HUMAN IgG SUBCLASS LIQUID REAGENT KITS
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This product should only be used by suitably trained personnel for the purposes stated in the Intended Use. Strict adherence to these instructions is essential at all times. Results are likely to be invalid if parameters other than those stated in these instructions are used. HUMAN IgG SUBCLASS LIQUID REAGENT KITS (for use on the Siemens BN™II* Analyser) For in-vitro diagnostic use only Product Code: NK001.T, NK006.T, NK007.T, NK008.T, NK009.T Product manufactured by: The Binding Site Group Ltd, 8 Calthorpe Road, Edgbaston, Birmingham, B15 1QT, U.K. www.bindingsite.co.uk Telephone : +44 (0)121 456 9500 Fax : +44 (0)121 456 9749 e-mail: info@bindingsite.co.uk *BN™ is a trademark of Siemens Healthcare Diagnostics Inc. The unopened kits should be stored at 2-8ºC, and can be used until the expiry date given on the kit box label. Unopened antisera, calibrators, controls and the reaction accelerator should be stored at 2-8C. Once opened they are stable for four weeks at 2-8C providing precautions to prevent evaporation are taken. Open vials should not be left on the analyser when not in use. If reagents are left at room temperature for long periods or repeatedly warmed/cooled this may lead to deterioration. Over time unopened vials of antisera can develop a precipitate or turbidity which is not caused by microbial contamination and does not affect the activity of the antisera. In such cases the antiserum should be clarified by filtration through a disposable filter, pore size 0.2µm or by centrifugation (10mins at approximately 15,000 x g). 7 8 INTENDED USE 8.1 SUMMARY AND EXPLANATION The four IgG subclasses show considerable differences in their properties, including ability to fix complement, to bind to macrophages and to pass through the placenta. Abnormal levels of one or more subclass may be associated with certain conditions, including anaphylaxis, autoimmune and gut diseases as well as hypo- and hypergammaglobulinaemia (ref. 1). In particular, reduced production of IgG2 in children may be associated with recurrent infections (ref. 2). The subject has been reviewed (refs 3, 4). Behring‟s Nephelometer permits fully automatic, rapid quantitative measurement of precipitation reactions for protein determination and can run all tests concurrently. 4.1 4.2 4.3 5 8.2 REAGENTS Human IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 antiserum. These antibodies have been adsorbed to be monospecific for the relevant subclass and are supplied in stabilised liquid form. They contain 0.099% sodium azide, 0.1% E-amino-ncaproic acid (EACA), 1mM ethylenediamine-tetraacetic acid (EDTA), 0.5% BSA and 0.01% benzamidine as preservatives. Calibrators and controls. These consist of delipidated, pooled human serum and are supplied in stabilised liquid form. They contain 0.099% sodium azide, 0.1% EACA and 0.01% benzamidine as preservatives. The concentration of IgG subclasses given on the vial has been obtained by comparison with the DA470k international reference material (refs 5, 6). Reaction accelerator. Contains 0.099% sodium azide as a preservative. WARNING: This product contains sodium azide and must be handled with caution; suitable gloves and other protective clothing should be worn at all times when handling this product. Do not ingest or allow contact with the skin (particularly broken skin or open wounds) or mucous membranes. If contact does occur wash with a large volume of water and seek urgent medical advice. Explosive metal azides may be formed on prolonged contact of sodium azide with lead and copper plumbing; on disposal of reagent, flush with a large volume of water to prevent azide build up. Materials provided in „Combi‟ kit (NK001.T) NK001.T 1 x 1.6mL 1 x 1.6mL 1 x 1.6mL 1 x 1.6mL 2 x 1mL 2 x 1mL 2 x 1mL 1 x 3mL Materials provided in „single specificity‟ kits (NK006.T, NK007.T, NK008.T, NK009.T) NK006/7/8/9.T 4 x 1.6mL 2 x 1mL 3 x 1mL 3 x 1mL 2 x 3mL 8.3 Materials required but not provided 8.3.1 8.3.2 Equipment for collection and preparation of test samples e.g. sample tubes, centrifuge etc. A fully operational and equipped analyser. 8.4 Test procedure 8.4.1 8.4.2 Prepare the analyser as per the user manual. We recommend that the IgG subclasses should be run separately to other tests, since they require the use of a reaction accelerator put onto the analyser as supplementary reagent. The IgG subclass assay protocols are already defined in the analyser. The IgG subclass calibrator should be put on the analyser as a Behring standard. Any Behring reagents should therefore be taken off prior to IgG Subclass analysis. Parameters are available in the appendix section of the insert. 8.4.3 8.5 To enter the calibrator value 8.5.1 It is likely that either „Prot. Standard PY, OR „Prot.Standard SL‟ have already been defined as the IgG subclass calibrator for the assays. The user can confirm this by clicking on to Definition and Standard. If the assay for the corresponding standard has been defined, there is an “X” in the field at the intersection of the assay and the standard. This must be the case in order to proceed. Click on Calibration and Standard lots. If a Behring lot number already exists for the calibrator for IgG subclasses (see first vertical column in the grid) there is no need to change it. If the user cannot see the assay concerned scroll across the screen until it appears. Click onto the intersection of the assay and the standard. (There may already be a previous value here or an “X”.) Click on to the standard name, then click onto “?”, the question mark icon. This will allow the user to enter the value given on the IgG subclass calibrator label. Click on to the Save button. CAUTION All donors of human serum supplied in this kit have been serum tested and found negative for hepatitis B surface antigen (HBsAg) and antibodies to human immunodeficiency virus (HIV1 and HIV2) and hepatitis C virus. The assays used were either cleared by the FDA (USA) or cleared for in vitro diagnostic use in the EU (Directive 98/79/EC, Annex II); however, these tests cannot guarantee the absence of infective agents. Proper handling and disposal methods should be established as for all potentially infective material, including (but not limited to) users wearing suitable protective equipment and clothing at all times. Only personnel fully trained in such methods should be permitted to perform these procedures. METHODOLOGY COMPONENTS Subclass Antisera Human IgG Subclass Calibrator Human IgG Subclass Control Serum Human IgG Subclass Low Control Reaction Accelerator (used as Supplementary Reagent‟) for use with IgG2 and IgG4 PRINCIPLE OF THE ASSAY The determination of soluble antigen concentration by nephelometric methods involves the reaction with specific antiserum to form insoluble complexes. When light is passed through the suspension formed a portion of the light is scattered forward and focused onto a photodiode by an optical lens system. The amount of scattered light is directly proportional to the specific protein concentration in the test sample. Concentrations are automatically calculated by reference to a calibration curve stored within the instrument. 4 SPECIMEN COLLECTION AND PREPARATION Components Human IgG1 Antiserum Human IgG2 Antiserum Human IgG3 Antiserum Human IgG4 Antiserum Human IgG Subclass Calibrator Human IgG Subclass Control Serum Human IgG Subclass Low Control Reaction Accelerator (used as „Supplementary Reagent‟) for use with IgG2 and IgG4 In normal adults, IgG constitutes approximately 75% of the total serum immunoglobulin. Within the IgG class, the usual order of concentration of the 4 subclasses is IgG1> IgG2> IgG3> IgG4, but the actual concentration of each may vary markedly between individuals. 3 STORAGE AND STABILITY Blood samples should be collected by venepuncture, allowed to clot naturally and the serum separated as soon as possible to prevent haemolysis. The serum may be stored at 2-8°C for up to 8 days prior to assay, or for prolonged storage kept undiluted at -20°C or below. Repeated freezing and thawing should be avoided. Microbially contaminated, haemolysed and lipaemic serum and samples containing particulate matter should not be used. These kits are intended for quantifying human IgG subclasses 1, 2, 3 and/or 4 immunoglobulins in serum on the BNII. Measurement of these immunoglobulins aids in the diagnosis of abnormal protein metabolism and the body‟s lack of ability to resist infectious agents. 2 6 Use fresh or deep frozen serum samples. FDA (USA) Information: Analyte Name: Immunoglobulins IgG Subclass Complexity Category: Moderate 1 Reagents from different batch numbers of kits are NOT interchangeable. If large numbers of tests are performed care should be taken to ensure that all the reagents are from the same batch. 8.5.2 8.5.3 8.6 To enter the reagent batch numbers 8.6.1 Click onto Calibration and Reagent and enter the 5 th and 6th numbers of the barcode on the label for IgG1 -> IgG4 reagents by selecting each individually, entering numbers and clicking on to the Save button. It is important that these are entered since the analyser will check the batch number entered. Insert Code: SIN024, Version: 10th August 2011, Page 1 of 11 8.7 Running an assay 8.7.1 Request the calibration of all four subclasses, by clicking on to Calibration and Reference Curve and selecting the assays from the list. After each selection click on to the Measure button. 8.7.2 Place the reagents into the racks. Antiserum reagents should be placed into lanes 1, 2, 3, 4 or 5, while the Reaction Accelerator bottle should be placed into lane 3, 4 or 5 and is used as the „Supplementary reagent‟ for the IgG2 and IgG4 assays. 8.7.3 Place the calibrator on a rack in lanes 6-15. 