fcs456d - Tesis Electrónicas UACh

UNIVERSIDAD AUSTRAL DE CHILE
Facultad de Ciencias
Escuela de Química y Farmacia
“Determinacion en ratones, del efecto inmunosupresor del
principio activo 14-Deoxiandrografolido (14 –DAP), de
Andrographis Paniculata”
Tesis de Grado presentada como parte de los requisitos para optar al Título de
Químico Farmacéutico.
Profesor Patrocinante: Sr. Rafael Burgos A. - Instituto Farmacología – Facultad de
Medicina Veterinaria.
Karina Pamela Seguel Poblete
Valdivia Chile 2004
Profesor Co-Patrocinante
Sr. Juan Hancke O. - Instituto de Farmacología – Facultad de Medicina Veterinaria.
Agradecimientos
En primer lugar y en forma muy especial, quiero agradecer al Doctor Rafael Burgos por toda la
ayuda y el apoyo, además de su buena disposición y paciencia para resolver todas mis dudas que
me abordaron durante la realización de mi tesis.
2
A todas las personas que me ayudaron en realizar la parte practica de mi tesis, por su gran apoyo
técnico. A el Instituto de Inmunología y el Instituto de Farmacología , por prestarme sus
dependencias para ejecutar mis experimentos.
A mi madre, Elizabeth por estar siempre a mi lado apoyándome, por exigirme y demostrarme
que todo se puede lograr si pones todo de tú parte. A mi padre, Adolfo por todo el trabajo y sus
esfuerzos para darme una educación superior, que me permita valerme en el futuro. A mi
hermana, Catherine por poder contar siempre con ella y darme su constante apoyo. Y a mi amiga
Katy por su buena disposición y por el tiempo que se dio en estos últimos momentos que necesité
de su ayuda.
Finalmente agradezco a Dios por darme la fortaleza para lograr una de las más importantes
metas de mi vida.
FUENTE DE FINANCIAMIENTO: PROYECTO FONDEF DO111024
Dedicatoria
“Las ciencias tienen las raíces amargas, pero muy
dulce los frutos”.
(Aristóteles).
A mis padres y hermana
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ABREVIATURAS
ºC
CO2
Con A
c.s.p
ELISA
ERK
H2O
H2O2
H2SO4
IL-2
IL-4
INF-γ
JNK
MAP quinasa
mg.
Ml
M
MHC
NK
Nm.
PBS
Pg
Perk
PLC-γ1
PKC
SBF
rpm
TMB
Μg
Μl
μM
Grados Celsius
Dióxido de carbono
Concanavalina A
cantidad suficiente para
Ensayo inmuno-absorción unido a Enzima
Extra celular receptor-activated Kinasa
Agua
Peróxido de hidrógeno
Acido sulfúrico
Interleuquina –2
Interleuquina –4
Interferón –gamma
Quinasa N- Terminal de C- jun
Quinasas de proteínas activadas por mitógeno
Miligramos
Mililitros
Molar
Complejo mayor de histocompatibilidad
Natural killer ( células asesinas naturales )
Nanometros
Buffer salino fosfato
Picogramos
Fosfo ERK
Posfolipasa C isoforma -γ1
Proteína quinasa C
Suero fetal bovino
Revoluciones por minuto
Tetrametilbenzidina
Microgramos
Microlitros
Micromolar
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RESUMEN
En la presente Tesis se estudió el efecto del 14–deoxiandrografolido (14 -DAP), un componente
de Andrographis paniculata, en la producción de citoquinas. Para éste propósito, un grupo de
ratones de la cepa “Rockefeller” fueron sacrificados y se le extrajo células de ganglio linfático,
las cuales fueron cultivadas con 14-DAP en presencia o en ausencia de Concanavalina A (Con
A), una lectina mitogenica. Posteriormente en el sobrenadante de células linfoides se determinó
la producción de citoquinas Th1 y Th2 por ELISA “Sándwich”.
Además, se evaluó la
viabilidad celular por medio de la Tinción con Azul de Tripan y se determinó la actividad de la
MAP quinasa ERK1/2, mediante Western Blotting.
Los resultados obtenidos mostraron que 14 -DAP “in vitro” disminuye la producción de INF-γ,
una de las citoquinas Th1. No se evidencio ninguna influencia del compuesto sobre la producción
de IL-2. En cuanto a la producción de IL-4, una importante citoquina Th2 no se vio afectada por
éste compuesto en los diferentes experimentos. Además se observó que 14-DAP no influyó en la
viabilidad celular y a una concentración de 10μM produjo una inhibición en la actividad MAP
quinasa ERK1/2 inducida por Con A.
