Kit completo para la detección de cadena ligera Kappa de las

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Kit completo para la detección de cadena ligera Kappa de las
inmunoglobulinas mediante hibridación in situ cromogénica
(CISH)
Utilizando
tecnología
Zytovision
DESCRIPCIÓN:
Este kit contiene reactivos para llevar a cabo de forma manual o automatizada la técnica de hibridación in situ
cromogénica (CISH) sobre secciones de tejidos humanos fijados en formalina tamponada e incluidos en parafina.
Este kit contiene el sistema de revelado basado en el polímero Ultravision Quanto y es suficiente para la
realización de 20 determinaciones siguiendo el protocolo recomendado.
Presentación
: La referencia/presentación general para este Kit es:
MAD-001895QK – 20 test
Esta referencia es para presentación en envases de Polietileno de Baja Densidad (LDPE) con gotero. En caso de que el usuario desee
otro tipo de presentaciones (referencias/volúmenes diferentes) deberá contactar con el proveedor.
Uso Previsto
: Diagnóstico in vitro en la especie humana
Condiciones de almacenamiento : Frigorífico entre 2 y 8ºC.
Periodo de validez : El envase una vez abierto puede conservarse hasta la fecha de caducidad del reactivo señalada
en la etiqueta. Si el reactivo ha sido almacenado en otras condiciones a las señaladas en este documento el usuario
deberá chequear previamente su correcto funcionamiento teniendo en cuenta que la garantía del producto ya no es
válida.
Instrucciones especiales de manipulación: Este reactivo está especialmente diseñado para su manejo en los
inmunoteñidores LabVision Autostainer 480 y 780.
Advertencias y precauciones: 1) El producto solo debe ser manejado por usuarios entrenados y en laboratorios
autorizados. Para su manejo en investigación existen otras presentaciones más idóneas.
2) Téngase en cuenta que la última responsabilidad en la optimización e interpretación de las hibridaciones cromogénicas
practicadas corresponde al facultativo responsable y los técnicos que emplean el kit y que, asimismo, este conjunto de
reactivos no es más que una herramienta útil para la interpretación de los hallazgos morfológicos de cada caso en
conjunción con otros tests diagnósticos y los pertinentes datos clínicos del paciente.
3) El reactivo contiene azida sódica (NaN3) como conservante. Aunque este producto es altamente tóxico y si se mezcla
con agua o ácidos, principalmente en presencia de metales, existe peligro de explosión, estos riesgos están minimizados
al máximo cuando se emplea a concentraciones inferiores al 0,05% como ocurre en este caso. No obstante para el
manejo de este reactivo deben tomarse las siguientes precauciones: a) Uso de guantes y del equipo de protección
establecido para las técnicas de hibridación e inmunohistoquímicas del laboratorio así como estricto respeto de las
prácticas generales de seguridad existentes en el mismo; b) No almacenar los reactivos en envases metálicos ni emplear
utillaje de esta naturaleza para su manejo; c) Almacenar los residuos para su eliminación reglada en contenedores
apropiados según la normativa vigente en cada laboratorio. Nunca arrojarlos por el desagüe.
ESPECIFICIDAD
Las moléculas de Inmunoglobulinas (Igs) están compuestas por dos parejas de cadenas polipeptídicas, dos cadenas
pesadas (IgH de 50-70 kD) y dos cadenas ligeras (IgL de 23 kD), cada una de las cadenas ligeras a su vez contienen dos
dominios sucesivos: el primero constante y el segundo variable. Las cadenas ligeras se unen covalentemente a cada tipo
de cadena pesada y son ensambladas a través de reordenamientos somáticos de la región hipervariable del segmento
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genético V(D)J. Este proceso ocurre durante los estadios precoces de la maduración de los linfocitos B, de forma que
primero ocurre (estadio pro-B) el reordenamiento de la cadena IgH para definir el tipo de inmunoglobulina que va
secretar cada célula inmune y, posteriormente (estadio pre-B) se produce el reordenamiento de la cadena IgL.