8.7.4 In both cases the reaction accelerator rack and the calibrator rack will be rejected since no barcode is detected. The dialog opens on the screen, and the user must click onto the supplementary reagent/standard in the list box and then click on to the corresponding position required in the displayed rack. 8.7.5 Reinsert the racks by taking them off the analyser and putting them back on again. They should click into place. Approx measuring range (mg/L) 1310 – 42000 313 – 10000 175 – 5600 120 – 3840 IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 9 6-8 years IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 Total IgG 8-10 years IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 Total IgG 10-12 years IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 Total IgG 12-14 years IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 Total IgG 14-18 years IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 Total IgG Approx. sensitivity (using 1:5 sample dilution) 66mg/L 78mg/L 44mg/L 30mg/L QUALITY CONTROL The IgG subclass concentration assigned to the controls provided are given on the bottle labels. Results obtained during the running of assays should only be accepted if control results are within ±15% of the value(s) stated. 10 10.1 LIMITATIONS OF THE PROCEDURE 10.3 10.4 10.5 11 6345 2126 521 349 9700 4320 – 10200 720 – 4300 127 – 853 19 – 932 5680 - 13600 46 46 46 46 46 6421 1980 620 323 10200 4230 – 10600 760 – 3550 173 – 1730 16 – 1150 5680 - 14900 54 54 54 54 54 6581 2486 583 409 10500 3420 – 11500 1000 – 4550 283 – 1250 37 – 1360 6640 – 14900 48 48 48 48 48 6057 2614 708 521 10100 3150 – 8550 640 – 4950 230 –1960 110 – 1570 5500 – 14400 Within-run precision IgG1 Mean CV% IgG2 Mean CV% Serum 1 2709 2.36 1705 2.23 162 3.30 91.3 3.20 Serum 2 8657 2.95 3669 3.19 355 3.29 339 2.89 Serum 3 21007 3.98 8834 3.21 830 3.24 1011 1.73 12.2 Number (n) Mean (mg/L) Median (mg/L) 95 percentile range (mg/L) IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 30 30 30 30 6330 4528 790.7 280.0 6085 4541 706.4 215.3 3824 – 9286 2418 – 7003 218.2 – 1760.6 39.2 – 864.0 Paediatric ranges These ranges were obtained by measuring the total IgG and subclass content of paediatric serum samples from a Birmingham Hospital using Binding Site radial immunodiffusion products. All concentrations are in mg/L. N 39 39 39 39 39 Mean 5248 838 445 129 6640 95%ile range 1940 – 8420 225 – 3000 186 – 853 5 – 784 3270 – 12700 36 36 36 36 36 5495 1146 396 171 7770 3150 – 9450 360 – 2250 173 – 676 10 – 537 4680 – 12500 49 49 49 49 49 6149 1496 531 329 9280 3060 – 9450 605 – 3450 99 – 1221 18 – 1125 5320 - 13400 IgG4 Mean CV% Between-run precision IgG1 IgG subclasses IgG3 Mean CV% Three serum preparations each containing different levels of IgG subclasses were assayed on six separate occasions using kits from a single batch. All concentrations are in mg/L. IgG2 IgG3 IgG4 Mean CV% Mean CV% Mean CV% Mean CV% 2811 3.56 1724 3.44 169 2.07 90.7 6.69 Serum 2 8478 2.99 3372 2.57 376 1.78 336 3.32 Serum 3 21480 4.02 3712 4.83 850 2.39 985 3.90 Serum 1 Adult normal ranges 0-2 years IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 Total IgG 2-4 years IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 Total IgG 4-6 years IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 Total IgG 32 32 32 32 32 Three serum preparations each containing different levels of IgG subclasses were assayed. Each value given was calculated from 10 measurements made on the same assay run. All concentrations are in mg/L. EXPECTED VALUES These ranges were obtained by measuring the subclass content of sera provided by the Birmingham Blood Transfusion Service taken from healthy adult donors. 11.2 95%ile range 2880 – 9180 440 – 3750 155 – 853 4 – 992 4540 – 13600 PERFORMANCE CHARACTERISTICS 12.1 The ranges provided below have been obtained from a limited number of British samples and are intended for guidance purposes only. Wherever possible it is strongly recommended that local ranges are generated. 11.1 Mean 5758 1754 437 331 8860 The following data was obtained in our laboratory using this product. Nephelometric IgG Subclass assays have been shown to correlate well versus Binding Site Single Dilution RID assays with a wide range of samples. These kits are not suitable for the measurement of samples containing rheumatoid factor, paraproteins, other circulating immune complexes (CIC) or for lipaemic or haemolysed samples due to the unpredictable degree of nonspecific scatter these sample types may generate. Unexpected results should be confirmed using an alternative assay method. Customers are strongly recommended to run both controls with every batch of samples being assayed. Should a control value be out of range when run against a stored curve it is recommended that the assay be recalibrated. Where control values fall outside the ±15% limit against calibration curves, check the instrument and parameters before repeating the assay. If the problem persists, refer to the supplier. The results obtained from measuring IgG subclasses should not be used in assessing atopy in allergic patients. Diagnosis cannot be made and treatment must not be initiated on the basis of IgG subclass measurements alone. Clinical history and other laboratory findings must also be taken into account. 10.2 12 N 43 43 43 43 43 12.3 Between-batch precision Different serum preparations each containing different levels of IgG subclass were assayed using different batches of kits. The overall CV% of the results at each concentration is given below. All concentrations are in mg/L. IgG1 Mean Serum 1 4411 (no. of Samples) Serum 2 14191 (no. of Samples) Serum 3 20190 (no. of Samples) 13 1. 2. 3. 4. 5. 6. CV% 4.57 (11) 4.39 (11) 4.43 (11) IgG2 Mean 504 4194 11530 CV% 3.93 (10) 4.93 (10) 5.07 (10) IgG3 Mean 136 658 1463 CV% 4.70 (10) 6.33 (10) 4.92 (10) IgG4 Mean 204 468 827 CV% 6.27 (11) 5.78 (10) 5.94 (11) BIBLIOGRAPHY Shakib, F & Stanworth D R (1980), Human IgG subclasses in health and disease (Part II). La Ricerca Clin. Lab. 10, 561-580. Shackleford, P G, Polmar, S H et al (1986), Spectrum of IgG2 subclass deficiency in children with recurrent infections: Prospective study. J. Pediatr. 108, 647-653. Hamilton, R H (1987), Human IgG subclass measurements in the clinical laboratory. Clin. Chem. 33, 1707-1725. Schur, P H (1987), IgG subclasses – a review. Annals of Allergy 58, 89-99. Carr-Smith, H.D, Overton, J, Bradwell, A.R. (1997). IgG subclass value assignment to the protein reference preparation CRM470. Clin. Chem. Vol. 43, No. 56, PS238. Williams, D.R., Wilson, C.T., Carr-Smith, H.D. (2009). Assignment of IgG Subclass Values to the Protein Reference Preparation DA470k. Clin. Chem. Vol. 55, No. S6, PS C-90. Insert Code: SIN024, Version: 10th August 2011, Page 2 of 11 HUMAN IgG SUBKLASSEN KIT Zur Verwendung auf dem Siemens BN™II Nephelometer* Nur zur in vitro Diagnostik Bestell-Nr.: NK001.T, NK006.T, NK007.T, NK008.T, NK009.T In England hergestellt von: The Binding Site Group Ltd, 8 Calthorpe Road, Edgbaston, Birmingham, B15 1QT, U.K. www.bindingsite.co.uk Vertrieb in Deutschland und Österreich durch: The Binding Site GmbH, Robert-Bosch-Straße 2A D-68723 Schwetzingen, Deutschland Telefon: +49 (0) 6202 92 62 0 Fax: +49 (0) 6202 92 62 222 e-mail: office@bindingsite.de Die ungeöffneten Kits sind bei 2-8°C bis zum auf dem Außenetikett angegebenen Verfallsdatum haltbar. Ungeöffnete Reagenzien, Kalibratoren, Kontrollen und Reaktions-Accelerator bei 2-8°C lagern. Nach dem Öffnen sind sie 4 Wochen bei 2-8°C stabil. Reagenzien so lagern, dass keine Verdunstung stattfinden kann. Offene Flaschen nach Gebrauch nicht im Gerät stehen lassen. Längere Lagerung bei Raumtemperatur und häufiger Wechsel zwischen Warm und Kalt führen zu einer vorzeitigen Alterung und damit zum Verfall der Reagenzien. Es kann bei den ungeöffneten Antiseren eine Trübung oder ein Präzipitat während der Lagerung auftreten. Dies ist nicht auf mikrobiologische Kontaminationen zurückzuführen und beeinflusst nicht die Aktivität der Antiseren. In solchen Fällen das Antiserum durch Filtration durch Einmal-Filter mit Porengröße von 0,2µm oder Zentrifugation (10min. bei ca. 15000g) klären. PROBENENTNAHME UND –VORBEREITUNG Blutproben über Venenpunktur sammeln und auf natürliche Weise gerinnen lassen. Serum so schnell wie möglich vom Gerinnsel trennen um eine Hämolyse zu vermeiden. Die Seren können bei 2-8°C bis zu 8 Tagen vor dem Test gelagert werden. Für eine längere Lagerung wird empfohlen die Seren unverdünnt bei mindestens -20°C einzufrieren. Keine mikrobiell oder mit Partikeln verunreinigte Seren, oder hämolytische oder lipämische Seren verwenden. 8 VERWENDUNGSZWECK EINLEITUNG Bei gesunden Erwachsenen stellt IgG ca. 75% des Gesamtimmunglobulins dar. Innerhalb der IgG-Klasse nimmt die Konzentration in der Reihenfolge IgG1> IgG2> IgG3> IgG4 ab, wobei der tatsächliche Gehalt individuell deutlich variieren kann. Die vier IgG Subklassen zeigen deutliche Unterschiede in ihren Eigenschaften, wie z.B. Fähigkeit zur Komplementbindung, Makrophagenbindung und Placentadurchlässigkeit. Von der Norm abweichende Werte einer oder mehrerer Subklassen können mit verschiedenen Erkrankungen in Verbindung gebracht werden, z.B. Autoimmunerkrankungen, Anaphylaxie, Darmerkrankungen, sowie Hypo- und Hypergammaglobulinämien (Ref. 1). Speziell bei Kindern kann sich eine verminderte IgG2-Produktion durch wiederkehrende Infektionen bemerkbar machen (Ref. 2; Reviews: Ref. 3, 4). Das Behring BNII erlaubt eine vollautomatische, schnelle und quantitative Bestimmung der Präzipitationsreaktion zur Proteinbestimmung. Die vier IgG Subklassen können gleichzeitig gemessen werden. 3 LAGERUNG UND STABILITÄT Immer frisches oder tiefgefrorenes Serum verwenden. Zur quantitativen Bestimmung von Human IgG Subklassen 1, 2, 3 und 4 im Serum auf dem BNII. Die Bestimmung dieser Immunglobuline dient zur Unterstützung der Diagnose eines abnormalen Proteinmetabolismus und das Unvermögen des Körpers auf infektiöse Erreger zu reagieren. 2 6 7 *BN™ ist ein Warenzeichen von Siemens Healthcare Diagnostics Inc. 1 Reagenzien unterschiedlicher Chargen dürfen NICHT untereinander gemischt oder gemeinsam verwendet werden. Bei großem Testdurchsatz muss darauf geachtet werden, dass alle Reagenzien der gleichen Charge entstammen. TESTPRINZIP Die nephelometrische Bestimmung der Konzentration von löslichen Antigenen beruht auf der Reaktion mit einem spezifischen Antiserum, wodurch unlösliche Komplexe gebildet werden. Wird Licht durch die gebildete Suspension gestrahlt, wird nur ein Teil des Lichts durchgelassen und mit Hilfe eines optischen Linsensystems auf eine Photodiode fokusiert. Die Menge des Streulichts ist direkt proportional zur spezifischen Proteinkonzentration in der zu testenden Probe. Die Antigenkonzentration wird automatisch nach der Messung direkt an Hand einer im Gerät gespeicherten Kalibrationskurve berechnet. 