Las tres etapas de los métodos de investigación de patógenos en

Newsletter Microbial
http://www.microbial‐systems.com Núm.
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Noviembre ‐ Diciembre de 2008 Informaciones sobre Análisis Microbiológicos por PCR Las tres etapas de los métodos de investigación de patógenos
en alimentos basados en PCR
“...no todas las matrices permiten un
crecimiento pleno
de las bacterias... ”
Introducción Los métodos microbiológicos para investigar la presencia de bacterias patógenas en alimentos tienen en
común una etapa de enriquecimiento en medios nutritivos y/o selectivos para aumentar la concentración de
organismos a detectar. Esto ocurre, por ejemplo, con
los métodos para Salmonella, Listeria o Campylobacter. Posteriormente, se procede al aislamiento en placa
usando medios de cultivo específicos (cromogénicos,
selectivos, etc..) que pondrán de manifiesto la presencia de estas bacterias. Finalmente, se confirman las
colonias sospechosas mediante pruebas específicas.
La PCR es especialmente útil en los análisis de investigación de patógenos en alimentos por su sensibilidad,
especificidad, pero sobre todo, por su selectividad
frente a la microbiota interferente, con tiempos de
obtención de resultados a partir de 24 horas. Quizás
por estas razones, esta técnica se ha ido implantando
Figura 1. Los métodos basados en PCR comparten con los clásicos la etapa de enriquecimiento “..es recomendable
siempre utilizar
aquél método de
extracción de
ADN que mantenga un mejor compromiso entre rapidez y rendimiento”
“La PCR es una
técnica muy selectiva, es decir, es
capaz de reconocer
una secuencia diana en medio de
miles de otros genomas a detectar”
progresivamente en los laboratorios de control alimentario, en sustitución de los métodos tradicionales.
Los métodos basados en PCR comparten con los métodos de cultivo en placa la necesidad de un paso de
enriquecimiento. A partir de ahí, los procedimientos
se completan con dos pasos más: la extracción del
ADN y la detección propiamente dicha (figura 1)
Primera etapa: Enriquecimiento
Esta etapa es común para todos los métodos y su
misión es elevar el número de bacterias hasta niveles
detectables. El enriquecimiento debería permitir la
reparación de las bacterias debilitadas y por consiguiente su multiplicación hasta un número suficientemente elevado [1]. Las normas que establecen los
procedimientos en este tipo de análisis incluyen un
enriquecimiento en medio líquido a partir de una
porción de muestra. En la tabla 1 se resumen los medios usados en los principales análisis.
Tabla 1. Medios de enriquecimiento y tiempos requeridos para los principales análisis. (a) Puede necesitarse un segundo enriquecimiento (b) Especies termotolerantes ‐ 1 ‐ El éxito del enriquecimiento puede condicionar el
resultado del análisis; por un lado, no todas las matrices permiten un crecimiento pleno de las bacterias y
por otro éstas no siempre están fisiológicamente activas. Por este motivo debemos conocer las características de las matrices que se analizan y aplicar, si es
necesario, algún tipo de corrección [2,3].
Segunda etapa: Extracción de ADN Cuando utilizamos métodos basados en PCR, el ADN
de las bacterias pasa a ser el analito (Figura 2). Su
extracción pasa necesariamente por la lisis de la bacteria, es decir, por la rotura de su envuelta o pared celular [4]. La liberación al medio del contenido celular
implica la presencia de una abundante fracción proteica con la que el ADN va a interaccionar, no siempre de
forma positiva: las bacterias poseen nucleasas, enzimas encargadas de hidrolizar el ADN, que pueden
degradar completamente la fracción nucleica. Por esta
razón, los métodos utilizados deben ser suficientemente drásticos para romper la pared celular
(especialmente en bacterias grampositivas) y a su vez
proteger el ADN. Una vez extraído, el ADN puede
purificarse para eliminar todas las sustancias inhibidoras que, generalmente provenientes de la matriz,
pueden interferir en la PCR. Al final, un método de
extracción debe medirse por su rendimiento (cantidad
de ADN obtenida), así como por la capacidad del ADN
de ser amplificado. Ésta última dependerá de la concentración y tipo de inhibidores presentes.
Figura 2. El Ácido Desoxirribonuclei‐
co es el analito en las determinacio‐
nes por ADN, por lo que debemos obtenerlo con la mayor eficiencia y pureza posible. Existen distintos métodos rápidos para extraer el ADN
de las bacterias. De éstos es recomendable siempre
utilizar aquél que mantenga un mejor compromiso
entre rapidez y rendimiento. Podemos distinguir dos
tipos de métodos de extracción de ADN: los que incorporan un paso de purificación con columna de sílica y
los que no. Los primeros suelen ser largos, caros y
requieren mucha manipulación, por lo que es posible
que no siempre se ajusten a las necesidades de los
laboratorios, a menos que la matriz a analizar contenga una alta concentración de sustancias inhibidoras.