De estos resultados podemos concluir que 14-DAP disminuye la actividad de las células Th1,
disminuyendo la respuesta inmune celular. Por otro lado, 14-DAP no afecto a la citoquina Th2
que participa en la generación de la respuesta inmune humoral. El mecanismo, por el cual se
produce tal disminución involucraría
en parte vías de transducción de señal que lleva a la
activación de MAP quinasa, por lo que, no se descartaría que otras vías de transducción de señal
estén involucradas.
SUMMARY
In the present Thesis the effect of 14-deaoxyandrographolide (14-DAP), a component of
Andrographis paniculata, in the cytokine production was studied. For this purpose, a group of
stump mice "Rockefeller" was sacrificed and lymphatic ganglion cells were extracted, which
were cultivated with 14-DAP in presence or absence of mitogenic lectin Concanavalin A(Con A).
5
Then in the supernatant of lynphoid cells the production of cytokine Th1 and Th2, was
determined by ELISA "Sándwich". The cellular viability was also evaluated by means of the
Tripan Blue and the activity of MAP kinase ERK1/2 was determined, using Western Blotting.
The results showed that 14-DAP “in vitro” decreases the production of INF-γ, one of the Th1
cytokine. No effect of the compound on the production of IL-2 was observed. The production of
IL-4 (an important Th2 cytokine), was not affected by this compound in the different
experiments. Furthermore, 14-DAP didn't influence cellular viability and at a concentration of
10μM produced an inhibition in the activity MAPkinase ERK1/2 induced by Con A.
We can conclude that 14-DAP decreases the activity of the Th1 cells, decreasing the cellular
immune response. On the other hand, 14-DAP did not affect the Th2 cytokine that helps in the
generation of the response immune humoral. The mechanism, by which this decrease takes place
would involve partly signals that activate MAP kinase. Therefore, other signal transduction
pathways cannot be discarded.
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1. INTRODUCCION
El sistema inmunológico
ha evolucionado hasta convertirse en un mecanismo de defensa
extraordinariamente complejo en los organismos superiores. Este sistema defensivo tiene la
particularidad de responder en forma especifica, ante la aparición de agentes extraños,
denominados antígenos que una vez que ingresan al organismo son neutralizados y eliminados.
(Roitt et al, 1997).
Al entrar un antígeno a un organismo ocurre una serie de eventos que están relacionados entre sí .
El antígeno es atrapado y destruido por células con gran capacidad de fagocitosis (células del tipo
granulocíticos y macrofágicos derivados de los monócito) que se encuentran en todos los tejidos
del organismo, en especial en los órganos linfoides como el bazo, nódulos linfáticos, tejido
linfoide asociado a mucosas y otros órganos de filtración como el hígado. Los macrófagos no
sólo atrapan y destruyen los antígenos, sino que también están encargados del procesamiento de
antígeno para ser presentado a los linfocitos T. Este procesamiento consiste en la ingestión del
antígeno, su inclusión en un fagolisozomas, su transformación en péptido (que tiene ocho a
catorce aminoácidos de longitud) que más tarde son armados (ensamblados) con moléculas de
complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) propios (Goodman y Gillman, 1996) y su
expresión en la membrana plasmática. Produciéndose de esta forma un reconocimiento doble de
antígeno peptídico procesado y de las moléculas de MCH propios por el receptor de las células T
(TCR ), las que bajo la influencia de las citoquinas secretadas por los monócitos ( monoquinas ),
se activan dividiéndose y produciendo diversas citoquinas que hacen posible tanto la respuesta
inmune humoral como la respuesta inmune celular.
En los organismos superiores la respuesta inmune especifica está compuesta por 2 mecanismo
principales: inmunidad celular e inmunidad humoral (por anticuerpos), ambas poseen un alto
nivel de especificidad orientada a cualquier antígeno. La respuesta inmune celular está mediada
por linfocitos T y la repuesta inmune humoral por linfocitos B. La respuesta por parte de los
linfocitos T (CD 4+), con la generación de citoquinas, es una condición necesaria para que se
originen los otros componentes de la respuesta inmunitaria, que son los linfocitos T citolíticos y
7
la respuesta de anticuerpo (respuesta humoral), por lo tanto los linfocitos T (CD 4 +), han sido
denominados linfocitos T “helper” ( Goodman y Gillman, 1996 ). Los linfocitos T “helper”
(CD4+) se pueden diferenciar en linfocitos Th1 y linfocitos Th2, cuyo patrón de diferenciación
esta determinado por los estímulos presentes de manera precoz durante las respuestas
inmunitarias, teniendo los linfocitos Th1 como principales funciones efectoras la activación de la
respuesta inmune celular (Flech y Kaufman, 1989) específicamente activación de macrófagos.
