Primer Congreso Virtual de Ciencias Morfológicas. Primera Jornada Científica de la Cátedra Santiago Ramón y Cajal. 01 Características microscópicas de las gónadas de Peltophryne peltocephala (Tschudi, 1838) (Anura. Bufonidae) Autores: Ana Sanz Ochotorena1, Yamilka Rodríguez Gómez2, María de Lourdes Segura Valdéz3, Reyna Lara Martínez4, Luis Felipe Jiménez García5 1 Profesora Titular, Facultad De Biología Universidad de La Habana, Cuba. 2 Profesora Auxiliar, Facultad De Biología Universidad de La Habana, Cuba 3 Profesora Titular, Facultad de Ciencias. UNAM, México 4 Técnico Docente, Facultad de Ciencias. UNAM, México 5 Profesor Titular, Facultad de Ciencias. UNAM, México anitasanz@infomed.sld.cu RESUMEN Se informa por primera vez la estructura de las gónadas de ambos sexos del sapo endémico de Cuba, Peltophryne peltocepahala y fue encontrado en los ovarios el órgano de Bidder, que no es frecuente en las hembras de estos bufónidos. Se colectaron cuatro hembras y cuatro machos que fueron tratados acorde a las normas éticas de manipulación de animales. Las gónadas se fijaron en Bouin, paraformaldehído y glutaraldehído para ser procesadas mediante las técnicas microscópicas de inclusión en parafina y microscopía electrónica. Los cortes se tiñeron con H-E y la tricrómica de Mallory y se aplicó la técnica de DAPI. Los resultados indican que hembras y machos estaban en etapa reproductiva. La gónada masculina está rodeada por una fina túnica albugínea y no se apreciaron pigmentos en esta. En la parte anterior del testículo se halla el órgano de Bidder. El testículo está constituido por lóbulos seminíferos en los cuales se encuentran las células sexuales organizadas en cistos, lo cual coincide para la mayoría de los anuros descritos. Predominaron los cistos de espermátidas y espermatozoides y esto se evidenció en las fotom icrografías electrónicas. Los ovarios muestran una cavidad central. Se observaron folículos previtelogénicos ubicados en estructuas parecidas a lamelas y huevos oviducales. En el ovario se encontró también un órgano de Bidder lo cual es un hallazgo muy importante y esto puede contribuir a futuros estudios sobre el grupo y a su ubicación taxonómica y filogenética 1 Primer Congreso Virtual de Ciencias Morfológicas. Primera Jornada Científica de la Cátedra Santiago Ramón y Cajal. PALABRAS CLAVE: Peltophpryne peltocepahala, gónadas, órgano de Bidder, ovarios, testículos, bufónidos INTRODUCCIÓN Los anfibios anuros tienen dos testículos ovoides rodeados por tejido conectivo denominado la túnica albugínea, la cual a veces está peculiarmente pigmentada (1, 2). Las células sexuales en desarrollo: espermatogonias, espermatocitos, espermátidas y espermatozoides se encuentran dispuestas en cistos o quistes asociadas a células de Sertoli, en el interior de los lóbulos seminíferos formando el tejido germinal que constituye el parénquima germinal del testículo (3). Los ovarios de los anuros, por otra parte, son pares también, y ocupan una posición dorsal en la cavidad abdominal, muy relacionados con los riñones, presentan una cavidad central típica y contienen ovocitos en diferentes grados de desarrollo (4) lo cual les da un aspecto racimoso. Existe la creencia que solo en los machos de la Familia Bufonidae se presenta una característica distintiva que es la presencia en la parte anterior del testículo de un ovario vestigial llamado el órgano de Bidder. La literatura refiere al órgano de Bidder como una estructura exclusiva de los machos bufónidos y esto se ha usado como un carácter diagnóstico para esta familia (5, 6, 7). Sin embargo esa estructura puede estar presente también en las hembras (8, 9) en la misma posición anterior a la gónada. Aún no existen evidencias plenas que el órgano de Bidder sea una estructura vestigial o posea alguna función endocrina (10). Sin embargo en machos este