TESTOSTERONE - Diagnóstica Internacional

TESTOSTERONE
Inmunoensayo Enzimático para la Determinación Cuantitativa de la
Hormona de la Testosterona en Suero Humano
Solo para diagnóstico In Vitro
Para uso exclusivo en laboratorios clínicos o de gabinete
Conservar entre 2°C a 8°C
NOMBRES COMUNES Y DE PROPIEDAD
Inmunoensayo de la Enzima de Testosterona
USO DESTINADO
Para la determinación cuantitativa de la hormona de la testosterona en
suero humano.
INTRODUCCIÓN
La Testosterona (17β-hidroxi-4-androsten-3-ona) es un esteroide C19,
es el androgeno más potente naturalmente secretado. Es secretada por
las celulas de Leydig de los testículos, las glándulas suprarrenales y los
ovarios, y es el andrógeno más importante secretado en el torrente sanguíneo. En los hombres, la testosterona es secretada principalmente por
las células de Leydig de los testículos y en las mujeres aproximadamente
el 50% de la testosterona circulante se deriva de converison periférica de
androstenediona, con los restos de la secreción directa de testosterona
de las glándulas suprarrenales y los ovarios.
En los hombres, los niveles de testosterona aumentan durante el último
trimestre de la vida fetal debido a la estimulación de la gonadotropina
pituitaria placentaria, posteiormente viene un declive y aumento nuevamente 30-60 días después del nacimiento. Después de esto, las concentraciones de testosterona disminuyen a niveles bajos en la infancia. En el
inicio de la pubertad masculina, la secreción de gonadotropinas conduce
a un aumento de la producción testicular de la testosterona. En los hombres adultos, los niveles séricos de testosterona muestran una variación
circadiana, con niveles pico en la mañana.
La testosterona es responsable para el desarrollo de características
sexuales masculinas secundarias y sus medidas son útiles para evaluar
los estados de hipogonadismo. en los varones prepúberes, los niveles
elevados de testosterona se encuentran tanto en la pubertad precoz de la
gonadotrofina dependiente e independiente (ej. testoxicosis, hiperplasia
suprarrenal o tumor suprarrenal), así como en los defectos del receptor de andrógenos. En los hombres adultos, los niveles altos de testosterona se asocian con enfermedades hipotalámicas pituitarias, tumores
testiculares, hiperplasia suprarrenal congénita y cáncer de próstata. Del
mismo modo, en los varones adolescentes y adultos, niveles bajos de
testosterona se asocian con diversas condiciones patológicas, como hipogonadismo primario (ej. disgenesia testicular, síndrome de kinefelter)
y las deficiencias de gonadotropinas (ej. hipopituitarismo, síndrome de
Kallman)
En las mujeres, hay un incremento mucho menor en los niveles séricos
de testosterona durante el tercer trimestre, seguido por los bajos niveles
en la infancia, y un pequeño aumento durante la pubertad. En las hembras de todas las edades, niveles elevados de testosterona puede estar asociados con una variedad de disgenesia gonadal, enfermedad del
ovario poliquístico, y de ovario y tumores adrenales.
Cat. IIDE-2103
VER.1
Las mediciones de testosterona también puede ser utilizado en mujeres
para el seguimiento y ajuste de los medicamentos supresores de andrógenos y dosis. La concentración de testosterona en suero puede ser
planteada por ciertos medicamentos, tales como 19-nortestosterona,
epitestosterona, etisterona y danazol. Del mismo modo, las drogas comunes de anticonceptivos orales, fármacos que contienen acetato de cyprotarone (CPA), y la hormona liberadora de gonadotropina (GnRH) son
muy eficaces en la supresión de las concentraciones de testosterona.
Las mediciones de testosterona en el período postnatal inmediato puede
ayudar en el diagnóstico diferencial de genitales ambiguos, mientras que
las mediciones antes y después de la administración exógena de gonadotropina puede ayudar a detectar criptorquidia y otras anormalidades
estructurales.
