inhibicion-de-acetil-y-butilcolinesterasas-por

Carbamates with Differential Mechanism of Inhibition Toward Acetylcholinesterase and
Butyrylcholinesterase
En términos neuroquímicos, todas las fibras preganglionares simpáticas y parasimpáticas poseen como
neurotransmisor específico o primario la acetilcolina, por interacción con receptores colinérgicos nicotínicos.
La eliminación se produce por medio de hidrólisis de la acetilcolina a colina y acetato, reacción catalizada
por la enzima acetilcolinesterasa. Hay dos tipos de colinesterasas: la acetilcolinesterasa y la butirilcolinesterasa.
Los carbamatos son enzimas anticolinesterásicas que producen la inhibición irreversible de la colinesterasa.
Los inhibidores de la acetilcolinesterasa prolongan la vida de la acetilcolina, incrementan su concentración
en los receptores correspondientes.
Sitio activo de Acetilcolinesterasa y Butirilcolinesterasa
Acetilcolinesterasa: posee una triada catalítica compuesta por la serina nucleófilica, histidina, y glutamato.
Además el residuo Y337 forma parte de E-hélice.
Butirilcolinesterasa: Estructuralmente es muy similar a la acetilcolinesterasa también posee la triada catalítica
formada por serina nucleófilica, histidina, y glutamato, pero el sitio de union es Y332 y F329.
Relación estructura Actividad
Carbamatos fenotiazínicos muestra inhibición reversible de butirilcolinestersa mientras que exhiben comúnmente la
inhibición pseudoirreversible de la acetilcolinesterasa. Se ha sugerido que los derivados de la fenotiazina inhiben la
butirilcolinesterasa por su unión a F329 y Y332.
Figura 2. Regiones del sitio activo de la Butirilcolinesterasa humana.
Figura 3. Regiones del sitio activo de la acetilcolinesterasa humana.
Inhibición reversible de la butirilcolinesterasa por los Carbamatos Fenotiazínicos
Se debe a la interacción entre F329 y Y332 de butirilcolinesterasa con los anillos de benceno de la fenotiazina
tricíclica, lo cual impide que el carbamoil llegue y carbamile la fracción S198 de la Butirilcolinesterasa de la tríada
catalítica.
Carbamatos
La mayoría de los carbamatos son inhibidores pseudoirreversible de colinesterasas, pero producen una
inhibición reversible de la enzima butirilcolinesterasa, lo que sugiere que no forman un enlace covalente con el
catalizador serina.
Esta inhibición atípica es atribuible a una interacción π-π de la fracción fenotiazina con F329 y Y332 en
butirilcolinesterasa.
Objetivo
Explorar la relación actividad-estructura de la inhibición de las colinesterasas por los derivados de carbamatos
fenotiazinicos.
Hipótesis
Los carbamatos fenotiazínicos exhiben una inhibición reversible de la butirilcolinesterasa debida a la interacción
entre F329 y Y332 de butirilcolinesterasa con los anillos de benceno de la fenotiazina tricíclica.
Identificación del problema
Los Carbamatos fenotiazínicos muestran distintos mecanismos de inhibición de la acetilcolinesterasa y
butirilcolinesterasa.
Estrategias para la resolución del problema
1. Síntesis de derivados de carbamatos fenotiazínicos y evaluación por sus propiedades inhibitorias de las
colinesterasas humanas.
Se sintetizaron 29 compuestos a partir de una fenotiazida y cada carbamato derivado fue examinado por su
habilidad para inhibir la acetilcolinesterasa y Butirilcolinesterasa humanas.
Tabla 1. Carbamatos Alquil y Aminoalquil fenotiazínicos.
Tabla 2. Carbamatos arilfenotiazínicos.
Estudios de cinética de enzimas
Para cada carbamato fenotiazínico se puso a prueba su capacidad en función del tiempo para llevar a cabo
la desactivación de butirilcolinesterasa y la acetilcolinesterasa..
Ninguno de los derivados mostró inhibición pseudoirreversible de Butirilcolinesterasa salvaje obtenida de
plasma humano purificado, como se evidenció por la ausencia de pérdida adicional de la actividad enzimática
después de preincubación de la enzima con el inhibidor. Por el contrario, todos los carbamatos fenotiazínicos aquí
descritos muestran una desactivación tiempo dependiente de acetilcolinesterasa humana recombinante purificada
(Tablas 1 y 2) porque hubo un aumento en el grado de inhibición de esta enzima con el aumento en el tiempo de la
preincubación de la enzima y el inhibidor.
Estudios Moleculares Computacionales
Métodos computacionales se utilizaron para examinar las características moleculares que podrían influir en
la inhibición de colinesterasas por carbamatos fenotiazínicos.