8.1 TESTDURCHFÜHRUNG Gelieferte Materialien „Kombi‟ Kit‟ (NK001.T) Komponenten Human IgG1 Antiserum Human IgG2 Antiserum Human IgG3 Antiserum Human IgG4 Antiserum Human IgG Subclass Calibrator (Human IgG Subklassen-Kalibrator) Human IgG Subclass Control Serum (Human IgG SubklassenKontrollserum) Human IgG Subclass Low Control (Human IgG SubklassenKontrollserum „Low Level‟) Reaction Accelerator (Reaktions-Accelerator zur Verwendung als „Zusatzreagenz‟ bei IgG2 und IgG4) 8.2 NK001.T 1 x 1,6mL 1 x 1,6mL 1 x 1,6mL 1 x 1,6mL 2 x 1mL 2 x 1mL 2 x 1mL 1 x 3mL Gelieferte Materialien, für die individuellen Kits (NK006.T, NK007.T, NK008.T, NK009.T) Komponenten NK006/7/8/9.T Subclass Antisera (Subklassen Antiseren) 4 x 1,6mL Human IgG Subclass Calibrator (Human IgG Subklassen Kalibrator) 2 x 1mL Human IgG Subclass Control Serum (Human IgG Subklassen 3 x 1mL Kontrollserum) Human IgG Subclass Low Control (Human IgG Subklassen 3 x 1mL Kontrollserum „Low Level‟) 2 x 3mL Reaction Accelerator (Reaktions-Accelerator-zur Verwendung als „Zusatzreagenz‟ bei IgG2 und IgG4) 8.3 Benötigte, nicht im Kit Enthaltene Materialien 8.3.1 8.3.2 Laborausstattung zum Sammeln und Vorbereiten der Proben (Probenröhrchen, Zentrifugen usw.). Einen voll ausgestatteten und funktionsfähigen Behring BNII. Human IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 Antiseren. Diese Antiseren sind monospezifisch für die jeweilige Subklasse und liegen als stabilisierte Flüssigkeiten vor. Enthaltene Konservierungsmittel: 0,099% Natriumazid, 0,1% E-aminocapronsäure (EACA), 1mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 0,5% BSA und 0,01% Benzamidin. 8.4 Durchführung 8.4.1 8.4.2 4.2 Kalibratoren und Kontrollen. Sie werden aus delipidisiertum, gepooltem Humanserum hergestellt und liegen als stabilisierte Flüssigkeiten vor. Enthaltene Konservierungsmittel: 0,099% Natriumazid, 0,1% (EACA) und 0,01% Benzamidin. Der Wert von IgG Subklassen wurde durch Vergleich mit mit dem internationalen DA470k-Referenzmaterial ermittelt (Ref. 5, 6). 8.4.3 Gerät wie im Handbuch beschrieben vorbereiten. Es wird empfohlen, dass die IgG-Subklassen-Tests nicht mit anderen Tests gleichzeitig gemessen werden, da für sie ein Reaktions-Accelerator anstatt des Zusatzreagenz (SRP) verwendet wird. Die IgG-Subklassen-Testparameter sind bereits im Gerät vorhanden. Den IgG-Subklassen-Kalibrator anstatt des Dade-Behring-Standards in das Gerät setzen. Daher alle Reagenzien von Dade-Behring vor der Messung der IgG Subklassen aus dem Gerät nehmen. Die Testparameter sind in dem Anhang aufgelistet. 4.3 Reaktions-Accelerator. Enthaltene Konservierungsmittel: 0,099% Natriumazid. 8.5 Eingabe der Kalibratorwerte 8.5.1 Wahrscheinlich wurde bereits der „Prot. Standard PY‟ oder „Prot.Standard SL‟ als IgG-Subklassen-Kalibrator definiert. Zur Überprüfung die Funktion Definition und Standard anklicken. Ist an den Kreuzungspunkten zwischen einem der Standards und den Tests ein „X‟, so ist der Standard für diese Tests definiert. Es muss sichergestellt werden, dass einer dieser beiden Standards für die IgG Subklassen definiert ist. Die Funktion Kalibrator und Standard lots anwählen. Ist bereits eine DadeBehring-Chargennummer für den Standard eingegeben (siehe 1. Vertikale Spalte des Rasters), braucht diese nicht geändert werden. Sind die gewünschten Tests nicht in der Liste zu sehen, dann die Liste am Bildschirm durchgehen, bis sie erscheinen. Auf den Kreuzungspunkt zwischen Standard und Test klicken. (Hier erscheint entweder eine alte Kalibratorkonzentration oder ein „X‟.) Zuerst den Standard-Namen und anschließend das Feld „?‟ anklicken. Jetzt können die IgG-Subklassen-Konzentrationen, die auf dem Flaschenetikett angegeben sind, eingegeben werden. Nach der Eingabe die Daten speichern. 4 4.1 5 REAGENZIEN WARNUNGEN UND VORSICHTSMAßNAHMEN Jede Einzelspende von humanem Serum wurde untersucht und bezüglich Antikörper gegen das Human-Immunschwäche-Virus (HIV 1 & 2), das Hepatitis-C-Virus und gegen das Hepatitis-B-Oberflächenantigen (HBsAG) als negativ befunden. Die hierfür verwendeten Tests sind entweder von der FDA (USA) zugelassen oder für den Gebrauch in der in vitro Diagnostik in der EU freigegeben (Directive 98/79/EC, Annex II). Es gibt aber zur Zeit keine absolut sicheren Testmethoden zum Auschluss dieser und anderer Infektionsträger. Umgangs- und Entsorgungsmethoden sollten denen für potentiell infektiösem Material entsprechen (inklusive dem Tragen entsprechender Schutzkleidung). Der Test sollte nur von entsprechend geschultem Personal durchgeführt werden. ACHTUNG: Dieses Produkt enthält Natriumazid und muss mit den entsprechenden Vorsichtsmaßnahmen behandelt werden. Das Tragen von Handschuhen und anderer Schutzkleidung wird während des Umgangs mit diesem Produkt empfohlen. Verschlucken sowie Kontakt mit Haut (v.a. bei Verletzungen) oder Schleimhäuten vermeiden. Nach Kontakt Hautstelle mit viel Wasser abspülen und ärztlichen Rat einholen. Natriumazid kann mit Blei- oder Kupferrohren explosive Metallazide bilden. Nach der Entsorgung mit ausreichender Menge Wasser, nachspülen um Azidablagerungen zu vermeiden. Dieser Test sollte nur für den angegebenen Verwendungszeck von entsprechend geschultem Laborpersonal durchgeführt werden. Die Einhaltung der Arbeitsanleitung bei allen Arbeitsschritten ist dringend notwendig. Bei Verwendung von abgeänderten Testparametern kann die Richtigkeit der Ergebnisse nicht garantiert werden. 8.5.2 8.5.3 Insert Code: SIN024, Version: 10th August 2011, Page 3 of 11 8.6 Eingabe der Chargen-Nummer der Reagenzien 8.6.1 Die Funktion Kalibration und anschließend Reagenzien anwählen und die 5. und 6. Zahl des Barcodes für jedes Reagenz eingeben und die Daten speichern. Der Barcode befindet sich auf dem jeweiligen Flaschenetikett. Die Eingabe dieser Daten ist wichtig, da das BNII die eingegebenen ChargenNummern überprüft. 8.7 Testdurchführung 8.7.1 Kalibrationskurve anfordern indem die Funktionen Kalibration und anschließend Referenzkurven angewählt werden. Dann die gewünschten Tests aus der Liste auswählen. Nach jeder Auswahl die Funktion Messung anklicken. Reagenzien in die entsprechenden Schlitten setzen. Die Antiseren auf die Bahnen 1, 2, 3, 4 oder 5 und das Zusatzreagenz auf die Bahn 3, 4 oder 5 setzen. Das Zusatzreagenz wird anstelle des „SRP‟-Reagenz für IgG2 und IgG4 verwendet. Den Kalibrator auf Bahn 6-15 plazieren. Das Gerät wird sowohl den Schlitten mit dem Zusatzreagenz als auch den Schlitten mit dem Kalibrator nicht akzeptieren, da keine Barcodes erkannt werden. Auf dem Bildschirm wird ein Dialogfenster geöffnet. Hier das Zusatzreagenz und den Kalibrator anklicken und anschließend die entsprechende Position des gezeigten Schlittens anklicken. Die Schlitten erneut in das Gerät einführen. Danach sollten die Reagenzien akzeptiert werden. 8.7.2 8.7.3 8.7.4 8.7.5 Ungefährer Messbereich (mg/L) 1310 – 42000 313 – 10000 175 – 5600 120 – 3840 IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 9 4-6 Jahre IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 Total IgG 6-8 Jahre IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 Total IgG 8-10 Jahre IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 Total IgG 10-12 Jahre IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 Total IgG 12-14 Jahre IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 Total IgG 14-18 Jahre IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 Total IgG Ungefähre. Sensitivität (bei einer 1:5-Probenverdünnung) 66mg/L 78mg/L 44mg/L 30mg/L QUALITÄTSKONTROLLE Die IgG-Subklassen-Konzentrationen der Kontrollen sind auf dem jeweiligen Flaschenetikett angegeben. Der von dem BNII gemessene Wert sollte maximal 15% vom angegebenen Wert abweichen. 12 N 49 49 49 49 49 Mittelwert 6149 1496 531 329 9280 95%ile Bereich 3060 – 9450 605 – 3450 99 – 1221 18 – 1125 5320 - 13400 43 43 43 43 43 5758 1754 437 331 8860 2880 – 9180 440 – 3750 155 – 853 4 – 992 4540 – 13600 32 32 32 32 32 6345 2126 521 349 9700 4320 – 10200 720 – 4300 127 – 853 19 – 932 5680 - 13600 46 46 46 46 46 6421 1980 620 323 10200 4230 – 10600 760 – 3550 173 – 1730 16 – 1150 5680 - 14900 54 54 54 54 54 6581 2486 583 409 10500 3420 – 11500 1000 – 4550 283 – 1250 37 – 1360 6640 – 14900 48 48 48 48 48 6057 2614 708 521 10100 3150 – 8550 640 – 4950 230 –1960 110 – 1570 5500 – 14400 LEISTUNGSDATEN Die nachfolgend aufgeführten Daten wurden mit diesem Kit im Labor von The Binding Site erhalten. 10 10.1 10.2 10.3 10.4 10.5 11 GRENZEN DES TESTS 12.1 Die nephelometrische Bestimmung der IgG Subklassen korreliert bei einer großen Probenzahl sehr gut zur Binding Site IgG Subklassen Single Dilution RID Methode. Dieser Kit ist nicht für die Bestimmung von lipämischen oder hämolysierten Proben, oder Proben, die Rheumafaktoren, Paraproteine oder andere zirkulierende Immunkomplexe enthalten, geeignet, da diese Proben einen nicht vorhersagbaren Anteil an unspezifischen Streulicht erzeugen können. Ungewöhnliche Ergebnisse sollten mit einer alternativen Methode überprüft werden. Es wird dringend empfohlen, dass beide Kontrollen bei jedem Testansatz mitgeführt werden. Wird eine gespeicherte Kalibrationskurve verwendet und liegt das Kopntrollergebnis außerhalb des Vertrauensbereichs, sollte der Test neu kalibriert werden. Liegt die Kontrolle direkt nach der Kalibration außerhalb des Vertrauensbereichs ( 15%), sollten die Testparameter und das Gerät überprüft werden, bevor der Test wiederholt wird. Bleibt das Problem bestehen, wenden Sie sich bitte an Ihre Lieferfirma. Die IgG-Subklassen-Ergebnisse sollten nicht zur Diagnose einer Atopie bei Allergie-Patienten verwendet werden. Die Diagnose und Einleitung einer Therapie dürfen nicht ausschließlich auf der IgG-Subklassen-Bestimmung basieren. Das klinische Bild und andere serologische Befunde müssen ebenfalls berücksichtigt werden. Serum 1 Serum 2 Serum 3 12.2 11.1 Erwachsene Die unten aufgeführten Normalbereiche basieren auf der Untersuchung des Subklassengehalt Seren vom Blood Transfusion Service in Birmingham. Anzahl (n) 30 30 30 30 Mittelwert (mg/L) 6330 4528 790,7 280,0 Median (mg/L) 6085 4541 706,4 215,3 95 Percentile Bereich (mg/L) 3824 – 9286 2418 – 7003 218,2 – 1760,6 39,2 – 864,0 11.2 Kinder Diese Werte wurden mittels Radialer Immundiffusion (The Binding Site „Single Dilution‟) ermittelt. Die Seren der Kinder wurden in einem Krankenhaus von Birmingham (England) gesammelt. Alle Angaben sind in mg/L. 12.3 N 39 39 39 39 39 Mittelwert 5248 838 445 129 6640 95%ile Bereich 1940 – 8420 225 – 3000 186 – 853 5 – 784 3270 – 12700 36 36 36 36 36 5495 1146 396 171 7770 3150 – 9450 360 – 2250 173 – 676 10 – 537 4680 – 12500 IgG3 Mittel VK% -wert 162 3,30 355 3,29 830 3,24 IgG4 Mittel VK% -wert 91,3 3,20 339 2,89 1011 1,73 IgG1 Mittel VK% -wert 2811 3,56 8478 2,99 21480 4,02 IgG2 Mittel VK% -wert 1724 3,44 3372 2,57 3712 4,83 IgG3 Mittel VK% -wert 169 2,07 376 1,78 850 2,39 IgG4 Mittel VK% -wert 90,7 6,69 336 3,32 985 3,90 Inter-Chargen-Variation Verschiedene Serumpräparationen, die sehr unterschiedliche IgG-SubklassenKonzentrationen enthalten, wurden mit verschiedenen Reagenz-Chargen gemessen. Der Variationskoefizient (VK) für die gemessene IgG-Subklassen-Konzentration jeder Serumpräparation wurde bestimmt. Der mittlere VK wird in der nachfolgenden Tabelle aufgelistet. Alle Konzentrationsangaben sind in mg/L. IgG1 MittelVK% wert Serum 1 4,57 4411 (Anzahl der Proben) (11) Serum 2 4,39 14191 (Anzahl der Proben) (11) Serum 3 4,43 20190 (Anzahl der Proben) (11) 13 1. 