órgano según algunos autores (11) puede convertirse en un ovario funcional como una estrategia reproductiva de las especies de este grupo. Lo cierto es que la información de su presencia y función en hembras y machos de bufónidos aún es polémica y escasa. El sapo Peltophryne peltocephala es endémico de Cuba y está ampliamente distribuido en todo el archipiélago cubano. Clasificada la especie por la IUCN (International Union for Conservation) como de menor preocupación por su relativa abundancia (11), no se ha estudiado su biología reproductiva. Por lo anteriormente expresado, el objetivo del presente trabajo es determinar las características histológicas de sus ovarios y testículos al igual que detectar y describir el órgano de Bidder. MATERIAL Y MÉTODOS 2 Primer Congreso Virtual de Ciencias Morfológicas. Primera Jornada Científica de la Cátedra Santiago Ramón y Cajal. Se colectaron cuatro machos y cuatro hembras en el Parque Nacional Desembarco del Granma en octubre del año 2010. Todos los animales fueron tratados como lo establece el código de ética para su manipulación. Previamente a la disección los animales fueron anestesiados con éter en una campana hermética. Fragmentos de testículos y también del órgano de Bidder se fijaron en Bouin para el procesamiento histológico clásico en parafina. Los cortes se obtuvieron en un micrótomo manual entre 5 y 7µm y se colocaron en portaobjetos con albúmina como adherente. A las 24 horas los cortes fueron teñidos con hematoxilina y eosina y con la técnica de Mallory. Las observaciones se realizaron en un microscopio Carl Zeiss modelo Axiomat, con objetivos de 20X, 40X y 100X. Las imágenes se digitalizaron mediante el programa Scion Image. Otros fragmentos de gónadas se colocaron en paraformaldehído al 4% (Panreac) para aplicar la técnica de DAPI y en glutaraldehído al 2.5% (Applichem) para microscopía electrónica. En el caso del procesamiento para microscopía electrónica las piezas se lavaron con PBS y se postfijaron con tetraóxido de osmio al 1% por varias horas. La inclusión se llevó a cabo con resina epóxica. Los cortes ultrafinos se realizaron en un ultramicròtomo Leika Ultracut y fueron contrastados utilizando acetato de uranilo (PolySciences) al 3 % y citrato de plomo (PolySciences) al 0.3 %. Se observaron las rejillas bajo un microscopio electrónico de transmisión, JEOL JEM 1010. RESULTADOS Los resultados indican que los dos sexos estaban en plena actividad reproductiva. Los testículos muestran en posición anterior un órgano de Bidder (Figura 1) que en el caso de un macho es bilobulado. La morfología interna del órgano de Bidder consta de dos partes, una porción central de tejido conectivo con vasos sanguíneos y la corteza periférica que contiene folículos previtelogénicos (Figura 1). Toda la gónada está cubierta por una fina capa de tejido conectivo, la túnica albugínea y no se observa pigmentación. El epitelio germinal de la parte de la gónada que corresponde al testículo está organizado en lóbulos (Figura 1). Los lóbulos están separados por tejido conectivo escaso y fino. Estos lóbulos forman unidades morfológicas, que son los elementos seminíferos del testículo. Entre las unidades seminíferas hay tejido intersticial compuesto por células de Leydig, fibroblastos y vasos sanguíneos. Cada lóbulo seminífero contiene clusters o agrupaciones de células germinales en diferentes estadios de diferenciación organizadas en cistos o quistes que ocurren debido a la íntima asociación morfofuncional con las células de 3 Primer Congreso Virtual de Ciencias Morfológicas. Primera Jornada Científica de la Cátedra Santiago Ramón y Cajal. Sertoli. En los cistos (Figura 1, 2 y 3) las células están en un mismo estado de diferenciación y con un desarrollo sincrónico. Se identificaron Los diferentes tipos celulares diferenciados de acuerdo a su morfología