En humanos existen dos isotipos de IgL: , codificado por un gen localizado en el cromosoma 2 y , con el gen
codificante situado en el cromosoma 22. Cada uno de los linfocitos B producen inmunoglobulinas con cadena pesada
(IgG, IgM, IgA, IgD o IgE) y cadena ligera (IgL ) o (IgL ), nunca ambas simultáneamente. En condiciones normales,
60% de los linfocitos B producen cadena ligera y el resto cadena . Por este motivo en toda proliferación linfoide de
carácter reactivo se reconoce una población mixta células positivas para cadenas ligeras K o , lo que se conce como
expresión policlonal.
Como todas las neoplasias malignas los linfomas B son tumores clonales originados a partir de una célula transformada;
por ello solo son capaces de producir una de las cadenas ligeras de las inmunoglobulinas, lo que se conoce como
expresión monoclonal. Por este motivo la determinación de la relación que existe entre los dos isotipos de las cadenas
ligeras de las inmunoglobulinas en una población celular problema representa una herramienta esencial para establecer
la clonalidad en los linfomas B y discrasias de células plasmáticas neoplásicas y reactivas.
Esta sonda ha sido diseñada para la detección del ARNm de las cadenas ligeras kappa ( ) de las inmunoglobulinas en
tejidos o células fijados con formalina tamponada al 10% incluidos en parafina a través de técnicas de hibridación in situ
cromogénica (CISH).
APLICACIONES DIAGNÓSTICAS:
La determinación de la proporción relativa que existe de los dos isotipos de las cadenas ligeras de las inmunoglobulinas
mediante técnicas de hibridación in situ cromogénica está indicada para la detección de monoclonalidad en trastornos
linfoproliferativos de células B, lo que proporciona un importante apoyo diagnóstico de linfoma frente a hiperplasia
linfoide u otras linfadenitis reactivas; así como en discrasias y leucemias de células plasmáticas, mieloma y
plasmocitoma.
CALIBRADORES Y CONTROLES
Patrón de Inmunotinción: Citoplasmático
Control Positivo: Sección tisular procedente de amígdala
Control Negativo: Preparación homóloga a la muestra problema incubada con un mARN no específico para la cadena
ligera Kappa de las inmunoglobulinas.
LIMITACIONES DEL REACTIVO
El uso sobre tejido congelado no ha sido evaluado.
TIPOS DE MUESTRA
Secciones de 4 micras de espesor montadas sobre portaobjetos especiales para inmunohistoquímica y obtenidas de
tejidos incluidos en parafina, preferiblemente fijados en formalina tamponada.
PRINCIPIO DEL MÉTODO ANALÍTICO (hibridación in situ)
La hibridación in situ (ISH) permite la detección de secuencias especificas de DNA o RNA en muestras histológicas y citológicas,
sin perder los detalles morfológicos. El fundamento de la ISH está basado en la hibridación entre una secuencia de DNA o RNA
marcado específicamente (sonda) y una secuencia de DNA o RNA presente en la muestra. En caso de existir
complementariedad entre las secuencias se produce la hibridación, que tiene como resultado un producto hibrido. Los híbridos
pueden ser fácilmente visualizados por un procedimiento de tinción inmunohistoquímica cromogénica (CISH) dirigida hacia el
marcador específico de la sonda empleada.
La técnica ISH es altamente sensible, específica y fácil de realizar; además, no contiene productos radioactivos. Los reactivos
suministrados en este kit están perfectamente adaptados entre sí y por lo tanto, el kit constituye una herramienta de fácil uso
para la realización de CISH.
COMPONENTES Y REACTIVOS SUBMINISTRADOS EN EL KIT:
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•
Proteinasa K
Sonda marcada con Digoxigenina frente a cadena ligera Kappa de las inmunoglobulinas humanas
Anticuerpo Anti-Digoxigenina
Bloqueante de la Peroxidasa Endógena
Ultrabloqueante Quanto
Amplificador del Polímero Quanto
Polímero Ultravision Quanto
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20 tests
20 tests
20 tests
20 tests
20 tests
20 tests
20 tests
Cromógeno: Tampón substrato + DAB
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20 tests
EQUIPAMIENTO Y MATERIAL NECESARIO PERO NO SUMINISTRADO EN EL KIT
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Cámara húmeda de incubación
Portaobjetos tratados con silano o tratados eléctricamente
Cubreobjetos
Placa térmica o estufa (37ºC)
Batería de desparafinado-hidratación (Xileno, etanol absoluto y a concentraciones del 80% y 70%)
Tampón TBS
Micropipetas
Hematoxilina de contraste
Microscopio óptico
PROTOCOLO TÉCNICO PARA CISH CADENA LIGERA KAPPA SOBRE TEJIDOS INCLUIDOS EN PARAFINA UTILIZANDO
EL KIT DE DETECCIÓN DE MASTER DIAGNÓSTICA
Este protocolo está recomendado para la realización de CISH sobre secciones de tejido fijado en formalina tamponada e incluido
en parafina.