2. 0-2 Jahre IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 Total IgG 2-4 Jahre IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 Total IgG IgG2 Mittel VK% -wert 1705 2,23 3669 3,19 8834 3,21 Inter-Assay-Variation Serum 1 Serum 2 Serum 3 Die unten aufgeführten Normalbereiche basieren auf der Untersuchung eines gesunden Blutspenderkollektivs aus Großbritannien mit diesen Kits und dienen nur zur Orientierung. Es wird empfohlen eigene Normalbereiche zu bestimmen. IgG1 Mittel VK% -wert 2709 2,36 8657 2,95 21007 3,98 Drei verschiedene Serum-Präparationen, die unterschiedliche IgG-SubklassenKonzentrationen enthalten, wurden in sechs verschiedenen Ansätzen mit Kits von einer Charge untersucht. Alle Konzentrationsangaben sind in mg/L. ERWARTETE WERTE IgG Subklasse IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 Intra-Assay-Präzision Drei verschiedene Serum-Präparationen, die unterschiedliche IgG-SubklassenKonzentrationen enthalten, wurden untersucht. Jeder Wert wurde aus 10 Bestimmungen, die in einem Ansatz gemessen wurden, ermittelt. Alle Konzentrationsangaben sind in mg/L. 3. 4. 5. 6. IgG2 MittelVK% wert 3,93 504 (10) 4,93 4194 (10) 5,07 11530 (10) IgG3 MittelVK% wert 4,70 136 (10) 6,33 658 (10) 4,92 1463 (10) IgG4 MittelVK% wert 6,27 204 (11) 5,78 468 (10) 5,94 827 (11) REFERENZEN Shakib, F & Stanworth D R (1980), Human IgG subclasses in health and disease (Part II). La Ricerca Clin. Lab. 10, 561-580. Shackleford, P G, Polmar, S H et al (1986), Spectrum of IgG2 subclass deficiency in children with recurrent infections: Prospective study. J. Pediatr. 108, 647-653. Hamilton, R H (1987), Human IgG subclass measurements in the clinical laboratory. Clin. Chem. 33, 1707-1725. Schur, P H (1987), IgG subclasses – a review. Annals of Allergy 58, 89-99. Carr-Smith, H.D, Overton, J, Bradwell, A.R. (1997). IgG subclass value assignment to the protein reference preparation CRM470. Clin. Chem. Vol. 43, No. 56, PS238. Williams, D.R., Wilson, C.T., Carr-Smith, H.D. (2009). Assignment of IgG Subclass Values to the Protein Reference Preparation DA470k. Clin. Chem. Vol. 55, No. S6, PS C-90. Insert Code: SIN024, Version: 10th August 2011, Page 4 of 11 COFFRETS POUR LE DOSAGE DES SOUSCLASSES d‟IgG EN NEPHELEMETRIE (pour une utilisation sur Siemens BN™II*) Pour un usage en diagnostic in vitro uniquement Références : NK001.T, NK006.T, NK007.T, NK008.T, NK009.T. Produits fabriqués en Angleterre par la société : The Binding Site Group Ltd, 8 Calthorpe Road, Edgbaston, Birmingham, B15 1QT, U.K. www.bindingsite.co.uk Distribués en France par la société : The Binding Site France 14 rue des Glairaux, BP226, 38522 Saint-Egrève Cedex. Téléphone : 04.38.02.19.19 Fax : 04.38.02.19.20 e-mail : info@bindingsite.fr *BN™ est marque déposée de Siemens Healthcare Diagnostics Inc. (spécialement sur les zones abîmées) ou des muqueuses. S‟il y a contact, laver abondamment avec de l‟eau et demander un avis médical. Des azides de métaux explosifs peuvent se former par contact prolongé entre de l‟azide de sodium et les tuyauteries en plomb et cuivre; pour éliminer les réactifs, rincer avec un large volume d‟eau pour prévenir tout dégât. Ce produit ne doit être utilisé que par du personnel entrainé. Le suivi de ces instructions est essentiel. Les résultats seront considérés comme invalides si d‟autres paramètres autres que ceux ci sont utilisés. Les réactifs de différents lots NE SONT PAS interchangeables. Si un nombre important de tests est réalisé, des précautions doivent être prises pour s‟assurer que les réactifs utilisés sont issus du même lot. 6 Les coffrets non ouverts doivent être conservés entre 2-8°C et peuvent être utilisés jusqu‟à la date de péremption indiquée sur l‟étiquette de la boîte. Une fois ouverts, les composants du coffret peuvent être conservés à 2-8°C pendant 4 semaines à condition que les précautions pour empêcher l‟évaporation soient prises. Il est recommandé de ne pas laisser les flacons ouverts sur les néphélémètres en dehors de leur utilisation. Si des réactifs sont laissés à température ambiante pendant de longues périodes ou fréquemment changés de température (froid/chaud), leur altération risque d‟être plus rapide. Au cours du temps, les flacons d'antisérums non ouverts peuvent développer un précipité ou un trouble qui n'est pas lié à une contamination bactérienne et qui n'affecte pas l'activité de l'antisérum. Dans de telles situations, l'antisérum doit être clarifié par filtration à travers un filtre jetable ayant des pores de 0,2µm ou par centrifugation (10 minutes à 15000 x g approximativement). 7 1 PRÉSENTATION GÉNÉRALE Chez les sujets adultes en bonne santé, l‟IgG représente environ 75% de la concentration en Immunoglobulines sériques totales. Dans la classe des IgG, les concentrations de chaque sous classe sont généralement dans l‟ordre IgG1 > IgG2 > IgG3 > IgG4, bien que la concentration effective de chaque sous classe puisse varier considérablement selon les individus. Les quatre sous classes d‟IgG présentent des différences considérables dans leurs propriétés, incluant la capacité de fixation du complément, de se lier aux macrophages et de passer la barrière placentaire. Des taux inusuels d‟une ou plusieurs sous classes peuvent être associés à certaines pathologies comme l‟anaphylaxie, les maladies autoimmunes, digestives, les hypo et hypergammaglobulinémies (réf. 1). En particulier, une diminution de synthèse de l‟IgG2 chez l‟enfant peut être associée à des infections récurrentes (réf. 2). Cet aspect a été bien étudié (réfs 3 et 4). Le néphélémètre Behring permet le dosage rapide des protéines spécifiques par néphélémétrie, et peut effectuer simultanément le dosage des quatre sous-classes à partir du même tube. La mesure quantitative des réactions de précipitation se fait de façon automatique, rapide et reproductible. 3 PRINCIPE DU TEST La détermination de la concentration en antigène soluble en néphélémétrie induit la réaction avec un antisérum spécifique pour former des complexes insolubles. Lorsque la lumière passe à travers la suspension, une partie de la lumière est dispersée et dirigée vers une photodiode par un système de lentilles optiques. La quantité de lumière dispersée mesurée est directement proportionnelle à la concentration en protéine spécifique de l‟échantillon. Les concentrations sont automatiquement calculées par rapport à la courbe étalon pré-établie. 4 4.1 4.2 4.3 5 PREPARATION ET COLLECTE DES ECHANTILLONS Utiliser des sérums fraîchement prélevés ou congelés. INDICATIONS Ces coffrets sont destinés au dosage quantitatif des sous-classes d‟IgG, 1, 2, 3 et/ou 4 dans le sérum humain par néphélémétrie en utilisant les néphélémètres BNII. La mesure de ces immunoglobulines apporte une aide dans le diagnostic du métabolisme anormal des protéines et des problèmes de l‟organisme pour résister aux agents infectieux. 2 STOCKAGE ET STABILITÉ RÉACTIFS Antisérums IgG1, IgG2 IgG3, IgG4. Ces antisérums de mouton ont été adsorbés de manière à être monospécifiques de la sous-classe désirée, et sont fournis sous forme liquide et prêts à l‟emploi. Ils contiennent 0,099% d‟azide de sodium, 0,1% d‟acide E-amino-n-caproïque (EACA), 1mM acide éthylène diamine tétracétique (EDTA), 0,5% de BSA et 0,01% de benzamidine comme conservateurs. Calibrateurs et contrôles. Ils sont préparés à partir de pools de sérum humains délipidés, et sont fournis sous forme liquide et stable. Ils contiennent 0,099% d‟azide de sodium, 0,1% d‟EACA et 0,01% de benzamidine comme conservateurs. La concentration en sous-classes d‟IgG indiquée sur les étiquettes des flacons ont été obtenues par comparaison avec la référence internationale DA470k (réfs 5 et 6). Réactif accélérateur. Il contient 0,099% d‟azide de sodium comme conservateur. Les échantillons de sang doivent être collectés par ponction veineuse, permettant une coagulation naturelle. Le sérum doit être séparé dès que possible afin d‟éviter une hémolyse. Le sérum peut être stocké à 2-8°C pendant 8 jours avant le test ou congelé sans diluer (à -20°C ou à une température inférieure) pour une conservation plus longue. Il est recommandé d‟éviter les congélations et les décongélations répétées. Les échantillons contaminés par des bactéries, hémolysés, lipidiques ou contenant des particules de matière ne doivent pas être utilisés. 8 8.1 ATTENTION: Ce produit contient de l‟azide de sodium et doit être manipulé avec précaution; des gants appropriés et d‟autres vêtements de protection doivent être portés lors de toutes manipulation. Ne pas ingérer ou avoir de contact avec la peau Matériel fourni coffret „Combi‟ (NK001.T) Composants Human IgG1 Antiserum (antisérum anti-IgG1 humaines) Human IgG2 Antiserum (antisérum anti-IgG2 humaines) Human IgG3 Antiserum (antisérum anti-IgG3 humaines) Human IgG4 Antiserum (antisérum anti-IgG4 humaines) Human IgG Subclass Calibrator (calibrateur sous-classes IgG humaines) Human IgG Subclass Control Serum (contrôle sous-classes IgG humaines) Human IgG Subclass Low Control (contrôle bas sous-classes IgG humaines) Reaction Accelerator (réactif accélérateur (réactif supplémentaire à utiliser avec IgG2 et IgG4) 8.2 NK001.T 1 x 1,6mL 1 x 1,6mL 1 x 1,6mL 1 x 1,6mL 2 x 1mL 2 x 1mL 2 x 1mL 1 x 3mL Matériel fourni (NK006.T, NK007.T, NK008.T, NK009.T) Composant Subclass Antisera (antisérum sous classe appropriée) Human IgG Subclass Calibrator (calibrateur sous-classe IgG humaines) Human IgG Subclass Low Control (contrôle bas sous-classe IgG humaines) Human IgG Subclass Control Serum (contrôle haut sous-classe IgG humaines) Reaction Accelerator (réactif accélérateur (réactif supplémentaire à utiliser avec IgG2 et IgG4) NK006/7/8/9.T 4 x 1,6mL 2 x 1mL 3 x 1mL 3 x 1mL 2 x 3mL 8.3 Matériel nécessaire et non fourni 8.3.1 8.3.2 Le matériel nécessaire à la préparation des échantillons (par exemple tubes, centrifugeuse...). Néphélémètre et accessoires. 