y disposición en los cistos. Aunque se observan en los cistos células sexuales masculinas en todas las etapas de la espermatogénesis, hubo un predominio de cistos de espermátidas y espermatozoides. Esto se puede apreciar en la Figura 1 donde se observan en un corte clásico teñido con la técnica de Mallory. En la Figura 2 la fotomicrografía que muestra una imagen tomada al microscopio electrónico de transmisión, se identifican cistos de espermátidas, en cuyo citoplasma es posible distinguir mitocondrias. Estas células pasan el proceso de espermiogénesis para generar a los espermatozoides. Además de observar en esta transición la presencia de mitoncondrias, ocurre la formación del acrosoma y la síntesis del axonema de la cola o flagelo. Los espermatozoides están caracterizados por una extraordinaria compactación nuclear y una reducción del citoplasma. En la Figura 3 se observa el marcaje positivo al DAPI indicando la presencia de ADN compactado característico de espermátidas y espermatozoides. Los ovarios tienen una cavidad central y se aprecian folículos previtelogénicos cuyos núcleos tienen numerosos nucléolos que pueden verse en la Figura 4. Los folículos están dispuestos en estructuras parecidas a lamelas, con tejido conectivo y vasos sanguíneos entre ellas. La capa granulosa que rodea al ovocito, de células foliculares es única, un epitelio simple, y por fuera se encuentra la teca de tejido conectivo vascularizada. Esto se mantiene así en todos los tipos de folículos detectados. Se observaron también grandes huevos en el oviducto. En la parte derecha de la Figura 4 se aprecia lo que parece ser un órgano de Bidder. En éste, los ovocitos están muy unidos, todos en un mismo estado previtelogénico. Si se compara con la Figura 1, se observa que los ovocitos del órgano de Bidder del macho muestran similar morfología que los ováricos (Figura 4) y con los del órgano de Bidder de la hembra de esta especie. Se observaron pocos ovocitos vitelogénicos y uno al inicio de la vitelogénesis el cual se muestra en la Figura 5 donde se aprecian las relaciones de la membrana del ovocito con las proyecciones citoplasmáticas de las células foliculares. Pueden apreciarse también gránulos de vitelo de diferentes tamaños y características, en el citoplasma. 4 Primer Congreso Virtual de Ciencias Morfológicas. Primera Jornada Científica de la Cátedra Santiago Ramón y Cajal. DISCUSIÓN En cuanto a la arquitectura histológica general del testículo observada en P. peltocephala se verificó una gran similitud con las descripciones de otras especies de anuros (3) y de otros miembros cercanos de bufónidos (13, 14)). Las células en los lóbulos seminíferos mostraron actividad espermatogénica intensa, sin embargo se apreció un predominio de cistos de espermátidas y espermatozoides lo cual pudiera indicar el final de la etapa reproductiva. La disposición en cistos de las células sexuales dentro de los lóbulos afirma esta peculiar condición en los anfibios anuros en general, por ejemplo, para el hylido Scinax fuscovarius (15). Las espermátidas se caracterizan por un alargamiento celular y nuclear, que se producen simultáneamente con la condensación de la cromatina, pues está ocurriendo el proceso de espermiogénesis y en esta etapa se observan las espermátidas desde redondeadas o tempranas hasta los espermatozoides (16). La reacción positiva al DAPI observada es coherente con la compactación de la cromatina que parece ocurrir en la espermiogénesis. Al final de la espermatogénesis, los espermatozoides se mantienen unidos como en ramilletes (13), que siguen siendo sostenidos por las células de Sertoli. La túnica albugínea transparente pudiera indicar una característica de esta especie. Los autores del presente trabajo han hallado pigmento hasta en el tejido intersticial de las gónadas de otros sapos de este género (2) y