Tema 6: MÉTODOS PARA EL ESTUDIO DE HORMONAS 6.1. Radioinmunoanálisis. 6.2. Enzimoinmunoanálisis. 6.3. Fluoroenzimoinmunoanálisis. 6.4. Quimioluminoinmunoanálisis. INTRODUCCIÓN Para la determinación de hormonas y sus metabolitos pueden utilizarse diversos métodos: químicos, espectrofotométricos, cromatográficos. Los más utilizados son las técnicas inmunoquímicas: radioinmunoanálisis (RIA), enzimoinmunoanálisis (EIA), fluoroinmunoanálisis (FIA) y quimioluminoinmunoanálisis. 6.1. RADIOINMUNOANÁLISIS Es una técnica inmunológica propuesta en 1959 por Yallow y Berson, que tiene una gran aplicación en clínica. Permite la cuantificación exacta de compuestos biológicos presentes en el organismo en concentraciones tan bajas como ng/ml (nanogramo=10-9 g) o incluso de pg/ml (picogramo=10 -12 g), incluso hacerlo en mezclas con enormes cantidades y diversidad de materiales extraños, por lo que no es necesario purificar previamente la muestra. Fundamento: El radioinmunoanálisis se basa en una reacción antígeno-anticuerpo. Los anticuerpos deben ser específicos contra la substancia que queremos determinar, y tener una gran afinidad. La cantidad de anticuerpo añadida al análisis es limitada, e inferior a la cantidad de antígeno total. Por lo que va a quedar saturado con él. El antígeno es la hormona (de la muestra) que queremos determinar, (antígeno frío). Además del antígeno (hormona) presente en la muestra problema, se va a añadir una cantidad constante y conocida de antígeno pero marcado (antígeno caliente). Los antígenos marcados se forman sustituyendo algunos de los átomos normales del antígeno por los correspondientes isótopos radiactivos (H3 =tritio, P32 ), o introduciendo radioisótopos extraños en la molécula (yodo=I125 unido a un resto de TYR). Los dos tipos de antígenos, frío y caliente, van a competir, en igualdad de condiciones, por unirse con el anticuerpo disponible. Las concentraciones del antígeno marcado y del anticuerpo son constantes, la única variable del sistema es la concentración de antígeno no marcado (muestra problema). Cuanto mayor sea la cantidad de antígeno frío en la muestra problema, este desplazará al antígeno caliente y por tanto se fijarán al anticuerpo cantidades menores de antígeno marcado. 1 Así pues, la formación de complejos radiactivos (Ag*-Ac) varía en función de la concentración del antígeno no marcado: a mayor concentración de antígeno no marcado, mayor formación de complejos antígeno-anticuerpo no marcados, y menor formación de complejos radiactivos, y viceversa. Separación de las fases ligada y no ligada Tras la reacción antígeno-anticuerpo, en el tubo de reacción encontraremos: • • las fracciones libres, constituidas por antígeno frío y antígeno marcado las fracciones ligadas formadas por complejos antígeno-anticuerpo y antígeno marcado -anticuerpo. Sin embargo, la radiactividad total en el tubo permanece constante antes y después de la reacción, por lo que hay que separar la fase ligada de la no ligada y contar la radiactividad en una de ellas, sin interferencia de la otra. Hay diferentes métodos de separación están basados en las distintas propiedades del antígeno libre y del complejo antígeno-anticuerpo: • • Adsorción: Con carbón activo, dextrano o resinas. Adsorben (se unen) específicamente la fase libre (antígenos frío y caliente) pero no se unen a los complejos antígeno-anticuerpo que quedarían en solución. Tras centrifugación, el carbón sedimenta en el fondo del tubo con la fase no ligada mientras que la fase ligada queda en el sobrenadante, que se aspira o decanta. Este método se utiliza cada vez menos. Precipitación química: Hay substancias como el etanol, el propilenglicol o el sulfato amónico que alteran la solubilidad de las proteínas provocando su precipitación. Precipitan los complejos ligados. Tras centrifugación, quedan los complejos ligados