8.4 Procédure 8.4.1 8.4.2 Préparer l‟analyseur pour une utilisation manuelle. Nous recommandons de passer les sous-classes séparément des autres paramètres parce que l‟analyse demande l‟utilisation d‟un réactif supplémentaire : le réactif accélérateur. Les protocoles sont définis par le néphélémètre. Le calibrateur doit être déposé dans l‟appareil comme un standard Behring. Tous les réactifs Behring doivent être retirés de l‟analyseur. Les paramètres d’analyse sont donnés dans l’appendice. 8.4.3 PRÉCAUTIONS Tous les sérums humains fournis dans ce coffret ont été testés et trouvés négatifs pour l‟antigène de surface de l‟hépatite B (Ag HBs), pour le virus de l‟hépatite C et pour les anticorps anti-virus de l‟immunodéficience humaine (HIV1 and HIV2). Les tests utilisés ont soit été approuvés par la FDA (USA) ou accepté pour un usage en diagnostic in-vitro par l‟union européenne (Directive 98/79/EC, Annexe II); néanmoins ces tests ne peuvent garantir l‟absence d‟agents infectieux Tous les échantillons doivent donc être manipulés comme des produits potentiellement infectieux. Seul un personnel qualifié dans la manipulation d‟échantillons potentiellement infectieux est autorisé à utiliser ce coffret. METHODOLOGIE 8.5 Entrer les valeurs du calibrateur 8.5.1 Il est possible que les « Prot. Standard PY » ou « Prot standard SL » soient déjà définis comme calibrateurs des sous-classes d‟IgG. L‟utilisateur peut confirmer en cliquant sur Definition et Standard. Si les essais pour ces standards ont été définis, il y a une croix dans le champ d‟intersection. Il faut passer par cette étape avant de poursuivre l‟analyse. Cliquer sur Calibrateur et Standard lot. Si les numéros de lot sont déjà entrés, il n‟est pas nécessaire de les modifier. Si l‟utilisateur ne voit pas apparaître l‟analyse, il est nécessaire de la rechercher à l‟écran. 8.5.2 Insert Code: SIN024, Version: 10th August 2011, Page 5 of 11 8.5.3 Cliquer sur l‟intersection des essais et des standards (une valeur peut déjà être inscrite ou un « X »). Cliquer sur le nom du standard puis cliquer sur « ? », l‟icône point d‟interrogation. Ceci permettra à l‟utilisateur de rentrer les valeurs indiquées sur l‟étiquette du flacon du calibrateur. Sauvegarder les valeurs entrées. 8.6 Entrer les numéros de lot 8.6.1 Cliquer sur Calibration et Réactifs puis entrer le 5ième et 6ième chiffre du code barre des étiquettes des anti-IgG1, IgG2, IgG3 et IgG4. Sauvegarder les chiffres entré. Il est important d‟entrer les numéros puisque l‟appareil vérifie automatiquement les code barres. 8.7 Analyse 8.7.1 Demander la calibration des quatre sous-classes, en appuyant sur Calibration et Courbe de référence et en sélectionnant l‟analyse à partir de la liste. Après chaque sélection, cliquer sur le bouton de Mesure. Placer les réactifs dans les racks. Les antisérums doivent être placés en position 1,2,3,4 ou 5, alors que le flacon de réactif accélérateur doit être en 3, 4 ou 5ème position et utilisé comme réactif supplémentaire pour la quantification des IgG2 et IgG4. Placer le calibrateur sur le rack en position 6 à 15. Dans les deux cas les racks du réactif accélérateur et du calibrateur vont être rejetés puis qu‟aucun code barre sera détecté. La boîte de dialogue s‟ouvrira et cliquer sur « réactif supplémentaire/standard » de la liste il est possible de repérer la position exacte des réactifs. Remettre les racks en les retirant puis e les repositionnant dans l‟analyseur. 8.7.2 8.7.3 8.7.4 8.7.5 Gamme de mesure approximative (mg/L) 1310 – 42000 313 – 10000 175 – 5600 120 – 3840 IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 9 4-6 ans IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 IgG totales 6-8 ans IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 IgG totales 8-10 ans IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 IgG totales 10-12 ans IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 IgG totales 12-14 ans IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 IgG totales 14-18 ans IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 IgG totales Sensibilité approximative (dilution 1:5) 66mg/L 78mg/L 44mg/L 30mg/L 12 10.1 10.3 10.4 10.5 11 VALEURS ATTENDUES Adultes Ces valeurs ont été obtenues en mesurant les sous-classes de sérums d‟adultes sains fournis par le Birmingham Blood Transfusion Service. Sous-classe IgG IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 11.2 43 43 43 43 43 5758 1754 437 331 8860 2880 – 9180 440 – 3750 155 – 853 4 – 992 4540 – 13600 32 32 32 32 32 6345 2126 521 349 9700 4320 – 10200 720 – 4300 127 – 853 19 – 932 5680 - 13600 46 46 46 46 46 6421 1980 620 323 10200 4230 – 10600 760 – 3550 173 – 1730 16 – 1150 5680 - 14900 54 54 54 54 54 6581 2486 583 409 10500 3420 – 11500 1000 – 4550 283 – 1250 37 – 1360 6640 – 14900 48 48 48 48 48 6057 2614 708 521 10100 3150 – 8550 640 – 4950 230 –1960 110 – 1570 5500 – 14400 Nombre (n) 30 30 30 30 Moy. (mg/L) 6330 4528 790,7 280,0 Médiane (mg/L) 6085 4541 706,4 215,3 Gamme 95 percentile (mg/L) 3824 – 9286 2418 – 7003 218,2 – 1760,6 39,2 – 864,0 Enfants Ces valeurs ont été obtenues en mesurant les IgG totales et les sous-classes en utilisant des sérums pédiatriques provenant d‟un hôpital de Birmingham. Les résultats ci-dessous ont été obtenus en utilisant des coffrets d‟immuno-diffusion radiale The Binding Site. Toutes les concentrations sont en mg/L. 0-2 ans IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 IgG totales 2-4 ans IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 IgG totales PERFORMANCES Précision intra-essai La précision intra-essai a été établie à partir de 3 sérums de concentrations différentes mesurés 10 fois chacun. Les concentrations sont en mg/L. Sérum 1 Sérum 2 Sérum 3 12.2 N 39 39 39 39 39 Moyenne 5248 838 445 129 6640 Gamme 95 percentile 1940 – 8420 225 – 3000 186 – 853 5 – 784 3270 – 12700 36 36 36 36 36 5495 1146 396 171 7770 3150 – 9450 360 – 2250 173 – 676 10 – 537 4680 – 12500 IgG1 Moy. CV% 2709 2,36 8657 2,95 2100 3,98 7 IgG2 Moy. CV% 1705 2,23 3669 3,19 8834 3,21 IgG3 Moy. CV% 162 3,30 355 3,29 830 3,24 IgG4 Moy. CV% 91,3 3,20 339 2,89 1011 1,73 Précision inter-essai La précision inter-essai a été établie à partir de 3 sérums mesurés au cours de 6 essais distincts utilisant des coffrets d‟un seul lot. Les concentrations sont en mg/L. Sérum 1 Sérum 2 Sérum 3 Les valeurs ci-dessous ont été obtenues à partir d‟une population limitée de sujets sains britanniques. Elles sont données à titre indicatif. Il est fortement conseillé à chaque laboratoire d‟établir ses propres normes. 11.1 Gamme 95 percentile 3060 – 9450 605 – 3450 99 – 1221 18 – 1125 5320 – 13400 Les résultats suivants ont été obtenus dans les laboratoires de la société The Binding Site en utilisant un coffret BNII. 12.1 LIMITES DE LA METHODE Il existe une bonne corrélation entre les dosages néphélémétriques et les dosages en immuno-diffusion radiale. Ces coffrets ne sont pas utilisables pour mesurer des échantillons hémolysés, lipidiques contenant du facteur rhumatoïde, des paraprotéines ou des complexes immuns circulants, a cause du degré de lumière diffractée non spécifique que ces échantillons peuvent générer. Les résultats inattendus doivent être confirmés en utilisant une autre méthode. Il est fortement recommandé aux utilisateurs de passer les deux contrôles lors de chaque série. Si une valeur obtenue à partir d‟une courbe de calibration enregistrée est en dehors des valeurs attendues, la calibration doit être refaite. Si les valeurs des contrôles présentent une variation supérieure à ±15% par rapport aux valeurs attendues, vérifier l‟instrument et le paramétrage avant de répéter l‟essai. Si le problème persiste, contacter le fournisseur. Les résultats du dosage des sous-classes ne doivent pas être utilisés chez les sujets allergiques lors de maladies atopiques. Un diagnostic ne peut pas être fait et un traitement ne doit pas être commencé uniquement sur la base du dosage des sous classes d‟IgG. L‟histoire clinique du patient ainsi que d‟autres tests doivent également être pris en considération. 10.2 Moyenne 6149 1496 531 329 9280 CONTROLE DE QUALITÉ Les concentrations des contrôles sont indiquées sur l‟étiquette du flacon. Les résultats seront corrects si la valeur obtenue diffère au maximum de 15% par rapport à la valeur cible. 10 N 49 49 49 49 49 12.3 IgG1 Moy. CV% 2811 3,56 8478 2,99 2148 4,02 0 IgG2 Moy. CV% 1724 3,44 3372 2,57 3712 4,83 IgG3 Moy. CV% 169 2,07 376 1,78 850 2,39 IgG4 Moy. CV% 90.7 6,69 336 3,32 985 3,90 Précision inter-lot Plusieurs sérums contenant différentes concentrations d‟IgG ont été quantifiés en utilisant différents lots de coffrets. Les coefficients de variation (CV) de la mesure des concentrations en sous-classes pour chaque préparation ont été calculés. Le CV global est donné ci-dessous (toutes les concentrations sont en mg/L). IgG1 Moy. Sérum 1 (nombre de lots) Sérum 2 (nombre de lots) Sérum 3 (nombre de lots) 13 1. 2. 3. 4. 5. 6. 4411 14191 20190 CV% 4,57 (11) 4,39 (11) 4,43 (11) IgG2 Moy. 504 4194 11530 CV% 3,93 (10) 4,93 (10) 5,07 (10) IgG3 Moy. 136 658 1463 CV% 4,70 (10) 6,33 (10) 4,92 (10) IgG4 Moy. 204 468 827 CV% 6,27 (11) 5,78 (10) 5,94 (11) BIBLIOGRAPHIE Shakib, F & Stanworth D R (1980), Human IgG subclasses in health and disease (Part II). La Ricerca Clin. Lab. 10, 561-580. Shackleford, P G, Polmar, S H et al (1986), Spectrum of IgG2 subclass deficiency in children with recurrent infections: Prospective study. J. Pediatr. 108, 647-653. Hamilton, R H (1987), Human IgG subclass measurements in the clinical laboratory. Clin. Chem. 33, 1707-1725. Schur, P H (1987), IgG subclasses – a review. Annals of Allergy 58, 89-99. Carr-Smith, H.D, Overton, J, Bradwell, A.R. (1997). IgG subclass value assignment to the protein reference preparation CRM470. Clin. Chem. Vol. 43, No. 56, PS238. Williams, D.R., Wilson, C.T., Carr-Smith, H.D. (2009). Assignment of IgG Subclass Values to the Protein Reference Preparation DA470k. Clin. Chem. Vol. 55, No. S6, PS C-90. Insert Code: SIN024, Version: 10th August 2011, Page 6 of 11 KITS DE REACTIVOS LÍQUIDOS PARA SUBCLASES IgG HUMANA (para uso en el Siemens BN™II*) El presente producto debe ser utilizado por personal especializado. Se recomienda observar estrictamente el procedimiento indicado. No se garantizan resultados válidos obtenidos utilizando parámetros diferentes que los indicados. Los reactivos de diferentes lotes NO son intercambiables. En caso de realizar un número elevado de tests, averigüe que todos los reactivos sean del mismo lote. 6 Para diagnóstico in-vitro únicamente Códigos: NK001.T, NK006.T, NK007.T, NK008.T, NK009.T Producto fabricado por: The Binding Site Group Ltd, 8 Calthorpe Road, Edgbaston, Birmingham, B15 1QT, U.K. www.bindingsite.co.uk The Binding Site Spain S.L.U. C/ Balmes 243 4º 3ª, 08006 Barcelona Teléfono 902027750 Fax: 902027752 e-mail: info@bindingsite.es web: www.bindingsite.es 1 El kit debe conservarse a 2-8°C, y puede utilizarse hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta. Los antisueros, calibradores, controles y el acelerador de reacción no abiertos deben conservarse a 2-8°C. Una vez abiertos, son estables durante 4 semanas a 2-8°C siempre que se evite la evaporación y contaminación. Los viales abiertos no deben dejarse en el analizador cuando no se estés utilizando. Si los reactivos se dejan a temperatura ambiente durante periodos prolongados o si se enfrían y atemperan repetidamente, puede provocar su deterioro. Los viales de antisuero no abierto pueden, con el tiempo, desarrollar un precipitado o turbidez que no está originada por contaminación microbiana y que no afecta a la actividad del antisuero. En estos casos el antisuero ha de aclararse por filtración a través de un filtro desechable de 0,2µm de poro o por centrifugación (unos 10 minutos a 15,000xg). 7 *BN™ es una marca de Siemens Healthcare Diagnostics Inc. UTILIZACIÓN Las muestras de sangre se han de obtener por punción en vena, dejar que coagule de modo natural y separar el suero lo antes posible para prevenir la hemólisis. El suero se conserva a 2-8ºC hasta 8 días, o se congela sin diluir a -20ºC para periodos más largos. Evitar la congelación repetida de las muestras. No deben utilizarse muestras hemolizadas, lipémicas, con contaminación microbiana o muestras que contengan partículas. 8 8.1 RESUMEN Y EXPLICACIÓN La IgG en adultos normales supone aproximadamente el 75% de las inmunoglobulinas séricas totales. Dentro de la clase IgG, el orden habitual de concentración de las 4 subclases es IgG1>IgG2>IgG3>IgG4, aunque la concentración real puede variar mucho entre individuos. Las 4 subclases IgG muestran propiedades considerablemente distintas, incluyendo la capacidad de fijación del complemento, unión a macrófagos y paso a través de la placenta. Niveles anormales de una o más subclases pueden estar asociados con ciertas condiciones, incluyendo anafilaxis, enfermedades autoinmunes e intestinales así como hipo- o hiper-gammaglobulinemia (ref 1). Concretamente, una producción disminuida de IgG2 en niños puede estar asociada con infecciones recurrentes (ref. 2). Este tema ha sido revisado (refs 3 y 4). El nefelómetro de Behring permite una automatización completa, la cuantificación rápida de reacciones de precipitación para la determinación de proteínas y pueden realizar todos los ensayos al mismo tiempo. 3 PRINCIPIO La determinación de la concentración de antígenos solubles por métodos nefelométricos supone la reacción con un antisuero específico, con lo que se forman complejos insolubles. Cuando la luz pasa a través de la suspensión una parte de la luz se dispersa y enfoca a un fotodiodo por medio de un sistema de lentes ópticas. La cantidad de luz dispersa es directamente proporcional a la concentración de la proteína específica en la muestra. Las concentraciones se calculan automáticamente en referencia a una curva de calibración almacenada en el instrumento. 4 4.1 REACTIVOS Antisueros IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 humana. Son monoespecíficos para la subclase correspondiente y se suministran en forma líquida estabilizada. Contienen: azida sódica 0,099%, ácido E-amino-N-caproico (EACA) 0,1%, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 0,1%, BSA 0,5% y benzamidina 0,01% como conservantes. 4.2 Calibradores y controles. Preparados a partir de una mezcla estabilizada y libre de lípidos de suero humano, se suministran en forma líquida estabilizada. Conservantes: azida sódica 0,099%, EACA 0,1% y benzaminida 0,01%. La concentración de las subclases IgG indicada en la etiqueta se ha obtenido por comparación con el material de referencia DA470k (refs. 5 y 6). 4.3 Acelerador de reacción. Conservante: azida sódica 0,099%. 5 OBTENCIÓN Y PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS Utilice muestras de suero frescas o ultra congeladas. Este kit está preparado para la cuantificación de las subclases IgG 1, 2, 3 y/o 4 humanas en suero en el analizador BNII. La medida de estas inmunoglobulinas ayuda en el diagnóstico del metabolismo anormal de proteínas y la incapacidad del organismo en su resistencia frente a agentes infecciosos. 2 CONSERVACIÓN Y ESTABILIDAD AVISO: Este kit contiene azida sódica debe manipularse con precaución; use guantes y vestuario protector adecuado en todo momento al manipular este producto. No trague ni permita el contacto con la piel o las mucosas (especialmente si hay heridas). En caso de contacto, lave con abundante agua y consulte a un médico. Con el plomo y el cobre pueden formarse azidas metálicas explosivas. Cuando se elimine el reactivo, lave con mucha agua los recipientes para evitar la acumulación de azida. Material suministrado en el kit “Combi” (NK001.T) Componentes Human IgG1 Antiserum (Antisuero IgG1 Humana) Human IgG2 Antiserum (Antisuero IgG2 Humana) Human IgG3 Antiserum (Antisuero IgG3 Humana) Human IgG4 Antiserum (Antisuero IgG4 Humana) Human IgG Subclass Calibrator (Calibrador IgG Subclase Humana) Human IgG Subclass Control Serum (Suero control IgG Subclase Humana) Human IgG Subclass Low Control (Control Bajo IgG Subclase Humana) Reaction Accelerator (Acelerador de Reacción, utilizado como “Reactivo Suplementario” para uso con IgG2 e IgG4) 8.2 NK001.T 1 x 1,6mL 1 x 1,6mL 1 x 1,6mL 1 x 1,6mL 2 x 1mL 2 x 1mL 2 x 1mL 1 x 3mL Material suministrado en los kits monoespecíficos (NK006.T, NK007.T, NK008.T, NK009.T) Componentes Subclass Antisera (Antisueros de subclases) Human IgG Subclass Calibrator (Calibrador IgG Subclase Humana) Human IgG Subclass Control Serum (Suero Control IgG Subclase Humana) Human IgG Subclass Low Control (Control Bajo IgG Subclase Humana) Reaction Accelerator (Acelerador de Reacción, utilizado como “Reactivo Suplementario”) para uso con IgG2 e IgG4) NK006/7/8/9.T 4 x 1,6mL 2 x 1mL 3 x 1mL 3 x 1mL 2 x 3mL 8.3 Materiales necesarios pero no suministrados 8.3.1 8.3.2 Materiales necesarios para la preparación de las muestras, como tubos para la recolección de la sangre, pipetas, centrífuga, etc. Analizador automático funcional y equipado. 8.4 Procedimiento de ensayo 8.4.1 8.4.2 Prepare el analizador como indica el manual de usuario. Recomendamos que las subclases IgG se ensayen por separado a otros tests, ya que requieren la utilización de un acelerador de reacción colocado en el analizador como reactivo suplementario. Los protocolos para el ensayo de las subclases IgG se encuentran ya definidos en el analizador. El calibrador de subclase IgG se ha de colocar en el analizador como un estándar de Behring. Por tanto, cualquier reactivo Behring se ha de quitar del instrumento antes del análisis de la subclase IgG. Los parámetros están disponibles en la sección apéndice del folleto interior. 8.4.3 PRECAUCIONES Los sueros humanos suministrados en el kit han sido sometidos a screening para donantes, resultando negativos a la presencia del antígeno de superficie de la hepatitis B y a la presencia de los anticuerpos de la ante los virus HIV1, HIV2 y HCV. Las técnicas usadas están aprobadas por la FDA (USA) o para el diagnóstico in vitro por la UE (Directiva 98/79/EC, Anexo II). Sin embargo los sobredichos ensayos no garantizan la ausencia de agentes infecciosos. Por lo tanto, deben tratarse los reactivos como potencialmente infecciosos. Tanto la manipulación como los métodos de eliminación de desechos deberán realizarse conforme a la normativa de materiales infecciosos y solo personal adecuadamente instruido deberá efectuar el test. METODOLOGÍA 8.5 Para introducir el valor del calibrador 8.5.1 Es probable que „Prot. Standard PY, OR „Prot.Standard SY‟ hayan sido ya definidos como el calibrador de subclase IgG para los ensayos. El usuario puede confirmarlo haciendo click en Definition y Standard. Si se ha definido el ensayo para el estándar correspondiente, hay una “X” en el campo de la intersección del ensayo y el estándar. Debe ser así para proceder. Haga click en Calibrator y Standard lots. Si ya existe un número de lote Behring para el calibrador para subclases IgG (vea la primera columna vertical en la cuadrícula) no hay que cambiarlo. Si el usuario no puede ver el ensayo, desplácese a través de la pantalla hasta que aparezca. Haga click en la intersección del ensayo y el estándar. (Debe haber un valor previo o una “X”). Haga click sobre el nombre del patrón, luego click en “?”, el icono de pregunta. Esto permitirá al usuario entrar el valor de la etiqueta del calibrador de subclase IgG. Pulse el botón Save. 8.5.2 8.5.3 Insert Code: SIN024, Version: 10th August 2011, Page 7 of 11 8.6 Para introducir los números de lote de los reactivos 8.6.1 Haga click en Calibration y Reagent e introduzca los numerous 5º y 6º del código de barras de la etiqueta para los reactivos IgG1 -> IgG4 seleccionándolos individualmente y haciendo click en el botón Save. Es importante que se introduzcan ya que en analizador comprobará el número de lote introducido. 