Cromatografia - Dipartimento di Chimica

Chimica Analitica Ambientale
a.a. 2004/2005
Cromatografia
Metodo di separazione di miscele di analiti, basato sulla loro distribuzione tra due fasi:
•
Fase mobile
si muove con continuità a contatto con la fase stazionaria
(gas, liquido)
•
Fase stazionaria
fase fissa (solido, liquido)
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
LC
GASCROMATOGRAFIA
GC
Liquido – Liquido (LLC)
Gas – Liquido (GLC)
Liquido – Solido (LSC)
Gas – Solido (GSC)
Scambio ionico (IEC)
Gel filtrazione
(Size exclusion, SEC
o Gel Permeation GPC)
Varie classi di cromatografia:
1) CROMATOGRAFIA DI ADSORBIMENTO (sviluppata per prima nel 1903 da
M. Tswett)
FASE STAZIONARIA
solido su cui il soluto viene adsorbito tramite siti attivi
(anche GC) (gel di silice, allumina)
liquida
FASE MOBILE
gassosa
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2) CROMATOGRAFIA DI RIPARTIZIONE
FASE
STAZIONARIA
liquido come sottile pellicola distribuito
un supporto solido
inerte (anche GC) (gel di silice
ricoperto di liquido (eventualmente
legato) immiscibile con fase mobile)
liquida
FASE MOBILE
gassosa
3) CROMATOGRAFIA A SCAMBIO IONICO (solo LC)
FASE MOBILE
FASE STAZIONARIA
liquida
solido al quale sono legati permanentemente dei gruppi carichi
positivamente o negativamente (resine a scambio ionico, cationiche o
anioniche)
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4) CROMATOGRAFIA A ESCLUSIONE MOLECOLARE (o FILTRAZIONE SU
GEL)
FASE STAZIONARIA
gel con pori delle dimensioni delle sostanze
da separare (in genere macromolecole)
liquida
FASE MOBILE
gassosa
5) CROMATOGRAFIA PER AFFINITA’
FASE STAZIONARIA
FASE MOBILE
solido selettivo
liquida
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Cromatografia su colonna: fase
stazionaria contenuta in colonne di
vario diametro
Cromatografia su strato
sottile (TLC)
Schema a blocchi di un generico cromatografo liquido:
Il campione è iniettato mediante l’iniettore in testa alla colonna, mentre l’eluente passa
continuamente attraverso la stessa. Gli analiti presenti nel campione viaggiano nella
colonna a diverse velocità e di conseguenza passano attraverso il rivelatore con tempi
differenti.
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Risposta rivelatore
cmax
tr
tr (Vr)
ÔIl cromatogramma è un grafico in cui si riporta in ordinata la variazione del segnale del
rivelatore al passaggio degli analiti in funzione del tempo.
ÔSi ottengono dei profili a forma di picco o banda, che indicano che i tempi di
permanenza delle molecole di una stessa sostanza in colonna non sono uguali.
ÔI picchi sono abbastanza simili a curve gaussiane.
ÔL’area del picco cromatografico è proporzionale alla quantità di sostanza iniettata,
e alla sua concentrazione se vengono iniettati volumi costanti.
ÔSe le condizioni sono identiche anche l’altezza del picco è proporzionale alla quantità di
analita.
ÔLa posizione del picco sull’asse delle ascisse è data dal tempo di ritenzione (o dal
volume di ritenzione), che corrisponde al massimo del picco, cioè al momento in cui la più
alta frazione di molecole di quella sostanza passa attraverso al rivelatore.
Distribuzione di un soluto tra due fasi
Consideriamo un sistema ad un soluto (A) e due fasi immiscibili. Il componente A viene a
distribuirsi fra fase stazionaria (s) e fase mobile (m) secondo il seguente equilibrio:
Am ' As
cui corrisponde un ccooeeffffiicciieennttee ddii ddiissttrriibbuuzziioonnee
KD =
[A]s
cs
=
c m [ A]m
o un elevato valore di KD indica che il componente A preferisce la fase stazionaria e si
muove lentamente attraverso la colonna
o bassi valori di KD indicano che il componente A ha poca affinità con la fase
stazionaria e quindi si muove rapidamente
A causa delle velocità di migrazione diverse i componenti vengono a separarsi tra loro; per
effetto del continuo trasferimento le molecole avanzano finchè sono nella fase mobile,
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sono ferme finchè sono nella fase fissa, la velocità di migrazione è determinata quindi dal
coefficiente di distribuzione.
