Crecimiento microbiano En microbiología el crecimiento se define como el incremento en el número de células. •La bipartición (fisión binaria) es el proceso por el cual una célula se divide para formar dos células iguales. •El intervalo que transcurre en la formación de dos células a partir de una célula se llama generación y el tiempo requerido para esto es el tiempo de generación o tiempo de duplicación. Fisión binaria Durante la fisión binaria cada célula hija recibe una copia del cromosoma, de los ribosomas, complejos macromoleculares, así como monómeros y iones inorgánicos para existir como una célula independiente. El ADN se ancla a la membrana y así, cada célula hija se queda con una copia. Se forma un septo que dará lugar a cada una de las células, las envolturas rodean a cada copia del ADN y finalmente se da la separación de las células. Proteínas Fts Las proteínas Fts (filamentous temperature sensitive) interactúan para formar el aparato de división llamado divisoma. •FtsZ polimeriza y forman una anillo en el centro de la célula. •FtsA es una enzima ATP hidrolasa que provee la energía para ensamblar proteínas en el divisoma. •ZipA ancla a FtsZ a la membrana citoplasmática. •FtsI es una proteína involucrada en la síntesis de peptidoglucano y es también llamada proteína de unión a penicilina (su actividad es bloqueada por el antibiótico). Replicación del ADN La replicación del ADN ocurre previo a la formación del anillo FtsZ, este se forma en el espacio entre los cromosmas duplicados. •MinC es un inhibidor de la división celular y previene que FtsZ ensamble el anillo hasta que el centro se encuentre formado. •MinE inhibe la actividad de MinC y se ancla al centro de la división. •FstK participa en la elongación. •FstZ también tiene actividad de GTP hidrolasa, libera energía para la polimerización y despolimerización, así como para el ensamblaje y desensamblaje del anillo. Proteína MreB y la forma de las bacterias La presencia de la proteína MreB se ha relacionado con la forma de las bacterias no cocoides. •FtsZ tubulina bacteriana. •MreB actina bacteriana. Nature Cell Biology 5, 175 - 178 (2003) Autolisinas Pequeñas aberturas son llevadas a cabo por las enzimas autolisinas que tiene una función similar a la lisozima. Las autolisinas se encuentran presentes en el complejo divisoma. La síntesis del nuevo peptidoglocano deja en la células Gram positivas una cicatriz. Las aberturas y la síntesis debe ser coordinada para evitar la autolísis de la célula. Bactoprenol y transpeptidación El bactoprenol acarrea los precursores de la pared celular, en el periplasma interactúa con la enzima que inserta los precursores de pared celular y cataliza la formación del enlace glucosídico. La transpeptidasa forma el enlace peptídico entre las cadenas de aminoácidos de las unidades de mureína. Crecimiento exponencial Cuando un cultivo se duplica de manera regular durante un intervalo de tiempo, se denomina crecimiento exponencial. Una gráfica aritmética del crecimiento muestra un incremento constante mientras una logarítmica (log10) permite observar con respecto al tiempo cuando el crecimiento es exponencial y puede entonces calcularse el tiempo de generación. Tiempo de generación Tiempo de generación (G) es el tiempo requerido para que una célula se divida o una población se duplique. G = t/n Si partimos de una célula al cabo de una generación habrá duplicado su número y así sucesivamente en cada generación. Como se puede comprobar el crecimiento se