2. Instrumentación de microscopía óptica

2. Instrumentación
de microscopía óptica
2. Instrumentación de microscopía óptica
Lentes
Un medio transparente
limitado por dos
superficies
curvas
2. Instrumentación de microscopía óptica
Lentes
Diferente curvatura
2. Instrumentación de microscopía óptica
Lentes
Diferente curvatura
2. Instrumentación de microscopía óptica
Lentes
Diferente curvatura
2. Instrumentación de microscopía óptica
Lentes
Diferente índice de refracción
2. Instrumentación de microscopía óptica
Lentes
Diferente índice de refracción
2. Instrumentación de microscopía óptica
Lentes
Distancia focal:
El punto de convergencia de los rayos refractados cuando los
rayos incidentes provienen de una fuente tan lejana que
pueden considerarse paralelos entre sí.
Distancia
focal
2. Instrumentación de microscopía óptica
Lentes positivas (convergentes)
Enfocan los rayos paralelos en un punto detrás de la lente
Biconvexa
Plano-convexa
Menisco
2. Instrumentación de microscopía óptica
Lentes negativas (cóncavas)
Bicóncava
Plano-cóncava
Menisco
2. Instrumentación de microscopía óptica
Lentes negativas (cóncavas)
Divergen los rayos de luz
2. Instrumentación de microscopía óptica
Lentes negativas (cóncavas)
Distancia focal
F
2. Instrumentación de microscopía óptica
Aberraciones de las lentes
ABERRACIÓN:
Imperfección de un sistema óptico que
produce una imagen defectuosa, deficiente
en nitidez o en su semejanza al objeto.
2. Instrumentación de microscopía óptica
Tipos de aberraciones
Aberraciones geométricas
Aberraciones cromáticas
●
Aberración esférica
●
De posición
●
Astigmatismo
●
De magnitud
●
Coma
●
Distorsión
●
Curvatura de campo
2. Instrumentación de microscopía óptica
Aberración esférica
Los rayos que atraviesan la lente cerca de sus extremos
convergen en un punto más cercano a la lente que los que
cruzan por el centro.
2. Instrumentación de microscopía óptica
Aberración esférica
Causas:
●
Daños en el objetivo, grasa de los dedos y restos de aceite de
inmersión en la lente frontal del objetivo.
●
Cubreobjetos de espesor o índice de refracción inadecuado.
●
Longitud de tubo incorrecta.
●
Medio de montaje inadecuado.
●
Espesor excesivo de la muestra.
2. Instrumentación de microscopía óptica
Aberración esférica
Corrección:
●
●
Combinación de lentes convergentes y divergentes con
aberraciones esféricas opuestas.
Insertando diafragmas fijos en el objetivo reduciendo el
campo visual a la región central de la imagen.
2. Instrumentación de microscopía óptica
Astigmatismo
Las líneas verticales y horizontales se enfocan en dos
puntos distintos del eje óptico.
Punto de enfoque de las líneas verticales
Punto de enfoque de las líneas horizontales
Punto objeto
2. Instrumentación de microscopía óptica
Coma
Diferentes zonas circulares concéntricas de la lente
proporcionan aumentos distintos a una imagen desplazada
del eje.
Imagen
Punto objeto
2. Instrumentación de microscopía óptica
Distorsión
La imagen aparece deformada a causa de un incremento o
descenso gradual desde el centro hasta el contorno. Las
líneas rectas aparecen curvadas.
Se produce en lentes a las que se les pone un diafragma.
Imagen normal
Distorsión de cojín
Distorsión de barril
2. Instrumentación de microscopía óptica
Curvatura de campo
La lente enfoca una superficie plana del objeto como si
fuese esférica.
Cuando están enfocados los bordes del objeto no lo está el
centro y al revés.
El centro y los límites de la imagen se enfocan a distancias
distintas.
2. Instrumentación de microscopía óptica
Aberración cromática de posición
Los distintos colores o longitudes de onda de la luz se
enfocan a diferentes distancias de la lente.
La imagen aparece rodeada de anillos con variedad de
colores según el enfoque.
