detección de las variantes alélicas de la k-caseína en

DETECCIÓN DE LAS VARIANTES ALÉLICAS DE LA K-CASEÍNA EN GANADO
DE LECHE UTILIZANDO LA TÉCNICA SSCP
DETECTION OF THE ALLELIC VARIANTS OF THE K-CASEIN IN MILK
CATTLE USING TECHNIQUE SSCP
JULIÁN DAVID NARANJO1, JAIME EDUARDO MUÑOZ2, JUAN GONZALO MORALES3,
ANDRÉS MAURICIO POSSO4
PALABRAS CLAVE:
RESUMEN
Caseina, Kappa Caseina, Harton del
Valle.
Las proteinas lácteas se clasifican en caseínas, proteinas en el suero y
proteinas en la membrana del glóbulo graso. Las Caseínas al mismo tiempo
se clasifican en AS1, AS2, ß y kappa. La Kappa caseína está conformada por 2
alelos, el A y el B. La leche con una mayor presencia de la Kappa caseína de
tipo B es mas estable al calor y a temperaturas de congelación y ofrece un
mayor rendimiento quesero. En este trabajo se emplean las técnicas PCRRFLP y PCR-SSCO para determinar las alelos A y B, específicamente para la
raza bovina criolla Hartón del Valle y por lo tanto, se determina indirectamente el potencial de procesamiento de su leche.
KEY WORDS:
Casein, Kappa casein, Hartón del
Valle
ABSTRACT
The lacteal proteins are classified in caseins, proteins in the whey and proteins in
the fatty globule membrane. The caseins at the same time are classified in AS1,
AS2, ß and kappa. The Kappa casein is constituted by 2 alleles, the A and the B.
The milk with a major presence of the Kappa casein type B is more stable to heat
and to freezing temperatures and offers a major cheese yield. In this work are
employed techniques PCR-RFLP y PCR- SSCP in order to determine the alleles A
and B, specifically for the bovine criolla race Hartón del Valle and therefore, it is
determined indirectly the processing potential of its milk.
____________
Recibido para evaluación: Diciembre 7 de 2004. Aprobado para publicación: Febrero 15 de 2005.
1
2
3
4
Biólogo Universidad del Valle
I.A. Esp. Universidad Nacional de Colombia
I. A. MSc. Universidad Nacional de Colombia
Laboratorio de Biología Molecular. Universidad Nacional de Colombia.
Correspondencia: biotecnología@unicauca.edu.co
100
INTRODUCCIÓN
La raza bovina criolla Hartón del Valle tiene su origen en
los bovinos Bos taurus traídos por los conquistadores
españoles al valle superior del río Cauca alrededor de
1539. El censo más reciente muestra una población
aproximada de 5460 cabezas en el departamento del
Valle del Cauca y una cuantía menor en otros departamentos de Colombia. A pesar de que se estableció un
patrón fenotípico racial que corresponde en líneas generales a una raza adaptable a un sistema de producción de doble propósito, la raza se explota en algunos
casos para leche o para carne solamente según las preferencias de cada criador (1).
La adaptabilidad del Hartón al medio tropical se manifiesta a través de una alta tolerancia al calor y a enfermedades, larga vida, baja mortalidad, alta fertilidad y una
productividad razonable de carne, leche y trabajo de
acuerdo con el manejo que le provean. En cuanto a la
productividad, la raza es de desarrollo lento pero alcanza 308 kg de peso a los 22 meses en las novillas y 426
kg en las vacas a los 4 años, en los machos el crecimiento es un poco más acelerado y pueden alcanzar
pesos de 280 kg a los 18 meses, 443 kg a los 36 meses
y de 750 a 980 kg en los toros de 5 años o más. La
producción de leche es variable según el grado de selección, ordeño con o sin ternero y manejo nutricional.
En el ordeño con ternero la producción promedio es de
1362 + 157 kg en 245 días y sin ternero 1956 + 546 kg
en 298 días.
Estudios comparativos han revelado que existen marcadas diferencias, cuantitativas y cualitativas, en la composición de la leche de diferentes especies de mamíferos, sin embargo, todas contienen fosfo-proteínas ácido-precipitables (caseínas), lactosa, -lactoalbúmina y
lípidos.