Por otra parte, los linfocitos Th2 tienen como principal función efectora la estimulación del
crecimiento y diferenciación de los linfocitos B, modulando en forma positiva la respuesta
inmune humoral (Abbas et al, 2002).
Las citoquinas son proteínas (generalmente glucoproteínas) de peso molecular relativamente
pequeña (Roitt et al, 1997) que son producidas frente a un estimulo y que cumplen un rol como
reguladores y promotores del crecimiento de la respuesta inmune (Palomo et al, 1998). Con
respecto a la nomenclatura utilizada para clasificar las citoquinas, generalmente se basan en que
muchas de éstas son producidas por los leucocitos (p. ej macrófagos, células T) y que actúan
sobre otros leucocitos, recibiendo entonces el nombre de Interleuquinas (IL), éste termino ha sido
útil debido a que a medida que se caracterizan nuevas citoquinas, desde el punto de vista
molecular se les asignan un número por ej: IL –1, IL-2, etc, permitiendo mantener de esta forma
una nomenclatura normalizada. Entre las citoquinas más importante en el desarrollo de la
respuesta inmune se encuentran principalmente IL-2, IL-4 e INF -γ.
La IL-2 es secretado generalmente por linfocitos Th1, constituye para los linfocitos T un
importante factor de crecimiento autocrino (Abbas
et al, 2002), también contribuye a la
diferenciación de las células T CD8+ a linfocitos T citolíticos (CTL) en conjunto con el INF -γ (
Fong y Mosmann , 1990 ). En cuanto a INF -γ, también es secretado por células asesinas
naturales (NK), esta citoquina actúa sobre los macrófagos aumentando la fagocitosis y
la
destrucción de microorganismos; sobre los linfocitos B estimula la producción de anticuerpo IgG;
aumenta la expresión del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) e induce la
diferenciación de los linfocitos T CD 4+ a Th1. IL-4 es secretado por linfocitos Th2 (Penix et
al; 1996), ésta citoquina tiene como función inducir la activación y diferenciación de las células
8
B dando lugar a la producción de Ig G1 e Ig E, adicionalmente actúa como factor de crecimiento
y diferenciación de los linfocitos T CD 4+ a Th2.
Desde la producción de éstas y otras citoquinas por las células T en respuesta a un antígeno , es
predominantemente regulada a nivel de transcripción, siendo esto esencial en la regulación de la
respuesta inmune. Por lo tanto, el reconocimiento de este antígeno por los receptores de la células
T (TCR) inicia una secuencia de señalas bioquímicas en las células T que dan lugar a la
activación transcripcional de determinados genes que codifican muchas de las proteínas
(citoquinas) que median las repuestas biológicas de estas células. Existen cuatro vías de
transducción de señal diferentes iniciadas por la unión del antígeno al TCR que conducen a la
activación de cuatro tipos de enzimas, una vía Ras, que activa una cascada
de enzimas
denominadas quinasas de proteínas activadas por mitógeno (MAP quinasa) que conduce
finalmente a la activación de ERK 1 y ERK 2; una vía Rac que conduce a la activación de la
JNK; una vía dependiente de PLC γ1-Ca+2 que conduce a la activación de la Calcineurina y una
vía dependiente de PLC γ1- DAG que lleva a la activación de la PKC. A su vez estas enzimas (la
fosfatasa calcineurina, PKC, ERK, JNK) contribuyen a la activación de los factores de
transcripción, las cuales son: El factor nuclear de las células T activadas (NFAT; de ingles
nuclear factor of activated T cells ); la AP-1 (proteína de activación –1) y el factor nuclear κB
(NF-κB), estos factores de transcripción finalmente actúan potenciando la expresión génica de
las citoquinas en las células T estimuladas (Abbas et al, 2002 ).