λ azul < λ verde < λ rojo
2. Instrumentación de microscopía óptica
Aberración cromática de magnitud
Los rayos de luz de un determinado color se proyectan
con más aumentos que los rayos de luz de otro color.
2. Instrumentación de microscopía óptica
Aberración cromática
CORRECCIÓN:
●
●
●
Utilizar una fuente de luz monocromática.
Introducir un sistema de filtros que solo dejen pasar
unas pocas longitudes de onda.
Sustituir la lente simple por un doblete de lentes
combinando distintos tipos con los índices de refracción
y dispersión adecuados.
2. Instrumentación de microscopía óptica
Descripción del microscopio óptico
Partes mecánicas:
Son las partes y dispositivos que tienen la
misión de soportar los componentes ópticos a
la vez que facilitan las manipulaciones y el
uso del instrumento.
2. Instrumentación de microscopía óptica
Descripción del microscopio óptico
Tubo
(binocular)
Revólver
Platina
Movimiento
(foco)
Pie
Columna
o brazo
2. Instrumentación de microscopía óptica
Descripción del microscopio óptico
Objetivo:
2. Instrumentación de microscopía óptica
Descripción del microscopio óptico
Objetivo:
●
●
●
Es el sistema óptico convergente colocado en
el extremo correspondiente al objeto.
La lente o conjunto de lentes que se sitúan
más cerca de la preparación.
Su finalidad es formar una imagen real de
ésta que será observada a través de un ocular
o recogida en una pantalla.
2. Instrumentación de microscopía óptica
Descripción del microscopio óptico
Objetivo:
Sus principales características son
●
Aumento
●
Apertura numérica
2. Instrumentación de microscopía óptica
Descripción del microscopio óptico: objetivo
Aumento:
Aumento total = Aumento objetivo x aumento ocular
Generalmente ocular = 10X
Por ejemplo, para un objetivo de 100X
Aumento total = 100 x 10 = 1000 aumentos
2. Instrumentación de microscopía óptica
Descripción del microscopio óptico: objetivo
Aumento:
¿Qué significa un aumento de 1000X?
¡Hay que poner siempre la escala en las imágenes!
2. Instrumentación de microscopía óptica
Descripción del microscopio óptico: objetivo
●
Ángulo de apertura:
Es el formado por los rayos extremos que
intervienen en la imagen.
Objetivo
2α
Muestra
2. Instrumentación de microscopía óptica
Descripción del microscopio óptico: objetivo
●
Apertura numérica:
Es una medida de la capacidad para recoger
la luz y resolver detalles pequeños a una
distancia objeto fija.
Apertura numérica, A.N. = n x sen α
n es el índice de refracción del medio
α es el semiángulo de apertura
2. Instrumentación de microscopía óptica
Descripción del microscopio óptico: objetivo
Apertura numérica:
●
●
Expresa el diámetro del haz luminoso que
puede recoger el objetivo.
Se entiende que cuantos más rayos
procedentes del objeto entren en la lente para
formar la imagen mejor será la calidad de
ésta, así como su definición.
2. Instrumentación de microscopía óptica
Descripción del microscopio óptico: objetivo
Apertura numérica:
A.N. = n x sen α
●
●
Se puede aumentar α. Pero llegar al máximo
teórico de 90º se ve limitado en la práctica.
Se puede aumentar n. Mediante líquidos de
inmersión.
2. Instrumentación de microscopía óptica
Descripción del microscopio óptico: objetivo
●
Aumento útil:
Es la relación entre el tamaño de la imagen y
el tamaño del objeto.
Hay un mínimo para que se puedan resolver los detalles
que está en torno a 500 veces la A.N.
Hay un máximo más allá del cual no se obtiene más
resolución ni más información y está en torno a 1000
veces la A.N., son aumentos vacíos.
2. Instrumentación de microscopía óptica
Descripción del microscopio óptico: objetivo
●
Poder de resolución:
El inverso de la mínima distancia entre dos
puntos que todavía se entienden como
separados, d.
Se define en relación a la A.N. y a λ.
d = 0,61λ / A.N.
