La secuenciación del ADN

Biotecnología
Sesión 12
Biotecnología, 2a parte
Clonación de ADN
•  Los investigadores usan enzimas de restricción
para cortar el ADN, luego unen los fragmentos
usando ADN ligasa
•  Los fragmentos con “colas
complementarias” (extremos pegajosos), se unen
por complementaridad de bases
•  Enzima de restricción
•  Enzima de origen bacteriano que se usa para
cortar secuencias específicas de nucléotidos en el
ADN. Su nombre proviene de que ellas restringen
el crecimiento de ADN viral
ADN Recombinante
Fragmentos de ADN de diferentes organismos
se combinan para producir una molécula
híbrida: ADN Recombinante
•  ADN Recombinante
•  Una molécula de ADN que contiene
material genético de más de un organismo
Formación del ADN Recombinante
Enzima de
restricción
(corta)
Una enzima de
restricción reconoce
una secuencia
especifica
de bases (cuadros
naranja) en ADN de
cualquier origen o
fuente.
1
2
mezcla
La enzima corta el
ADN de dos origenes
en fragmentos. Esto
deja extremos
“pegajosos”.
ADN ligasa
(pegar)
3 Cuando los
4 ADN ligasa une los
fragmentos de ADN de
fragmentos y así se
las fuentes, se mezclan genera una molécula
juntos y los extremos se de ADN recombinante
aparean con las bases
complementarias.
Plásmidos como Vectores de Clonación
Kpn l
Sph l
Pst l
Bam Hl
Eco RI
Vector de clonación pDrive
3.85 kb
Sal l
Acc l
Xho l
Xba l
Bst XI
Sac l
A
B
Not l
Clonación de ADN
A Una enzima de restricción
corta secuencias específicas en
ADN cromosómico y en un
plásmido vector de clonación
Fragmentos de
ADN
cromosómico
ADN
cromosomal
B ADN ligasa une las dos piezas
de ADN.
Plásmido
recombinante
plásmido
vector de
clonación
Plásmido
cortado
C El Plásmido recombinante se
inserta en una célula hospedera.
Cuando la célula se multiplica, se
hacen muchas copias de los
plásmidos.
Librerías de ADN
Librerías de ADN
•  Son conjuntos de células que contienen
colectivamente los diversos fragmentos de ADN de
un organismo.
•  Una librería o biblioteca genómica, colectivamente
contiene todo el ADN de un genoma
•  Bibliotecas de ADN y la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) ayudan a los investigadores a
aislar fragmentos particulares de ADN
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
utiliza cebadores (“primers”) y ADN polimerasa
resistente al calor, para producir una sección particular
de ADN sin tener que clonarlo en células vivas
•  Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
Método que genera rápidamente muchas copias de
una sección específica de ADN
•  cebador
•  Hebra sencilla, corta de ADN, diseñada para
formar un híbrido con un fragmento de ADN
Multiplicación por PCR
•  La PCR puede ser usada en cualquier
muestra de ADN con al menos una (1)
molécula de ADN, Cualquier muestra que
contenga ADN se puede usar, aún un sólo
espermatozoide, un cabello dejado en la
escena del crimen, o una momia.
•  Cada ciclo de una reacción de PCR dobla el
número de copias de una sección de ADN –
30 ciclos pueden hacer mil millones de copias
PCR (1)
1
•  El molde o templado de ADN se mezcla con los
cebadores, nucleótidos y la enzima resistente al calor Taq
ADN polimerasa
Sección blanco
PCR (2)
2
Cuando la mezcla se calienta, la doble cadena de
ADN se separa en las hebras sencillas. Cuando se
enfría, algunos de los cebadores se aparean con el
molde de ADN
PCR (3)
La Taq polimerasa empieza la síntesis de ADN donde
están los cebadores, de modo que se forman las
hebras complementarias de ADN en las hebras
sencillas del molde de ADN
3
PCR (4)
La mezcla se vuelve a calentar y el ADN de doble cadena se separa
en hebras sencillas. Cuando se enfría, algunos de los cebadores se aparean
con el molde de ADN. El ADN que se ha copiado antes, también sirve de
molde.
