Ingeniería Genética 2010 Clase130810 - U

Acción de la enzima de
restricción EcoRI
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Nucleic Acids Res. 2001 September 15; 29(18): 3705–3727.
Structure and function of type II restriction endonucleases
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Endonucleasas de restricción Tipo II
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Endonucleasas de restricción Tipo II
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Eco RI: Model image of the restriction enzyme ECO RI (red and yellow) binding to DNA
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(blue). The enzyme is made up of two Ssymmetrical
units that correspond to the double
helix structure of DNA.
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Frecuencias de corte por ER
(en un DNA 50 %GC)
La mayoría de las ER reconocen secuencias de
entre 4 y 6 pb
pb..
z La probabilidad que se encuentre una secuencia
de 4 nt en el DNA es:
([1/4]4) = 1 en 256 pb
pb..
z
z
Una secuencia de 6 nt = ([1/4]6) = 1 en 4.096 pb
pb..
Otras ER reconocen secuencias más largas
(hasta 8 pb
pb).
). Un sitio de reconocimiento de 8 pb
ocurrirá con una ffrrecuencia de aproximadamente
1 en 65.536 bases ([1/4]8). Ej. NotI
z
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Frecuencias de corte en ER’s
Corte Frecuente
Sitio
Corte Infrecuente Sitio
Sau3AI
GATC\
EcoRI
G\AATTC
TaqI
T\CGA
NotI
GC\GGCCGC
HaeIII
GG\CC
BamHI
G\GATCC
Nt.CviPII
\CCD
BcgI
CGANNNNNN\TGC
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Ligación de
fragmentos de
restricción con
extremos cohesivos
v/s
Ligación de
extremos romos
DNA I + DNA II
T4 DNA ligasa
li
ATP
DNA recombinante
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Otros enzimas
Metilasas
Nucleasas
F f
Fosfatasas
Polimerasas
Transcriptasa
p
inversa
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DNA pol I de E. coli
Fragmento Klenow
Klenow H and Henningsen I "Selective Elimination
of the Exonuclease Activity of the Deoxyribonucleic
Acid Polymerase from Escherichia coli B by Limited
Proteolysis" Proc Natl Acad Sci vol. 65 pp. 168
(1970).
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Usos de DNA polimerasa I de E. coli
Síntesis de DNA de doble hebra desde
moldes de DNA de hebra simple
z “Rellenado” de extremos 3´
3´recesivos de
fragmentos de DNA
z Digestión de extremos 3´
3´ protuberantes
z Preparación de sondas de DNA
radiactivas
z
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Usos del fragmento Klenow de la
DNA pol I de E. coli
A. Relleno de extremos
3’ recesivos para generar
3
extremos romos
5’-3’ DNA
polimerasa
en
presencia
de dNTP y
F Klenow
F.
B. Degradacion de extremos
3’ protuberantes,
protuberantes
t b
t , para generar
extremos romos
3’-5’ exonucleasa
de la DNA pol
Klenow
AATT-OH
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Marcación de DNA por iniciación al
azar (random
(random priming)
Nucleótidos radiactivos
Hexámeros 1 y 2: partidores
M: hebra templado (hebra simple)
P: polimerasa
N: hebra recien sintetizada
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Marcación por traslado del nick
(Nick translation)
translation)
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DNA polimerasa Taq
z
z
z
z
z
Uso en PCR
Original de bacteria termófila
termófilaThermus
Thermus aquaticus
Termo--resistente
Termo
resistente,, activa a altas temperaturas
Carece de actividad 3’
3’--5’ exonucleasa (mayor frecuencia
de errores en la polimerización:
polimerización: 1 en 1000 a 1 en 10.000
pb))
pb
Otras termoestables con actividad 3’
3’--5’ exo se usan para
amplificación de secuencias que se requiere preservar
de mutaciones (Pfu
Pfu,, Vent DNA pol
pol,, Tli,
Tli, etc)
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Síntesis de
cDNA por
T
Transcriptasa
i t
inversa
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T7 o T4 RNA polimerasas
Oi
Origen
viral:
i l de
d ffagos T7 o T4
z Síntesis de RNA usando DNA como
templado. Requiere un promotor
p
compatible.
z Uso en la transcripción in vitro de genes
de interés.
z En construcción de sistemas de expresión
recombinante.
recombinante
z
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Usos de T7 RNA polimerasa
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Nucleasas
z
z
z
Desoxirribonucleasas (DNasas
DNasas),
), sustrato es DNA
Ribonucleasas (RNasas
RNasas),
), sustrato en RNA
Endonucleasas y exonucleasas
•Mas usadas son:
•DNasa I (endonucleasa)
(
)
•Eliminar DNA de preparaciones de RNA o de proteínas.
•Estudio de interacción DNA-proteína por DNasa
footprinting.
•RNasa
RNasa A (endo-ribonucleasa)
(endo ribonucleasa)
•Eliminar RNA de preparaciones de DNA.
•Las dos son originales de páncreas de bovino.
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Exonucleasa III
•Remoción de
nucleotidos, uno a uno,
desde el ext. 3’ OH.
•ExoIII
E III ataca
t
ell 3' OH en
DNA doble hebra con
extremo romo o extremo
5’ protuberante.
ExoIII
ExoIII
Ejemplo de aplicación de
ExoIII en la generación
de mutaciones por
deleción en un
promotor.
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DNA ligasas
T4 DNA ligasa
ATP
•catalizan la formación de un enlace fosfodiéster entre un extremo 3’
OH y un 5’ PO4
•T4 DNA ligasa. Aplicacion en la formación de moléculas de DNA
recombinante.
•Liga fragmentos cohesivos (complementarios) y romos, aunque
éstos últimos son menos favorecidos.
•Extremo fosfato en C 5’ es fundamental.
•ATP como cofactor
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Fosfatasa alcalina de intestino de
ternera (CIP)
•Aplicación: desfosforilación de extremos 5´P para
evitar autoligación, en clonamiento de DNA.
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T4 Polinucleótido quinasa (PNK)
Aplicaciones
1. Marcación de ácidos nucleicos (RNA y DNA) en el extremo 5´
por fosforilación con γ32P-ATP
2. Fosforilación de oligonucleótidos sintéticos en el extremo 5’
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Electroforesis en gel de DNA
Método analítico de visualización del DNA
basado en la migración del DNA a través de
un gel
Gel
Polímero de agarosa
P lím
Polímero
de
d acrilamida
il mid o poliacrilamida
p li
il mid
V=qE/f
V= velocidad de migración
E= gradiente de potencial eléctrico (Volts/cm)
q= carga eléctrica efectiva de la partícula
f= coeficiente de fricción (tamaño y forma)
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Gel electrophoresis of DNA
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