2. Instrumentación de microscopía óptica
Descripción del microscopio óptico: objetivo
Poder de resolución:
d = 0,61λ / A.N.
Plan-apo (inmersión) 100 X - A.N.=1,40
●
Luz azul (400 nm)
d = 0,61*400/1,40 = 174 nm
●
Luz roja (650 nm)
d = 0,61*650/1,40 = 283 nm
2. Instrumentación de microscopía óptica
Descripción del microscopio óptico: objetivo
●
Distancia de trabajo:
La distancia entre la lente frontal del objetivo y
la muestra cuando ésta está enfocada.
Objetivo
Distancia de trabajo (WD)
Muestra
2. Instrumentación de microscopía óptica
Descripción del microscopio óptico: objetivo
Distancia de trabajo elevada:
Distancia de trabajo corta:
Baja resolución
Alta resolución
d = 0,61λ / A.N.
A.N. = n x sen α
2. Instrumentación de microscopía óptica
Descripción del microscopio óptico: objetivo
Tipos de objetivos según las correcciones:
●
●
●
●
Acromáticos: corregida la a. cromática para rojo y azul, y
la esférica para verde.
Semiapocromáticos (fluorita): corregida la a. cromática y
esférica para 2 ó 3 colores.
Apocromáticos: corrección cromática y esférica para 4 ó
más colores.
De campo plano: curvatura de campo muy corregida.
2. Instrumentación de microscopía óptica
Descripción del microscopio óptico: objetivo
Tipos de objetivos según las correcciones:
A. esférica
Acromáticos
A. cromática
Curv. campo
1 color
2 color
no
Plan-acromáticos 1 color
2 color
sí
Fluorita
2 – 3 colores
2 – 3 colores
no
Plan-fluorita
3 – 4 colores
2 – 4 colores
sí
Plan-apocromát.
3 – 4 colores
4 – 5 colores
sí
2. Instrumentación de microscopía óptica
Descripción del microscopio óptico: objetivo
Indicaciones en el exterior de los objetivos:
Fabricante
Correcciones
Aumentos
Óptica corregida a infinito
Sin cubreobjetos
Apertura numérica
Distancia de trabajo
2. Instrumentación de microscopía óptica
Descripción del microscopio óptico: objetivo
2. Instrumentación de microscopía óptica
Descripción del microscopio óptico: objetivo
2. Instrumentación de microscopía óptica
Descripción del microscopio óptico
Longitud de tubo: Óptica corregida a infinito (ICS)
tubo
2. Instrumentación de microscopía óptica
Descripción del microscopio óptico
Longitud de tubo: Óptica corregida a infinito (ICS)
La distancia imagen se sitúa en el infinito, es decir, los
rayos de luz que salen del objetivo son tan paralelos
que parece que la imagen se forme en el infinito.
Se coloca estratégicamente una lente de tubo dentro
del cuerpo del tubo entre el objetivo y el ocular para
producir la imagen intermedia.
2. Instrumentación de microscopía óptica
Descripción del microscopio óptico: (ICS)
Óptica corregida a infinito
ocular
objeto
objetivo
lente intermedia
Óptica finita
ocular
objeto
objetivo
2. Instrumentación de microscopía óptica
Descripción del microscopio óptico
Sistemas de iluminación:
●
Condensadora
●
Fuentes de iluminación
2. Instrumentación de microscopía óptica
Descripción del microscopio óptico
Condensadora:
Es el sistema óptico convergente situado
antes de la platina encargado de iluminar
adecuadamente el objeto para obtener el
máximo rendimiento del objetivo.
2. Instrumentación de microscopía óptica
Descripción del m. óptico: condensadora
Cuando la A.N. de iluminación es casi igual a la A.N.
máxima del objetivo se disminuye el contraste.
En las muestras de contraste alto con detalles diminutos
se debería iluminar la A.N. del objetivo por completo.
Pero si la muestra tiene poco contraste se debe
disminuir el cono de iluminación de la A.N. del objetivo
para impedir que la imagen quede borrosa debido al
poco contraste.
2. Instrumentación de microscopía óptica
Descripción del m. óptico: condensadora
El cono de luz que ilumina la A.N. de objetivo se controla
por medio de un diafragma de iris.