Parámetros
1. Volumen molecular total
2. Ángulo de mariposa se refiere al ángulo entre los dos planos definidos por los anillos de benceno de la
fenotiazina tricíclica. Para todos los compuestos fue siempre 146 ± 0,1º. La conformación mariposa de la
fenotiazina tricíclica provee una forma adecuada π-π de apilamiento de los anillos de benceno de esta fracción con
el F329 y Y332 dentro del sitio activo de la Butirilcolinesterasa como se sugiere anteriormente.
3. Valor log P
Relaciones estructura-actividad
La mayoría de los carbamatos conocidos desactivan las colinesterasas por la formación de un enlace covalente
tiempo dependiente (carbamilación) en el sitio activo de serina que antecede la hidrólisis del sustrato, como se
puede observar en la figura 11 en los pasos A, B, C.
Sitio activo serina
La desactivación de la enzima es iniciada por un
ataque nucleofílico del oxígeno de la tríada catalítica
de serina, en el grupo carbonilo del carbamato.
Carbamilación
Residuo carbamilado de serina.
Enzima activa
Figura 11. Mecanismo general de la inhibición pseudoirreversible de la
colinesterasa por carbamatos
La inhibición de la acetilcolinesterasa por Carbamatos fenotiazínicos
1. Alquil carbamatos: Inhibidores pseudoirreversible menos potentes de la acetilcolinesterasa que la rivastigmina
por que este último carbamato genera un anión fenóxido estabilizado por resonancia como un grupo saliente en el
paso de la carbamilación de la enzima (Figura 11C). Por el contrario, los alquil carbamatos deben producir un ion
alcóxido muy básico en el mismo paso. Este tipo de grupo saliente desfavorable también debería observarse para el
carbamato isopropílico (4), esto hace que su relativamente alta potencia inhibitoria sea difícil de explicar a menos
que la naturaleza compacta del sustituyente isopropílico facilite la interacción de los carbamatos con el sitio rico en
grupos arílicos de la acetilcolinesterasa. Varios carbamatos alquilamino fenotiazínicos, en especial 8, 9, 10, y 13
(Tabla 1), fueron, al igual que la mayoría de los alquil carbamatos, débiles inhibidores de la acetilcolinesterasa.
Hubo notables excepciones. En comparación con la rivastigmina, el carbamato 2-pirrolidiniletil (11) fue 40 veces
mejor inhibidor, mientras que el derivado 2-piperidiniletil (12) fue aproximadamente 3 veces mejor en la
inactivación de la acetilcolinesterasa. Es posible que los argumentos iniciales para la entrega de los más potentes
alquil carbamatos compactos (1, 4 y 7) estén también operando aquí con 11 y 12. Además, en vista de la mayor
inhibición de acetilcolinesterasa por 11, es posible que el átomo de nitrógeno heterocíclico protonado del grupo
pirrolidínico puede estar tan posicionado como para permitir una favorable interacción π-catiónico con W86 de la
enzima (Figura 1), generando la estabilización del inhibidor por una reacción en el sitio activo gorge garganta,
como ocurre con la acetilcolina en este sitio. Aun más, en 11, la presencia de un nitrógeno catiónico puede ayudar a
estabilizar el grupo saliente oxianión a través de catálisis ácido intramolecular.
2. Carbamatos arílicos: La mayoría de aril carbamatos fenotiazínicos (Tabla 2) fueron significativamente mejores
en inactivar la acetilcolinesterasa que rivastigimina. Todos estos carbamatos, incluida la rivastigmina, producen un
anión fenóxido estabilizador de la resonancia, perdiendo un grupo en el paso de la carbamilación (Figura 11C).
Para determinar si los efectos sobre la estabilidad electrónica del fenóxido perdiendo un grupo, podría estar
contribuyendo a una mayor potencia de la carbamatos fenotiazínicos, varios fenil carbamatos sustituidos fueron
examinados (Tabla 2). Allí no hubo un claro patrón para sugerir que predominan efectos electrónicos porque
sustituyentes idénticos en posiciones orto-, meta- o para- no demostraron un patrón predecible de potencia
inhibidora (Tabla 2). La única excepción posible fue con la fuerte liberación de electrones por parte del sustituyente
metoxi en los compuestos 18, 19, y 20. Esta serie exhibe un efecto debilitante sobre ka, cuando este grupo estaba en
la posición orto-(18) o para- (20) en donde la donación de electrones podría desestabilizar el grupo saliente
fenóxido. Esto se refleja en los bajos valores de ka de 18 y 20 en comparación con los meta-derivados (19), donde
el grupo metoxi tiende a ser electrón-extractor, o al no sustituido fenil carbamato (14). El impedimento estérico en
el gorge de la acetilcolinesterasa producido por el voluminoso grupo 2-t-butilo (25) ayuda a explicar porque este
carbamato es aproximadamente 60 veces menos potente que su homólogo para (26). Los efectos estéricos también
pueden hacer al 2-naphthyl (29) alrededor de 150 veces menos potente que el correspondiente 1-naphthyl derivados
(28) que presenta una conformación muy diferente a causa de su punto de adhesión a la fenotiazina, como se ha
visto comparable con derivados de amida. De todos los carbamatos fenotiazínicos sintetizados, el mejor inhibidor
de acetilcolinesterasa fue 3- (N, N-dimetilamino) fenil (24). La potencia de este derivado no se explica fácilmente
en términos electrónicos o estéricos. Es posible que, para este compuesto, el grupo nitrógeno o el anillo fenilo
puedan mejorar la unión del compuesto a acetilcolinesterasa. Alta potencia inhibidora para la acetilcolinesterasa de
24, 27, y 28, a pesar del gran volumen molecular total de estos compuestos (Tabla 2). Esto implica que sólo la
porción de la molécula que contiene la fracción carbamato necesita ser mostrada a S203 para que se produzca la
formación del enlace covalente.
