Práctica: Electroforesis y extracción de ADN Biología AISLAMIENTO DE ADN GENÓMICO Fundamento: La purificación de ADN se ha convertido hoy día en una técnica imprescindible en la mayoría de los laboratorios dedicados a investigación biológica, farmacéutica o médica. Es imprescindible obtener ADN para poder secuenciarlo, también para el diagnóstico de enfermedades genéticas y para muchas otras finalidades. Por ejemplo, hoy se pueden diagnosticar enfermedades infecciosas o parasitarias investigando la presencia de secuencias de ADN bacteriano, vírico o de parásitos en las muestras de ADN humano. El estudio del ADN tiene también variadas aplicaciones forenses, antropológicas, evolutivas, etc. El aislamiento de ADN a partir de cualquier muestra biológica se realiza a partir de un extracto en el que se solubiliza y del que posteriormente se eliminan todo tipo de moléculas biológicas acompañantes, glúcidos, lípidos y proteínas. Los métodos de extracción son muy variados y dependen del material biológico de partida y de las características del ADN que se pretenda purificar. No es lo mismo pretender purificar ADN cromosómico de una bacteria que ADN plasmídico. Tampoco es igual tratar de purificar ADN a partir de una muestra ósea fosilizada que a partir de un cultivo bacteriano o de una muestra de sangre. Cada situación requiere procedimientos particulares, aunque la finalidad es siempre la misma, obtener en disolución el ADN requerido lo más intacto posible. Hay que considerar que por su estructura, cadenas polinucleotídicas enormemente largas, el ADN produce soluciones muy viscosas y puede romperse con suma facilidad. Una vez solubilizado el ADN, la muestra debe tratarse adecuadamente para eliminar glúcidos y lípidos, lo que normalmente no ocasiona problemas. Es más difícil eliminar proteínas. Tenga en consideración que existen multitud de proteínas que se unen muy fuertemente al ADN y que muchas de ellas, fundamentalmente histonas, forman parte integrante de la cromatina, estableciendo interacciones muy estables para formar los cromosomas eucarióticos. Las proteínas se pueden eliminar forzando su desnaturalización y por medio de incubaciones con proteasas para que se degraden a péptidos y aminoácidos libres que serán fácilmente eliminados con posterioridad. Las etapas finales de la purificación siempre se basan en la precipitación del ADN, lo que se consigue fácilmente con disoluciones alcohólicas en presencia de sales que produzcan una fuerza iónica adecuada. En los últimos años se han desarrollado multitud de métodos para obtener ADN puro y totalmente libre de proteínas. Este ADN es adecuado para estudios estructurales, secuenciación, hidrólisis específica con enzimas de restricción, y en general para todas las técnicas de biología molecular. Este método necesita un tiempo relativamente largo para completarse, por eso vamos a realizar un método más sencillo y rápido con el que vamos a extraer ADN genómico a partir de la mucosa bucal. Práctica: Electroforesis y extracción de ADN Biología EXTRACCIÓN DE ADN A PARTIR DE MUCOSA BUCAL Reactivos: S Dodecil sulfato sódico (SDS) al 5% en agua. S Acetato sódico 3 M. S Etanol absoluto. Método: 1. Tome un tubo estéril de 25 o 30 ml, y añada 10-12 ml de agua del grifo. Enjuáguese la boca durante 15 segundos con el agua, procurando distribuirla bien por todas las mucosas bucales. Deposite de nuevo el agua en el tubo. De esta forma se colectan muchas células de descamación de las mucosas. 2. Añada al tubo 0.5 ml de SDS al 5%, 0.5 ml de acetato sódico 3M y 10 ml de etanol absoluto frío y mezcle suavemente por inversión del tubo. Mantenga el tubo en el congelador durante unos minutos (mínimo 15 minutos para obtener buenos resultados). 3. Mezcle suavemente, invirtiendo el tubo unas pocas veces y espere la aparición de hebras blanquecinas, que están constituidas por ADN genómico. 4. Obviamente esta preparación sencilla es un ejemplo de la facilidad para extraer ADN. En este caso será un ADN muy contaminado con proteínas y otras biomoléculas. 5. Si se pretendiera utilizar este ADN para posterior manipulación, secuenciación, amplificación, etc. Debería ser procesado para la eliminación de todas las biomoléculas contaminantes. ELECTROFORESIS DE ADN Se llevará a cabo una electroforesis para visualizar el ADN plasmídico. Se observarán varias bandas que se corresponden con el ADN plasmídico en diferentes estados topológicos ya que los ADN circulares presentan distinta movilidad electroforética en función de su grado de enrollamiento. La electroforesis se realizará en un gel de agarosa al 1 %. 1. PREPARACIÓN DEL GEL Fundamento La agarosa disuelta en agua a temperaturas próximas a ebullición forma geles cuando se enfría debido a que las fibras poliméricas forman agregados que se entrecruzan. Dependiendo de la concentración de la disolución de agarosa los poros que quedan en la malla del gel serán de distinto tamaño y, por tanto, hay que utilizar diferentes concentraciones para separar moléculas de ácidos nucleicos para cada rango de tamaños. Método 1. Cargar 10 ul de la muestra en un pocillo del gel y 5 ul en otro pocillo. Práctica: Electroforesis y extracción de ADN Biología 2. Conectar los cables a la fuente de alimentación y colocar la tapa de la cubeta. Asegúrense de que la polaridad es correcta. 3. Fijar el voltaje en 80 v. 4. Desconectar la electroforesis apagando la fuente de alimentación cuando el colorante llegue al extremo del gel. 5. Quitar la tapa al aparato y con cuidado retiren la bandeja con el gel (el gel puede resbalar de la bandeja por lo que hay que colocar un dedo en los lados libres para que no se mueva). 6. Colocar el gel sobre el transiluminador UV y observen el ADN. En la figura inferior se muestra un minigel con un plásmido en tres estados topológicos: