Biotecnología animal Métodos de transferencia de genes en
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¿Cual es el objetivo de realizar Biotecnología animal? A. Biotecnologí Biotecnología animal B. C. D. Se pueden generar animales modificados (“animales transgénicos”) para muchos propósitos, que sirvan de modelos a enfermedades humanas o introducir nuevos caracteres a animales importantes en producción como vacas o peces Métodos genéticos como selección asistida por marcadores (MAS) ayuda a identificar zonas en el cromosoma con caracteres importantes como crecimiento Los genes se pueden transferir a través de especies, familias e incluso reinos como resultado de tecnología del DNA recombinante Los principales objetivos de la biotecnología animal son razas que sean más nutritivas y animales económicamente más productivos, incrementen el crecimiento y desarrollo, así como anticuerpos y producción de vacunas Métodos de transferencia de genes en animales Métodos de transferencia de genes en animales Para insertar un gen correctamente en un animal, el gen (denominado el transgen) necesita expresarse en el momento adecuado y la cantidad y lugar adecuado del animal Promoters y secuencias reguladoras son esenciales El gen se debe incorporar al cromosoma para una expresión adecuada Microinyección 1. La inyección del gen de interés en un huevo fertilizado de un animal donador 2. El gen debe ser insertado antes que la primera división celular de tal modo que todas las células del animal contienen el gen 3. Los pasos en el proceso son: a. Identificació Identificación (y a veces modificació modificación por mutació mutación) de un gen de interé interés b. Inserció Inserción del gen de interé interés en el vector apropiado c. Microinyecció Microinyección del DNA dentro del pronucleo de un huevo fertilizado d. Implantació Implantación del huevo microinyectado en una madre de alquiler e. Permitir el desarrollo del embrió embrión hasta su nacimiento f. Demostració Demostración que el gen ha sido incorporado de manera estable en el genoma huesped y es heredado en la descendencia g. Demostrar que el gen se expresa y es correctamente regulado en el organismo del huesped 1 Transferencia génica de célula madre embrionaria 4. Animales fundadores, fundadores, que son los animales que tienen el nuevo gen en las cé células germinales (reproductivas (reproductivas)) se cruzan para establecer nuevas lí líneas gené genéticas con las caracterí características de interé interés 5. Se ha desarrollado la Microscopí Microscopía diferencial de interferencia de manera que el el nú nú cleo de los huevos son visibles para insertar en las madres lo antes posible 6. Problemas potenciales: potenciales: a. Sobreviven pocos huevos inyectados b. El gen se inserta al azar en los cromosomas c. No todas las cé células del animal reciben el gen d. El gen no se expresa lo suficiente 1. (ES) Células indiferenciadas que se dividen para producir células diferenciadas mientras mantienen sus características de indiferenciadas (llamadas células pluripotentes) 2. Células madre embrionarias “Embryonic stem (ES) cells” se usan para promover reemplazamiento génico dirigido (recombinación homóloga) de manera que el gen se inserta en el cromosoma adecuado 3. Los pasos son los siguientes: a. Células ES se extraen del embrión b. El gen de interés se inserta en las células (llamado “transfección”) c. El gen es dirigido por recombinación homóloga y marcadores de selección d. Las células ES con el gen adecuado se inyectan en embriones parcialmente desarrollados denominados “blastocitos”, que se implanta en una madre e. La descendencia es cribada por el caracter de interés 4. Se puede usar para modelos de enfermedades humanas como la enfermedad de Gehrig, cancer, Alzheimer, fibrosis cistica Problemas con recombinación homóloga Recombinación no-homóloga frecuente Solución: vectores de reemplazo La construcción KO contiene 1) Gen neoR Flanqueado por 2) 2 segmentos de gen objetivo y 3) El gen HSVtk Parte del gen se reemplaza con neoR Células ES se seleccionan por la integración NeoR y contra ka integración de HSVtk* (NeoR+/ HSVtk-) en ganciclovir 2 2 en 1 lg ge n Recombinación homóloga de to 5. en gm NeoR se se gm en to d el Vectores de reemplazo HSVtk Plásmido de reemplazo linearizado Integración al azar NeoR NeoR+/ HSVtk- Puede inactivar gene para monitorizar el