Arabidopsis thaliana

FLORACIÓN
Biotecnología Vegetal 2010
Licienciatura en Biotecnología
UNSAM
130 millones de años, durante el período Cretáceo temprano
> 2000 años: Flores anormales
Siglo XVII: Linneo relaciona con el desarrollo
1790: Goethe introduce el concepto Metamorfosis anormal
1894: Bateson define Mutantes homeóticas en animales
1950: Descubrimiento de las FITOHORMONAS
1980: Aislamiento de mutantes homeóticas
Identificación de genes
1990: Modelo ABC
Ciclo de vida de una planta angiosperma (Nicotiana tabacum)
Organismos modelo para el estudio de la floración
Arabidopsis thaliana
Antirrhinum majus
30 cm de altura
A 25ºC crecen 10.000/m2
Semillas en 6 semanas
8 generaciones en un año
De fácil transformación
Disponibilidad de mutantes
gran tamaño
experimentos de cruza fàciles
obtención de material
Disponibilidad de mutantes
(transposones)
Diagramas florales de dos plantas modelo, Arabidopsis thaliana y Antirrhinum majus.
A) Los cuatro verticilos florales contienen, desde el exterior al interior: sépalos (verticilo 1),
pétalos (verticilo 2), estambres (verticilo 3) y carpelos fusionados para formar el ovario (verticilo
4). Los pequeños círculos negros dentro del ovario indican los óvulos
3 cuestiones básicas que las
plantas deben solucionar para
reproducirse con éxito:
• Cuándo florecer
• Dónde han de brotar las flores
• Cómo construir los órganos
florales
Estrategia de estudio:
(1990) Aislamiento de mutantes afectados en cada uno de las etapas de floración
• con tiempo de floración alterado (más tardíos o tempranos)
• con defectos en la iniciación de las flores
• con defectos en la identidad de los órganos florales (ej, con pétalos sustituyendo
a estambres, etc.)
Mutantes afectados en el tiempo de floración
A) aquellos que florecen más tarde sólo en días largos
(vía de señalización de días largos)
B) aquellos que florecen más tarde tanto en días largos como en
días cortos
(vía independiente del fotoperíodo)
Floración depende de LUZ - FOTOPERíODO
Arabidopsis thaliana
planta facultativa de día largo
Días largos – 3 semanas
Días cortos (8 hs luz) – 2 meses
Cadillo
Crisantemos
Dalias
Espinaca
Gladiolos
Lechuga
Trigo
Lirios
Beleño
FOTOPERÍODO
•Respuesta a las variaciones estacionales de la longitud del día
•Efecto de la duración de la longitud del día sobre la floración, descubierto
hace 75 años por GARNER y ALLARD.
•Respuesta biológica a un cambio en las proporciones de luz y oscuridad que
tienen lugar en un ciclo diario de 24 hs (CIRCADIANO)
La longitud relativa del día y la
noche determina el momento de
floración de las plantas.
Las tres curvas representan los
cambios anuales en la longitud del
día en ciudades de EEUU que están
a diferentes latitudes (Miami, 26º N;
Chicago, 40º N y Winnipeg, 50º N).
Las líneas horizontales muestran el
fotoperíodo efectivo de tres plantas
de día corto diferentes (el cadillo, 16
horas; la soja “Biloxi”, 14 horas; el
tabaco “Maryland Mammoth”, 12
horas).
Responden a una VALOR CRÍTICO de la longitud del día.
No es importante el TIEMPO ABSOLUTO DE ILUMINACIÓN.
Fotoperíodo = afectado por las CONDICIONES AMBIENTALES
Floración del beleño
22°C
22°C
28.5°C
15.5°C
10 hs 20 min
10 hs
11 hs 30 min
8 hs 30 min
SI
NO
SI
SI
La respuesta a la luz varía en las diferentes especies vegetales, existiendo
correlación entre el número de ciclos luz/oscuridad y la rapidez de la floración o el
número de flores que se forman.
Las plantas controlan el fotoperíodo midiendo HORAS DE OSCURIDAD
1938 = HAMMER y BONNER
LAS PLANTAS DE DÍA CORTO NECESITAN OSURIDAD ININTERRUMPIDA
Diagrama que ilustra como la interrupción luminosa durante el período de
oscuridad (fotoperíodos cortos) previene la floración en una planta de día
corto y la promueve en una de día largo
Base química de la fotoperiodicidad
1959 = FITOCROMOS
Proteínas solubles - dos subunidades idénticas - 1200 aminoácidos - 125 kilodaltons.
Cada subunidad consta de un dominio amino terminal globular, al que se une un cromóforo responsable de
la absorción de la luz, y de un dominio carboxilo terminal, implicado en la dimerización y en la función
reguladora del fitocromo.
