Espectroscopia de Resonancia de Paramagnética Electrónica (RPE) Alejandro Solano Peralta Lab. de RPE Facultad de Química– uímica–U.N.A.M. Unidad de Servicios de Apoyo a la Investigación ¿Qué es Resonancia Paramagnética Electrónica ? La Resonancia Paramagnética Electrónica (EPR por su acrónimo en ingles) es una técnica espectroscópica que permite detectar especies con electrones desapareados. Esta técnica complementa otras técnicas analíticas y es la única que permite la detección directa de radicales libres formados en varios sistemas químicos o biológicos. 1 ¿Qué formas experimentales hay para estudiar compuestos químicos? Métodos -Espectroscopía de Absorción -Resonancia Magnética Nuclear -Resonancia de Espín Electrónico -Flourescencia -Dicroísmo Circular Magnético -Raman -Infra-Rojo -Polarografía, VC., etc Directo propiedades del metal (oxidación y el número de coordinación )- permite caracterización cinética Indirecto 2 Radiación Electromagnética Longitud de onda 1 λ, (m) 10-6 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 µm mm 10-5 10-4 10-3 10-2 10-1 1 10-7 10-8 10-9 10-10 10-11 10-12 10-13 10-14 nm 10 101 Å 102 pm 103 104 105 106 Energía hν, (eV) 107 Radiación Radio Microondas IR Vis UV Rayos X Rayos X (suaves) (duros) Rayos Rayos γ cósmicos Excitación vibración electrónica e- de core bajo y alto nuclear rotación + Campo B espín nuclear Espectroscopía espín electrón NMR EPR FTIR, Raman Abs,CD/MCD L-, K-edge XAS Métodos instrumentales (Técnicas Técnicas Espectroscópicas) utilizados en química inorgánica. Gamma eV 14000 Rayos X 8000 UV/vis Infra-rojo 4-1 2000 Micro-ondas Radiofrecuencia 0.1-0.01 10-4 -10-5 10-6 -10-7 IR EPR NMR ABS Mössbauer 0 δ XAS 1800 1900 1400 2100 2000 1500 1600 1700 -1 Wavenumber (cm ) EXAFS MCD Raman mm/s 2500 x1/3 EXAFS edge 3000 ENDOR 3500 Magnetic field (G) Q 351 near-edge 407 pre-edge EQ 8960 8980 476 9000 9020 Energy (eV) 9040 9060 CD 530 568 676 30000 25000 20000 15000 10000 -1 Wavenumber (cm ) 400 500 700 -1 Raman Shift (cm ) 800 11 12 13 14 15 16 17 Frequency (MHz) 3 EPR vs. NMR 1.95 2.08 EPR Muy especifico dado que los paramagnetos son relativamente raros; en una proteína se puede esperar solo un centro paramagnético Radiación de micro-ondas con energías de 1010 Hz (10 GHz) y λ de ~ 5 cm Se hace un barrido de campo magnético (0 – ≈ 6000 G) a frecuencia constante µe = -gβS (β = eh/4πmc) g ~ 2.00 1.96 2.05 Reduced Enzyme T<=10K 1.87 2800 3000 3200 3400 3600 3800 4000 Magnetic Field (G) centros Fe-S < 10 K EPR vs. NMR NMR Mas general dado que 1H, 31P, 13C son altamente abundantes; en proteínas, millones de magnetos nucleares radiación de radiofrecuencia con energías de 108 Hz (100 MHz) y λ de ~ 100 m Se hace un barrido de frecuencia a campo magnético constante µN = -gNβ NI (βN = eh/4πMc) gN ~ 5.58 para un protón 4 Fenómeno de EPR Desdoblamiento de niveles electrónicos (Efecto Zeeman) m s = +1/2 hν = gβH Zero Field m s = -1/2 Increasing Field En un campo magnético aplicado, el espín del electrón se alinea de forma paralela o antiparalelamente al campo. Estas orientaciones tiene diferente energía. Este desdoblamiento es llamado el desdoblamiento Zeeman. Información obtenida por EPR 1. Cuál tipo de paramagneto esta presente? ... Huellas digitales! Metal, Radical, sistemas Interactuando, ... 2. Cuántos Paramagnetos están presentes? ... Cuantificación! 3. Información sobre estructura Geométrica y Electrónica de las especies paramagnéticas. 