Algunos métodos disponibles actualmente sin paso de
purificación son Chelex® , Shock térmico y DNAready® (Microbial). Este último está especialmente
diseñado para todo tipo de matrices alimentarias y
bacterias y ofrece un buen equilibrio entre rendimiento y amplificabilidad.
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Tercera etapa: Detección Se trata de conseguir multiplicar exponencialmente un gen exclusivo
(diana) de la bacteria a detectar. Éste debe ser específico para cada
bacteria y de secuencia altamente conservada, para evitar falsos resultados negativos (ver Newsletter Microbial número 1). Para ello, es
necesario que el juego de oligonucleótidos que vayamos a utilizar sea
suficientemente específico.
presenta una serie de ventajas en relación a las técnicas tradicionales.
La principal es la rapidez en la obtención de resultados, lo que permite
a la industria alimentaria una rápida liberación de lotes, especialmente
de aquellos productos más perecederos. Un resultado positivo no requiere ningún otro tipo de confirmación, lo que ahorra tiempo y dinero. No obstante, esta ventaja serviría de poco sin un adecuado nivel de
fiabilidad en los resultados, particularmente los negativos.
¿Cuál de las tres etapas es la más importante? Lo cierto es que cada una
de ellas por sí sola puede hacer fracasar la determinación. Sin una
buena preparación de la muestra no se enriquece adecuadamente a las
bacterias. Sin una correcta extracción de ADN no se obtiene un analito
de calidad suficiente para ser amplificado. Finalmente, con un mal
detector podemos pasar por alto muestras positivas, especialmente si
Cada vez existen más kits disponibles en el mercado para esta etapa. tiene deficiencias en su límite de amplificación o en su inclusividad.
Ante esta diversidad, la elección no es fácil, y por tanto el responsable
técnico del laboratorio debe conocer los siguientes aspectos básicos del Bibliografía kit para tomar una decisión (ver Newsletter Microbial numero 1):
[1]. NORTH W, .R. Jr. 1961 Lactose pre-enrichment method for isolation of SalmoLa PCR es una técnica muy selectiva, es decir, es capaz de reconocer
una secuencia diana en medio de miles de otros genomas. Esto hace
que la detección por PCR de una bacteria en un caldo de enriquecimiento con presencia de microbiota acompañante sea más sensible que
con el uso de la placa.
nella from dried egg albumen. Applied Microbiology 9, 188-195.
1. Grado de conservación de la diana genética
2. Límites de detección y amplificación
3. La inclusión de un control interno de amplificación
4. Inclusividad y exclusividad
[2]. American Public Health Association (1992a). Compendium of Methods for the
Microbiological Examination of Foods, 3rd edn. Washington, DC: APHA.
[3]. American Public Health Association (1992b). Standard Methods for the Examination of Dairy Products, 16th edn. Washington,DC:APHA.
[4]. Stirling, D. DNA Extraction from Fungi, Yeast, and Bacteria. In: Methods in
Molecular Biology, Vol. 226: PCR Protocols, Second Edition. Edited by: J. M. S.
Conclusiones El uso de la PCR en la investigación de patógenos (Salmonella, Liste- Bartlett and D. Stirling © Humana Press Inc., Totowa, NJ
ria, Campylobacter, Escherichia coli, Enterobacter sakazakii, etc...)
Microbial presenta el nuevo sistema Legiofast ENVIRON
La nueva tecnología de Microbial hace realidad la detección de una sola copia por reacción
Aunque teóricamente una sola copia de genoma por reacción es suficiente, en la práctica algunos sistemas de PCR requieren hasta 100
unidades para que el resultado sea inequívocamente positivo. Microbial ha introducido una mejora substancial en la sensibilidad de su kit
de detección de Legionella pneumophila, que permite detectar una
sola copia del gen diana a un valor de Ct sensiblemente más bajo
(~4,5 unidades). Por tanto, una célula por reacción produce un positivo mucho más claro. Así, por ejemplo, el nuevo Legiofast ENVIRON
permite detectar con
claridad positivos de una
Comparación de los valores de Ct obteni‐
copia por reacción a
dos al usar el nuevo Legiofast ENVIRON valores de Ct=33,1, mientras que con el anterior
formato se obtenía un
valor de 37,8 (ver tabla).
Valores de Ct superiores a
35 introducen dudas
acerca del resultado,
puesto que en ocasiones
la muestra en blanco (non
-template control, NTC)
presenta un ligero aumento de fluorescencia al
final del programa de
amplificación.
Con el nuevo Legiofast, la presencia de un solo genoma de Legionella pneu‐
mophila puede ser detectada de manera inequívoca El nuevo Legiofast ENVIRON, está disponible en presentaciones de
50, 100 y 500 reacciones y forma parte del compromiso de Microbial
de ofrecer los mejores y más fiables sistemas de detección, basados en
dianas genéticas de alto grado de conservación.
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