1. Desparafinado
a.
b.
Incubar los portaobjetos con las secciones de tejido parafinado en la estufa a 60ºC toda la noche.
Desparafinar:
- Xilol 2x 10 min
- Etanol absoluto 2x 5 min
- Etanol 80% 5 min
- Etanol 70% 5 min
- Agua destilada (10 min)
2. Digestión enzimática
a.
b.
c.
Diluir 5 µl de Proteinasa K concentrada en 2 ml de Tampón TBS.
Aplicar la solución resultante sobre el tejido e incubar 8 min a temperatura ambiente (TA).
Lavar 3 veces con Tampón TBS a TA
3. Hibridación
a.
b.
c.
Aplicar 10 µl de sonda sobre el tejido.
Colocar un cubreobjetos sobre la sección.
Colocar el portaobjetos en una camera húmeda e incubar 1 hora a 55ºC.
4. Detección y revelado (manual o automático)
a.
b.
c.
d.
e.
f.
g.
h.
i.
j.
k.
Retirar el cubreobjetos y lavar 3 veces en Tampón TBS a TA
Aplicar sobre el tejido 200 µl del bloqueante de la Peroxidasa e incubar 10 min a TA
Lavar 3 veces en tampón TBS.
Aplicar sobre el tejido 200 µl del Ultrabloqueante Quanto e incubar 8 min a TA.
Desechar sin lavar.
Aplicar sobre el tejido 200 µl del anticuerpo anti-digoxigenina e incubar 10 min a TA.
Lavar 3 veces en tampón TBS.
Aplicar sobre el tejido 200 µl del Amplificador del Polímero Quanto e incubar 10 min a TA.
Lavar 3 veces en tampón TBS.
Aplicar sobre el tejido 200 µl del Polímero Ultravision Quanto y incubar 10 min a TA.
Lavar 3 veces en Agua Destilada
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l.
Mezclar una gota del cromógeno DAB en 1 ml de Substrato del DAB y aplicar la solución resultante sobre el
tejido; incubar 5 min a TA
m. Lavar 3 veces en Agua destilada.
n. Aplicar 200 µl de Potenciador de la DAB y incubar 2 min a TA.
o. Lavar 3 veces con Agua destilada.
5. Tinción de Contraste y montaje
a.
b.
c.
d.
Teñir con Hematoxilina de Contraste.
Azular en agua del grifo.
Deshidratar y aclarar en alcoholes de concentraciones crecientes y xileno.
Montar e interpretar los resultados al microscopio.
INCIDENCIAS Y RECLAMACIONES
Se recomienda seguir exhaustivamente todas las indicaciones contenidas en estas instrucciones técnicas. En caso de
que se produzcan resultados atípicos o no esperados se ruega contacten con el delegado comercial de la zona
representante de Vitro S.A. En su defecto, pueden dirigirse a Master Diagnóstica en la dirección comercial, telefónica o
electrónica arriba indicada.
LIMITACIONES DEL REACTIVO
Si se han cumplido todas las condiciones de almacenamiento y manejo en el laboratorio, este reactivo está garantizado
durante todo su tiempo de caducidad. Master Diagnóstica no es responsable de los daños, lesiones personales o
pérdidas económicas en que este reactivo pueda encontrarse implicado.
BIBLIOGRAFÍA:
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2.
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light chain expression in B-cell non-Hodgkin lymphomas using formalin-fixed, paraffin-embedded tissues and a
heat-induced epitope retrieval technique. Appl Immunohistochem Mol Morphol. 2002;10:258-262.
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