4. En Metales de Transición - Información cualitativa acerca del Tipo y Numero de Ligantes 5. Es la sustancia, ¿paramagnética ? ... pero algunos sistemas de espín entero (S = 1, 2, 3, etc) son inactivos al EPR, “EPR silent” 6. En sistemas interactuantes– Información sobre las Distancias 5 Campos de aplicación de EPR Que sustancias pueden ser medidas por EPR? Todas las sustancias que contengan al menos un electrón desapareado Física: susceptibilidad, semiconductores, puntos cuánticos, centros de defecto... Química: cinética de reacción - et, organometálica, catálisis, magnetos moleculares... ionización por Radiación : dosimetría – radiación de alanina, daño por radiación , alimentos irradiados... Investigación de materiales : polímero, vidrios, superconductores, corrosión, fulerenos, marcaje ... Biología: reacción, plegamiento & dinámica de enzimas, cinética de reacción -et, centros metálicos... (Química Bioinorgánica) ÁREAS RELACIONADAS La técnica de EPR involucra variadas disciplinas incluyendo química, física, biología, ciencia de materiales y ciencias médicas. A través de estas medidas espectroscópicas se puede obtener importante información estructural y dinámica, aún de procesos químicos o físicos que están ocurriendo al momento de realizarse las medidas y sin perturbar al proceso como tal. 6 APLICACIONES QUÍMICA Birradicales y moléculas en estado triplete Investigaciones cinéticas Comportamiento de radicales libres en corrosión Comportamiento de pinturas bajo irradiación UV Investigación de Polímeros Procesos de oxidación-reducción Estudio de mecanismos de reacción etc FÍSICA •Efectos de las irradiaciones •Defectos en cristales ej.: Centros de color en haluros alcalinos Detección óptica de Resonancia Magnética Influencia de impurezas en semiconductores Campos cristalinos en monocristales Microcristales con iones magnéticos etc GEOLOGÍA Datación Sonoquímica in situ APLICACIONES BIOLOGÍA Efecto de los Rayos X sobre compuestos biológicos Detección de drogas Control de alimentos irradiados Reacciones enzimáticas Fotosíntesis Observación de iones y elementos de transición Propiedades magnéticas anormales de ácidos nucleicos etc MEDICINA Investigación de reacciones carcinogenésicas Estudio de la sangre y de microorganismos Estudio de radicales libres en tejidos vivos Fotosíntesis Técnicas de “spin label” Técnicas de”spin probe” “Técnicas de imaging” etc 7 Aplicabilidad de EPR Que sustancias pueden ser medidas por EPR? En Química Bioinorgánica estos son: 1. 2. 3. 4. 5. Iónes de Metales de Transición (CuII,NiI,III,CoII,FeIII,MnII,VIV,MoV) Radicales de cadenas laterales de Proteínas (Tyr•,Trp•,Gly•,Cys•) Radical Cofactor (Semiquinonas, Radical Flavina ...) Radicales Inorgánicos (NO•,O2•-,....) Especies paramagnéticas transcientes en procesos generados por luz ...pero también 1. Trampas de espín (spin traps) pueden ser usados para “atrapar” Radicales de vida corta 2. Etiquetas de espín (Spin Labels) se pueden adjuntar a Proteínas, Ácidos Nucleicos, ... Para estudiar su estructura y Dinámica Ejemplo 1; Radicales Libre Disminución de la señal RPE (resonancia paramagnética electrónica) emitida por el radical hidróxido generado por vía química. 