El contenido total de proteínas en la leche varía entre 10
y 200 g L-1 dependiendo de la especie (para especies
bovinas se encuentra alrededor de 35 g L-1), e incluye
caseínas αs1-, αs2-, β- y kappa además de otras en menor cuantía (Woodward 1978) citado por Muysson &
Verrinder (2). Las caseínas αs1-, αs2-, β- y K-CN (CASAS1, CASAS2, CASB Y CASK por sus loci genéticos
respectivamente) representan el 80% de las proteínas
de la leche bovina; el resto está constituido por Betalactoglobulina (alrededor del 10% de las proteínas tota-
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les), -lactoalbúmina (en torno al 2% de las proteínas
totales) y pequeñas cantidades de diversas proteínas
(enzimas, inmunoglobulinas, etc.) (3).
Las caseínas son sintetizadas en la glándula mamaria y
son los constituyentes lácteos principales en los productos de los hatos lecheros. Estas proteínas se precipitan a un pH entre 4.5 y 5.0 formando el cuajo. Las
caseínas αs1- y αs2- corresponden aproximadamente al
48% de las caseínas totales en la leche de bovinos, mientras que las β- y k-caseínas constituyen el 35 y 13%
respectivamente (Davies & Law 1980) citados por
Muysson & Verrinder (2).
Las α y β caseínas contienen grupos serina fosfato los
cuales se pueden unir al calcio y causar la precipitación
de las proteínas en la leche. La kappa-caseína carece de
este grupo serina fosfato por lo cual su capacidad para
unirse al calcio es pobre y es insensible a este tipo de
precipitación inducida.
La k-caseína juega un papel esencial al impedir que
otras proteínas se precipiten al interactuar con ellas y
formar grandes agregados poli-dispersos llamados
micelios. Sin embargo, bajo condiciones especiales
como un pH bajo (4.5 - 5.0) o proteólisis por quimosina
y un medio rico en calcio la k-caseína pierde su capacidad estabilizadora de micelio; la consecuente precipitación de caseínas permite la formación de el cuajo
resultante, materia prima para la manufacturación de
quesos. Figura 1.
En los últimos años, diversas investigaciones han demostrado que algunas variantes genéticas de las
caseínas influyen en las características queseras de la
leche bovina. Las caseínas están codificadas por genes
autosómicos y están estrechamente ligados (4) lo que
implica que la unidad de transmisión genética sea el
haplotipo que según Klug & Cummings (5) es un grupo
de alelos de loci íntimamente ligados que se encuentran
en un individuo y normalmente se heredan cómo una
unidad, segregando de forma mendeliana simple. El
gen de la kappa-caseína (CASK) ha sido ampliamente
estudiado debido a que es la más importante de las
caseínas. Según Kaminski (1996) citado por Barroso et
al. (6), hasta la fecha se han descrito seis variantes
alélicas: A, B, C, E y las recientemente descritas F y G.
En particular, la leche bovina que contiene kappa-caseí-
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FIGURA 1. Representación gráfica de la formación de micelios, mediada por la capa caseína.
na del tipo B presenta, respecto a la que posee kappacaseína del tipo A, las siguientes características: contenido proteico más alto, estabilidad mayor al calor y a la
congelación y aptitud quesera mayor; tiempo de coagulación menor, cuajo más consistente y un 5 al 10% más
de rendimiento quesero (Walsh et al. 1988) (Sherbon et
al 1967, Ns-Kwai-Hang et al 1984) citados por Ordás (7).
Se utilizaron dos técnicas conocidas para la identificación de los alelos A y B de la capa caseína. La primera,
conocida como PCR-RFLP, permite de forma un poco
más compleja y con mayores costos, la utilización
enzimas de restricción para la identificación de los diferentes alelos. La segunda, PCR-SSCP, permite llegar a
los mismos resultados, pero sin la utilización de las costosas enzimas y con una metodología más abreviada.
énfasis recae en la estandarización de la muestra y no en
un estudio poblacional.
PCR-RFLP
Se trataron 15 µ l de producto de PCR con 5U de cada
una de las tres enzimas de restricción: HinfI (con sitio de
reconocimiento 5´-GANTC-3´), HaeIII (sitio de reconocimiento 5´-GGCC-3´) y MaeII (sitio de reconocimiento
5´-ACGT-3´) en tres reacciones separadas.
Después de digeridos los productos de PCR, los fragmentos obtenidos se visualizaron en geles de poiliacrilamida al
12%, para la construcción de los mapas de restricción y la
subsiguiente identificación de los alelos.