produce en progresión geométrica: 1 generación -------------> 2 células 2 generaciones -------------> 4 células 3 generaciones -------------> 8 células 4 generaciones -------------> 16 células 5 generaciones -------------> 32 células Tiempo de generación To -------------> No 1 generación -------------> 2No = No21 2 generaciones -------------> 4No = No22 3 generaciones -------------> 8No = No23 4 generaciones -------------> 16No = No24 5 generaciones -------------> 32No = No25 n generaciones (T) -------------> N = No2n lg N - lg No n = ___________________ lg 2 lg N - lg No n = ____________________ 0.301 t G = ___________________________ 3.3 (lg N - lg No) N = No2n lg N = lg No + n lg 2 n = 3.3 (lg N - lg No) Tiempos de duplicación Bacteria Medio Tiempo de duplicación (minutos) Escherichia coli Glucosa-sales 17 Bacillus megaterium Sacarosa-sales 25 Streptococcus lactis Leche 26 Staphylococcus aureus Medio de infusión de corazón Streptococcus lactis Medio con lactosa Lactobacillus acidophilus Leche Rhizobium japonicum Manitol-sales-extracto de levadura 344-461 Mycobacterium tuberculosis Medio definido 762-932 Treponema pallidum Testículos de conejo 27-30 48 66-87 1980 Log del número de microorganismos Curva de crecimiento C B D E A Tiempo Curva de crecimiento •A (Fase Lag). Periodo de latencia o adaptación: no hay aumento significativo de la densidad celular, el crecimiento es asincrónico. •B (Fase Log). Periodo de crecimiento exponencial, el crecimiento es sincrónico y se alcanza la máxima velocidad de crecimiento. •C (Fase pre-estacionaria). Periodo de retardo desaparece el crecimiento exponencial, los microorganismos entran en estrés. •D (Fase estacionaria). Periodo estacionario: no hay cambios significativos de la densidad celular con respecto al tiempo, existe un equilibrio entre los microorganismos vivos y muertos. •E (Fase de muerte). Fase en la que el equilibro desaparece y predominan los microorganismos muertos. No hay nutrientes para el recambio y las condiciones del medio de cultivo son adversas para el crecimiento. Tipos de cultivo •Cultivo en lote •Cultivo en lote alimentado •Cultivo en continuo Temperatura Óptimo (3) Velocidad de crecimiento (2) (1). Gelificación de la Mínimo membrana; los Máximo procesos de transporte se llevan a (1) (4) cabo lentamente y Temperatura no hay crecimiento. (2). Las reacciones enzimáticas aumentan su velocidad. (3). Las reacciones enzimáticas se llevan a cabo a su máxima velocidad. (4). Desnaturalización de proteínas y membrana citoplasmática. Lisis térmica. Temperatura. Temperatura. Clasificación. Clasificación de microorganismos de acuerdo a su temperatura óptima de crecimiento Psicrófilos 0 - 20°C Flavobacterium sp. 13ºC (b-) Mesófilos 20 - 40°C Escherichia coli 37ºC (b-) Termófilos 40 – 60°C G. stearothermophylus 60ºC (b+, esp) Hipertermófilos 60 – 80°C Thermococcus celer Termófilos extremos > 80°C Pyrodictium brockii Psicotróficos: Microorganismos que crecen a temperatura ambiente pero causan contaminación en condiciones de refrigeración. Temperatura. Nature 409, 1092-1101 (22 February 2001) Microorganismos patógenos E. coli Trichomonas vaginalis Candida albicas Helicobacter pylori pH Microorganismos pH 1 2 Acidófilos 3 4 5 6 Neutrófilos 7 8 9 10 Alcalófilos 11 12 13 14 pH Nature 409, 1092-1101 (22 February 2001) pH 3.3–3.5 pH 8.8–8.3 Temperature and pH requirements for growth distinguish thermophilic bacteria and archaea. Zona en la que las bacterias están mejor adaptadas. Zona en la que las arqueas