argumentan que su presencia estaría debida a respuestas a la contaminación. P. peltacephala está distribuido en todo el archipiélago cubano y, o no responde a la contaminación de la misma manera que sus congéneres o en los ecosistemas donde él habita aquella no es tanta. Por otra parte, este sapo vive frecuentemente a la sombra y bajo las rocas, por lo que no parece necesitar pigmento como elemento protector de la de sus gónadas y células sexuales a la intensa luz solar. La propuesta anterior es una explicación diferente de su presencia en otros anuros cubanos (2) que sí habitan en lugares muy soleados. Los ovarios son característicos de los anfibios en general (4). Los numerosos nucléolos en los ovocitos previtelogénicos, presentes también en otros anfibios (17), evidencian una fuerte síntesis de RNAr necesaria para el desarrollo temprano (16). Sin embargo debe destacarse la disposición u ordenamiento de los folículos en el ovario como en lamelas rodeadas de fino tejido conectivo. Esta disposición es muy característica de peces y de algunos anfibios urodelos (4). La ausencia de ovocitos vitelogénicos indica que las hembras también están culminando una etapa 5 Primer Congreso Virtual de Ciencias Morfológicas. Primera Jornada Científica de la Cátedra Santiago Ramón y Cajal. o ciclo reproductivo, como los machos. Otro aspecto peculiar de los ovarios de P. peltocephala es la presencia de un órgano de Bidder, no observado en la disección de los ejemplares y sí en los cortes histológicos. Esto evidencia que se encuentra interno y no tan conspicuo como en los machos. La presencia de esta estructura puede significar que Bidder es un órgano endocrino como lo han informado investigadores australianos recientemente (10) y no un ovario vestigial o rudimentario (5, 6, 7). Ellos encontraron un patrón de actividad de transcripción de genes en el órgano de Bidder completamente independiente de las gónadas de ambos sexos, a pesar de su morfología similar al ovario. Los resultados de estos investigadores sugieren que este órgano es probable que tenga un papel en el desarrollo esteroidogénico diferente al de las gónadas. Lo cierto es que el hallazgo del órgano de Bidder en un sapo de Cuba abre nuevas posibilidades en cuanto a su ubicación entre los bufonidos y crea expectativas sobre la función de esta estructura. CONCLUSIONES 1. Los testículos de P. peltocephala presentan características morfológicas similares a otros anfibios anuros con peculiaridades propias. 2. Se encontró un órgano de Bidder en la parte cranial del testículo con estructura que semeja a los encontrados en otros machos bufónidos. 3. Los ovarios contienen folículos previtelogénicos ubicados en lamelas y se detectó un órgano de Bidde interno por primera vez en una hembra de un sapo cubano. 4. Ambos sexos estaban en etapa reproductiva, quizás culminándola por el predominio de cistos de espermátidas y espermatozoides en los machos y de huevos oviducales y folículos previtelogénicos en las hembras, indicando un próximo receso. 6 Primer Congreso Virtual de Ciencias Morfológicas. Primera Jornada Científica de la Cátedra Santiago Ramón y Cajal. BIBLIOGRAFÍA 1. de Oliveira, C & R. Zieri Testicular pigmentation in Physalaemus natteteri (Steindachner) (Amphibia, Anura) with anatomical obervations on the extracutaneus pigmentary system. Revista Brasilera de Zoología 22 454-460, junho 2005. 2. Sanz-Ochotorena Ana, María de Lourdes Segura-Valdés, Yamilka RodríguezGómez, Reyna Lara-Martínez y Luis Felipe Jiménez-García Pigmentos en los testículos de cinco anfibios endémicos de Cuba (Eleutherodactylus turquinensis, E. cuneatus, E. glamyrus, Bufo longinasus longinasus y B. longinasus cajalbanensis Revista TIP 14(1):48-55, 2011 3. De Oliveira, C.; Zanetoni, C. & Zieri, R. Morphological observations on the testes of Physalaemus cuvieri (Amphibia, Anura). Rev. Chil. Anat., 20(3):263268, 2002. 