colocando suero humano en
presencia de un sobrenadante de cultivo el cual produce
una opalescencia clara del mismo (Reacción de Nagler),
o alternativamente sembrando Agar con yema de huevo
el cual se torna opalescente. La adición de la antitoxina
específica se usa como contraprueba, sea en placas o en
la prueba del suero. La siembra directa de materiales en
Agar yema de huevo (media placa con antoxina) permite
determinar en pocas horas la presencia de C. perfringens
en muestras clínicas. La opalescencia del suero y la yema
de huevo se deben a que la alfa-toxina es químicamente
una lecitinasa.
Estructura antigénica - Toxinas
C. perfringens del tipo A produce por lo menos 12
sustancias de naturaleza proteica de poder antigénico, 4
de ellas toxinas, de las cuales la alfa es la más poderosa.
Esta toxina se define como dermonecrótica-letal y
hemolítica. Químicamente es una lecitinasa C - o
fosfolipasa C- que degrada la lecitina. La activación de la
toxina es dependiente de los iones Ca++ y Mg++. De
alto poder antigénico, los Ac. antitoxina son los únicos
que pueden neutralizar el efecto de la misma. La alfatoxina actúa sobre lipoproteínas que contienen lecitina en
la membrana celular y en las mitocondrias. La acción
necrótica tisular es evidente, no así las acciones a nivel
sistémico. Otras sustancias antigénicas de menor poder
tóxico son importantes auxiliares en la diseminación de
la enfermedad.
Clostridium septicum
Flora normal intestinal de hombre y animales, móvil
perítrico, es productor de alfa-toxina y se encuentra
asociado en el 10% de los casos de mionecrosis o sepsis
de origen endógeno.
Clostridium histoliticum
Flora normal del hombre y los animales,
aerotolerante productor de alfa-toxina y beta-toxina.
Esta última es una proteína con actividad enzimática
(colagenasa) que destruye las fibras del colágeno.
9
Clostridium novyi
Existen tres tipos A B y C. Se trata de bacilos
grandes, móviles perítricos con esporas subterminales.
2. Clostridios enterotoxigénicos
C.perfringens tipo A. --> Intoxicación alimentaria
Este germen productor de una enterotoxina (detallada
en otro Capítulo) produce una intoxicación alimentaria
de tipo leve. Los síntomas de la enfermedad dependen de
la acción de la enterotoxina sobre la mucosa intestinal, la
misma es producida cuando alimentos contaminados con
esporos son calentados para su cocción y la germinación
y posterior multiplicación acumula toxinas.
C. prefringens tipo C. --> Enteritis necrotizante
Se trata de una enfermedad mucho más severa que la
anterior, pudiendo ser letal. Los síntomas de la
enfermedad son ocasionados por la beta-toxina
producida por estos gérmenes.
C. difficile --> Enterocolitis seudomembranosa
Se trata de una especie anaerobia estricta, miembro
de flora normal intestinal humana, y se han descrito seis
serogrupos en relación con su toxicidad. C. difficile
produce 2 toxinas: una toxina B citotóxica y una toxina
A, enterotoxina potente; ambas son las determinantes de
la enfermedad. En ciertas circunstancias el origen de la
enfermedad es endógeno y su causa es, por una intensa
antibióticoterapia, en especial con Clindamicina. Al
parecer los ATB al eliminar la flora normal permitirían
un hiperdesarrollo de C. difficile.
3. Clostridium tetani
TETANOS
C. tetani es el agente productor del Tétanos,
descubierto en 1889 por Kitasato.
Morfología
Bacilo Gram positivo, delgado, de 3 a 8 µm de
longitud, móvil perítrico, posee tendencia al Gram
negativo en cultivos viejos y materiales clínicos, con
esporos terminales que deforman el soma bacteriano
dándole una forma característica de raqueta o palillo de
tambor.
Cultivos
Anaerobio obligado, algo exigente, temperatura
óptima de crecimiento a 37ºC, pH óptimo 7.4. Las
exigencias nutritivas son cubiertas por el agregado de
sangre o carne cocida, produce una betahemólisis débil,
no fermenta hidratos de carbono. Los esporos resisten 20
minutos a la ebullición y una esterilización segura
requiere auto-clave (121ºC, 15 min.)