8 Ejemplo 2; INDUSTRIA DEL PETRÓLEO Las anomalías micromagnéticas observadas sobre los campos se han interpretado como el resultado de la presencia, en niveles cercanos a la superficie, de abundante magnetita en forma de agregados esferoidales de cristales que han crecido por la alteración de óxidos de Fe en un ambiente reductor inducido por el H2S y el petróleo gaseoso que se desprenden del reservorio subyacente. Ejemplo 3; DOSIMETRÍA Los cambios inducidos en las propiedades físicas de materiales estables, debido a la creación en ellos de centros paramagnéticos, son estudiados en detalle mediante espectroscopía de Resonancia Paramagnética Electrónica (EPR). Los parámetros físicos obtenidos son: el momento magnético efectivo del centro paramagnético, y las interacciónes hiperfinas, magnética y eléctrica, propias y con los átomos vecinos en el material. Otros parámetros importantes que se obtienen son: el número de defectos paramagnéticos, y su comportamiento dinámico, en función de temperatura y de tiempo. 9 REVISTA de divulgación internacional Fundada en 1989 http://ierec.scs.uiuc.edu/IES.html Federación Europea de Grupos de Resonancia Paramagnética Electrónica http://www.cf.ac.uk/esr/fed.html Bibliografía General 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. J. E. Huheey, E. A. Keiter, R. L. Keiter, “Inorganic Chemistry”, Harper Collins, 1993. Graybeal, D., "Molecular Spectroscopy", VCH, 1992 Drago, R. S., “Physical Methods in Chemistry”, Saunders College Pub. (Saunders Golden Sunburst Series), 1990 Atherton, N. M., “Principles of Electron Spin Resonance”, Ellis Horwood PTR Prentice Hall (Physical chemistry series), 1993 Weil, J. A., Bolton, J. 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Berliner & Jacques Reuben (eds), EMR of Paramagnetic Molecules in Biological Magnetic Resonance Vol. 13, Plenum, 1993 a) Neese, F., Zero-field splitting, in “Calculation of NMR and EPR parameters: theory and applications”, cap. 34, edit by Kaupp, M., Bühl, M & Malkin, V., Wiley-VCH, 2004; b) Neese, F., Application to EPR in Bioinorganic chemistry, in “Calculation of NMR and EPR parameters: theory and applications”, cap. 36, edit by Kaupp, M., Bühl, M & Malkin, V., Wiley-VCH, 2004 Algunos sitios web recomendados International EPR(ESR) Society http://ieprs.org/index.php Electron Magnetic Resonance at Bristol http://www.chm.bris.ac.uk/emr/ Index For Professor Phil Rieger's Notes on ESR http://www.chm.bris.ac.uk/emr/Phil/ Pagina de EPR de Bruker -Biospin http://www.bruker-biospin.com/brukerepr/index.html 11 Fundamentos de EPR Aspectos teóricos Propiedades Elementales de los Electrones Un Electrón tiene las siguientes propiedades: - • Masa me • Carga –e0 monopolo Eléctrico • Espín → Momento Dipolar Magnético µ S µ= − ge β 2.002319... Magneton de Bohr N S El Dipolo Magnético en un campo Magnético: N Dipolo Magnético E=-µ µB =±geβB campo B 12 Fenómeno de EPR Laboratory Paramagnet Electromagnet N N S S Higher Energy Moment against the direction of the field N S N S Lower Energy Moment in the direction of the field Un Electrón en un campo Magnético Energía de un Electrón en un campo magnético: E=-µ µB =±ge β |Β| cos(θ) En Mecánica cuántica : solo Orientaciones con cos(θ)=±1/2 son posible Así, el Electrón puede tener solo dos estados: |+1/2> y |-1/2> “Arriba“ “Abajo“ 13 Fenómeno de EPR Teoría vs. Experimento Primeramente, la energía E de un sistema está dada por el campo magnético aplicado y el momento magnético (µ) en la dirección del campo magnético aplicado B: E = -µ · B Para el caso más simple, un electrón libre (S = 1/2 y ms = +1/2), el momento magnético resultado del momento de espín intrínseco (µe) esta definido por: µe = -g β S E=hν Acorde con la ecuación de Planck así una transición (donde S=1/2) puede ser inducida entre estos niveles aplicando ∆E = h ν = g β B Fenómeno de EPR Condición de resonancia hν=gβB Donde B es el valor de campo donde ocurre la absorción de micro-ondas y β es el magnetón de Bohr (46.69 x 10-6 cm-1 G-1) ν = frecuencia (GHz) El efecto fue primero descubierto por Zavoisky en Kazan en 1944. E. Zavoisky, J.Phys. U.S.S.R., 9:211, 245 (1945). 