En el dominio carboxilo distinguimos el “núcleo”, de interés en la transmisión de la información ambiental
percibida, las regiones PAS1 y PAS2, implicadas quizás en interacciones entre proteínas, y la región DHQ,
que debe su nombre a la semejanza que guarda con los dominios histidina quinasa.
Chromophore-binding domain
•N-terminal
•recibe luz roja
Dominio C-terminal
•dispara cascada de señalización
CROMÓFORO = tetrapirrol lineal denominado fitocromobilina
Ca++
G proteins
PK
TF
Activacion de
genes
FITOCROMOS
El dímero de fitocromo existe
en dos formas fotoconvertibles:
Pr, que absorbe luz roja, y Pfr,
que absorbe luz roja lejana.
Se sintetizan en la forma
inactiva Pr; la absorción de luz
roja
produce
un
cambio
reversible en la conformación
de la proteína (acercamiento)
que la convierte a la forma
activa Pfr. Esta última forma
puede inactivarse y volver a la
conformación
Pr
por
la
absorción de luz roja lejana.
Los espectros de absorción de Pr y Pfr se solapan en buena parte, lo que
significa que la forma activa Pfr coexiste siempre con la inactiva Pr en un
fotoequilibrio que se establece en función de la proporción relativa de luz roja y
roja lejana de la irradiación incidente.
Estado de fotoequilibrio o
“ESTADO FOTOESTACIONARIO”
Φ = [ Pfr]/[Ptot]
Φ = Equilibrio fotoestacionario
[Pfr] = concentración de fitocromo rojo lejano
[Ptot] = concentración total de fitocromos (Pfr + Pr)
La síntesis de los fitocromos depende de genes nucleares y plastídicos
La fitocromobilina es sintetizada en los plástidos.
La unión de la apoproteína con la fitocromobilina es autocatalítica (espontánea)
Las condiciones de luz controlan la ubicación subcelular de los fitocromos y su interacción
con PIF3, un posible factor de transcripción. El fitocromo acabado de sintetizar es inactivo (forma
Pr) y se aloja en el citoplasma. Si la célula recibe luz roja (R), el fitocromo se convierte en la forma
Pfr activa y pasa al núcleo, donde puede unirse a PIF3. Si se irradia con luz roja lejana (RL), el
fitocromo Pfr se inactiva y se desprende de PIF3. El complejo formado por Pfr y PIF3 podría
regular la expresión génica. Otros componentes de la transducción de la señal lumínica, como
SPA1 y FAR1, se instalan también en el núcleo, donde podrían intervenir en el control de la
expresión génica.
Procesos regulados por los fitocromos
9Alargamiento de pecíolos y entrenudos
9Formación de primordios foliares
9Síntesis de clorofilas y antocianinas
9Crecimiento de las hojas
9Diferenciación de estomas
9Distribución de fotoasimilados
9Formación de tubérculos
9Germinación de las semillas
9Floración
Experimentos de Chailakhyan (1937) con especies de crisantemo (PDC).
La floración ocurre cuando las hojas están sometidas a fotoperíodos de día corto aunque
las yemas florales estén en condiciones de día largo. Sin embargo, cuando las hojas
fueron puestas en condiciones de día largo, la floración no se produjo aunque las yemas
estuviesen en fotoperíodos de día corto (limbo de la hoja).
Control hormonal de la floración????
FLORÍGENO
9pasa de las hojas a la planta nueva por INJERTO
9no atraviesa agar ni tejidos muertos
9necesita conexión anatómica de tejido vivo
9se movería a través del sistema floemático
GIBERELINAS y ANTESINA ???
Existirían sustancias INDUCTORAS e INHIBIDORAS ???
Vía facultativa de días largos
1. percepción de la luz por fotorreceptores de luz azul (CRY1, CRY2)
y de luz en el rojo lejano (PHYA)
2. Por mecanismos aún no conocidos en profundidad, estos fotorreceptores
"comunican" la presencia de luz a los componentes (TOC1, CCA1,
LHY) de un "reloj molecular" que es capaz de determinar cuál es la
duración relativa del día respecto a la noche
3. En caso de reconocer los días largos, se activa la expresión
de genes como CONSTANS (CO) y FT genes.
CO es un TF clave en la floración bajo condiciones de días largos.
Plantas KO en CO ---- floración en días largos ocurre tan tarde como
en días cortos
Plantas sense CO ----- en días cortos provoca la floración temprana
incluso en condiciones adversas.