en el sedimento y la fracción libre en el sobrenadante, que se elimina por aspiración o decantación. • Precipitación inmunológica: Se utiliza un segundo anticuerpo contra el anticuerpo del sistema. La unión del segundo anticuerpo al complejo antígenoanticuerpo da lugar a un complejo de gran tamaño, en general insoluble y fácilmente precipitable. Tras incubación y centrifugación, la fase libre queda en el sobrenadante y se separa por aspiración o decantación. Este método es muy utilizado en RIA. • Fase sólida: Consiste en inmovilizar al anticuerpo a un soporte sólido, que puede ser la propia pared del tubo, bolitas de vidrio, partículas de Sephadex (polímero). La separación se consigue simplemente aspirando el medio de incubación. Este método tiende cada vez más a utilizarse por ser sencillo, práctico, más corto y requiere menos manipulación, e incluso permite su automatización. Una vez separadas las fases, normalmente, se lee la radiactividad de la fase ligada utilizando un contador gamma (γ), si el isótopo utilizado para el marcaje es I125 , o un contador beta (β) en el caso de haber marcado con tritio (3 H). Un contador de centelleo no detecta directamente la presencia de un radioisótopo sino que la muestra radiactiva se halla dispersa en el centelleador. El centelleador es un líquido (líquido de centelleo) con propiedades fluorescentes. Como consecuencia de las desintegraciones radiactivas se excitan las moléculas del líquido de centelleo y emiten fluorescencia que es detectada en el contador. 2 Construcción de la curva patrón Para poder relacionar los valores de radiactividad obtenidos con la concentración de hormonas, hay con construir una curva patrón que relacione estos parámetros. La curva patrón se prepara al mismo tiempo que el análisis de las muestras problema, aplicando la técnica a una serie de tubos que contienen cantidades conocidas de la hormona a determinar (antígeno no marcado patrón) y las mismas cantidades de antígeno marcado y de anticuerpo que se usan en el análisis: • • En el primer tubo no hay antígeno no marcado, por lo que todos los centros de unión del anticuerpo serán ocupados por el antígeno marcado. A este punto de máxima unión del antígeno marcado se llama B0 o Bmáx , que representa la radiactividad máxima que se puede unir. Los siguientes tubos tienen concentraciones conocidas cada vez mayores de hormona, a mayor concentración de antígeno no marcado menor formación de complejos antígeno marcado -anticuerpo, ya que ambos antígenos compiten por unirse al anticuerpo. Los resultados obtenidos nos permiten construir una curva patrón representando gráficamente la radioactividad obtenida (ó el % sobre Bo) en estos tubos (eje de ordenadas, eje Y).frente a las concentraciones conocidas de antígeno no marcado contenida en cada uno de los tubos (eje de abscisas, eje X). Ejemplo de curva patrón: (100 de Ag*) Ag frio % Ac-Ag * 100% 25 50 100 200 400 700 900 1900 50% 500 1000 1500 2000 %AcAg* 80 % 67 % 50 % 33 % 20 % 13 % 10 % 5% Ag frío La conc entración de hormona en las muestras problema se calcula interpolando en esta curva patrón la medida de radiactividad obtenida para cada tubo problema. La curva patrón se puede representar gráficamente como una recta utilizando un papel semilogarítmico, lo que facilita la lectura de los resultados. Como en cualquier método analítico, hay una variabilidad experimental debida a numerosos factores (reactivos, aparatos, operador, etc.) por lo que es frecuente que todas las determinaciones se hagan por duplicado. Si los resultados obtenidos son similares, el resultado final se calculará como la media aritmética de los dos valores. Tanto los contadores beta como gamma, en la actualidad, disponen de programas informáticos para cada una de las determinaciones hormonales, por lo que son capaces de hacer todos los cálculos de