Transición Epitelial-Mesenquimal (EMT) en Cáncer Mamario Alejandro Cervantes Arias, David J. Argyle University of Edinburgh, The Roslin Institute Estudiante de Doctorado Introducción La Transición Epitelial-Mesenquimal (EMT) es un proceso presente durante la embriogénesis, carcinogénesis, metástasis y recurrencia tumoral. Durante este proceso, las células epiteliales pierden sus características y adquieren propiedades mesenquimales: pérdida de adhesión celular, aumento en movilidad e invasividad, resistencia a apoptosis, y cambios morfológicos. Este complejo proceso involucra diversos factores de transcripción y posteriores objetivos transcripcionales epiteliales y mesenquimales, incluyendo E-Cadherina, -catenina, Fibronectina, y Vimentina. Particularmente, la vía de señalización del Factor de Crecimiento Transformante beta (TGF-B) es crucial para la inducción de la EMT, durante la cual las células de cáncer mamario pueden adquirir características de célula madre (célula troncal). Mi proyecto de investigación se ha basado en la evaluación del TGF-B como promotor del proceso de EMT durante la metástasis en carcinoma mamario de HUMANOS, perros y gatos. Además, hemos trabajado investigando un posible vínculo entre la EMT y la teoría de las células madre de cáncer a través del tratamiento celular con TGF-B. EMT Polaridad arriba-abajo Células epiteliales Epitelio (nicho) Células mesenquimales Polaridad frente-atrás Vaso sanguíneo MET Polaridad frente-atrás Polaridad arriba-abajo Epitelio (nicho) Objetivos: Hemos demostrado que el TGF-B puede inducir EMT en células de carcinoma mamario de humanos, perros y gatos, y aparentemente también permite que las células adquieran características de célula madre; como resistencia a la apoptosis y auto-renovación. Si logramos confirmar esto, el TGF-B puede ser un blanco para bloquear la EMT durante el progreso del cáncer y así, desarrollar una potencial cura. Resultados: Las células estimuladas con TGF-B mostraron morfología mesenquimal (forma alargada) y un visible incremento en marcadores mesenquimales y factores de transcripción así como una disminución en marcadores epiteliales confirmado por análisis de Western Blot. También mostraron mayor habilidad de invasión en ensayos de cierre de herida. Las células estimuladas migraron mas rápido que las no estimuladas, colonizando así la herida. Además, la habilidad para formar mamo-esferas (las cuales son representativas de células madre de cáncer) fue mayor en células estimuladas, mostrando a su vez incremento en marcadores mesenquimales, sugiriendo un vínculo entre la EMT y las células madre de cáncer. Se llevaron a cabo estudios de expresión de proteína mediante los cuales confirmamos que las células estimuladas expresan marcadores mesenquimales en mayor proporción que las no estimuladas. Finalmente, células estimuladas y no estimuladas fueron clasificadas en CD133+ y CD133- (CD133 es un marcador de células madre) para así poder evaluar su respuesta a agentes quimioterapéuticos. Las células fueron expuestas a diferentes concentraciones de los quimioterapéuticos Doxorubicina y Mitoxantrona, donde se pudo observar que en las células clasificadas como CD133-, las estimuladas con TGF-B mostraron mayor resistencia. Cambios morfológicos: Se observaron cambios en morfología celular en líneas celulares de carcinoma mamario de perros (REM), gatos (CMC) y humanos (MCF7), en donde las células sin tratamiento permanecían con morfología epitelial mientras las células tratadas con TGF-B a 10ng/ml mostraron morfología mesenquimal (forma alargada y pérdida de contacto celular), lo cual puede ser el primer paso de invasión y metástasis en células cancerosas. Grupo control (MCF7) MCF7 + TGF Formación de mamo-esferas: Las células tratadas pudieron formar de manera más fácil y rápida células esferoidales en un medio de cultivo sin suero y con bajos niveles de glucosa en recipientes de baja adherencia a una densidad baja. Estas esferas son representativas de células madre de cáncer. REM CMC MCF7 Cambios a nivel molecular: Se realizaron estudios de expresión de proteínas por medio de análisis de Western Blot, en donde se pudo confirmar que las células tratadas expresaban marcadores mesenquimales en mayor proporción comparadas con las células no tratadas. Así mismo, los marcadores epiteliales se vieron reducidos significativamente en las células estimuladas con TGF- . Ensayo de cierre de herida: Posterior a realizar una “herida” con una punta de pipeta de 200 µl en pozos cubiertos por células, se compararon las distancias relativas de migración, en donde pudimos observar que las células tratadas con TGF- cerraron la herida más rápido que las células no tratadas, dando a entender que su respuesta migratoria es mejor. Tanto las células de carcinoma mamario canino como las de carcinoma mamario felino que fueron estimuladas con TGF- migraron más rápido que las no estimuladas. Para calcular el porcentaje de la distancia relativa de migración se utilizó esta fórmula: % = 100 (A-B) /A, en donde A = ancho de herida antes de incubación y B = ancho de herida después de incubación. Ensayo de quimio-sensibilidad: Previamente se separaron las células CD133+ y CD133- (CD133 es un marcador de células madre) para evaluar la respuesta a quimioterapia de células que supuestamente deben ser mas resistentes. Se sometieron las células a diferentes concentraciones de los agentes quimioterapéuticos Doxorubicina y Mitoxantrona, en donde se observo que entre las células CD133-, las tratadas con TGF- mostraron más resistencia que las no tratadas. Conclusiones Estos datos confirmaron que durante la EMT, las células de carcinoma mamario adquieren características de células madre mediante TGF-B, sugiriendo que la EMT y el fenotipo de célula madre están estrechamente relacionados durante la migración celular y metástasis. Estos hallazgos indican que la vía del TGF-B puede ser un blanco importante para el desarrollo de terapias nuevas contra el cáncer y su progreso. A B Perspectivas: • Interferencia de ARN por medio de siRNA de ciertos genes como Tribbles1, posiblemente involucrados en este proceso. • Ensayos de invasión celular in vitro. • Ensayos de invasión celular in vivo utilizando la membrana corio-alantoidea de embriones de pollo como modelo (membrana con alto número de vasos sanguíneos).