La magnitud de la respuesta frente a un determinado estimulo antigénico depende de varios
factores, algunos dependen del antígeno y otros dependen del huésped. En éste ultimo grupo
adquiere especial relevancia la regulación inmune a cargo de las células Th1 y Th2. Estas
poblaciones de linfocitos secretan citoquinas que activan a un tipo particular de respuesta, es
decir, las Th1 activan la respuesta inmune celular y las Th2 activan la respuesta inmune humoral.
Las citoquinas secretadas tanto por los linfocitos Th1 y Th2 envían señales positivas, a cada una
de estas ramas de la respuesta inmune y por otro lado antagonizan a la población de células T
contrarias, generalmente de esta manera la respuesta inmune resultante es predominantemente
celular o predominantemente humoral, que es lo que hoy conocemos como “polarización de la
respuesta inmune”. Al respecto se sabe que frente a infecciones por microorganismos
9
intracelulares (virus y algunas bacterias) la respuesta inmune celular comandada por Th1, es
fundamental , pero a su vez muchas enfermedades autoinmunitarias específicas del organismo y
reacciones inflamatorias como los granulomas se deben a una activación excesiva de las células
Th1. Por otro parte, las células Th2 son responsables de la defensa frente a las infecciones por
helmintos y antrópodos y de las reacciones alérgicas.
De acuerdo a lo expuesto resulta de gran interés práctico poder modular la eficiencia del sistema
inmune, y contar con herramientas más eficientes para estimular o suprimir selectivamente la
respuesta inmune celular o humoral. Como en la actualidad existen pocos fármacos disponibles
en el mercado que disminuyan la respuesta inmune en aquellos casos que esta es indeseable (
transplante de órganos y trastornos autoinmunitarios ), es de gran importancia encontrar nuevos
inmunosupresores potenciales, que no produzcan infecciones ni sean un factor de riesgo en la
formación de linfomas y canceres similares.
Andrographis paniculata es una planta medicinal perteneciente a la familia Acanthaceae (Gupta
et al, 1990), originaria de Asia, principalmente de China, India y Corea (Zhang y Tan, 1998), en
China esta planta es conocida como Chuan Xin Lin y es medicada para el tratamiento de
disentería bacteriana (Calabrese et al, 2000), meningitis, hepatitis aguda, enfermedades
cardiovascular y muchas otras condiciones inflamatorias agudas (Chang et al, 1991). 14-DAP,
una lactona diterpénica que se encuentra en altas concentraciones en Andrographis paniculata
(Thamlikitkul et al, 1991) y que es extraído de la parte aérea por medio de solución alcohólica o
alcalina, podría ser una nueva alternativa terapéutica en el caso de rechazo de órganos
transplantados y en tratamientos de enfermedades autoinmunitarias. Por lo tanto, se tiene como
propósito de esta investigación estudiar el efecto del 14-DAP, en la producción de citoquinas tipo
Th1 y Th2.
En base a lo antes expuesto se ha formulado la siguiente Hipótesis de trabajo:
“El principio activo 14-DAP inhibe la actividad de las células Th1 y por lo tanto es capaz de
disminuir la respuesta inmune celular ”.
Teniendo como objetivo general:
10
“Evaluar el efecto inmunosupresor de 14-DAP en células de ganglio de ratón”.
Y como objetivos específicos, los siguientes:

Determinar si 14-DAP disminuye la respuesta inmune

Determinar si 14-DAP inhibe la producción de citoquinas tipo Th1 (IL2, INF-γ) en células de
ganglio de ratón estimuladas o no con Concanavalina -A.

Determinar si 14-DAP inhibe la producción de citoquinas tipo Th2 (IL4) en células de
ganglio de ratón estimuladas o no con Concanavalina -A.

Evaluar la viabilidad de las células de ganglio de ratón cultivadas con 14-DAP y estimuladas
con Concanavalina –A por 24 horas.

Evaluar la inhibición de la actividad de MAP quinasa inducida por 14-DAP en células de
ganglio de ratón estimuladas con Concanavalina -A.
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2. MATERIALES Y METODOS
1. Animales
Se usaron como animales de experimentación ratones de la cepa “Rockefeller” (RF) del vivero
del Instituto de Inmunología de la Universidad Austral de Chile. Para cada experimento se
eligieron en forma aleatoria el número de ratones a utilizar, al igual que su sexo y edad. Estos
fueron alimentados con concentrado especial para ratones y agua “ad Libitun”.