4
PCR (5)
En cada ciclo de PCR puede duplicarse el número de
copias de la secuencia de ADN de interés
5
PCR
Método que genera
rápidamente muchas
copias de una
sección específica
del ADN
Temperaturas altas90 C para romper
los puentes de
hidrógeno
Las bajas son
alrededor de 50 C
que permite la
formación de doble
cadena
Método de Electroforesis
•  La electroforesis es una técnica para la
separación de moléculas según su movilidad
en un campo eléctrico
•  El tipo de uso más común para el análisis de
ácidos nucleicos o de proteínas utiliza como
soporte un gel, habitualmente de agarosa o
de poliacrilamida
•  Los ácidos nucleicos ya disponen de una
carga eléctrica negativa que los dirigirá al
polo positivo
Método de Electroforesis
Puede usarse ADN
nuclear,
cloroplástico o
mitocondrial
S
Secuenciación de ADN
•  La secuenciación del ADN revela el órden de los
nucleótidos en un fragmento del ADN
•  El genoma completo de varios organismos ya se ha
secuenciado
Secuenciación del ADN
•  Método de determinación del órden de nucleótidos en el
ADN
•  ADN polimerasa replica parcialmente un molde de ADN
•  Produce una mezcla de fragmentos de ADN de diferentes
tamaños
•  Los fragmentos se separan por electroforesis
5. Pasos en Secuenciación de ADN
dideoxinucleótidos
1
Secuenciación depende de dideoxinucleótidos para
terminar la replicación del ADN – cada uno está
marcado con un pigmento coloreado
Pasos en Secuenciación de ADN
2. La ADN
polimerasa usa una sección de ADN
como templado para síntetizar nuevas
cadenas de ADN - la síntesis de cada nueva
cadena se termina cuando se agrega un
dideoxinucleótido con un marcador
3. Al final de la reacción, la mezcla contiene
muchas copias incompletas del ADN original
Pasos en Secuenciación de ADN
4. La electroforesis separa fragmentos de ADN
en bandas de acuerdo con el largo
5. Un computador detecta y registra el color de
bandas sucesivas en el gel - el órden de
colores representan la secuencia del ADN
templado
Secuenciación de ADN
Molde de ADN
2
3
4
5
El Proyecto Genoma Humano
•  El genoma humano consiste de alrededor de
3 mil millones de bases
•  A la espera de patentar las secuencias, la
empresa de Craig Venter, Celera Genomics,
inventó métodos muy rápidos de
secuenciación del ADN genómico usando
supercomputadoras
•  En 2003, se completó la secuencia del
genoma humano, pero los gobiernos
decidieron que no podía ser patentada
El Proyecto Genoma Humano
Genómica
•  Genómica dá ideas sobre la función del genoma
humano
•  La secuencia completa del genoma esta disponible.
No obstante, se llevará mucho tiempo el
entendimiento de la información codificada
•  genómica
•  Es el estudio de los genomas
•  Incluye comparaciones de las secuencias
completas de genomas, así como el análisis
estructural de los productos génicos y el estudio
de variaciones de pequeña escala
Comparación de Genomas
•  La comparación de genomas de diferentes
organismos muestra evidencia de relaciones
evolutivas y se usa en investigación médica
•  Esta es una región del gen para la ADN polimerasa:
Fugu
Perfiles de ADN
•  Perfil de ADN identifica a una persona por su
ADN
•  Ejemplos de perfiles de ADN incluyen la
determinación de arreglos individuales de
SNPs, y análisis de repeticiones cortas en
tandem usando PCR
•  En investigaciones criminales, un perfil de
repeticiones cortas en tandem se conoce
como “huella de ADN”
Análisis Personalizado de ADN
•  Este circuito integrado
“chip” revela cuales de
las 906,600 versiones
de SNPs están
presentes en el ADN de
un individuo
•  SNP: “polimorfismo de
un sólo nucléotido”
Se han identificado cerca de 4.5
mill de SNP en el ADN humano y
cada día aumentan
“Chip”: Pieza de silicio pequeña y con
forma cuadrada o rectangular en cuyo
interior hay un circuito integrado con
millones de componentes;
generalmente se combina con otros
elementos para formar un sistema más
complejo, como un ordenador.