Antígenos
Posee antígenos H flagelares (10 tipos), O somáticos
y en los esporos.
Poder patógeno
Todos los síntomas de la enfermedad son atribuibles
a la producción de una poderosa toxina:
tétanoespasmina. La toxina, intracelular y liberada por
autólisis, es una proteína TERMOLABIL que se
inactiva por calentamiento -60ºC durante 20 minutos- o
por formaldehído, esta propiedad es de extraordinaria
importancia ya que si bien la toxina pierde su poder
patógeno, no pierde su poder antigénico transformándose
en toxoide, el cual confiere una excelente inmunidad a
los sujetos inoculados. Químicamente es una cadena
polipeptídica de pm 150 kdalton, que posee tres
subunidades A, B y C. Al momento de su liberación
existe un clivaje, al parecer por las proteasas bacterianas,
quedando dos subunidades A y BC unidas por un puente
disulfuro.
La toxina tetánica es una de las toxinas más
poderosas que existen, en especial para el hombre y los
animales.
Mecanismo de acción de la toxina tetánica
Con exclusivo sitio de acción a nivel de Sistema
Nervioso (regiones A y BC con afinidad para receptores
gangliósidos) es capaz de actuar a distancia por el
siguiente mecanismo. Una vez fijada al receptor celular
la toxina ingresa a la célula por endocitosis y se mueve
por vía retrógrada a través de los axones.
Entonces la toxina interfiere la transmisión sináptica
inhibiendo la liberación de neurotrasmisores
inhibitorios tales como la Glicina, de las neuronas
inhibitorias. Los efectos estímulo-inhibición de las
neuronas motoras son desbalanceados causando una
rigidez muscular. Esta se manifiesta en los músculos más
fuertes: maseteros (trismus) flexores de extremidades
superiores y extensores de extremidades inferiores y
tronco (opsitótonos).
La contaminación
Los esporos de C. tetani se hallan ampliamente
distribuidos en el suelo y medio ambiente, las formas
vegetativas son flora normal de hombre y animales,
especialmente equinos. Una herida contaminada con
esporos de C. tetani es la puerta de entrada del germen.
Estas heridas deben poseer un contexto especial de
necrosis o de sustancias necrotizantes (bajos Eh.); en
general se trata de heridas punzantes, cuerpos extraños
como astillas, espinas, etc. Existe una forma muy temida
de tétanos que es el tétanos neonatal, provocado por el
corte del cordón umbilical con instrumentos contamindos.
La Clínica
Luego de un período de incubación variable 4 a 10
días se desarrolla la enfermedad que puede ser
localizada, con espasmos musculares de músculos
adyacentes a la herida o, con mayor frecuencia,
generalizada. Los síntomas son todos aquellos
provocados por la contracción espástica muscular con
afectación de los músculos respiratorios, alteraciones
cardiovasculares y muerte.
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El Diagnóstico
El diagnóstico es Clínico ya que es muy difícil el
aislamiento bacteriológico; apenas unos pocos gérmenes
que produzcan ínfimas cantidades de toxina son
suficientes para desencadenar el proceso.
La inmunidad y la prevención
La enfermedad no confiere inmunidad ya que la
cantidad de toxina que desencadena los síntomas no es lo
suficientemente grande como para activar el Sistema
Inmunitario.
La prevención se logra con la inmunización activa de
toda la población a partir de los 3 meses de edad
utilizando el Toxoide tetánico. Confiere una protección
del 100% en inmunocompetentes y es inadmisible no
estar correctamente inmunizado. La inmunización pasiva
con gamma globulinas hiperinmunes de donantes se
utiliza como coadyuvante en la enfermedad y como
protección pasiva en sujetos no vacunados con heridas
tetanígenas.
4. Clostridium Botulinum
BOTULISMO
La enfermedad del botulismo data desde 1870 para
describir una intoxicación alimentaria mortal por
ingestión de salchichas (latín, botulus = salchicha). En
realidad múltiples alimentos conservados pueden
provocar la intoxicación. En la época actual el empleo de
autoclaves y métodos modernos de esterilización hacen
que los productos comerciales enlatados hayan perdido
el protagonismo quedando el riesgo reducido a la
manufactura casera de enlatado de carnes, pescados y
vegetales. Aun así la cocción de los enlatados destruye la
toxina botulínica por lo cual sólo existe riesgo en
aquellos alimentos a consumirse directo de la lata sin
previa cocción.