4. Ogielska, M: Reproduction in Amphibians. EUA, Science Piblishers Enfield 436 pp 2009. 5. Gordon Alexander Bidder's Organ in Bufo melanostictus Schneider Copeia Vol. 1932, No. 2 pp. 78-80 (Jul. 1, 1932). 6. Farias C. F., S. P. Carvalho-e-Silva and L. de Brito-Gitirana: Bidder's organ of Bufo ictericus: a light and electron microscopy analysis. Micron Volume 33, Issues 7-8, pp 673-679 (2002). 7. Duellman, W. E. & Trueb, L. Biology of amphibians. McGraw-Hill, 670p, (1994) 8. Falconi, R., D. Dalpiaz, and Francesco Zaccanti: Morphological Aspects of Gonadal Morphogenesis in Bufo bufo (Amphibia anura): Bidder's Organ Differentiation J. Exp. Zool. 301A:378-388, (2004). 9. Farias, CF, Azevedo, Rodrigo Alves, de Brito-Gitirana, L: Expression pattern of glycoconjugates in the Bidderian and ovarian follicles of Brazilian toad Bufo ictericus as analyzed by lectin histochemistry. Brazilian Journal of Biology, Brasil, v. 66, n. 1a, p. 29-41, (2006) 10. Abramyan J, Wilhelm D, Koopman P.: Molecular characterization of the Bidder's organ in the cane toad (Bufo marinus). J Exp Zool B Mol Dev Evol. Sep 15; 7 Primer Congreso Virtual de Ciencias Morfológicas. Primera Jornada Científica de la Cátedra Santiago Ramón y Cajal. 314(6):503-13, 2011 11. Federico D. Brown, Eugenia M. Del Pino, Georg KrohneBidder's organ in the toad Bufo marinus: Effects of orchidectomy on the morphology and expression of lamina-associated polypeptide 2 Development, Growth & Differentiation, Volume 44, Issue 6, pages 527–535, December 2002 12. Hedges Blair, Luis Díaz: Peltophryne peltocephala. In: IUCN 2011. IUCN Red List of Threatened Species. 2010, Version 2011 13. Sanz Ochotorena Ana, María de Lourdes Segura Valdés, Yamilka Rodríguez Gómez, Reyna Lara Martínez, Luís Felipe Jiménez García Estructura y ultraestructura de las gónadas del macho de Bufo fustiger (Anura: Bufonidae) Revista TIP 11 (2), 81-86, 2008. 14. Sanz-Ochotorena, Ana; María de Lourdes Segura Valdés, Yamilka Rodríguez Gómez, Reyna Lara Martínez, Luís Felipe Jiménez García Ultraestructura de la gónada del macho de dos subespecies de Bufo longinasus Revista TIP 13 (2):36-39, 2009 15. Oliveira, C. & Vicentini, C. A. Descrição anatômica dos testículos e corpos adiposos de Scinax fuscovarius (Anura, Hylidae). Biociências, 6:79-88, 1998. 16. Gilbert, Scott F. Developmental Biology, Eighth Edition. Sinauer. Associates. Inc, 818 pp. 2010. 17. Rodríguez-Gómez, Y, Ana Sanz-Ochotorena, María de Lourdes Segura-Valdéz, Reyna Lara-Martínez, Luís Felipe Jiménez-García: Acta Microscopica Vol. 19, No. 3, 2010, pp. 271- 278. Morfología del ovario en ranas del género Eleutherodactylus (Anura: Leptodactylidae). 2010 ANEXOS 8 Primer Congreso Virtual de Ciencias Morfológicas. Primera Jornada Científica de la Cátedra Santiago Ramón y Cajal. Figura 1: Testículo y órgano de Bidder (OB) de Peltophryne peltocephala. La flecha señala los cistos. Tricrómica de Mallory. 50X Figura 2: Fotomicrografía al microscopio electrónico de transmisión, que muestra un lóbulo seminífero de P.peltocephala. Esp=espermátidas, m= mitocondrias, Epz=Espermatozoides 6K 9 Primer Congreso Virtual de Ciencias Morfológicas. Primera Jornada Científica de la Cátedra Santiago Ramón y Cajal. Figura 3: Cistos de espermátidas y espermatozoides en un lóbulo de P.peltocephala positivos a la técnica DAPI marcados en la foto con *. 60X Figura 4: Ovario y órgano de Bidder (OB) de la hembra de P.peltocephala FPV= folículos previtelogénicos. H-E 50X 10 Primer Congreso Virtual de Ciencias Morfológicas. Primera Jornada Científica de la Cátedra Santiago Ramón y Cajal. Figura 5: Fotomicrografía al microscopio electrónico de transmisión que muestra la periferia de un ovocito en vitelogénesis. Se observan las relaciones células foliculares ovocitos (*). CF= células foliculares, V=vitelo 11