están mejor adaptadas. Zona en la que ambas están bien adaptadas. Nature Reviews Microbiology 5, 316-323 (April 2007) Oxígeno Enzimas Metabolismo Ejemplos Es necesario para el crecimiento, contiene SOD y catalasa. Respiración aerobia Micrococcus luteus P. aeruginosa Aerobios Obligados Respiración aerobia, anaerobia y fermentación Enterobacter sp. S. cerevisiae Requieren baja concentración de O2, presentan SOD y catalasa. Respiración aerobia Spirillum vollutans Aerotolerantes No requieren O2, pero crecen en su presencia. Sólo SOD. Fermentación S. pyogenes Clostridium sp. Obligados El O2 es letal, no contiene enzimas destoxificantes Fermentación o respiración anaerobia Metanobacterium formicicum Facultativos Microaerofilicos Crecen mejor en presencia de oxígeno, presentan SOD y catalasa. Anaerobios Relación con el O2 Crecimiento en medio fluido de Tioglicolato. Aerobio obligado Aerobio facultativo Microaerofílico Anaerobio aerotolerante Anaerobio obligado Cultivo de anaerobios Jarra de anaerobiosis NaHCO3 + NaBH4 + O2 → CO2 + H2O + H2 Enzimas destoxificantes O2 + e- → O2- + e- + 2H+ → H2O2 + e- + H+ → HO. + e- + H+ → Reacción general: O2- Superoxido H2O2 Peroxido de hidrógeno H2O + OH. Radical hidroxilo H2O Agua O2 + 4e- + 4H+ → 2H2O Superoxido dismutasa (SOD) O2- + O2- + 2H+ → H2O2 + O2 Catalasa H2O2 + H2O2 → 2H2O + O2 Peroxidasa H2O2 + NADH + H+ → 2H2O + NAD+ Concentración de solutos Concepto Definición No Halófilos Crecen en concentraciones de 1-6 % de NaCl Halófilos moderados Crecen en concentraciones de 6-15% de NaCl Halófilos extremos Crecen en concentraciones de 15-30% de NaCl Halotolerantes Toleran disminuciones en el aw pero crecen mejor en ausencia de solutos. Osmófilos Son capaces de vivir en altas concentraciones de azúcares. Xerófilos Crecen en condiciones de aw bajo. Actividad del Agua aw es la relación entre la presión de vapor del aire en equilibrio con una sustancia o solución a la presión de vapor a la misma temperatura del agua pura. aw Medio de crecimiento Microorganismos que desarrollan 1.000 Agua pura Caulobacter, Spirillum 0.995 Sangre humana Streptococcus, Escherichia 0.980 Agua salada Pseudomonas, Vibrio 0.950 Pan Muchos cocos G+ 0.900 Miel de maple, jamón Cocos G- 0.850 Salami Saccharomyces rouxii 0.850 Pastel de frutas, jalea Saccharomyces bailii, Penicillium 0.800 Lagos salados Halobacterium, Halococcus 0.750 Cereales, dulces, frutas secas Xeromyces bisporus y otros hongos xerófilos. Solutos compatibles Son compuestos que forman los microorganismos para compensar la concentración de solutos exterior. •Aminoácidos: Glicina-betaína y ectoina CH2 CH3 CH3 N CH2 CH3 Glicina-Betaina N CH2 C C COOCH3 N COO- Ectoina •Carbohidratos: Sacarosa y trehalosa •Poli alcoholes: Manitol y glicerol •Otros: KCl y propionato dimetilsulfonico (PDS) Formación de solutos compatibles Organismo Bacterias no fotótrofas Cianobacterias de agua dulce Cianobacterias marinas Algas marinas Cianobacterias de lagos salados Bacterias fototrópicas, anoxigénicas halofílicas ( Ectothiorhodospira) Soluto principal aw máximo Glicina betaína , prolina (G+), glutamato (G-) 0.97 – 0.90 Sacarosa, trehalosa 0.98 a-glucosilglicerol Manitol, glucosidos, prolina, PDS 0.92 Glicina betaína 0.90 – 0.75 Glinina betaína. Ectoína, trehalosa Arqueas halófilas extremas (Halobacterium) y algunas bacterias (Haloanaerobium) KCl 0.75 Alga verde halofílica (Dunaliella) Glicerol 0.75 Levaduras xerófilas Glicerol 0.83 – 0.62 Hongos filamentosos xerófilos Glicerol 0.72 – 0.61