efecto en crecimiento o para desarrollar tratamientos 6. Mutagé Mutagénesis dirigida en rató ratón a. Inserció Inserción de DNA en un lugar especí específico del cromosoma b. Genes se pueden tambié también inactivar (llamado (llamado KO) c. Los pasos en crear ratones KOs son: 1) Un gen se inactiva al eliminar una parte del gen e insertar un gene de resistencia a antibió antibiótico en su lugar. DNA homó homólogo donde la recombinació recombinación va a ocurrir flanquea ambos lados del marcador. . El DNA insertado tambié é n lleva un gen que marcador tambi produce la piel negra 2) El gen se transfiere a cé células madres embrionarias. embrionarias. La células contendrá contendrán dos copias del gen de interé interés y dos copias del de del gen de piel negra (en homozigosis) NeoR+/ HSVtk+ HSVtk convierte ganciclovir en una droga tóxida y mata células HSVtk+ 3) Las cé células se criban con antibió antibióticos para determinar la correcta inserció inserción del DNA 4) Las cé células madre embrionarias se transfieren a embriones de rató ratón tempranos 5) Los embriones se implantas en madres se permite su nacimiento 6) La descendencia tendrá tendrán piel blanca y negra, negra, siendo la piel negra un marcador para el gen eliminado. eliminado. Esto se llama una quimera, quimera, osea un rató ratón con cé células normales y cé células modificadas 7) La descendencia se cruzan con un rató ratón blaco y cualquier rató ratón completamente negro será será un rató ratón KO, conteniendo el gen inactivado en cada cé célula. lula. Esto muestra que el gen inactivado está está presente en todas las cé células d. El maí maíz KO se confirma para el gen diana por PCR Retrovirus y transferencia gé génica 1. Puede infectar a un animal de manera muy eficiente e integrar DNA en genomas 2. Usa RNA como genoma e infecta cé células sin matarlas 3. Durante al infecció infección el RNA se convierte en DNA por la enzima transcriptasa reversa. reversa. El DNA se integra en el genoma de la célula huesped expresá expresándose los genes víricos y formando el virus 4. Puede infectar diferentes tipos celulares con una sola copia de DNA, pero solo puede llevar pequeas candidades de DNA 5. Si el virus se usa como vector, el virus es inactivado eliminando los genes necesarios para el empaquetamiento y transcripció transcripció n reversa 3 Animales transgé transgénicos y sus aplicaciones A. Animales transgé transgénicos tiene genes eliminados (Knockout, KO) o genes añ añadidos (Knockin (Knockin,, KI) dependiendo de la aplicació aplicación del animal B. Ratones 1. Se usa como modelo para enfermedades humanas bien por KO del gen or reemplazando el gen normal con un gen mutado 2. Es posible usarlos como factorí factorías vivas: vivas: a. Productos transgé transgénicos como factor IX de coagulació coagulación en leche animal b. El gen de interé interés se debe expresar bajo un promotor especí específico de mamas c. Las proteí proteínas que se secretan en la leche son má más fá fáciles de aislar porque se pueden unir a la membrana plasmá plasmática de células de grasa producida en la leche Se pueden generar vacas con una mayor resistencia a enfermedades, enfermedades, reduciendo la cantidad de vacunas, vacunas, antibió antibióticos y visitas de veterinarios 4. Somatotropina bovina recombinante (rBST) ) ha sido aprovada como rBST droga animal y permite a las vacas incrementar la producció producción de leche hasta un 25%. La controversia es que aunque se ha probado que la rBST no es tó tóxica en humanos y las vacas no tienen mayor cantidad de proteí proteínas en su cuerpo D. Cerdos, Cerdos, Ovejas y Cabras 1. Modificadas por ingenierí ingeniería gené genética como bioreactores para producir proteí proteínas como factores VIII y IX de coagulació coagulación, hormona del crecimiento e interleukinas 2. Las proteí proteínas se pueden secretar en leche de ovejas y cabras sin efecto en los animales C. Vacas 1. Producidas por microinyecció microinyección de huevos siguiendo los pasos siguientes: siguientes: a. Coleccionar óvulos de terneras sacrificadas b. Maduració Maduración del óvulo in vitro c. Fertilizació Fertilización del óvulo in vitro d. Microinyecció Microinyección de DNA en el pronú pronúcleo masculino e. Desarrollar los embriones hasta el estadí estadío de blá blástula f. Cribar cé células de embriones es estadod de blá blástula por el gen