8.7 Realización de un ensayo 8.7.1 Solicite la calibración para las cuatro subclases haciendo click en Calibration y Reference Curve y seleccionando los ensayos de la lista. Tras cada selección haga click en el botón Measure. Coloque los reactivos en los racks. Los reactivos antisuero han de colocarse en las filas 1, 2, 3, 4 o 5, mientras que la botella de Acelerador de Reacción ha de colocarse en la fila 3, 4 o 5 y se utiliza como “Supplementary reagent” para los ensayos IgG2 e IgG4. Coloque el calibrador en un rack en las filas 6-15. En ambos casos el rack de acelerador de reacción y el rack de calibrador serán rechazados ya que no detecta código de barras. Se abre el diálogo en la pantalla y el usuario debe hacer click en el supplementary reagent/standard en la lista y después hacer click en la correspondiente posición requerida del rack mostrado. Recoloque los racks quitándolos primero del analizador y volviendo a colocarlos otra vez. 8.7.2 8.7.3 8.7.4 8.7.5 Rango de medida aproximado (mg/L) 1310 – 42000 313 – 10000 175 – 5600 120 – 3840 IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 9 4-6 años IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 IgG total 6-8 años IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 IgG total 8-10 años IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 IgG total 10-12 años IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 IgG total 12-14 años IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 IgG total 14-18 años IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 IgG total Sensibilidad aproximada (con una dilución de muestra 1:5) 66mg/L 78mg/L 44mg/L 30mg/L CONTROL DE CALIDAD Las concentraciones de subclases IgG asignadas a los controles suministrados se indican en las etiquetas de los viales. Los valores obtenidos para el control suministrado deben estar dentro de ±15% del valor de concentración indicado en la etiqueta. 10 10.1 10.2 10.3 10.4 10.5 Rango 95 percentil 3060 – 9450 605 – 3450 99 – 1221 18 – 1125 5320 - 13400 43 43 43 43 43 5758 1754 437 331 8860 2880 – 9180 440 – 3750 155 – 853 4 – 992 4540 – 13600 32 32 32 32 32 6345 2126 521 349 9700 4320 – 10200 720 – 4300 127 – 853 19 – 932 5680 - 13600 46 46 46 46 46 6421 1980 620 323 10200 4230 – 10600 760 – 3550 173 – 1730 16 – 1150 5680 - 14900 54 54 54 54 54 6581 2486 583 409 10500 3420 – 11500 1000 – 4550 283 – 1250 37 – 1360 6640 – 14900 48 48 48 48 48 6057 2614 708 521 10100 3150 – 8550 640 – 4950 230 –1960 110 – 1570 5500 – 14400 CARACTERÍSTICAS DEL MÉTODO Se obtuvieron los siguientes datos en nuestro laboratorio utilizando este producto. Se ha comprobado que los ensayos nefelométricos de subclases IgG correlacionan bien con los ensayos RID de dilución única de Binding Site, con un amplio número de muestras. Estos kits no son adecuados para la medida de muestras con niveles elevados de factores reumatoides, paraproteinas, complejos inmuno circulantes (CICs), o para muestras hemolizadas o lipémicas, debido al impredecible grado de dispersión inespecífica que pueden generar estas muestras. Resultados inesperados deben confirmarse mediante un método alternativo. Se recomienda a los clientes que ensayen ambos controles con cada lote de muestras ensayadas. Si un valor de control queda fuera de rango cuando se ensaya frente a una curva almacenada, el ensayo debe recalibrarse. Si quedan fuera de los límites aceptables en un ±15% frente a la nueva curva de calibración, se ha de comprobar el instrumento y los parámetros antes de repetir el ensayo. Si los problemas continúan, póngase en contacto con su proveedor. Los resultados de la medida de subclases IgG no deben utilizarse para evaluar atopia en pacientes alérgicos. No debe realizarse el diagnóstico ni iniciarse un tratamiento basándose únicamente en la medida de las subclases IgG, deben tenerse en cuenta también la historia clínica y resultados de otras pruebas de laboratorio. 12.1 Rangos normales, adultos Estos rangos se obtuvieron midiendo las subclases en sueros proporcionados por el Birmingham Blood Transfusion Service, de donantes adultos sanos. Precisión intra-ensayo Se ensayaron 3 preparaciones de suero con niveles distintos de subclases IgG. Cada uno de los valores mostrados se calculó a partir de 10 medidas realizadas en el mismo ensayo. Todas las concentraciones están en mg/L. IgG1 Media CV% 2709 2,36 8657 2,95 21007 3,98 Suero 1 Suero 2 Suero 3 12.2 Suero 1 Suero 2 Suero 3 12.3 IgG1 Media CV% 2811 3,56 8478 2,99 21480 4,02 IgG1 Media CV% Mediana (mg/L) Rango 95 percentil (mg/L) Suero 1 (nº. de muestras) IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 30 30 30 30 6330 4528 790,7 280,0 6085 4541 706,4 215,3 3824 – 9286 2418 – 7003 218,2 – 1760,6 39,2 – 864,0 Suero 2 (nº. de muestras) Suero 3 (nº. de muestras) 13 Rangos pediátricos Media 5248 838 445 129 6640 Rango 95 percentil 1940 – 8420 225 – 3000 186 – 853 5 – 784 3270 – 12700 36 36 36 36 36 5495 1146 396 171 7770 3150 – 9450 360 – 2250 173 – 676 10 – 537 4680 – 12500 IgG2 Media CV% 1724 3,44 3372 2,57 3712 4,83 IgG3 Media CV% 169 2,07 376 1,78 850 2,39 IgG4 Media CV% 90,7 6,69 336 3,32 985 3,90 Se ensayaron diferentes preparaciones de suero cada una con niveles distintos de subclases IgG, utilizando kits de lotes diferentes. A continuación se muestra el %CV global de los resultados para cada concentración. Todas las concentraciones se expresan en mg/L. Media (mg/L) N 39 39 39 39 39 IgG4 Media CV% 91,3 3,20 339 2,89 1011 1,73 Precisión inter-lote Número (n) 0-2 años IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 IgG total 2-4 años IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 IgG total IgG3 Media CV% 162 3,30 355 3,29 830 3,24 Precisión inter-ensayo Subclase IgG Estos rangos se obtuvieron midiendo la IgG total y las subclases en muestras de suero pediátricas del Birmingham Hospital, utilizando productos de inmunodifusión radial de Binding Site. Las concentraciones se expresan en mg/L. IgG2 Media CV% 1705 2,23 3669 3,19 8834 3,21 Se ensayaron 3 preparaciones de suero con niveles distintos de subclases IgG en seis ensayos separados utilizando kits del mismo lote. Las concentraciones se indican en mg/L. VALORES ESPERADOS Los valores indicados a continuación se obtuvieron a partir de un número limitado de muestras inglesas y se ofrecen únicamente como una guía. Es muy recomendable que cada laboratorio establezca sus propios rangos de normalidad. 11.2 Media 6149 1496 531 329 9280 LIMITACIONES DEL MÉTODO 11 11.1 12 N 49 49 49 49 49 1. 2. 3. 4. 5. 6. 4411 14191 20190 4,57 (11) 4,39 (11) 4,43 (11) IgG2 Media CV% 504 4194 11530 3,93 (10) 4,93 (10) 5,07 (10) IgG3 Media CV% 136 658 1463 4,70 (10) 6,33 (10) 4,92 (10) IgG4 Media CV% 204 468 827 6,27 (11) 5,78 (10) 5,94 (11) BIBLIOGRAFÍA Shakib, F & Stanworth D R (1980), Human IgG subclasses in health and disease (Part II). La Ricerca Clin. Lab. 10, 561-580. Shackleford, P G, Polmar, S H et al (1986), Spectrum of IgG2 subclass deficiency in children with recurrent infections: Prospective study. J. Pediatr. 108, 647-653. Hamilton, R H (1987), Human IgG subclass measurements in the clinical laboratory. Clin. Chem. 33, 1707-1725. Schur, P H (1987), IgG subclasses – a review. Annals of Allergy 58, 89-99. Carr-Smith, H.D, Overton, J, Bradwell, A.R. (1997). IgG subclass value assignment to the protein reference preparation CRM470. Clin. Chem. Vol. 43, No. 56, PS238. Williams, D.R., Wilson, C.T., Carr-Smith, H.D. (2009). Assignment of IgG Subclass Values to the Protein Reference Preparation DA470k. Clin. Chem. Vol. 55, No. S6, PS C-90. Insert Code: SIN024, Version: 10th August 2011, Page 8 of 11 APPENDIX / ANHANG / APPENDICE / APÉNDICE IgG1 Parameters / IgG1 Testparameter / Paramètres IgG1 / Parámetros IgG1 [ IgG1 Identification for Host Version Derived from assay Sample Type [ ] [ 1.0 ] [ 0 ] [ Serum ] 3 4 5 Transfer arm [Left ] Washing Program no. Probe cleaning intensity [0 ] Probe rinsing intensity Assay name (with assay selection) Abbreviation Transfer step 2. No. of Transfer Steps 1 2 ] Assay Name [Human IgG1 Antiserum] Position in List [ Behring Assay Code [ 51 System liquid [ Buffer] ] ] Allow multiple lots Mini-batch Do not interrupt preparation [ [0 1] ] Volume [µL] [ 70] Dispensing program no. [1] [ Reagent] [Reagent ] [IgG1 [ ] [Reagent ] [ [ ] [Reagent ] [ [ ] [Reagent ] [ ] Volume [µL] [ 40] Dispensing program no. ] Volume [µL] [ 0] Dispensing program no. ] Volume [µL] [ 0] Dispensing program no. ] Volume [µL] [ 0] Dispensing program no. [2] [1] [1] [1] Destination Mixing ] [0.600] [1] [ sec Dispensing program no. Preincubation Minimum [ 0 ] Maximum Start measurement after this transfer step [0] Measurement Prereaction Start prereaction [ 0.0 Factor [ 1.0 Initial measurement [ sec ] [ 7.5 Number of averaging points [ 4 VlinIntegral Start evaluation [ sec ] [ 0.0 Upper preeval. rate [ 0.0 Stop evaluation [ sec ] [ 0.0 Lower preeval. rate [ 0.0 Integral area [ 0 IgG2 Parameters / IgG2 Testparameter / Paramètres IgG2 / Parámetros IgG2 [ Fixed time ] [ 0.00 ] mg/L Method Lower Measuring Range Limit Assay name (with assay selection) ] Stop prereaction [ sec ] [ 0.0 ] Constant to be added [ 0.0 ] Last measurement [ sec ] [ 360 ] ] ] ] ] ] ] ] ] ] ] ] ] ] Polynomial regress. Min. search window Preeval. Window Min. regression time Upper max. eval. offset [ [ [ [ [ 3 0.0 0.0 0.0 0.0 Abbreviation [ IgG2 Identification for Host Version Derived from assay Sample Type [ ] [ 1.0 ] [ 0 ] [ Serum ] Variable start of eval. ] Assay Name [Human IgG2 Antiserum] Position in List [ Behring Assay Code [ 52 ] ] Allow multiple lots Mini-batch Do not interrupt preparation Measurement Remeasurement Lower remeasurement limit [ 0.000 ] limit [ 0.000 ] Max. no. of remeas. [ 1 ] If result within limits remeasure in Take Remeasurement in Method Lower Measuring Range Limit higher dilution lower dilution Upper remeasurement Prereaction Start prereaction [ 0.0 Factor [ 1.0 Initial measurement [ sec ] [ 7.5 Number of averaging points [ 4 VlinIntegral Start evaluation [ sec ] [ 0.0 Upper preeval. rate [ 0.0 Stop evaluation [ sec ] [ 0.0 Lower preeval. rate [ 0.0 Integral area [ 0 [ Same dilution ] [ Lowest result ] Result Unit No. of digits after decimal point Conversion factor from mg/L to IU/L Conversion factor from mg/L to U/L Conversion factor from mg/L to mol [ [ [ [ [ [ Fixed time ] [ 0.00 ] mg/L mg/L ] 0 ] 1.000000 ] 1.000000 ] 1.000000 ] ] Stop prereaction [ sec ] [ 0.0 ] Constant to be added [ 0.0 ] Last measurement [ sec ] [ 720 ] ] ] ] ] ] ] ] ] ] ] ] ] ] Polynomial regress. Min. search window Preeval. Window Min. regression time Upper max. eval. offset [ [ [ [ [ 3 0.0 0.0 0.0 0.0 Variable start of eval. Remeasurement Sample dilution Lower remeasurement limit [ 0.000 ] limit [ 0.000 ] Max. no. of remeas. [ 1 ] If result within limits remeasure in Take Remeasurement in [ 1:100 ] [ 1:5 ] Sample dilution Minimum dilution Turbidity check Turbidity threshold [800 ] Bit Turbidity factor [ 15 ] % Upper limit of turbidity check [1800 ] Bit If you do not wish the turbidity check to be