Isoterma di adsorbimento
cm
cs
Isoterma di adsorbimento = figura che correla le concentrazioni nelle due fasi a temperatura costante
o Nel caso ideale (curva A) KD è indipendente dalla concentrazione di soluto e i profili
di concentrazione, definiti picchi, sono simmetrici ed hanno l’andamento di una
funzione gaussiana o normale.
o In un sistema non ideale, KD dipende dalla concentrazione, quindi le molecole si
distribuiscono tra la fase mobile e quella stazionaria in funzione della
concentrazione. Questo provoca una dissimmetria nella banda cromatografia.
Le
deviazioni
dall’idealità
•
un’isoterma
•
un’isoterma del tipo C originerà un andamento di salita lenta del picco (fronting)
del
tipo
porteranno
B
darà
a
un
diverse
effetto
di
tipologie
di
picchi:
scodamento
(tailing)
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Parametri cromatografici
tr
ts
tempo morto, tm
tempo richiesto da un composto che non interagisce (non
trattenuto) con la fase stazionaria per essere eluito
ts
tempo che il soluto trascorre nella fase stazionaria prima di
essere eluito
tempo di ritenzione, tr
tempo che intercorre tra l’introduzione di un composto nel
sistema cromatografico e l’eluizione della sua massima
concentrazione (massimo del picco)
tr = ts + tm
volume di ritenzione, Vr volume di fase mobile necessario per eluire il composto
Vr = t r v m
volume della fase mobile in colonna, Vm
Vm = t m v m
Fattore di capacità, k’
k' =
volume occupato dalla
all’interno della colonna
fase
mobile
v m = velocità di flusso della fase mobile (ml/min)
parametro che definisce la ritenzione del soluto
ogni sostanza ha un valore caratteristico di k’,che dipende da
KD.
Rappresenta la frazione di analita in fase stazionaria e quella in
fase mobile nella colonna ad ogni istante
Ms
cV
V
= s s = s KD
M m c mVm Vm
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Dato che il tempo trascorso mediamente da una molecola rispettivamente nella fase
stazionaria e mobile è tr - tm e tm e che questi tempi sono proporzionali alla massa di
analita nelle due fasi, vale la relazione:
k' =
V r − Vm t r − t m
=
Vm
tm
e quindi KD si può ricavare direttamente dal cromatogramma.
Vr = Vm + V s K D
o Il volume di ritenzione aumenta all’aumentare delle dimensioni della colonna
o I volumi di ritenzione di sostanze con KD differenti sono differenti
Rapporto di ritenzione, R
R=
tm
=
tm + ts
1
1+
ts
tm
=
parametro che definisce la frazione di tempo che
il soluto trascorre nella fase mobile
1
1 + k'
Parametri per valutare la qualità delle separazioni
1. Risoluzione, R
E’ una grandezza che viene calcolata dal cromatogramma, e permette di caratterizzare la
separazione di due picchi cromatografici. Questo è importante per poter identificare e
quantificare esattamente due sostanze.
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tr1
R=
tr2
t r 2 − t r1
2 ∆t
=
W1 + W2 W1 + W2
2
tr1 e tr2 = tempi di ritenzione per le specie 1 e 2
W1 e W2 = larghezze dei picchi 1 e 2 misurate al punto di intersezione delle tangenti coi flessi del picco con la
linea di base
@ una completa separazione dei picchi è ottenuta per R > 1.5.
2. Selettività, α
α=
misura la separazione relativa di due picchi
tr 2 − tm
t r1 − tm
3. Fattore di capacità, k’
k' =
Ms
cV
V
= s s = s KD
M m c mVm Vm
@ Piccoli valori di k’ implicano che i composti eluiscono in prossimità del volume morto
e di conseguenza la separazione è scarsa.