2. Principio activo
En todos los experimentos se uso 14-DAP, un compuesto aislado de Andrographis paniculata,
producido por AMSAR PRIVATE LTD (Laboratorio Farmacéutico , India). Para cultivar las
células de ganglio linfático de ratón, se utilizaron las siguientes concentraciones: 2,5; 5; 7,5; 10;
12,5; 15; 17,5; 20; 25μM, las cuales fueron diluidas en DMSO al 0,4 % (ver anexo 1).
3. Aislamiento de los ganglios linfáticos de ratón
Los animales fueron sacrificados por inhalación de éter, se les extrajo de los ganglios, se
depositaron en una placa Petri que conteniendo 5 ml de medio de cultivo RPMI 1640 incompleto,
después fueron traspasados a otra que contenía 5 ml de RPIM 1640 completo (ver anexo 2) en
donde los ganglios fueron disgregados, obteniéndose las células linfoides que fueron
resuspendidos en 1 ml de medio RPMI 1640. Los linfocitos fueron cuantificados mediante
recuento en cámara de Neubauer, y finalmente la suspensión de linfocitos fue ajustada a una
concentración de 4x 10 6 células por ml en RPMI completo.
4. Determinación de citoquina “in vitro” por Elisa
Para la medición de citoquinas mediante la técnica ELISA, las células fueron cultivadas en placa
de cultivo de poliestireno de 24 pocillo de 2ml, en cada uno de los cuales se le colocó 1ml de
célula y 0,5 ml de las diferentes concentraciones de 14-DAP más 0,5 ml de Con A en una
concentración de 3,3μg/ml y dependiendo del diseño experimental, se reemplazó Con A por 0,5
12
ml de medio de cultivo, inmediatamente las placas fueron incubadas en una estufa a 37 ºC, en 1
atmósfera de humedad, con un 5% de CO2 por 24 horas. Pasado este periodo se tomaron las
muestras y se centrifugación por 1 minuto a 3200 rpm, los sobrenadantes se almacenaron bajo
refrigeración en alícuotas de 0,6 ml.
Para la determinación de la liberación de citoquina al medio, por los linfocitos de los ganglios
linfáticos, se utilizó el sobrenadante. Se contó con diferentes Kit comerciales los cuales fueron
adquiridos al Laboratorio Pharmingen, utilizándose los Kit de IL-2, IL –4 e IFN-γ, cada uno
cuenta con un primer anticuerpo de captura anti-antígeno, un segundo anticuerpo conjugado a
una enzima peroxidasa y una solución estándar de la citoquina para la elaboración de la curva de
calibración. Para evaluar la producción de las diferentes citoquinas se recurrió a la técnica ELISA
“Sándwich”, denominada también como ELISA de captura.
Para poder determinar al tipo de respuesta inmunológica involucrada, se evaluó la producción de
citoquina tipo Th1 como son: IL-2 e INF- γ y tipo Th2 como IL-4. En cada experimento se
utilizó placa para ELISA “high binding” (alta unión) de poliestireno de 96 pocillos. Se procedió
a sembrar 100 μl por pocillo del primer anticuerpo o anticuerpo “de captura”, el cual fue diluido
en buffer carbonato pH 9,5 ( ver anexo 3 ) con el fin de facilitar la unión a la placa , esto se dejó
incubando por toda la noche a 4ºC para asegurar aun más que el anticuerpo se una totalmente a la
fase sólida, trascurrido este tiempo de incubación el contenido de la placa fue eliminado y se lavó
3 ó 5 veces dependiendo de la citoquina a evaluar con una solución de lavado (ver anexo 5).
Después se bloqueo todos los sitios de unión de la placa con 200 μl por pocillo de solución de
bloqueo (ver anexo 6) y fue incubado por 1 hora a Tº ambiente, evitándose así la unión
inespecífica del antígeno, terminado esta etapa nuevamente se elimino el contenido de los
pocillos y se procedió a lavar la placa 3 veces. Luego se agregó 100 μl por pocillo de las
muestras problemas que contenían el antígeno (en duplicado), además en esta etapa se agregó
100μl de la curva de calibración especifica para cada citoquina, incubándose posteriormente la
placa
durante 2 horas a T º ambiente, trascurrido este tiempo, se eliminó nuevamente el
contenido de los pocillos y se lavó 5 veces. Una vez realizado esto se agregó 100 μl por pocillo
del segundo anticuerpo conjugado a peroxidasa, el que fue diluido en una solución de PBS10% y
de SBF 10% , enseguida se dejó la placa a Tº ambiente por 1 hora, pasado éste periodo la placa
13
se lavó 7 veces. Posteriormente se agregó 100μl de solución reveladora de TMB y H2O2 (ver
anexo 7), dejándose desarrollar la reacción por 30 minuto en oscuridad. Finalmente se detuvo la
reacción con 50μl de H2SO4 2M por pocillo y el resultado de esta reacción se evaluó midiendo
la absorbancia en un lector de ELISA con filtro de 450 nm.(EI x 800 Universal Microplate
Reader, Biotek).