Si el diafragma está muy cerrado la imagen está
demasiado contrastada y se pierde resolución.
Pero si está muy abierto la imagen sufre alteraciones a
causa de la difracción.
La posición correcta será cerrar hasta aproximadamente
2/3 del campo de visión cuando se observa el plano
focal posterior de la lente objetivo.
2. Instrumentación de microscopía óptica
Descripción del microscopio óptico
Fuentes de iluminación:
●
Luz natural: ya no se usa.
●
Lámpara incandescente: la más usada
●
Lámpara de arco: iluminación intensa y sin estructura
●
Lámpara de descarga: vapor de mercurio
2. Instrumentación de microscopía óptica
Descripción del microscopio óptico
Tipos de iluminación:
●
Iluminación crítica
●
Iluminación de Köhler
2. Instrumentación de microscopía óptica
Descripción del microscopio óptico
Iluminación crítica:
Se forma la imagen de la fuente luminosa sobre
la imagen a observar, en el plano de la muestra.
●
Iluminación muy brillante pero desigual con
puntos de diferente brillo.
2. Instrumentación de microscopía óptica
Descripción del microscopio óptico
Iluminación de Köhler:
Se ilumina estricta y únicamente la parte observada
del objeto.
Proporciona una intensidad suficiente y uniforme.
●
Evita la luz parásita que se produce en las partes
iluminadas y no observadas de la muestra.
2. Instrumentación de microscopía óptica
Mantenimiento, limpieza y conservación
del microscopio óptico
2. Instrumentación de microscopía óptica
Mantenimiento, limpieza y conservación
Cualquier componente es INCREÍBLEMENTE CARO
Enemigos primordiales del microscopio:
●
Polvo ¡¡Enemigo número 1!!
●
Agua y humedad ambiental
●
Grasa procedente de los dedos o del propio equipo
●
Restos de medios de inmersión, medios de montaje y
medios de cultivo
●
Ambientes químicamente agresivos
●
Sol directo y fuentes de calor
2. Instrumentación de microscopía óptica
Mantenimiento, limpieza y conservación
Normas básicas:
●
Cuando se hace mantenimiento de instrumentación hay
que invertir paciencia, no energía.
●
Siempre es mejor prevenir que reparar.
●
El microscopio óptico es un instrumento de precisión.
●
●
●
Hay que trabajar sobre una superficie
absolutamente limpia y con buena iluminación.
estable,
Usar la herramienta del tamaño apropiado.
No forzar nunca ningún elemento mecánico ni óptico
cuando se procede a desmontar y montar.
2. Instrumentación de microscopía óptica
Mantenimiento, limpieza y conservación
●
●
●
●
Cuando se retira cualquier elemento óptico o mecánico
que deje abierto el camino óptico, es imprescindible cegar
inmediatamente el hueco que queda libre con la ayuda de
una tapa ciega, o bolsa de plástico y cinta adhesiva con
el fin de evitar la entrada de polvo y suciedad.
No dejar nunca los tubos oculares o alguna posición del
portaobjetivos vacío, colocar un tapón ciego.
Cuando se desmonta un objetivo, mientras una mano lo
desenrosca la otra lo sujeta.
Cuando se monta un elemento óptico, no retirar la mano
hasta que no tengamos la absoluta certeza de que ha
quedado bien sujeto.
2. Instrumentación de microscopía óptica
Mantenimiento, limpieza y conservación
●
Está desaconsejado desarmar los elementos de los
conjuntos ópticos (ocular, objetivo, condensador, …) si no
es absolutamente imprescindible, puesto que se pueden
producir desajustes irreversibles en el posicionamiento de
las lentes, ya que, en muchos casos, han sido centradas
en fábrica por medio de banco óptico, y hacerlos reajustar
es caro.
Si se tuviera forzosamente que desarmar, es
recomendable apuntar la posición, el orden y la
orientación de todos los elementos ópticos y de las
respectivas piezas de sujeción.