Perfil de repeticiones cortas en tandem
•  Cada pico representa una repetición corta en tandem - el
tamaño del pico indica el número de repeticiones en un locus
Aplicaciones forenses
Granjas Biotecnológicas
•  Animales modificados genéticamente (GM) son
invaluables en investigación médica y otras
aplicaciones:
•  Ratones GM se usan en investigación genética y como
modelo de enfermedades genéticas
•  Animales GM producen proteínas para el tratamiento de
fibrosis quística, ataques cardíacos, desordenes de
coagulación, y exposición a gases neurotóxicos
•  Cabras GM producen proteína de la seda de araña en su
leche
•  Conejos GM producen interleucina 2 humana que induce la
divisón de células inmunes
Animales Genéticamente Modificados
•  El cerdo de la izquierda es transgénico para una proteína
fluorescente amarilla; el de la derecha no lo es
Animales Genéticamente Modificados
•  Mira es una cabra
transgénica que
produce un factor
humano
anticoagulante en su
leche
Humanos GM
•  Terapia Génica
•  Es la transferencia de un ADN recombinante en los
cromosomas de un individuo.
•  Se inserta un gen normal, sin la mutación para
corregir el defecto.
•  Se está utilizando como tratamiento para anemia
falciforme fibrosis quística, hemofilia A,
enfermedades de Parkinson y Alzheimer, varios tipos
de cancer y enfermedades hereditarias de los ojos,
oídos y sistema inmune.
Se conocen más de 15 000 trastornos genéticos graves
SCID-X1
•  La SCID-X1 es un desorden severo del gen IL2RG ligado al
cromosoma X, codifica para una proteína recepetora del
sistema inmune
•  Los niños afectados no pueden defenderse de las infecciones
y solo pueden sobrevivir en tiendas aisladas, libres de
germenes
•  En los 1990s, se le realizó terapia génica a 20 muchachos
con SCID-X1: Los investigadores usaron un virus ingenierado
para insertar copias del gen IL2RG no mutado en células
tomadas de su médula ósea. 18 se curaron.
Eventuales problemas
•  Nadie puede predecir en qué lugar del
cromosoma el virus inyectará el gen– si
interrumpe un gen que controle la división
celular, puede generarse un cáncer
•  Cinco de los 20 niños tratados con terapia génica
desarrollaron leucemia, cáncer de la médula ósea, y
1 murió.
•  Un joven, con otro desorden genético, desarrolló una
reacción alérgica muy severa al vector viral. Murió a
los 4 días de la terapia génica
Finalmente: Terapia Génica Exitosa
•  Rhys Evans nació
con SCID–X1 en
Reino Unido
•  Su sistema inmune
fue reparado
permanentemente
por terapia génica
cuando tenía 18
meses de edad.
Ahora tiene 13.
Clones Dorados
Los animales clonados tienden a tener problemas:
•  El primer mamífero clonado, la oveja Dolly, tuvo
problemas de envejecimiento cuando solo tenía dos
años.
•  Los clones pueden tener sobrepeso o tener órganos
agrandados.
•  Los ratones clonados desarrollan problemas de
pulmones e hígado y mueren prematuramente.
Transferencia de Núcleo de Células Somáticas
Animales Clonados
•  La campeona Holstein “Nelson’s Estimate Liz” (derecha) y su
clon, “Nelson’s Estimate Liz II" (izquierda)”
Un Perro Héroe
•  El policia Canadiense
James Symington y su
perro rescatista “Trakr”,
logró encontrar a la
quinta y última
sobreviviente de los
ataques a las Torres
Gemelas
Clonación de Trakr
•  Trakr murió en abril de 2009, de una enfermedad
degenerativa, probablemente relacionada con los
humos tóxicos en la Manzana Cero, pero su ADN vive
en sus clones
•  Trakr ganó el premio “Regalo de un Clon Dorado” por
un ensayo literario de su dueño
•  El ADN de Trakr fue enviado a Korea, se insertó en
óvulos de perro que se implantaron en perras “madres
sustitutas”
Cachorros Clonados
•  Los clones de Trakr fueron entregados a Symington en julio
de 2009