De manera análoga, la alteración del nivel de expresión de FT genes produce una
modificación del tiempo de floración
SOC: supresor de la actividad de CONSTANS, factor de transcripción del tipo MADS-box
FT: Flowering Locus T, proteína con dominio de inhibidor de RAF-Kinasas animales
CO: B-box Zinc-finger, que promueve la transcripción de flowering time genes
GI: prot nuclear, no existe en animales
Degradada en
oscuridad
por UB
Regulación POST TRANSCRPCIONAL
CONSTANS
En A thaliana, es el principal factor para diferenciar entre día largo y corto,
desde la hoja hasta el ápice
Actuaría específicamente en el tejido vascular para regular la síntesis o el
transporte a larga distancia de la señal foliar que inicia el desarrollo floral en el
meristema apical
Flowering Locus T
FT: proteína nuclear y citoplasmática, actúa en el núcleo como parte de
un complejo transcripcional con FD (Flowering Locus D, nuclear) que
activa la expresión de AP1 en meristemas florales.
FT
9señal móvil, ya sea
como RNAm o proteína
98 – 12 hs switch LD-SD
TSF: Twin sister of FT
Vía dependiente de giberelinas.
Giberelinas (GA) ---- reguladores de la floración
* mutantes GA (-) (por ejemplo ga1) no pueden florecer en días
cortos, pero sí en días largos, x vía facultativa de días largos.
* Aplicación exógena de GA acelelera la floración en Arabidopsis
Vía autónoma.
A pesar de su "autonomía" respecto al fotoperíodo, la actividad de esta vía sí
responde a otras señales ambientales, como la temperatura de crecimiento y la
vernalización.
* La regulación por la temperatura converge en un factor de transcripción
que reprime la floración denominado FLC, cuya expresión está
regulada mediante modificaciones en la cromatina.
Vía AUTÓNOMA
Las plantas mutantes en la VA presentan un retraso muy marcado ya sea en días
cortos (SD) como largos (LD) y niveles aumentados de mRNA FLC. Requieren
más frío para florecer.
Se identificaron 8 genes
LD (Luminodependens)
FLD
FVE
REF6
FCA
FY
FPA
FLK
con dominios comunes a prot que modifican CROMATINA
prote{inas involucradas en el metabolismo del mRNA
A pesar de no existeir evidencia de interacción directa con FLC, la represión de la
floración por los genes de la via autónoma se da principalmente a través de FLC.
Conferida por dos genes dominantes FLC y FRI
FRI: proteína nuclear, sólo encontrada en plantas, regula la expresión de FLC
VERNALIZACIÓN
9Supresión de genes que reprimen la floración
9Evitar la floración antes del invierno y que florezcan en primavera
9Se suele medir en días de frío
9Cereales de invierno: trigo, centeno
9Reversible por altas temperaturas
FLC: Flowering Locus C, proteína con dominio MADS-box
9Es un potente represor de la floración
9Las bajas temperaturas disminuyen los niveles de ARNm FLC
9Es ampliamente expresado en la planta (SAM, RAM, hojas) pero cumple su
papel principal en las HOJAS EXPANDIDAS
9Ibhibe la floración reprimiendo la expresión de los INTEGRADORES FLORALES
FT, FD y SOC1
VERNALIZACIÓN como switch epigenético
En 1965 los experimentos de Lang demostraron que
Planta expuesta al frío (vernalizada)
Mantenida en régimen SD (no inductivo) y creciendo a
temperaturas cálidas
NO FLORECE sólo tiene desarrollo VEGETATIVO
Cuando son canbiadas a fotoperíodo inductivo (LD) aún después
de muchos meses
FLORECEN
LA REPRESIÓN DE FLC ES MITÓTICAMENTE ESTABLE alo largo
de un gran número de divisiones celulares
Genes que participan en la vía de Vernalización
VRN1, VRN2, VIN3, VIL1 (VRN5/VIN3 like 1) y atPRMT5
Involucra el reclutamiento de
complejos que modifican la
cromatina hacia un grupo de
genes represores de la floración
que
están
silenciados
epigenéticamente
por
la
modificación de histonas.