14 Una Transición EPR Para cambiar la orientación del momento dipolar magnético del electrón en la presencia de un campo magnético se necesita aplicar una fuerza. Esta fuerza es provista por un fotón de microondas el cual induce una transición entre los niveles |-½> y |+½>. E(|+½>)= +½geβ|B| fotón de Microondas Condición de Resonancia : ∆E= geβ |B| = hν ν No Field E(|-½>)= -½geβ|B| Estados Electrónicos Field Present Fenómeno de EPR El Formalismo del Hamiltoniano de Espín; El experimento RPE registra la respuesta de una muestra paramagnética a la radiación electromagnética oscilante en presencia de un campo magnético estático. Por lo tanto, para interpretar el espectro RPE necesitamos considerar todas las interacciones entre el paramagneto y el campo magnético aplicado. Como? Ĥ Ψ = E Ψ (Mecánica Cuántica) 15 Fenómeno de EPR ĤΨ=EΨ ¿Quien es Ĥ? Ĥ = Ĥ elec + Ĥ CF + Ĥ LS + Ĥ ZE + Ĥ SS + Ĥ HF + Ĥ ZN + Ĥ II + Ĥ Q $ $ $ H elec = ∇ + V donde Ĥ es el operador Hamiltoniano total Pero si se considera solo la interacción del espín, ya sea nuclear o electrónico, se constituyen lo que se conoce como el Hamiltoniano de espín ĤS = Ĥ ZE + Ĥ LS + ĤSS + Ĥ HF + Ĥ Q Átomo de Hidrógeno: Hamiltoniano Magnético z Interacción ZEEMAN µH = γHI µe= −γeS S I B = k Bo Interacción de Contacto de FERMI Interacción DIPOLAR H = − gHβΗB0Iz + geβeB0Sz + a SzIz + a/2(S+I− + S−I+) 16 Diagrama de bloque de un espectrómetro EPR 1ra derivada CAVIDAD RESONANTE Si 2PoutT1« 1, donde Pout es la salida del Atenuador, entonces: dE dt = n0 Pout ∆E 17 SIMULACIÓN DE ESPECTROS DE RPE SIM (1993) A) Generación o Detección B) Análisis del Espectro de RPE (Confirmación de los valores de aj) C) Asignación de las aj (Cálculos Teóricos) SIMULADORES WINSIM (1996) Hogni Weihe, Copenhagen University Denmark WINEPR(1990) WINEPR SimFonia (1996) XSOPHIE (2002) Dave Duling, PEST Winsim: EPR Calculations for MS-Windows NT,95 Version 0.96, Public ESR Software Tools (P.E.S.T.), National Institute of Environmental Health Sciences Bruker WINEPR system (1990-96), Bruker-Franzen Analytik GmbH, Version: 2.11 WINEPR SimFonia Version 1.25 Bruker Analytische Messtecnik GmbH Simulación de espectros EPR de muestras aleatoriamente orientados (polvos) Donde S(B, νc) denota la intensidad espectral, µij2 es la probabilidad de transición, νc es la microondas frecuencia, νo(B) es la frecuencia resonante, σv es el ancho de la línea espectral, f [(νc - ν0(B), σv] una función de la forma de línea espectral (Gaussiana o Lorentziana) y C = constante centros paramagnéticos: simetría ortorrómbica o monoclínica, la integración necesita solo ser realizada sobre 1 o 2 octantes, respectivamente. simetría axial solo requiere integración sobre 0 < θ < π/2 simetría cúbica solo requieren a single orientación. 