insertado (transgen (transgen)) usando PCR g. Implantar los embriones en vacas recié recién fertilizada h. Nacimento de terneros 2. Ingenierí Ingeniería gené genética se usa en alterar composició composición de la leche para producir proteí proteínas humanas, humanas, como insulina, insulina, eritropoietina (EPO), y anticuerpos monoclonales 3. d. El mayor obstá obstáculo es impedir la respuesta inmune por el cuerpo humano. humano. Cerdos alterados gené genéticamente con antí antígenos de superficie modificados, modificados, y la producció producción de cerdos sin una copia del gen implicada en respuesta inmune e. La primera aplicació aplicación será será má más probablemente el transplante de isletas celulares porcinas productoras de insulina de cersos KO (que (que no producen insulina de cerdo) cerdo) para tratar diabetes. Corazó Corazón e hí hígado será serán los primeros órganos transplantados E. Revolució Revolución biotecnoló biotecnológica: gica: Humanizací Humanizacíon de tejidos y órganos de cerdos 1. PPL Therapeutics ha producido el primer cerdo clonado con un gen inactivado que codifica la enzima 1,3 galactosil transferasa (GT), que cataliza el movimiento de galactosa a la superficie de las células del cerdo 2. El sistema inmune humano, humano, que reconoce la galactosa en c élulas extrañ extrañas ataca cé células o tejidos con el azú azúcar, car, causando el rechazo de órganos 3. Cerdos transgé transgénicos tienen problemas como letargo, letargo, piel má más gruesa, gruesa, problemas de hígado, gado, úlceras y artritis El único éxito con cerdos ha sido con somatotropina de cerdo producida en E. coli y usado para tratar cerdos 5. Xenotransplante a. El uso de órganos animales en pacientes humanos b. Cerdos es el ánimal elegido puesto que son fá fácil de crecer y cruzar, cruzar, tiene órganos de tamañ tamaño similar al humano y pueden ser modificados gené genéticamente. ticamente. c. Preocupaciones sobre la tecnologí tecnología incluye aspectos éticos, ticos, uso de órganos animales en humanos, humanos, y enfermededes como retrovirus endó endógenos porcinos (PERV), similar a HIV, que se puede transmitir a humanos 4. 3. 4. Cerdos con KO en los dos genes GT se está están investigado, investigado, junto con cerdos enanos que con tienen PERV y son deseables para xenotransplantes Los receptores usados por el PERV para entrar cé células se han caracterizado, caracterizado, y un mé método de cribado se ha desarrollado para identificar si el PERV está está en cé células animales, animales, asegurando la inocuidad del xenotransplante 4 Aves 1. 2. 3. 4. Productos de granja como el pollo se puede mejorar disminuyendo el contenido de grasa y colesterol de los huevos Los huevos pueden servir como bioreatores para producir proteí proteínas valiosas a travé través de conseguir que secreten proteí proteínas valiosas dentro del huevo Los retrovirus son candidatos para la transfecció transfección de embriones en estado de blatodermos. blatodermos. Los problemas mayores es la inestabilidad del gen introducido y el pequeñ pequeño tamañ tamaño. La estructura del óvulo hace dificil la penetració penetración por microinyecció microinyección El uso de liposomas en un posible sistema de transformació transformación de células del blastodermo. blastodermo. Células transformadas se insertan en embriones del huesped debajo del espacio subgerminal para producir un animal quimé quiméricoL Propagación animal A. Inseminació Inseminación artificial 1. Permite animales de interé interés gené genético ser cruzados má má eficientemente, eficientemente, permitiendo el esperma diluido de un un toro ser inseminado entre 500 y 1000 vacas 2. Usado en ternero para incrementar la frecuencia de caracteres de interé interés 3. Ha incrementado la diversidad gené genética de animales en extinció extinción entre zooló zoológicos B. Clones animales 1. Clonació Clonación de germoplamas vivos (lifestocks (lifestocks)) ha sido comú común durante los últimos 20 añ años 2. Las cé células se pueden separar despué después de fertilizar (entre (entre 8 y 19 células), lulas), y los embriones se pueden desarrollar como gemelos. gemelos. Esto se ha intentado en humanos pero producen embriones defectivos y no se implantaron 3. Métodos de transferencia nuclear incrementa el nú número de descendientes de una hembra a cientos o miles a. La primera clonació