performed, set all values to 0. higher dilution lower dilution Upper remeasurement [ Same dilution ] [ Lowest result ] Result Unit No. of digits after decimal point Conversion factor from mg/L to IU/L Conversion factor from mg/L to U/L Conversion factor from mg/L to mol Washing Cuvette contamination [10000 ] Dilution probe contamination [0] Cuvette washing intensity [100000] Dilution probe rinsing intensity [0] [ [ [ [ [ mg/L 0 1.000000 1.000000 1.000000 ] ] ] ] ] Technical parameters Sample dilution Transfer step 1. Sample dilution Minimum dilution No. of Transfer Steps 1 2 3 4 [ 1:20 [ 1:5 ] ] 5 Turbidity check Transfer arm [Right ] Washing Program no. Probe cleaning intensity [1000000] Probe rinsing intensity System liquid [ Buffer ] Volume [µL] [ 70] Dispensing program no. [ Sample ] [Reagent ] [ [ ] [Reagent ] [ [ ] [Reagent ] [ [ ] [Reagent ] [ Destination Mixing [ sec [ 1] [10000000 ] ] Volume [µL] ] Volume [µL] ] Volume [µL] ] Volume [µL] ] [25] Dispensing program no. [ 0] Dispensing program no. [ 0] Dispensing program no. [ 0] Dispensing program no. [4] [2] [1] [1] [1] Turbidity threshold [800 ] Bit Turbidity factor [ 15 ] % Upper limit of turbidity check [1800 ] Bit If you do not wish the turbidity check to be performed, set all values to 0. Washing Cuvette contamination [10000 ] Dilution probe contamination [0] Cuvette washing intensity [100000] Dilution probe rinsing intensity [0] [ 0.0] Dispensing program no. [7] Preincubation Minimum [ 0 ] Maximum Start measurement after this transfer step [0] Insert Code: SIN024, Version: 10th August 2011, Page 9 of 11 Technical parameters Turbidity check Transfer step 1. Turbidity threshold [800 ] Bit Turbidity factor [ 15 ] % Upper limit of turbidity check [1800 ] Bit If you do not wish the turbidity check to be performed, set all values to 0. No. of Transfer Steps 1 2 3 4 5 Washing Transfer arm [Right ] Washing Program no. Probe cleaning intensity [1000000] Probe rinsing intensity System liquid [ Buffer] [ 1] [10000000 ] Volume [µL] [ 70] Dispensing program no. [4] [ Reagent] [Reagent ] [ACC [ Sample ] [Reagent ] [ [ ] [Reagent ] [ [ ] [Reagent ] [ ] Volume [µL] [ 10] Dispensing program no. ] Volume [µL] [ 25] Dispensing program no. ] Volume [µL] [ 0] Dispensing program no. ] Volume [µL] [ 0] Dispensing program no. Destination Mixing ] [0.000] Cuvette contamination [10000 ] Dilution probe contamination [0] Cuvette washing intensity [100000] Dilution probe rinsing intensity [0] [ sec [2] [2] [1] [1] Dispensing program no. [7] Preincubation Minimum [ 0 ] Maximum Start measurement after this transfer step [0] Technical parameters Transfer step 1. No. of Transfer Steps 1 2 3 No. of Transfer Steps 1 2 3 4 5 Transfer arm [Left ] Washing Program no. Probe cleaning intensity [0 ] Probe rinsing intensity [ [0 1] ] Volume [µL] [ 70] Dispensing program no. [1] [ Reagent] [Reagent ] [IgG2 [ ] [Reagent ] [ [ ] [Reagent ] [ [ ] [Reagent ] [ ] Volume [µL] [ 40] Dispensing program no. ] Volume [µL] [ 0] Dispensing program no. ] Volume [µL] [ 0] Dispensing program no. ] Volume [µL] [ 0] Dispensing program no. [2] [1] [1] [1] Destination Mixing ] [0.600] [1] [ sec [ 1] [10000000 ] Volume [µL] [ 70] Dispensing program no. [ Sample ] [Reagent ] [ [ ] [Reagent ] [ [ ] [Reagent ] [ [ ] [Reagent ] [ Destination Mixing System liquid [ Buffer] 5 Transfer arm [Right ] Washing Program no. Probe cleaning intensity [1000000 ] Probe rinsing intensity System liquid [ Buffer ] Transfer step 2. 4 ] Volume [µL] ] Volume [µL] ] Volume [µL] ] Volume [µL] ] [25] Dispensing program no. [ 0] Dispensing program no. [ 0] Dispensing program no. [ 0] Dispensing program no. [4] [2] [1] [1] [1] [ 0.0] Dispensing program no. [7] Preincubation Minimum [ 0 ] Maximum Start measurement after this transfer step [0] Transfer step 2. [ sec Dispensing program no. Preincubation Minimum [ 0 ] Maximum Start measurement after this transfer step [0] No. of Transfer Steps 1 2 3 4 5 Transfer arm [Left ] Washing Program no. Probe cleaning intensity [0 ] Probe rinsing intensity [ [0 1] ] IgG3 Parameters / IgG3 Testparameter / Paramètres IgG3 / Parámetros IgG3 System liquid [ Buffer] Volume [µL] [ 70] Dispensing program no. [1] [ Reagent] [Reagent ] [IgG3 [ ] [Reagent ] [ [ ] [Reagent ] [ [ ] [Reagent ] [ ] Volume [µL] [ 40] Dispensing program no. ] Volume [µL] [ 0] Dispensing program no. ] Volume [µL] [ 0] Dispensing program no. ] Volume [µL] [ 0] Dispensing program no. [2] [1] [1] [1] Destination Mixing ] [0.600] [1] Assay name (with assay selection) Abbreviation [ IgG3 ] Assay Name [Human IgG3 Antiserum] Identification for Host [ ] Position in List [ Version [ 1.0 ] Behring Assay Code [ 64 Derived from assay [ 0 ] Sample Type [ Serum ] ] ] Allow multiple lots Mini-batch Do not interrupt preparation Abbreviation ] Stop prereaction [ sec ] [ 0.0 ] Constant to be added [ 0.0 ] Last measurement [ sec ] [ 360 ] ] ] ] ] ] ] ] ] ] ] ] ] ] Polynomial regress. Min. search window Preeval. Window Min. regression time Upper max. eval. offset Remeasurement Lower remeasurement limit [ 0.000 ] limit [ 0.000 ] Max. no. of remeas. [ 1 ] If result within limits remeasure in Take Remeasurement in higher dilution lower dilution Upper remeasurement [ Same dilution ] [ Lowest result ] Result Unit No. of digits after decimal point Conversion factor from mg/L to IU/L Conversion factor from mg/L to U/L Conversion factor from mg/L to mol [ [ [ [ [ 3 0.0 0.0 0.0 0.0 [ IgG4 ] Assay Name [Human IgG4 Antiserum] Identification for Host [ ] Position in List [ Version [ 1.0 ] Behring Assay Code [ 0 Derived from assay [ 0 ] Sample Type [ Serum ] [ [ [ [ [ mg/L 1 1.000000 1.000000 1.000000 ] ] ] ] ] Sample dilution [ 1:20 [ 1:5 ] ] ] ] Allow multiple lots Mini-batch Do not interrupt preparation Measurement Method Lower Measuring Range Limit Variable start of eval. Sample dilution Minimum dilution [0] Assay name (with assay selection) [ Fixed time ] [ 0.00 ] mg/L Prereaction Start prereaction [ 0.0 Factor [ 1.0 Initial measurement [ sec ] [ 7.5 Number of averaging points [ 4 VlinIntegral Start evaluation [ sec ] [ 0.0 Upper preeval. rate [ 0.0 Stop evaluation [ sec ] [ 0.0 Lower preeval. rate [ 0.0 Integral area [ 0 Dispensing program no. IgG4 Parameters / IgG4 Testparameter / Paramètres IgG4 / Parámetros IgG4 Measurement Method Lower Measuring Range Limit [ sec Preincubation Minimum [ 0 ] Maximum Start measurement after this transfer step Prereaction Start prereaction [ 0.0 Factor [ 1.0 Initial measurement [ sec ] [ 7.5 Number of averaging points [ 4 VlinIntegral Start evaluation [ sec ] [ 0.0 Upper preeval. rate [ 0.0 Stop evaluation [ sec ] [ 0.0 Lower preeval. rate [ 0.0 Integral area [ 0 [ Fixed time ] [ 0.00 ] mg/L ] Stop prereaction [ sec ] [ 0.0 ] Constant to be added [ 0.0 ] Last measurement [ sec ] [ 720 ] ] ] ] ] ] ] ] ] ] ] ] ] ] Polynomial regress. Min. search window Preeval. Window Min. regression time Upper max. eval. offset Variable start of eval. Remeasurement Lower remeasurement limit [ 0.000 ] limit [ 0.000 ] Max. no. of remeas. [ 1 ] If result within limits remeasure in Take Remeasurement in Insert Code: SIN024, Version: 10th August 2011, Page 10 of 11 higher dilution lower dilution Upper remeasurement [ Same dilution ] [ Lowest result ] [ [ [ [ [ 3 0.0 0.0 0.0 0.0 Result Double-click on the field with an X at the intersection of the calibrator name and IgG4 and check the details below: Unit No. of digits after decimal point Conversion factor from mg/L to IU/L Conversion factor from mg/L to U/L Conversion factor from mg/L to mol [ [ [ [ [ mg/L 1 1.000000 1.000000 1.000000 ] ] ] ] ] Points on curve Start dilution Identification Value Permitted deviation [6 ] [ 1:2.5 ] [ ] [0 ] [ 10 ] Sample dilution Sample dilution Minimum dilution [ 1:20 [ 1:5 ] ] Turbidity check Turbidity threshold [800 ] Bit Turbidity factor [ 15 ] % Upper limit of turbidity check [1800 ] Bit If you do not wish the turbidity check to be performed, set all values to 0. Washing Cuvette contamination [10000 ] Dilution probe contamination [0] Cuvette washing intensity [100000] Dilution probe rinsing intensity [0] Technical parameters Transfer step 1 No. of Transfer Steps 1 2 3 4 5 Transfer arm [Right ] Washing Program no. Probe cleaning intensity [1000000] Probe rinsing intensity [ 1] [10000000 ] System liquid [ Buffer] Volume [µL] [ Reagent] [Reagent ] [ACC [ Sample ] [Reagent ] [ [ ] [Reagent ] [ [ ] [Reagent ] [ ] Volume [µL] [ 10] Dispensing program no. ] Volume [µL] [ 25] Dispensing program no. ] Volume [µL] [ 0] Dispensing program no. ] Volume [µL] [ 0] Dispensing program no. Destination Mixing ] [0.000] [ sec [ 70] Dispensing program no. [4] [2] [2] [1] [1] Dispensing program no. [7] Preincubation Minimum [ 0 ] Maximum Start measurement after this transfer step [0] Transfer step 2. No. of Transfer Steps 1 2 3 4 5 Transfer arm [Left ] Washing Program no. Probe cleaning intensity [ 0 ] Probe rinsing intensity System liquid [ Buffer] [ [ 1 0 ] ] Volume [µL] [ 70] Dispensing program no. [1] [ Reagent] [Reagent ] [IgG4 [ ] [Reagent ] [ [ ] [Reagent ] [ [ ] [Reagent ] [ ] Volume [µL] [ 40] Dispensing program no. ] Volume [µL] [ 0] Dispensing program no. ] Volume [µL] [ 0] Dispensing program no. ] Volume [µL] [ 0] Dispensing program no. [2] [1] [1] [1] Destination Mixing ] [0.600] [1] [ sec Dispensing program no. Preincubation Minimum [ 0 ] Maximum Start measurement after this transfer step [0] TO ENTER THE CALIBRATOR VALUES/ EINGABE DER KALIBRATORWERTE/ ENTRER LES VALEURS DU CALIBRATEUR / PARA INTRODUCIR LOS VALORES DEL CALIBRADORES: Double-click on the field with an X at the intersection of the calibrator name and IgG1 and check the details below: Points on curve Start dilution Identification Value Permitted deviation [6 [ 1:20 [ [0 [ 10 ] ] ] ] ] with zero calibrator Extrapolation bits % Double-click on the field with an X at the intersection of the calibrator name and IgG2 and check the details below: Points on curve Start dilution Identification Value Permitted deviation [6 [ 1:10 [ [0 [ 10 ] ] ] ] ] with zero calibrator Extrapolation bits % Double-click on the field with an X at the intersection of the calibrator name and IgG3 and check the details below: Points on curve Start dilution Identification Value Permitted deviation [6 ] [ 1:2.5 ] [ ] [0 ] [ 10 ] with zero calibrator Extrapolation bits % Insert Code: SIN024, Version: 10th August 2011, Page 11 of 11 with zero calibrator Extrapolation bits %