El EIA testosterona proporciona un ensayo sensible y fiable para la
medición de la testosterona total en suero humano. El kit dispone de
una gama estándar de 0.1 a 18 ng/mL y determinará una concentración
mínima detectable de 0.06 ng/mL. El ensayo proporciona resultados en 2
horas en un formato de placa de microtitulación.
PRINCIPIO DE LA PRUEBA
La prueba de testosterona EIA está basada en el principio competitivo
entre la testosterona en la muestra y el conjugado de testosterona-HRP
por un constante aumento en la cantidad de anti-testosterona de conejo.
En la incubación los pozos recubiertos de cabra anti-IgG de conejo son
incubados con 10 µL de estándar de testosterona, controles, muestras
del paciente, 100 µL de testosterona-HRP reactivo conjugado con 50
µl de reactivo anti-testosterona de conejo y a 37º C por 90 minutos. Durante la incubación un aumento fijado de HRP-etiquetado de testosterona
establece una competencia con la testosterona endógena, en él estándar, muestra o control de calidad del suero para fijar un número de sitios
unidos en el anticuerpo específico de la testosterona. Esto, así como el
aumento del conjugado peroxidasa de Testosterona, inmunológicamente
se une en el micro pozo para determinar la concentración presente en
las muestras.
Las no-uniones del conjugado peroxidasa de testosterona son ahora removidas de los micro pozos por medio de los lavados. Al agregar el reactivo TMB, éste es responsable de dar el color azul en una incubación a
temperatura ambiente por 20 minutos. El desarrollo del color es detenido
al adicionar la solución de paro (HCl) y la absorbancia es medida a 450
nm. La intensidad del color que se forme es proporcional a la cantidad
de enzima presente e inversamente proporcional a la cantidad de testosterona en la muestra. La curva estándar es obtenida al graficar la concentración contra la absorbancia. La concentración de Testosterona de la
muestra y al correr los controles con el estándar, puede ser calculada de
la curva estándar.
REACTIVOS
Materiales abastecidos con el equipo de prueba
1. Placa de micropozos cubiertos de Cabra Anti-Conejo IgG con 96
pozos
2. Estándares de referencia de Testosterona, que contienen 0, 0.1, 0.5,
2.0, 6.0 y 18 ng/mL. Líquido. Listo para usarse
3. Reactivo Anti-Testosterona. 1 Frasco
Distribuido por:
DIAGNÓSTICA INTERNACIONAL S.A. de C.V.
Rudyard Kipling 4886 Col. Jardines de la Patria
CP 45110 Zapopan, Jalisco, México
Lada sin costo: 01 800 440 0404 c/ 10 líneas
Tel: 01 (33) 3770 1940 c/ 10 líneas
1
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
Reactivo Conjugado de Testosterona–HRP. 1 Frasco
Control de Testosterona 1. Listo para usarse
Control de Testosterona 2. Listo para usarse
Reactivo TMB. 1 Frasco
Solución de Paro. 1 Frasco
Solucion Buffer de lavado concentrado. 1 Frasco
Instructivo de uso
Materiales requeridos pero no abastecidos
1. Pipetas de precisión: 10 µL, 50 µL, 100 µL y 1.0 mL
2. Puntas para pipeta desechables.
3. Agua destilada o desionizada.
4. Mezclador Vórtex.
5. Papel absorbente o toalla de papel.
6. Lector de Microplaca.
ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES PARA LOS USUARIOS
1. Precaución: Este kit contiene material humano. El material de base
utilizado para la fabricación de este equipo fue negativo para HbsAg,
HIV1/2 y HCV por métodos aprobados por la FDA. Sin embargo,
ningún método puede garantizar por completo la ausencia de estos
agentes. Por lo tanto, todos los productos de la sangre humana, incluidas las muestras de sueros, deben considerarse potencialmente
infecciosas. Su manejo y disposición debe ser definida por una adecuada guía nacional de seguridad de riesgo biológico o regulación,
cuando ésta existe.