2. Instrumentación de microscopía óptica
Mantenimiento, limpieza y conservación
●
●
●
Las ópticas y demás piezas que se vayan desmontando
hay que dejarlas en lugar seguro (cajas, estuches, …)
para evitar que rueden y caigan al suelo, depositándolas
en posición vertical y con el extremo que queda en el
interior del camino óptico protegido del polvo.
Si hay que reparar cualquier elemento situado en la base
del microscopio y para ello hay que tumbarlo o darle la
vuelta, primero es necesario retirar todos los elementos
que se sostienen por gravedad (filtros, oculares, …).
En ningún caso tocar el interior de los caminos ópticos
con los dedos, puesto que éstos suelen tener un
tratamiento superficial de color negro mate, y cualquier
huella de los dedos podría ocasionar brillos no deseados.
2. Instrumentación de microscopía óptica
Mantenimiento, limpieza y conservación
●
●
Evitar golpear la lente frontal de los objetivos contra la
preparación que se observa o contra cualquier otro
objeto. Esto podría producir rayas o señales sobre la
lente, fisuras en el cemento que fija la lente, e incluso su
desplazamiento hacia atrás. Si se fisura el cemento se
corre el riesgo de que entren líquidos como los medios de
inmersión o de montaje.
Los objetivos de inmersión hay que limpiarlos
inmediatamente al finalizar la sesión de observación.
2. Instrumentación de microscopía óptica
Mantenimiento, limpieza y conservación
●
●
●
Los restos de aceite o de otros medios de inmersión,
además de retener suciedad, pueden acabar
introduciéndose por capilaridad entre la montura y la lente
frontal del objetivo.
Al acabar la observación, limpiar el microscopio.
Siempre que no se esté utilizando el microscopio, debe
estar completamente tapado por medio de una funda.
Las fundas de plástico son un buen aliado para proteger
los microscopios.
2. Instrumentación de microscopía óptica
Mantenimiento, limpieza y conservación
Electrónica, fuentes de alimentación y sistemas de
iluminación:
Retirar el polvo de las ranuras de ventilación.
-Soplando con una pera de goma
-Aire o nitrógeno a presión
-Aspiración
Ayudándose de un pincel limpio, seco y libre de grasa.
2. Instrumentación de microscopía óptica
Mantenimiento, limpieza y conservación
Limpieza de la lámpara:
●
Alta temperatura, refrigeración por aire = polvo adherido
Dejar enfriar
Guantes de algodón
Retirar y limpiar con etanol
Suciedad carbonizada, usar amoníaco
2. Instrumentación de microscopía óptica
Mantenimiento, limpieza y conservación
Sustitución de la lámpara:
●
Respetar la duración máxima de las lámparas de vapor
de mercurio
Se limpia antes de colocarla como si fuese una lámpara
usada
2. Instrumentación de microscopía óptica
Mantenimiento, limpieza y conservación
Parte mecánica:
Retirar el polvo superficial con un trapo fino.
En caso de vertido accidental de medios de montaje
líquidos o medios de inmersión, etc.
●
Absorber el líquido con papel
●
Disolver y limpiar los restos con agua destilada
●
Secar bien
2. Instrumentación de microscopía óptica
Mantenimiento, limpieza y conservación
Parte óptica:
Retirar el polvo soplando con pera, nitrógeno o aire.
Limpiar en húmedo con papel óptico o trapo suave
humedecido en etanol, cristasol, isopropanol... con
movimiento circular.
Secar.
2. Instrumentación de microscopía óptica
Mantenimiento, limpieza y conservación
●
●
En aquellos microscopios en que trabajan varias
personas la limpieza periódica de los oculares
contribuye a minimizar el riesgo de contraer conjuntivitis.
Las huellas, los restos de medios de inclusión o de
montaje y el polvo presentes en el objetivo, sean del tipo
que sean, ocasionan una pérdida de resolución y
contraste debido a que dispersan la luz, dando la
sensación de que se tiene una aberración de esfericidad
elevada.
2. Instrumentación de microscopía óptica
Mantenimiento, limpieza y conservación
¡No usar nunca benceno, tolueno o xileno!
Son disolventes altamente tóxicos y muy agresivos frente
a pinturas y cemento de unión.