clonación animal con éxito fué fué el de una oveja en 1986, pero los estudios se iniciaron en los 1950s, donde núcleos de cé é lulas en diferentes estados de desarrollo se c transfirieron a óvulos enucleados (sin nú núcleo) cleo) para estudiar el desarrollo de una rana leopardo b. La comercializació comercialización permite caracteres de interé interés ser propagados y mantenidos en organismos vivos, vivos, para aplicaciones en agricultura y medicina 5 4. Electrofusión La clonació clonación de Dolly a. Se realizó realizó en 1996 en el instituto Roslyn en Escocia y fue la primera vez que un animal fue clonado usando ccé élulas somá somáticas b. El m mé étodo usado fue: fue: 1) A ccé élulas de ovulo en metafase se les eliminó eliminó el n nú ú cleo 2) Una ccé é lula mamaria de oveja en cultivo se le eliminó eliminó los nutrientes para que entre en el ciclo estacionario G0 3) Las dos ccé élulas se fusionaron por choque el elé éctrico ((electrofusi electrofusió ón) 4) Las cé células que se desarrollaron en cultivo para formar un embri embrió ón se introdujeron en una madre preparada hormonalmente para implantació implantaci ón 5) El embri embrió ón se desarrolló desarrolló totalmente y el genotipado de DNA confirmó confirm ó que Dolly era un clon c. Dolly muri murió ó en 2003 de un cá cáncer de pulmó pulmón normalmente encontrado en ovejas de m má ás edad; edad; aná análisis de DNA demostró demostró que los tel teló ómeros eran m má á s cortos de lo normal d. La controversia permanece, permanece, no está está claro si Dolly fue clonada de una célula mamaria o de una ccé élula madre embrionaria. Se necesitaron 277 para clonar Dolly, lo que lo hace muy ineficiente http://www.brinkmann.com/pdf/cell_fusion.pdf Pulso de fusión Células se ponen juntas Fase de Heterokaryon: Producto de fusión núcleos distintos Fusión inducida por un pulso eléctrico 5. ¿por que armó armó tanto revuelo? revuelo? Porque clonar puede producir desarrollos importantes: importantes: a. Se puede estudiar los efectos ambientales en animales idé idé nticos b. La gené genética de las enfermedades puede estudiarse en má má s detalle c. Se puede estudiar la gené gené tica del desarrollo en má más detalle d. Animales modificados gené gené ticamente y clonados posteriormente pueden producir grandes cantidades de proteí proteínas terapé terapé uticas humanas en la leche 6. Ratones se clonaron en 1998 usando una inyecció inyecció n de nú cleo en óvulos enucleados, enucleados, y se han clonado cabras, cabras, conejos y gatos 6 Regulació Regulación de animales transgé transgénicos A. B. Mucho má más preocupació preocupació n pú pública de animales que de plantas transgé transgé ncias, ncias, debido a su efecto potencial en el medio ambiente, ambiente, el riesgo a la salud de consumir alimientos modificados gené genéticamente La crí crítica tiene preocupació preocupació n porque la FDA quiere regular animales modificados gené gené ticamente de la misma manera que drogas animales, animales, animales transgé transgénicos pueden ser aprovados demasiado rá rápido y sin la revisió revisió n del gobierno Patente de animales modificados gené genéticamente A. B. C. D. E. En 1930 el congreso de los EEUU aprobó aprobó el Acto de patentes, patentes, pero plantas no se patentaron hasta 1970. En 1987, la oficina de patentes de EEUU declaró declaró que organismos multicelulares no humanos que no ocurren normalmente, normalmente, incluyendo animales se pueden patentar Patentes, Patentes, trademarks, copyrights, y andtrade secrets se consideran propiedad intelectual y hay un gran debate por desarrollos en biotecnologí biotecnología en los últimos 15 añ años. os. Mucho debate se ha generado en patentes animales Se incluye interrogantes sobre posibles consecuencias de los usos comerciales de organismos patentados, patentados, incluyendo implicaciones medioambientales, medioambientales, la salud del animal modificado y efectos potenciales del proceso evolutivo Agricultores está están preocupados de patentes animales, animales, puesto que animales patentados pueden generar un menor nú número de granjas y más potentes y pequeñ pequeños granjeros no pueden tener la nueva tecnologí í a o animales tecnolog Discusió Discusiónes abiertas sobre aspectos éticos, ticos, sociales, sociales, y legales osn importatnes para asegura el progreso adecuado de la biotecnologí biotecnología 7