18 MÉTODOS DE CÁLCULO EN QUÍMICA TEÓRICA Hückel (HMO) π-Electrónicos SC-HMO Pariser-Parr-Pople (PPP) MÉTODOS ZDO Pople et al. All Valence CUÁNTICOS Dewar et al. MÉTODOS Ab initio CNDO INDO PNDO MINDO/n PM3 AM1 SCF-HF (Hartree-Fock) CI (Int. de Configuraciones) MP (Møller-Plesser) CC (Coupled Cluster) FUNCIONALES DE LA DENSIDAD (DFT) LDA GC SVWN BLYP Híbridos B3LYP 19 Radical Vinilo Radical Naftaleno 8 Cálculo de tipo DFT: B3LYP/EPR-II 1 7 2 6 3 Geometría optimizada con UHF/6-311++G(3df,2dp) 13C 1 H3 H1 H2 13C 2 5 Exp. 4 McCONNELL a1 = 4.90 G ρ1π (1,4,5,8) = 0.181 a2 = 1.83 G ρ2π (2,3,6,7) = 0.069 a1 a2 = 2.67 ρ1 ρ2 = 2.62 Núcleos Exp (G) líneas Teor. (G) 13C 1 107.57 (D) 1:1 115.24 13C 2 - 8.55 (D) 1:1 - 6.06 H1 68.5 (D) 1:1 63.02 H2 34.2 (D) 1:1 36.44 H3 15.7 (D) 1:1 17.98 Densidad de espín (DFT) B3LYP/EPR-II//UHF/6-311++G(3df,2dp) Densidad electrónica Densidad de espín 20 Puente de hidrógeno intermolecular (trazo de contorno HOMO del compuesto trans-1) Theoretical study was performed using code deMon-KS, which is a DFT-LCGTO-based method. Sosa-Torres, et al, Inorg. Chim. Acta, 357, 4596 (2004) Cu A ¿Estructura? Cu-Cu; Cu-S; Cu-N distances; metal coordination numbers 21 Escala de g en metales de transición gy=1.91 gz=2.02 Centros Fe-S en Proteínas y Enzimas. Señales EPR Características reduced gav=1.91 [2Fe-2S]2+/+ Rieske gz=2.05 reduced gav=1.96 gx=1.79 [2Fe-2S]2+/+ Ferredoxin gy=1.95 oxidized gav=2.01 gx=1.89 gz=2.02 [3Fe-4S]+/0 gx,y=2.00 reduced gav=1.96 Química BioBioinorgánica oxidized gav=2.06 gz=2.06 gy=1.92 [4Fe-4S]2+/+ gx=1.88 gx,y=2.04 gz=2.12 [4Fe-4S]3+/2+ HiPIP 300 320 340 360 380 400 Magnetic field [mT] 22 Interacción espín electrónico - espín nuclear El desdoblamiento electrón - núcleo refleja el ambiente del electrón y puede ser usado para identificar el tipo de molécula que contiene un electrón desapareado e identificar a detalle la distribución de carga electrónica. especies NiFe-CO •El primer cúmulo metálico en biología conteniendo Ni y Fe (1985) Ni X Fe S S Fe Fe S S Fe Interacción espín electrónico - espín nuclear freq = 9.86486 e+09 Hz N O. 3470 3480 3490 3500 3510 3520 3530 3540 3550 3560 3570 Campo magnético (G) 23 Interacción espín electrónico - espín nuclear Interacción espín electrónico - espín nuclear Espectro ESR del radical anion naftaleno; espectros delgadas en la parte baja muestra el quinteto 1:4:6:4:1 correspondiente al acoplamiento a las 2 series de 4 protones equivalentes. 24 Interacción espín electrónico - espín nuclear Espectro ESR, de muestra en polvo simulado por computadora, de Cu(acac)2 Interacción espín electrónico - espín nuclear [*10^ 3] 6 Cu(tpp) 4 2 0 -2 -4 -6 -8 -10 2500 2600 2700 2800 2900 3000 [G] 3100 3200 3300 3400 3500 25 Interacción espín electrónico - espín nuclear ANISOTROPÍA DEL Co2+ (S =3/2, I =7/2) EN ENTORNO OCTAÉDRICO Interacción espín - espín Sistemas acoplados con ST = 1, 2 electrones desapareados que pueden interactuar para dar un sistema de espín con 4 subniveles ms =0, (-1, 0, +1). S = 0, 1 Ms= 0, +1 0 -1 La magnitud de J puede ser determinada por EPR. 26 TÉCNICAS DE GENERACIÓN DE ESPECIES PARAMAGNÉTICAS Solamente una muy pequeña fracción de sustancias se encuentran en la naturaleza en un estado paramagnético Estos son los siguientes: O2, NO, radicales NITRÓXIDO, ciertos IONES DE TRANSICIÓN y ciertos DEFECTOS PUNTUALES en Sólidos. Sin embargo es posible obtener sustancias paramagnéticas utilizando alguno de los siguientes procesos: A). Reducción Química Monoelectrónica. La reacción de ciertos hidrocarbonos poliacénicos con metales alcalinos en éter y en vacío da lugar a disoluciones estables de los correspondientes ANIONES RADICALES. B). Oxidación Química Monoelectrónica. Las Reacciones de los mismos poliacenos con un oxidante fuerte, tal como H2SO4 concentrado o AlCl3, dan lugar a disoluciones estables de los correspondientes CATIONES RADICALES Los radicales OH. formados por fotolisis