@ Elevati valori di k’ indicano una buona separazione, ma anche tempi di analisi lunghi
cui si associa una riduzione di sensibilità e un allargamento del picco.
Valori ottimali di k’: 0 > k ’< 15.
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Il piatto teorico
Sebbene la cromatografia sia un processo in continuo, si può immaginare che la colonna
sia divisa in N sezioni, in ciascuna delle quali viene raggiunto l’equilibrio tra fase
stazionaria e fase mobile. Ognuna di queste sezioni è un piatto teorico. Se la lunghezza
totale della colonna è L, l’altezza equivalente a un piatto teorico (HETP) è:
HETP =
L
N
o Per convenzione l’efficienza di una colonna è espressa in N piatti teorici.
o Tanto maggiore è il numero di piatti teorici, tanto maggiore è l’efficienza della
colonna.
o L’efficienza di una colonna dipende dal fatto che i picchi siano più o meno allargati,
picchi stretti danno una buona separazione.
o Essendo l’altezza del piatto equivalente correlata ad N, maggiore è N, minore è
HETP, e maggiore è l’efficienza della colonna.
Non è raro che una colonna cromatografica possieda diverse migliaia di piatti teorici.
Es.
Se una colonna di 1m possiede 104 piatti teorici, HETP=1 m/104=10-4 m
Proprietà dei picchi gaussiani
L’andamento delle bande d’eluizione o picchi cromatografici è generalmente di tipo
gaussiano:
cmax
AB = W = 4σ
A
B
LINEA DI BASE
L’ampiezza di una banda gaussiana è proporzionale alla deviazione standard della banda.
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L’ampiezza di banda alla linea di base, W, è definita come 4σ, dove σ è la deviazione
standard.
Misurando il tempo di ritenzione e la larghezza di banda (in unità di tempo) si ricava il
numero dei piatti teorici:
N=
t r2
σ2
= 16
t r2
W2
⎛ t ⎞
⎟⎟
= 5.54⎜⎜
W
⎝ 1/ 2 ⎠
2
In base a questa relazione la risoluzione può essere calcolata dai parametri di selettività
(α), capacità (k’) e numero dei piatti teorici (N):
R=
k' =
N=
∆t r
W
Vr − V m t r − t m
=
Vm
tm
t r2
σ2
= 16
α=
t r2
W2
t r = t m (k' +1)
⎛ t ⎞
⎟⎟
= 5.54⎜⎜
⎝ W1 / 2 ⎠
2
W =4
tr
N
tr2 − tm
t r1 − t m
R=
1
⎛ α − 1 ⎞⎛ k' ⎞
N⎜
⎟⎜
⎟
4
⎝ α ⎠⎝ k' +1 ⎠
Efficienza della
colonna
Selettività
Capacità
R si può migliorare aumentando N, cioè cercando di diminuire la larghezza del picco
cromatografico:
o diminuendo le dimensioni delle particelle
o diminuendo la viscosità dell’eluente
o aumentando la temperatura (aumenta la velocità del trasferimento di massa)
@
Non si deve aumentare troppo la lunghezza della colonna (tempi di
separazione troppo lunghi)
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Allargamento delle bande cromatografiche
E’ misurato dal numero di piatti teorici nel processo cromatografico considerato, ed è
dovuto al fatto che le molecole di analita, pur uguali fra di loro, e quindi con uguale KD,
possono trascorrere tempi differenti all’interno della colonna, per varie ragioni.