Morfología
El C. botulinum es un bacilo Gram postivo recto,
con extremos redondeados, móvil perítrico, produce
esporos resitentes al calor, subterminales que deforman
algo el soma bacteriano.
Cultivos
Anaerobio estricto, desarrolla en medios con sangre,
produciendo colonias betahemolíticas, bastante exigente
en cuanto a requerimientos nutritivos, fermentan la
glucosa. Los esporos son muy resistentes al calor, a las
radiaciones y a los agentes químicos.
Estructura antigénica
De composición compleja y bastante indefinida no
existen antígenos en las células vegetativas que resulten
de importancia.
Según el tipo de exotoxina producida se han descrito
8 tipos serológicos A al G. Tienen importancia
epidemiológica ya que, excepto los tipos C y D, el resto
produce un solo tipo de toxina.
El poder patógeno
La patogencidad está dada exclusivamente por la
exotoxina que habitualmente es producida fuera del
organismo, al punto que más que una infección se
debería considerar como intoxicación o envenenamiento.
La toxina botulínica y su mecanismo de acción
La toxina se genera incubando los gérmenes entre 25
a 38ºC a un pH de aproximadamente 7. Si bien es
considerada una exotoxina, se libera cuando se produce
la lisis de la bacteria. Su dosis letal es tan poderosa que
un µg (milésima de mg) contiene 200.000 dosis letales
para un ratón de 20 gr y se acepta que apenas unos
gramos serían capaces de eliminar toda la humanidad.
De naturaleza proteica, al igual que la tetánica, se trata
de una cadena polipeptídca de 150kda con tres regiones
A, B, y C de baja toxicidad, que cuando son clivadas se
forman dos cadenas, una pesada y una liviana unidas por
puentes disulfuro y con marcada actividad tóxica.
Existen 8 tipos de toxina antigénicamente distintos,
genéticamente dirigidos por bacteriófagos. La toxina
botulínica es ingerida y sortea la barrera digestiva
aparentemente protegida por otras proteínas con las
cuales forma complejos, más aun, de hecho las proteasas
digestivas activan la toxina. A diferencia de la toxina
tetánica, la toxina botulínica afecta las terminaciones
nerviosas periféricas. Una vez que atravesó la barrera
intestinal, llega vía hematógena a las uniones
neuromusculares, provocando un bloqueo presináptico
de la liberación de acetilcolina. La interrupción de la
estimulación nerviosa provoca una parálisis fláccida
irreversible conduciendo a la muerte por parálisis de los
músculos respiratorios.
Tipos de intoxicación botulínica
Existen 4 formas de botulismo.
a. Botulismo alimentario. Forma clásica
letal por ingestión de la toxina producida en
alimentos conservados mal esterilizados.
b. Botulismo infantil. Se trata de la
ingestión de esporos por los lactantes (clásico
chupete con miel) con multiplicación de los
Clostridios en el intestino con producción de
toxina en la luz intestinal y posterior absorción.
c.
Botulismo de las heridas. Forma muy
rara a partir de heridas infectadas.
d. Botulismo no determinado. En
mayores de un año que padecen la enfermedad
sin hallarse ningún vehículo aparente.
La Clínica
Con un período de incubación corto (12 a 24 hs),
dependiendo de la cantidad de toxina ingerida, se
producen los signos toxo-dependientes: debilidad,
lasitud, visión borrosa y doble, disfagia y disfonía. Con
el progreso de la enfermedad otros grupos musculares
son afectados entre ellos los respiratorios.
El diagnóstico
Es fundamentalmente Clínico, pudiendo confirmarse
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la intoxicación con el estudio de los alimentos o restos de
alimentos ingeridos para buscar toxina botulínica.
La prevención
La prevención de esta enfermedad pasa por evitar la
fabricación y consumo de alimentos "en forma Casera" si
no existe seguridad de la perfecta esterilización. En
cuanto a alimentos de origen comercial las severas
normas bromatológicas hacen casi imposible la
contaminación; si no existe esa certeza deberá siempre
calentar los alimentos a la ebullición durante unos
minutos. Respecto al botulismo del lactante se evitarán
los alimentos posiblemente contaminados.
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