clonación - Aula Virtual FCEQyN

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CLONACIÓN
Clonación
Producción de un gran número de copias
de una región de ADN (fragmentos o
genes) o de ADNc
Clonación
Celular
Acelular
Célula anfitriona
PCR
Secuenciación
Estudio de estructura de ácido nucleicos
Amplificación
Estudio de homología entre especies
Identificación de mutaciones; por ej. asociadas a
enfermedad
Objetivos
de la
clonación
Estudio del proceso de transcripción y
traducción
Estudio de regulación (promotores)
Expresión
Para su identificación
Producción de
proteína o ARN
(formas normales
o alteradas)
Para su estudio (propiedades función)
Para aplicarla (producción comercial),
diagnóstico, terapéutico, nutrición,
industria….
Ingeniería de proteína con alteraciones
de sus propiedades (para estudio o
aplicación)
Etapas
1.
2.
3.
4.
Preparación del inserto de ADN a clonar
Preparación del vector
Unión del fragmento de ADN al vector
Introducción del ADN recombinante en una
célula anfitriona
5. Propagación celular y selección del clon con el
gen de interés
6. Análisis del gen clonado
Preparación del inserto de ADN a clonar
Preparación del inserto de ADN a clonar
Preparación del inserto de ADN a clonar
ARNm
5´
---GAUUGCAAUCG----AAAAAAAA
Cebador oligo dT
5´
Cola poli A
---GAUUGCAAUCG----AAAAAAAA
3´
dNTPs
3´
TTTTTTTTT
3´
5´
Transcriptasa inversa
5´
3´
Hibrido ARNm:ADNc
---GAUUGCAAUCG----AAAAAAAA
---CTAACGTTAGC----TTTTTTTTT
CTPs
5´
3´
3´
5´
Transferasa terminal (añade al extremo 3´)
---GAUUGCAAUCG----AAAAAAAA
3´
CCCCC---CTAACGTTAGC----TTTTTTTTT
5´
Hidrólisis alcalina (degrada sólo el ARN)
ADNc monocatenario 3´
CCCCC---CTAACGTTAGC----TTTTTTTTT
Oligo dG + dNTPs
5´
DNApolI
GGGGG---GATTGCAATCG----AAAAAAAA
ADNc bicatenario
3´
CCCCC---CTAACGTTAGC----TTTTTTTTT
5´
DNA
recombinante
vector
Enzima de
restricción
ADN
Ligasa
* VECTORES
* ENZIMAS
* PREPARACIÓN DEL INSERTO
* METODO DE TRANSFORMACIÓN
* SELECCIÓN DE CLONES
Etapas
1.
2.
3.
4.
Preparación del inserto de ADN a clonar
Preparación del vector
Unión del fragmento de ADN al vector
Introducción del ADN recombinante en una
célula anfitriona
5. Propagación celular y selección del clon con el
gen de interés
6. Análisis del gen clonado
Vector de clonación
Un vector es una molécula de ADN de tamaño
pequeño, fácil de aislar y caracterizar, con
secuencia y mapa de restricción conocidos.
Deben ser fáciles de introducir en una célula
anfitriona y una vez allí deben tener capacidad
de REPLICACIÓN AUTÓNOMA.
Muchos sitios de restricción
Por lo menos un gen marcador que permita
distinguir cuales células llevan el ADNr
Vectores de clonación y de expresion
Vectores de clonación
Vectores de clonación
Plásmidos
lacZ’
polylinker
pUC18
2686pb
amp
ori
EcoRI
SacI
KpnI
SmaI
BamHI
XbaI
SalI
PstI
SphI
HindIII
Vectores de clonación
Plásmidos
DNA
recombinante
vector
Enzima de
restricción
ADN
Ligasa
* VECTORES
* ENZIMAS
* PREPARACIÓN DEL INSERTO
* METODO DE TRANSFORMACIÓN
* SELECCIÓN DE CLONES
Vectores de clonación
Virus
Vectores de clonación
Virus
Vectores de clonación
Quimeras: Cósmidos
Combina las ventajas de plásmidos y fagos
El fragmento plasmídico proporciona las
características de tamaño pequeño, circularidad,
un origen de replicación, sitios de restricción,
marcadores seleccionables y la propagación en
bacterias como si fueran plásmidos
El fragmento del fago proporciona las
secuencias cos que permite el
empaquetamiento en cápside vírica
Vectores de clonación
Cromosomas artificiales
BACs: contienen genes que reducen su
capacidad de copia, es mas estable y no
sufre reordenamientos
YACs: contiene secuencias de
centrómero, telómeros y un origen de
replicación.
Etapas
1.
2.
3.
4.
Preparación del inserto de ADN a clonar
Preparación del vector
Unión del fragmento de ADN al vector
Introducción del ADN recombinante en una
célula anfitriona
5. Propagación celular y selección del clon con el
gen de interés
6. Análisis del gen clonado
Unión del fragmento de ADN al vector:
Formación del ADNr
Etapas
1.
2.
3.
4.
Preparación del inserto de ADN a clonar
Preparación del vector
Unión del fragmento de ADN al vector
Introducción del ADN recombinante en una
célula anfitriona
5. Propagación celular y selección del clon con el
gen de interés
6. Análisis del gen clonado
Introducción del ADN recombinante en una
célula anfitriona
Célula anfitriona: procariota
Escherichia coli
Fácil de obtener
Fácil manipulación
Fácil de multiplicar
Se conoce su genética
Introducción del ADN recombinante en una
célula anfitriona
Célula anfitriona: eucariota
Mas difíciles de obtener y mantener, se utilizan con fines específicos como análisis
de la regulación génica y expresión de proteínas
Saccharomyces cerevisiae
Células individuales
Crecimiento rápido y económico,
manipulables
Organización eucariota
De interés biotecnológico por su capacidad
de expresión y maduración de proteínas
Métodos de introducción del ADNr
Etapas
1.
2.
3.
4.
Preparación del inserto de ADN a clonar
Preparación del vector
Unión del fragmento de ADN al vector
Introducción del ADN recombinante en una
célula anfitriona
5. Propagación celular y selección del clon con el
gen de interés
6. Análisis del gen clonado
Propagación celular y selección del clon con
el gen de interés
Detección y selección del clon con el gen de
interés
Métodos de hibridación
Métodos inmunoquímicos
Métodos genéticos o de selección fenotípica.
• Genes que codifican una proteína detectable
• Genes de resistencia a antibiótico
• Genes que complementan defectos nutricionales
Detección y selección del clon con el gen de
interés
Expresión génica
UN EJEMPLO….
¿Cómo hago para obtener una
secuencia de un gen desconocido?
Lacasa
5´
I
II
III
IV
3´
PCR-inversa
Genotecas
PREGUNTAS???
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