Un modo conveniente per riassumere tali ragioni è presentato dall’equazione di van
Deemter, secondo cui l’altezza equivalente del piatto teorico in funzione della velocità
lineare u della fase mobile è data:
HETP = A +
B
+ Cu
u
Resistenza al trasferimento di
massa
u = velocità lineare della fase mobile
Diffusione longitudinale
Diffusione vorticosa
I tre termini dell’equazione di van Deemter corrispondono alle diverse cause di
allargamento del picco cromatografico:
Il primo termine A corrisponde alla “dispersione vorticosa”, dovuta al diverso
cammino che le molecole possono seguire tra le particelle di fase stazionaria per
raggiungere il fondo della colonna
ƒ
A = 2d p λ
dp = diametro delle particelle impaccate
λ = misura dell’irregolarità dell’impaccamento
o indipendente dalla velocità di flusso
o quest’effetto considera i vari percorsi che una specie può seguire
quando migra attraverso la colonna
o è dipendente dalla dimensione e dalla forma del materiale di
impaccamento e dalla qualità dell’impaccamento
o per limitare la diffusione vorticosa e quindi minimizzare HETP meglio
usare per l’impaccamento materiale di piccole dimensioni e uniforme
ll secondo termine B corrisponde alla “dispersione longitudinale”, ed è dovuto alla
diffusione longitudinale, nella direzione del flusso e in senso contrario, dovuta alla
differenza di concentrazione tra la zone di fase mobile in cui è contenuto l’analita e
quelle adiacenti di eluente.
1
B = 2γDm
Dm = coefficiente di diffusione del soluto nella fase mobile
ƒ
u
γ = fattore di ostruzione o tortuosità
o in cromatografia liquida costituisce un contributo trascurabile alla
deformazione totale del picco. E’ però molto importante in
gascromatografia.
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ll terzo termine C corrisponde alla “dispersione di distribuzione di
massa”, ed è dovuto al trasferimento di massa nelle due fasi, che è
spesso il fattore dominante nella deformazione del picco. Questo
termine si può suddividere in due, Cf relativo alla diffusione nel film
fermo aderente alla particella, e Cp alla diffusione all’interno della
particella
ƒ
C = Cf + Cp
o termine dovuto al trasferimento di massa nelle due fasi, che è spesso
il fattore dominante nella deformazione del picco
Cf =
fp( 1 − p )d 2f
Df
u
Cp =
ωd 2p
Dm
u
Cf = diffusione nel film
Cp = diffusione all’interno della
particella
f =fattore di forma per la fase stazionaria
p = concentrazione di soluto nella fase stazionaria
dp = diametro particelle
Dm = coefficiente di diffusione del
soluto nella fase mobile
ω = misura della qualità del processo
di impaccamento
(1-p) = concentrazione di soluto nella fase mobile
df =spessore del film
Df = coefficiente di diffusione del soluto nel film
Tutti i fattori elencati contribuiscono a migliorare il processo cromatografico, se
diminuiscono, in quanto fanno diminuire l’altezza del piatto teorico, e quindi il numero dei
piatti teorici.
Riportando in grafico l’equazione di Van Deemter (HETP vs u) si ottiene una funzione
iperbolica:
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•
•
•
a velocità estremamente basse, il termine B/u dà il maggior contributo all’HETP
a velocità elevate diventa importante il termine Cu
l’impiego di particelle di piccole dimensioni diminuisce anche il termine A
La velocità di flusso ottimale è quella che corrisponde al minimo della curva.
L’equazione di van Demteer permette quindi di ottimizzare il processo in funzione della
velocità di flusso, ma non è in grado di predire né l’ampiezza della dispersione né l’effetto
della modifica di alcune variabili, quali la velocità di flusso o la dimensione delle particelle.
Teoria della velocità di allargamento delle bande
Tale teoria correla l’allargamento di banda con le proprietà cinetiche del sistema
cromatografico, quali appunto la velocità della fase mobile, le dimensioni delle particelle
del riempimento e la velocità di trasferimento di massa tra le fasi.
Vi sono tre contributi all’allargamento delle bande:
1) diffusione longitudinale o assiale
2) diffusione per turbolenza
3) resistenza al trasferimento di massa tra le fasi
1) diffusione longitudinale σL
0
x
un disco di soluto a contatto con un solvente si disperde per diffusione, cioè
diffonde simmetricamente rispetto al suo centro di massa.