2. No utilizar los reactivos después de la fecha de caducidad y no mezclar o utilizar los componentes de kits con diferentes números de
lote.
3. No usar el reactivo cuando se sospeche de una contaminación de
este.
4. No utilizar los reactivos si algún frasco está dañado.
5. Coloque nuevamente las tapas de los reactivos inmediatamente de
su uso. No cambie las tapas.
6. Cada pozo puede ser utilizado una sola vez.
7. No pipetee los reactivos con la boca.
8. Soluciones que contienen aditivos y conservantes, tales como azida
de sodio, no deben ser utilizados en la reacción enzimática.
9. Evitar el contacto con HCl 1N. Puede causar irritación de la piel y
quemaduras. Si esto ocurre, lave con abundante agua y busque atención médica si persiste la irritación.
10. Para uso diagnóstico In vitro.
PREPARACIÓN DEL REACTIVO
1. Todos los reactivos deben encontrarse a temperatura ambiente (1825 ºC) antes de su uso.
2. Todos los reactivos deben ser mezclados por inversión suave o torbellino antes de su uso. No inducir la formación de espuma.
3. Las muestras con concentraciones esperadas de Testosterona arriba
de 18 ng/mL. Pueden ser cuantificadas por dilución, con diluyente de
testosterona.
4. Preparar la solución Buffer de lavado aforando, el liquido concentrado de solución buffer con agua destilada, multiplicando el valor de la
concentración marcada en el frasco contra el volumen indicado en el
mismo. Ejemplo: Concentración 50x, Volumen 20mL. 20x50=1000.
Por lo tanto se afora a 1000 mL para llegar a una concentración de
1x.
RECOLECCIÓN Y PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
1. Solo muestras séricas son usadas en este test.
2. Las muestras no requieren ningún pre-tratamiento.
3.
4.
Las muestras de suero deben de ser almacenadas de 2-8 ºC hasta
por 24 horas y deben ser congeladas a -10 ºC o menos para períodos
más prolongados. No use muestras hemolizadas densamente o con
lipemizado grueso.
Nota: Por favor, no use muestras que contenga azida de sodio en
éste ensayo.
PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO
1. Asegurar el número de pozos deseados en el soporte.
2. Agregue 10 µL de los estándares, muestras y controles en los pozos
apropiados.
3. Agregue 100 µL del Reactivo Conjugado de Testosterona HRP en
cada pozo.
4. Agregar 50 µL de Reactivo anti-testosterona de conejo en cada pozo.
5. Agite suavemente por 30 segundos. Es muy importante que el
mezclado sea completo.
6. Incube por 90 minutos a 37ºC.
7. Lave y enjuague la microplaca 5 veces con solucion buffer de lavado
(Por favor no use agua de la llave)
8. Agregar 100 µL de Reactivo TMB dentro de cada pozo. Mezclar cuidadosamente por 10 segundos.
9. Incubar a Temperatura ambiente (18-25ºC) durante 20 minutos.
10. Para detener la reacción agregue 100 µL de solución de Paro a cada
pozo.
11. Mezcle cuidadosamente por 30 segundos. Es importante asegurar
que todo el color azul cambie al amarillo completamente.
12. Lea la densidad óptica a 450 nm con un lector de micro pozos dentro
de un lapso de 15 minutos.
CÁLCULO DE LOS RESULTADOS
1. Calcule los valores de absorbancia media (A450) para cada juego de
estándares de referencia, control, y muestras del paciente.
2. Elabore una curva estándar al trazar la absorbancia media obtenida
para cada estándar de referencia comparada con su concentración
en ng/mL sobre el papel cuadrícula, con los valores de absorbancia
sobre el eje vertical (Y) y las concentraciones sobre el eje horizontal
(X).
3. Utilice el valor de absorbancia media para cada muestra para determinar la concentración correspondiente de Testosterona en ng/mL
desde la curva estándar.