forma automática, representar la curva 3 patrón, y leer en ella los problemas, mostrando directamente los resultados finales del análisis. ENZIMOINMUNOANÁLISIS (EIA) Son técnicas inmunoquímicas cuantitativas basadas en reacciones antígenoanticuerpo como en el RIA, y siguiendo un protocolo experimental similar. La diferencia consiste en que, en este caso, el marcaje se hace con un enzima en vez de con un isótopo radiactivo. Se puede marcar tanto el antígeno como el anticuerpo (hay distintas estrategias). La cuantificación se hace, por tanto, basándose en la medida de la actividad del enzima marcador. Tras la formación del complejo antígeno-anticuerpo, en el momento adecuado, se añade un sustrato que es catalizado por el enzima transformándose en un compuesto coloreado lo que permite la medida de la actividad enzimática con ayuda de un espectrofotómetro. Esta medida de la actividad nos servirá para calcular la concentración de la molécula problema. Al igual que en el cado del radioinmunoanálisis es necesario elaborar una curva patrón. Con objeto de aumentar la sensibilidad de este análisis es frecuente utilizar el sistema biotina-streptavidina, que actúa como mecanismo multiplicador. Así, por ejemplo, el anticuerpo está unido a varias moléculas de biotina (vitamina). Cada molécula de biotina se une específicamente a varias moléculas de estreptavidina (similar a la avidina de huevo, pero de origen bacteriano y mayor afinidad). El enzima está unido a la streptavidina. De esta forma se consigue un efecto multiplicador de la señal. (Ej. 3 moléculas de biotina por anticuerpo x 4 moléculas de streptavidina, cada una con un enzima, se unen a cada molécula de biotina= 12enzima en vez de una). Las técnicas enzimáticas presentan numerosas ventajas respecto al radioinmunoanálisis (RIA): • no utilizan compuestos radiactivos lo que facilita la manipulación y evita la necesidad de instalaciones y licencias específicas) • reactivos de larga duración • posibilidades de automatización (estaciones automáticas ELISA) • gran sensibilidad Los EIA pueden ser de dos tipos: homogéneos y heterogéneos. • Los ensayos homogéneos no requieren lavado o separación física de las sustancias reaccionantes antes de medir la actividad enzimática. • Los ensayos heterogéneos sí necesitan la separación física de los reaccionantes en las fracciones libre y ligada antes de la determinación de la actividad del enzima marcador. 4 EIA homogéneo No requiere la separación de las fracciones ligada y libre resultantes de la reacción inmunológica. Los reactivos necesarios son el anticuerpo y el antígeno marcado con el enzima. Fundamento: Se basa en la competencia por el anticuerpo entre la sustancia problema y la marcada con el enzima. • Cuando el antígeno marcado se une al anticuerpo, este impide el acceso del sustrato al centro activo del enzima, por lo que anula su actividad. • A mayor concentración de la molécula problema, menor cantidad de antígeno marcado se unirá al anticuerpo, quedando mayor cantidad de antígeno marcado libre con el enzima activo dando una mayor actividad. En resumen, a mayor concentración mayor actividad, sin necesidad de separar las fracciones. EIA heterogéneo Requiere la separación de las fracciones ligada y libre resultantes de la reacción inmunológica. En esta modalidad, los reactivos son el anticuerpo y el antígeno marcado con el enzima. Fundamento: El antígeno de la muestra problema y el marcado compiten por el anticuerpo, de forma que cuanto mayor sea la cantidad de antígeno presente en la muestra problema, mayor cantidad de antígeno marcado con el enzima quedará sin unirse al anticuerpo. En este caso la actividad del enzima no se anula por la unión antígeno-anticuerpo. Se separan los complejos antígeno (marcado y no marcado)-anticuerpo, se añade el sustrato del enzima para que se produzca la reacción