La concentrazione in un punto a distanza x dal centro di massa c(x) è data da:
c( x ) =
M
2 πDt
−
e
x2
4 Dt
M = quantità di soluto nel disco
D = coefficiente di diffusione
x = distanza dal punto di origine
t = tempo
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L’equazione precedente rappresenta una distribuzione gaussiana con deviazione
standard:
σ = 2 Dt =
2 DL
u
t=
L
u
L = lunghezza colonna
u = velocità lineare fase mobile (cm min-1)
@ Risulta evidente che per le velocità comunemente usate in cromatografia liquida
questo contributo alla diffusione di banda è molto limitato.
2) diffusione per turbolenza (eddy diffusion) σE
Consideriamo una molecola trasportata dal solvente attraverso un ipotetico
riempimento, dove la direzione del flusso è verticale e che per semplicità il sistema
sia bidimensionale.
La molecola può seguire varie vie, arrivando quindi in tempi diversi alla fine della
colonna.
E’ un esempio di “cammino a caso” che può essere risolto in base alla teoria della
probabilità:
σ = l n = Ld p
σ = deviazione standard per tutto il percorso L
n = numero dei punti di decisione nel cammino e quindi uguale a L/dp
l = lunghezza di ogni stadio che viene assunto pari al diametro della particella
@ E’ quindi sufficiente ridurre le dimensioni delle particelle dell’impaccamento per
ridurre la dispersione, però questo porta ad un aumento nella pressione della colonna
(la caduta della pressione è inversamente proporzionale alla radice quadrata del
diametro delle particelle).
@ Indipendente dalla velocità di flusso.
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3) resistenza al trasferimento di massa σM
In un sistema ideale il raggiungimento dell’equilibrio della distribuzione della sostanza
tra le due fasi è infinitamente veloce, cioè all’avanzare della fase mobile nella fase
stazionaria corrisponde una distribuzione infinitamente rapida del soluto tra le due fasi.
In realtà le molecole spendono un tempo finito per passare tra le due fase. Il problema
è simile al precedente di “cammino casuale”: mano a mano che le molecole percorrono
la colonna devono scegliere se essere in fase stazionaria o nella fase mobile. Lo
scambio prevede quindi diverse decisioni, cioè più stadi nel cammino casuale. Il
tempo speso in fase stazionaria corrisponde ad un ritardo rispetto alla zona centrale,
altrimenti se la molecola sceglie la fase mobile essa sarà nel fronte anticipando la
banda.
In base alla teoria delle probabilità:
σ = 2 p (1 − p )Lut s
L = lunghezza colonna
u = velocità della fase mobile
p = frazione di tempo che il soluto passa nella fase mobile
(1-p) = frazione di tempo che il soluto spende in fase stazionaria
ts = tempo medio speso dal soluto in fase stazionaria
@ La diffusione della banda aumenta con la velocità di flusso e con ogni fattore che
tende ad aumentare il tempo di permanenza nella fase stazionaria, ad esempio una lenta
diffusione nelle particelle.
Gli effetti delle diverse diffusioni possono essere accorpati in un’unica relazione, dato che
la teoria delle probabilità prevede che la varianza totale di un sistema a più varianze sia
data dalla loro somma:
2
σ tot
= σ L2 + σ T2 + σ M2
2
σ tot
=
2 DL
+ Ld p + 2 p (1 − p )Lut s
u
HETP =
HETP =
σ2
L
2D
+ d p + 2 p (1 − p )ut s
u
@Questa
equazione è una versione semplificata della van Deemter
precedentemente riportata, in cui i termini relativi al trasferimento di massa sono
incorporati in un unico fattore.
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Indicazioni qualitative dalla cromatografia
Tempo (tr) o volume di ritenzione (Vr) dà indicazioni sulla identità di una specie. Questa
deve essere confermata tramite:
o aggiunta della specie presunta
o isolamento del picco, e conferma con tecniche spettroscopiche (IR,
NMR, massa)
Le indicazioni sulla assenza di una sostanza sono più sicure.
Determinazioni quantitative
Altezza del picco:
dipende dalla quantità di sostanza, ma anche dalla temperatura,
velocità di flusso del campione, velocità di iniezione del campione.
Area del picco:
dipende dalla quantità di sostanza, indipendente dai fattori sopra
menzionati.
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