4. En las muestras diluidas el resultado debe ser corregido por el factor
de dilución apropiado.
EJEMPLO DE CURVA ESTÁNDAR
Los resultados de una corrida estándar típica con lecturas de densidad
óptica a 450 nm mostradas en el eje (Y) contra las concentraciones de
Testosterona mostradas en el eje (X). Esta curva estándar es con el
propósito de ilustrar solamente, y no debe ser utilizada para hacer cálculos desconocidos. Cada usuario debe obtener sus propios datos y curva
estándar en cada experimento.
Testosterona (ng/mL)
Absorbancia (450 nm)
0
2.432
0.1
1.750
0.5
1.161
2.0
0.832
6.0
0.537
18.0
0.208
2
terona fueron combinados y ensayados por duplicado. La media de recuperación fue de 95.3%.
2.5
Absorbancia (450 nm)
2.0
# de par
Esperados
Testosterona
ng/mL
Observados
Testosterona
ng/mL
Recuperación
%
1
8.7
9.2
105.9
2
9.3
9.6
103.6
3
6.3
5.2
83.2
4
5.0
5.0
99.9
5
2.6
3.3
127.5
6
2.4
2.3
97.5
7
0.66
0.46
70.4
8
0.61
0.46
74.6
1.5
1.0
0.5
0.0
0
5
10
Testosterona Conc. (ng/mL)
15
20
VALORES NORMALES ESPERADOS
Cada laboratorio deberá establecer sus propios rangos normales según
la población de pacientes. La prueba de testosterona EIA fue seleccionada al azar de muestras clínicas de pacientes externos. Los resultados
de estas determinaciones son las siguientes:
Hombres:
Prepubertad (tardía)
Adulto 0.1- 0.2 ng/mL
3.0-10.0 ng/mL
Mujeres:
Prepubertad (tardía) Fase folicular Fase lútea
Post menopausia
0.1-0.2 ng/mL
0.2-0.8 ng/mL
0.2-0.8 ng/mL
0.08-0.35 ng/mL
Datos de la reactividad cruzada para diferentes endógenos y esteroides
farmacéuticos son resumidos en la siguiente tabla:
Reactividad Cruzada (%) =
CARACTERÍSTICAS DE RENDIMIENTO
SENSIBILIDAD
El nivel más bajo detectado de testosterona en esta prueba es de 0.05
ng/mL
PRECISIÓN
Precisión intra-ensayo
La precisión fue determinada dentro de la corrida por determinaciones de
4 muestras de suero diferentes en un ensayo. La variabilidad dentro del
ensayo es mostrada a continuación
MUESTRAS
1
2
3
4
# de replicas
24
24
24
24
Media Testosterona (ng/mL)
0.44
3.7
5.1
12.7
D.E.
0.03
0.4
0.4
0.6
C.V. %
6.4
10.0
8.3
5.0
Precisión inter-ensayo
La precisión fue determinada entre la corrida por la medición replicada de
6 muestras de suero diferentes sobre una serie de ensayos calibrados individualmente. La variabilidad entre la corrida es mostrada a continuación
MUESTRAS
1
2
ESPECIFICIDAD
Los siguientes materiales fueron revisados para la reactividad cruzada. El
porcentaje indicado de reactividad cruzada es de 50 % de desplazamiento
comparado con testosterona.
3
4
# de replicas
20
20
20
20
Media Testosterona (ng/mL)
0.45
3.4
5.0
13.3
D.E.