PCR-SSCP
MATERIALES Y MÉTODOS
Muestreo y Extracción de ADN
Como fuente de material genético, se utilizó la sangre
obtenida de 5 machos reproductores y 35 hembras de
la raza de ganado criollo Hartón del Valle en dos hatos
lecheros ubicados en Roldanillo, y dos unidades de
producción animal pertenecientes a la Universidad Nacional de Colombia sede Palmira, en Palmira y Candelaria. El tamaño de muestra puede parecer pequeño y poco
representativo de la población, pero es suficiente para
los objetivos trazados en el presente trabajo, ya que el
Se utilizaron 2 µ l de los productos de PCR, los cuales
se mezclaron con 8 l de buffer desnaturalizante (0.05%
de Xylene -Cianole, 0.05% de azul de Bromofenol, 5.5
mM de EDTA pH 8.0), se desnaturalizaron a 95oC por
dos minutos y luego se enfriaron en hielo al menos por
dos minutos para evitar que el ADN se renaturalice.
Las muestras se corrieron en un gel de poliacrilamida que
contenía 0.5X TBE (0.045 M tris-borato, 0.001 M EDTA,
pH 8.0). Después de la electroforesis las bandas se tiñeron
con plata de acuerdo a la metodología de Bassam et al
(1991) citado por Barroso et al (1998) y con las modifica-
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ciones de Barroso et al (6) quienes reducen la fijación de
20 a 5 minutos y la tinción de 30 a 20 minutos. La
electroforesis se realizó en una cámara de electroforesis
usando geles al 12% de poliacrilamida (radio de acrilamida:
N,N´-metilene-bis-acrilamida de 100:1), 5% de glicerol
y de dimensiones 12 x 8 cm. Las muestras se corrieron
por 7 horas a 200 voltios en 0.5X TBE con temperatura
ambiente regulada a 15oC.
FIGURA 2. Gel de poliacrilamida al 12%. De izquierda a
derecha tenemos el marcador de peso (50 pb), la mancha más intensa corresponde a 350 pb. Siguen individuos representantes de cada una de las combinaciones
posibles de alelos, y digeridos con las tres diferentes
enzimas de restricción. Las manchas negras corresponden a la enzima de restricción.
___HaeIII__ __MaeII__ ___HinfI__
MP AA AB BB AA AB BB AA AB BB
RESULTADOS
PCR-RFLP
Los fragmentos esperados al digerir los amplificados
con las diferentes enzimas de restricción se consignan
en la Tabla 1.
Como se esperaba, solo se encontraron individuos portadores de los alelos A y B, por lo cual el patrón de
bandas obtenidas para la combinación de alelos en los
individuos, se muestra en la Figura 2.
PCR-SSCP
La SSCP, permitió identificar los diferentes alelos sin la
utilización de las enzimas de restricción.
El patrón de bandas obtenido en la SSCP, se muestra en
la Figura 3.
FIGURA 3. El patrón de bandas obtenido para cada uno
de los individuos portadores de las diferentes combinaciones de los alelos.
AA
AA
AB
AB
BB
BB
Observe que cada banda corresponde a una de las hebras de ADN desnaturalizadas. Es así como en los individuos AB observamos 4 bandas, correspondientes a
cada una de las hebras de ADN, provenientes de los dos
cromosomas portadores del gen.
La discusión de los resultados se publicará en el texto
del trabajo de grado del mismo nombre, razón por la
cual solo se exponen los resultados.
TABLA 1. Extensión de los fragmentos obtenidos al digerir los productos de PCR con cada una de las enzimas de
restricción.
$OHOR
$
%
&
(
+LQI,
+DH,,,
0DH,,
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REFERENCIAS
(1) CASAS, I. & M. VALDERRAMA. 1998. El bovino
criollo Hartón del Valle. Programa de investigación "Conservación, Mejoramiento y utilización del
ganado criollo Hartón del Valle."
(2) Muysson & Verrinder
(3) BRAUNSCHWEIG, M., C. HAGGER, G.
STRANZINGER & Z. PUHAN. 2000. Associations
between casein haplotypes and milk production
traits of Swiss Brown Cattle. Journal of Dairy
Science. 86(6).
(4) ORDÁS, J. G. 1992. Selección de caseínas k bo-
103
vinas mediante polimorfismos de ADN y PCR.
Avances en Alimentación y Mejora Animal. 32:2123.
(5) KLUG, W. S. & CUMMINGS, M. R. 1999. Conceptos de Genética. 5ª edición. Madrid, Prentice Hall
Iberia. 814p.
6) BARROSO, A., S. DUNNER & J. CAÑÓN. 1998.
Technical note: Detection of Bovine Kappa-casein
variants A, B, C, y E by Means of Polymerase Chain
Reaction-single strand Conformation Polymorphism (PCR-SSCP). Journal Animal Science.
76:1535-1538.
(7) Ordás (1192)