Inhibición de butirilcolinesterasa por carbamatos fenotiazinicos
Todos los derivados de carbamatos fenotiazínicos inhiben la BuChE, a excepción de los siguientes
compuestos:
Log P 6.81
Log P 6.90
Los compuestos anteriores no poseen capacidad de inhibición de la butirilcolinesterasa ya que poseen
limitaciones en la solubilidad, demostradas por el Log P. (7)
En todos los casos la inhibición fue reversible debido a la interacción π- π entre la fenotiazina y los
residuos aromáticos F329 y Y332 en el sitio activo de la butirilcolinesterasa. (7)
Inhibición de butirilcolinesterasa por carbamatos alquilfenotiazínicos
Son inhibidores pobres porque sus grupos alquilo laterales son pequeños y tienen una habilidad limitada
para bloquear el acceso de los sustratos a la triada catalítica.(7)
Inhibición de butirilcolinesterasa por carbamatos aminoalquilfenotiazínicos
Buenos inhibidores una interacción adicional del nitrógeno protonado en estos grupos laterales con la
enzima, además de la interacción típica con el Y332 y el F239, hay una unión con el W82 en el sitio pi-catiónico.
Inhibición de butirilcolinesterasa por carbamatos fenotiazínicos aromáticos
En general, una sustitución en los grupos aromáticos no genera un cambio significativo en la extensión de
la inhibición. Sin embargo, la naturaleza planar de los grupos arilos en estos derivados puede constituir un factor
mayor en el bloqueo del acceso del sustrato a la triada catalítica, el ángulo mariposa de estos derivados permite una
mayor interacción con los residuos Y332 y F329, favorece la interacción π- π BuChE-fenotiazina.
El residuo Y337 en la acetilcolinesterasa interfiere con la unión con la fenotiazina, el A328 en la
butirilcolinesterasa es pequeño y no interfiere con la interacción π- π de los anillos aromáticos de la enzima y el
inhibidor.
2. Una serie de Butirilcolinesterasa mutantes se examinaron que tenían alteraciones en E-hélice
La inhibición selectiva y reversible de la butirilcolinesterasa por los derivados fenotiazínicos se explica por
la interacción entre la fenotiazina y dos residuos aminoácidos aromáticos de la enzima, F329 y Y332. La misma
interacción π- π es impedida en acetilcolinesterasa por la interferencia del Y337.
Reemplazando A328 en butirilcolinesterasa con un residuo aminoácido aromático hace que esta se asemeje
a la acetilcolinesterasa, la cual esta impedida con la Y337, al generar un impedimento estérico en el residuo A328
en las butirilcolinesterasas mutadas se expone el S198 a la carbamilación, pasando de inhibición reversible a
pseudoirreversible.
Conclusiones
1. Derivados de los carbamatos fenotiazínicos inhiben reversiblemente a la butirilcolinesteresa, por una unión π- π
entre la fenotiazina y los residuos F329 y Y332.
2. Derivados de los carbamatos fenotiazínicos inhiben en forma pseudoirreversible a la acetilcolinesterasa.
3. El impedimento del Y337 en la acetilcolinesterasa hace que estos derivados interaccionen con S203.
4. La alteración de los residuos 328,329 y 332 en el sitio activo de la butirilcolinesterasa altera el tipo de
inhibición producida por los carbamatos fenotiazínicos.
5. Carbamatos fenotiazínicos con grupos salientes estabilizados por resonancia son inhibidores potentes de la
acetilcolinesterasa.
6. Su interacción no covalente y capacidad de atravesar barrera hematoencefálica sugiere que estos carbamatos
fenotiazínicos hidrofóbicos podrían utilizarse como tratamiento en demencia.
7. Dominios dentro del sitio activo como el sitio catiónico y aniónico periférico podrían ser blancos para
desarrollar inhibidores de colinesterasas para tratamiento de demencias.