0.02
0.3
0.2
0.5
C.V. %
4.4
8.4
4.4
3.7
RECUPERACIÓN
Varias muestras de suero de pacientes con niveles conocidos de testos-
Conc. Testosterona Observada
Conc. Esteroides
X 100
Esteroide Reactividad-cruzada
Testosterona100%
Dihidrotestosterona
0.86%
Androstenediona
0.89%
Androsterona
1.0 %
17 β Estradiol
0.05%
Progesterona
<0.05%
Epitestosterona
<0.05%
17-OH-Progesterona <0.05%
Estriol
<0.05%
Cortisol
<0.05%
DHEA-Sulfato
<0.05%
APLICACIÓN CLINICA
Información citada de la referencia #7
HOMBRES
En hombres, la determinación de testosterona es utilizada como un indicador para la función de pruebas: bajos niveles hormonales han sido
encontrados en casos con sindrome de Klinefeter, criptorquidismo o anorquia. Hombres con deficiencia en testosterona con frecuencia presentan síntomas, tales como: disminución de líbido, disminución de la fuerza
muscular, gynecomastia e infertilidad.
MUJERES
1.- Desordenes:
La medición de la testosterona son utilizados frecuentemente en la evaluación de desordenes virilizantes. las concentraciones de testosterona
>2.0 ng/mL pueden indicar secreciones ovaricas andrógenas o neoplasma suprarrenal.
2.- Monitoreo de drogas supresoras de androgenos
La medición de la testosterona puede ser utilizada en mujeres para ajustes de drogas supresoras de andrógenos y sus dosis.
3
3.- Embarazo:
Concentraciones de testosterona son relativamente constantes durante
el embarazo.
LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO
1. Resultados confiables y reproducibles pueden ser obtenidos cuando
el procedimiento de la prueba se lleva a cabo con una comprensión
completa de las instrucciones del inserto del paquete y con la adhesión a las buenas prácticas de laboratorio.
2. El procedimiento del lavado es crítico. Un lavado insuficiente producirá una pobre precisión y las lecturas falsa de elevación de la
absorbancia.
3. Las muestras de para prueba en suero que muestran lipemia gruesa,
hemólisis densa, o turbidez no deben usarse con esta prueba.
4. Los resultados obtenidos del uso de este equipo deben ser usados
solamente como un coadyuvante a otros procedimientos de diagnóstico e información disponible al médico.
CONTROL DE CALIDAD
1. Las buenas prácticas de laboratorio requieren de controles que se
corran con curva de calibración. Un numero estadísticamente significativo deberá ser establecido con valores y rangos aceptables para
asegurar que se lleven acabo apropiadamente.
2. Nosotros recomendamos usar controles para inmunoensayos BioRad Lyphocheck. El equipo de testosterona solo provee controles
internos, nivel 1 y 2.
REFERENCIAS
1.
Chen A., Bookstein J.J., Meldrum D.R., Diagnosis of a testosterone-secreting
adrenal adenoma by selective venous catheterization. FI 1991. 55: 1202-1203
2.
Granoff A.B. and Abraham G.E., Peripheral and adrenal venous levels of steroids in a patient with virilizing adenoma. Obstet. Gynecol. 53: 111, 1979; 53:
111-115
3.
Bricaire C., Raynaud A., Benotmane A., Clair F., Paniel B., Mowszowicz I.,
Wright F., Moreau J.F., Kutten F., Mauvais-Jarvis P., Selective venous catheterization in Ildrogenism. J. Endocrinol Invest, 14(11): 949-956, 1991.
4.
Heinonen P.K., Androgen production by epithelial ovarian tumors in postmenopausal women. Maturitas, 13(2): 117-133, 1991.
5.
Tietz, N.W.: Clinical Guide to Laboratory Tests, Third Edition, pp. 578-580,
W.B. Saunders Company, Philadelphia, 1995.
6.
USA Center of Disease Control national Institute of Health manual “Biosafety
in Microbiological and Biomedical Laboratories”, 1984.
7.
ICN Guide to Endocrine Testing. Diagnostic Division, ICN Biomedicals, Inc.
pp. 2:33; 3: 4-6.
FABRICADO POR:
INTERNATIONAL IMMUNO-DIAGNOSTICS
1155 CHESS DRIVE No. 121
FOSTER CITY, CA 94404 USA
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