del H2O2 , abstraen átomos de hidrógeno de muchas moléculas orgánicas dando lugar a RADICALES LIBRES. C). Abstracción y Adición de Átomos de Hidrógeno La fotolisis de peróxidos orgánicos da lugar a radicales alcóxidos que también actúan abstrayendo átomos de H de moléculas orgánicas dando radicales libres. Cualquier tipo de irradiación de alta energía de monocristales orgánicos dan lugar a RADICALES LIBRES. La irradiación de determinadas muestras dan lugar a procesos fotoquímicos, D). Fotolisis que frecuentemente transcurren por VIA RADICALARIA. Si la vida de estos radicales es corta, se ha de realizar la Fotolisis in situ. En casos de vida muy corta es necesario utilizar técnicas de flash-fotolisis in situ. Las radiaciones de alta energía (Rayos X, Rayos γ y electrones rápidos E). Radiolisis de un Acelerador) siempre producen intermedios RADICALARIOS que pueden detectarse si son de vida corta con técnicas in situ o con radiolisis de pulso usando haces de electrones de muy alta energía con un Generador de Van der Graaf por ejemplo. 27 F). Generación Térmica La descomposición térmica de Cl2 y de ciertas especies en disolución dan lugar a RADICALES LIBRES. La técnica consiste en introducir un hilo de Pt caliente en la cavidad en el caso de gases. Ciertas sustancias: nitróxidos y nitronas que son diamagnéticas en sus G). Spin-Trapping estados normales, pueden reaccionar con radicales de vida muy corta (OH.) y dar lugar a RADICALES ESTABLES que pueden ser detectados y analizados fácilmente por RSE. H). Métodos Electroquímicos (espectro-electroquímica) Con una celda diseñada especialmente para la cavidad, pueden realizarse reacciones de oxidación y de reducción monoelectrónicas in situ, generándose así ANIONES y CATIONES RADICALES. Para sistemas en fase gas se utiliza una cámara de descarga adyacente a la I). Descargas cavidad resonante del espectrómetro que permite la generación de RADICALES LIBRES gaseosos que fluyen hacia dicha cavidad. SPIN - TRAPPING Muchos mecanismos de reacción biológicos han podido ser explicados gracias a esta técnica. Básicamente consiste en utilizar una sustancia diamagnética para estabilizar a un radical de vida muy corta y formar un ADUCTO PARAMAGNÉTICO Y ESTABLE. Del análisis del espectro de RSE del aducto y del conocimiento de la estructura del atrapador se puede deducir la estructura del radical atrapado. Detectables No detectables Radicales persistentes o estables. Son aquellos cuya concentración es [R.] > 10-7 El ejemplo más paradigmático de radical persistente obtenido por síntesis química es el RADICAL LIBRE PERCLORO TRIFENILMETANO (C6Cl6)3C. obtenido por el Grupo del Prof. Ballester (CSIC-Barcelona) en la década de los 60. (Le denominaban TIGRE ENJAULADO) Radicales inestables. Son aquellos cuya concentración es [R.] < 10-7 incluso en régimen de flujo estacionario típico de las técnicas in situ: Estable a T >300ºC No reacciona con HNO3/HCl O2.-, OH. , OR. ,SR. , (C6H6)3C. ,etc Insoluble en H2O 100% Radical 28 SPIN TRAPPING R. + ST AS. Aducto de spin: persistente Radical inestable Spin trap (diamagnético) Del análisis del espectro de del aducto se puede deducir la estructura del radical R. Spin Traps ( Nitrosocompuestos, nitronas) BIBLIOGRAFIA BÁSICA A. Carrington and McLachlan. Introduction to Magnetic Resonance. Harper Int., 1969 J.E. Wertz and J.R. Bolton. Electron Spin Resonance. Theory and Application. McGraw Hill, 1994. N.M. Atherton. 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