H3K9
H3K27
VIN3
PHD, en complejos
involucrados en la
regulación a nivel de
cromatina
No se expresa
constitutivamente, sólo
cuando la planta es
expuesta al FRÍO
sMeH4R3 (atPRMT5)
Otros targets de vernalización en Arabidopsis
FLC clade :
FLM/MAF1
MAF2
MAF3
MAF4
MAF5
Actúan reprimiendo la expresión de los integradores florales
En presencia de FRI actúa FLC
En ausencia de FRI y bajo ciertas condiciones, son activos los FLC clade
Arabidopsis thaliana Col, Landsberg erecta y Wassilewskija son fri
VERNALIZACIÓN
No es un mecanismo conservado como el fotoperíodo
PPD1 ~ CO
VRN1 = AP1/Ful
VRN2 = proteína con
dominio CCT, no tiene
homólogo en A thaliana,
pero en frío disminuye su
expresión como FLC
VRN3 = FT
9Requerimiento de
vernalización en LD
Cereales
MERISTEMA
APICAL
FLOWERING
TIME GENES
F
L
O
R
A
C
I
Ó
N
GENES DE
IDENTIDAD DE
MERISTEMA
MERISTEMA
FLORAL
GENES DE
TAMAÑO
DE MF
GENES DE
PATRÓN DE
ÓRGANOS
FLORALES
GENES
CADASTRALES
GENES DE
IDENTIDAD
DE
ÓRGANOS
FLORALES
FLOR
Esquema de las vías
de inducción floral y
targets moleculares
en Arabidopsis
Las flores de Arabidopsis se originan de un pequeño grupo de células
indiferenciadas denominadas meristema floral a los costados del meristema de
inflorescencia o de brote.
Genes de identidad de meristema
LEAFY, APETALA1, CAULIFLOWER y TERMINAL FLOWER , que mantiene la
identidad del meristema de inflorescencia.
LFY
lfy-26
inflorescence
wt
35S::LFY
LEAFY es suficiente para conferir identidad floral en
primordios en desarrollo cuando es expresado bajo un
promotor viral
LEAFY es un gen específico de plantas
No existen homólogos en células de animales
Hay una sola copia en Arabidopsis
No existen dominios proteicos que sugieran función bioquímica
LEAFY:VP16 fue usado como herramienta para estudiar la función de
LEAFY, sugiriendo que LFY se une al ADN
FENOTIPOS
LFY:VP16
Genes de identidad de órgano
Determinan el destino de las células del primordio floral. Estos genes forman parte del
Modelo “ABCE” que explica las bases moleculares del desarrollo floral.
Ejemplos de GIO son APETALA1 (el cual está involucrado en la identidad de meristema y
de órgano), APETALA2, APETALA 3, PISTILLATA and AGAMOUS
ap2
ap2-2 flower
ap3
ap3-3 flower
ag
ag-1 flower
B
AP3
PI
A
AP1
AP2
E
SEP2
SEP1
Sépalos
1
Pétalos
2
Flor tipo
salvaje
C
AG
SEP2
Estambres
3
SEP3
Carpelos
4
Mutante sep1,2,3
B
AP3
PI
C
AG
A
AP1
SEP1
AP2
SEP1
Sépalos
1
SEP2 SEP2
Pétalos
2
E SEP2
SEP3
Estambres
3
Carpelos
4
B
C
ap2
Carpelos
Estambres
Estambres
A
Sépalos
Carpelos
C
Sépalos
Carpelos
Carpelos
ap3
B
A
Sépalos
Pétalos
Pétalos
Sépalos
ag
Clase
Arabidopsis
thaliana
Antirrhinum
majus
A
AP1 , AP2
SQUAMOSA
(SQUA)
B
AP3 , PI
DEFICIENS
(DEF),
GLOBOSA (GLO)
C
AG
PLENA (PLE)
SEPALLATA
SEP1, SEP2,
SEP3
DEFH84,
DEFH200,
DEFH72
Genes de acción tardía (late-acting genes )
controlan el desarrollo del óvulo y la semilla (clase D)
Genes de identidad del tejido del fruto
(fruit tissue identity genes) .
EN 1990 FUE CLONADO EL PRIMER GEN DE IDENTIDAD DE ÓRGANO, AG,
AGAMOUS DE Arabidopsis thaliana.
SU SECUENCIA TIENE SEMEJANZA CON FACTORES DE TRANSCRIPCIÓN:
M
Mating Type de LEVADURAS
A
Agamous de Arabidopsis
D
Deficiens de Antirrhinum
S
SRF (Factor de Respuesta Sérica) de MAMÍFEROS
REGIÓN
INTERVINIENTE
AMINO
TERMINAL
N
M
DOMINIO
MADS
I
K
DOMINIO
KERATINA LIKE
CAJA CArG [CC (A/T)6 GG]
Elementos cis
C
CARBOXILO
TERMINAL
TETRÁMEROS: dos dímeros unidos a
dos cajas CArG, asociados por
interacción proteína – proteína a través
del dominio carboxilo terminal.
TRÍMEROS: un dímero unido a una caja
CArG asociado por interacción proteína
– proteína a través del dominio carboxilo
terminal a otra proteína MADS.
TETRÁMEROS: dos dímeros unidos
cooperativamente a dos cajas CArG sin
que exista interacción proteína –
proteína.