enzimática y se mide su actividad. La actividad será inversamente proporcional a la cantidad de antígeno en la muestra. ELISA Hay una variedad del EIA en la que se utiliza una fase sólida como método de separación, lo que es lo más habitual, recibe el nombre de ELISA (enzyme linked immunosorbent assay). ELISA tipo sándwich de antígeno Es la variedad de ELISA más utilizada y que da mejores resultados. Reactivos: Anticuerpo monoclonal ligado a la fase sólida, anticuerpo monoclonal marcado con el enzima. Se usan dos anticuerpos monoclonales diferentes contra determinantes distintos del mismo antígeno, lo que permite que los dos se puedan unir al antígeno al mismo tiempo, pero por sitios diferentes. Los anticuerpos específicos se encuentran en exceso unidos a la fase sólida (V.g. la pared del tubo de análisis), de forma que toda la hormona presente en la muestra problema reacciona con ellos quedando inmovilizada. A continuación se lava el tubo para eliminar el resto de moléculas sin interés (no unidas). Se añade un exceso de anticuerpos marcados con el enzima. Estos anticuerpos también se unen al antígeno del complejo inmovilizado, 5 pero por otro determinante antigénico diferente. Tras otro lavado que elimina el exceso de anticuerpo marcado no unido, se añade el sustrato y se cuantifica la reacción. La formación de producto será directamente proporcional a la concentración de antígeno en la muestra. FLUOROINMUNOANÁLISIS (FIA) Esta técnica sigue un protocolo básicamente igual al descrito para EIA, con la diferencia de utilizar como marcador una molécula fluorescente o un sustrato que por la acción de un enzima se transforma en una molécula fluorescente. La lectura de fluorescencia es utilizada para el cálculo de los resultados en la misma forma que en RIA. NOTA: Las moléculas fluorescentes son aquellas que al ser excitadas por una radiación con una longitud de onda determinada, inmediatamente emiten una radiación con una longitud de onda mayor que es medida por un espectrofluorímetro. (fluorescencia es distinto que fosforescencia) QUIMIOLUMINOINMUNOANÁLISIS Esta técnica sigue un protocolo básicamente igual al descrito para EIA, con la única diferencia de utilizar como enzima ligada un enzima (ej. peroxidasa) que cataliza la oxidación de un sustrato adecuado (ej. luminol + peróxido de hidrógeno). Este sustrato , al oxidarse, alcanza un estado de excitación electrónica, y al volver posteriormente los electrones a sus órbitas primitivas de menor energía, emiten la diferencia en forma de energía luminosa (=luminiscencia).Esta energía luminosa es medida en un luminómetro. La lectura de luminiscencia es utilizada para el cálculo de los resultados en la misma forma que en RIA. Preguntas de revisión 1. ¿Qué reactivos se utilizan para hacer un radioinmunoanálisis? 2. Al realizar un radioinmunoanálisis, ¿por qué es necesario separar las fases libre y ligada? 3. ¿Cómo realizaría una curva patrón? 4. Imagine que está evaluando la concentración de una hormona por radioinmunoanálisis y considerando que está detectando únicamente la radiactividad debida a la fase ligada ¿esperaría obtener más señal en una muestra con más o con menos cocentración de hormona? Justifique su respuesta. 5. ¿En qué consiste un enzimoinmunoanálisis? 6. ¿Cuál es la diferencia entre el enzimoinmunoanálisis homogéneo y el heterogéneo? 7. ¿Cuál es el fundamento de dicha diferencia? 8. Cuando se realiza un enzimoinmunoanálisis tipo sándwich de antígeno, el anticuerpo que se utiliza ¿debe estar en exceso o en defecto frente a la concentración de antígeno? ¿por qué? 9. ¿Cuál es la molécula marcadora en el fluorinmunoanálisis? ¿con qué aparato se detecta dicha señal? 10. En el quimioluninoinmunoanálisis es muy frecuente utilizar luminol, peróxido de hidrógeno y peroxidasa. Comente el papel que desempeña cada uno estos reactivos. 6