GENERACIÓN DE PLANTAS TRANSGÉNICAS DE ARROZ CON MENOR REQUERIMIENTO HÍDRICO Resumen ejecutivo El arroz forma parte de la dieta básica del pueblo mexicano y ocupa el cuarto lugar en producción de granos después del maíz, el trigo y el fríjol, por tal motivo el objetivo de este estudio es explorar las formas de manipular la ruta metabólica de la trehalosa en el arroz, con el fin de desarrollar variedades con una mejor tolerancia al estrés abiótico y con un mejor comportamiento. Los objetivos que guiaron el trabajo del investigador fueron los siguientes: a) obtener el DNA complementario (cDNA) de la trehalasa de arroz; b) construir un RNA de interferencia (RNAi) y un RNA antisentido (RNAas) para inhibir el gen de la trehalasa; c) diseñar un hairpin RNA (hpRNA) para la secuencia codificante de la trehalasa de arroz y un hpRNA para la región 3’ no traducible 3’UTR; d) construir vectores para la expresión constitutiva y regulada por estrés del RNAi, el RNAas y los hpRNAs de la trehalasa de arroz en plantas; e) introducir en plantas de arroz Oryza sativa var Índica de los cultivares Temporalero A95 (secano) y Morelos A98 (riego) mediante biobalística los vectores para la expresión constitutiva y regulada por estrés del RNAi, f) el RNAas y los hpRNA de la trehalasa de arroz en plantas; y g) analizar los fenotipos de las plantas seleccionadas y sus controles en cuanto a actividad fotosintética, acumulación de azúcares, tolerancia a sequía y producción de biomasa. La metodología que siguió el investigador fue la siguiente: Para la transformación genética de arroz (Oryza sativa) utilizó dos variedades del genotipo Índica: una de temporal (secano) y una de riego, que corresponden respectivamente a la Temporalero A95 y la Morelos A98. Quitó la cáscara (cariópside) de las semillas y las desinfectó en etanol al 70% por 3 minutos, y después en una solución de hipoclorito de sodio al 5 % durante 40 minutos con 5 gotas de Tween 20 por cada 25 ml de solución; después hizo cinco o seis lavados abundantes con agua destilada estéril, en donde las mantuvo hasta su siembra. Trabajó en la inducción de callo embriogénico y una vez que lo obtuvo preparó el tejido para la transformación y selección de transformantes. Obtuvo plántulas a partir del callo embriogénico y trabajó en el enraizamiento y aclimatación a condiciones de suelo de las plántulas regeneradas. A partir de ese momento procedió a las construcciones génicas. Inició con la amplificación y clonación de la secuencia del cDNA de la trehalasa de arroz; llevó a cabo la construcción de caset de expresión del RNAas de la secuencia trehalasa. Trabajó en la transformación de callo embriogénico de arroz por biobalística. La preparación de DNA la realizó mediante la técnica de Acetato de Amonio. Para la caracterización de las plantas transgénicas de arroz realizó: el análisis molecular; el análisis de la actividad Trehalasa; la preparación de extracto crudo de proteínas; la cuantificación de éstas, y el ensayo de actividad Trehalasa. Para determinar los niveles de tolerancia a estrés abiótico conferidos mediante la inhibición por antisentido de la enzima trehalasa, realizó ensayos en invernadero con el fin de determinar: el porcentaje de capacidad de campo, el contenido relativo de agua, la actividad fotosíntetica; llevó a cabo el análisis del contenido de carbohidratos de raíz, la colecta y almacenamiento de material vegetal, la extracción de carbohidratos y, por último, la derivatización de carbohidratos y su identificación por GC-MS. Demanda o problemática que atiende Generación y desarrollo de nuevo conocimiento y tecnología que ayuden a incrementar el rendimiento de las cosechas de arroz, tanto en campo como en invernadero. Mejorar la resistencia de las plantas de arroz a la sequía, la salinidad y las temperaturas extremas, y hacer que su tolerancia al estrés abiótico se incremente, mediante una la expresión coordinada y diferencial de su red de genes. Resultados obtenidos y/o descripción. Características de la tecnología generada El investigador clonó el cDNA de la trehalasa de arroz Oryza sativa variedad Índica cultivar Temporalero A95 y se manipuló un fragmento interno de 550 pb para su uso en la construcción de los plásmidos de inhibición por antisentido y RNA de interferencia de la trehalasa endógena de plantas transgénicas de arroz. Obtuvo plantas transgénicas de arroz de la variedad Índica y cultivares Morelos A92 (M92), Morelos A98 (M98) y Temporalero A95 (T95), a las que se les introdujo el RNA antisentido y el RNA de interferencia de la trehalasa. Obtuvo plantas transgénicas del cultivar M98 que presentan in vitro una disminución de la actividad trehalasa del 19 al 67%, y plantas transgénicas del cultivar T95 con disminución del 80 al 97%. Así mismo, las líneas transgénicas M98 presentaron en promedio un incremento en la acumulación de trehalosa que fluctúa del 54 al 100% con respecto al control bajo condiciones de sequía en invernadero. Logró plantas transgénicas del cultivar M98 que mantienen en invernadero características de crecimiento (altura y biomasa) y desarrollo (estadios) semejantes a los controles bajo condiciones normales, y que bajo condiciones de estrés por sequía presentan del 27 al 36% más producción de biomasa y un comportamiento fotosintético que va desde una menor inhibición con respecto al control (26%), hasta un incremento en un rango del 200 al 300 por ciento. Impactos Mediante la tecnología desarrollada en esta investigación no sólo es posible conferir tolerancia a estrés abiótico en un cultivo de gran importancia agronómica, sino que aumenta la capacidad fotosintética de la planta, lo que hace posible una mayor producción, lo que redunda en beneficio para los agricultores que se dedican a esta siembra, y puede significar una aportación para el logro de la suficiencia alimentaria. Costos estimados de la aplicación de los resultados y/o tecnología generada No es posible cuantificar el costo por la aplicación de este conocimiento, en tanto que es experimental. Ámbito de aplicación Los Mochis, Sinaloa, y Noreste, en el distrito de riego de Las Ánimas, en Tamaulipas, hasta el Sureste del país, en Chiapas. Información adicional o comentario La mayor parte del arroz cultivado en el Norte y el Centro de la república se cultiva en condiciones de riego, bajo siembra directa o trasplante, mientras que la mayoría del arroz que se cultiva en el Sur es de temporal y siembra directa. Clave del proyecto: SAGARPA 2003-C01-235 Sistema Producto y/o línea estratégica de atención: genética vegetal y fitomejoramiento Investigador: doctor ROBERTO MONTES DE OCA LUNA Institución: Universidad Autónoma de Nuevo León