5. Determinación de la viabilidad de las células de ganglio linfático
de ratón
Para determinar la viabilidad celular, las células fueron cultivadas en placa de cultivo de
poliestireno de 96 pocillo, en los que en cada uno se colocó 100 μl de células, 50 μl de las
diferentes concentraciones de 14-DAP más 50 μl de Con A 3,3μg/ml, luego se incubó por 24
horas en la estufa a 37 ºC, en 1 atmósfera de humedad, con un 5% de CO 2. Se tomaron muestras
a tiempo diferente de incubación, el primero se tomó inmediatamente terminado el sembrado en
la placa de cultivo, correspondiendo éste tiempo a las 0 horas de cultivo e incubación, para ello se
resuspendió la muestra y se sacó 1μl, agregándose inmediatamente 1μl de Azul de Tripan
(dilución 1:2), posteriormente esta mezcla una vez bien homogenizada, se sacó 10μl los que
fueron colocados en la cámara de Neubauer. Como el Azul de Tripan es una molécula coloreada
de gran peso molecular que sólo es capaz de entrar en las célula que tiene la membrana alterada,
las células muertas o muy alteradas se observaron de color azul, mientras que las células vivas
se observaron incoloras. De este modo se pudo determinar la viabilidad celular, es decir, el
número de células vivas que es dependiente del número de células muertas (células azules) que
fueron observadas en la cámara de Neubauer. Posteriormente la placa de cultivo fue colocada
nuevamente
en la estufa
bajos las mismas condiciones
y pasado 24 horas de cultivo e
incubación , se repitió el procedimiento antes descrito.
6. Determinación de la actividad map quinasa ERK1/2
Para determinar la actividad de MAP quinasa ERK1/2 se uso la técnica de Western Blotting. Las
células fueron cultivadas en placa de cultivo de poliestireno de 24 pocillos de 2 ml., en los que
en cada uno se colocó 750 μl de células, 375 μl de las diferentes concentraciones de 14-DAP
más 375 μl de Con A 3,3μg/ml o 375μl de RPMI 1640 completo estéril, después la placa fue
14
incubada en una estufa a 37 ºC, en 1 atmósfera de humedad, con un 5% de CO2 por 1 hora.
Transcurrido éste periodo, se tomaron 1,5 ml de muestra, cada una de las cuales fueron sometidas
a centrifugación por 8 minuto a 500 rpm, enseguida se realizó una extracción de proteínas con
buffer de extracción de proteínas (ver anexo 8), las que fueron cuantificadas mediante el método
de Bradfort (reactivo de Bratford 5 X, Laboratorio Winkler LTDA). Estas se separaron mediante
electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones desnaturante SDS-PAGE (ver anexo 9 y
10) y posteriormente fueron electrotransferidas a una membrana de nitrocelulosa .
Para evaluar la actividad de MAP quinasa se determinó específicamente la cantidad de pERK1
y pERK2 , para lo cual, se bloqueó la membrana de nitrocelulosa con 5ml de buffer de bloqueo
(ver anexo 11) aproximadamente por 2 horas a Tº ambiente y con agitación constante,
transcurrido este tiempo la membrana se lavó con buffer de lavado TBS –T (ver anexo 12) 3
veces por 10 minutos. Después se incubó con agitación constante a 4ºC toda la noche con el
primer anticuerpo para pERK 1/2 ( rabbit IgG, Santa Cruz Biotechnology) en una dilución de 1:
2000 con buffer de bloqueo; se volvió a lavar con buffer de lavado TBS-T, 3 veces por 10
minutos. Luego la membrana de nitrocelulosa fue incubada con el segundo anticuerpo conjugado
con peroxidasa para
pERK 1/2 (anti-rabbit IgG–HRP, Santa Cruz Biotechnology) durante 1
hora a Tº ambiente con agitación constante, éste segundo anticuerpo también fue diluido con
buffer de bloqueo en una dilución de 1:2000, a continuación nuevamente se lavó con buffer de
lavado TBS-T, 3 veces por 10 minutos. Finalmente se reveló mediante quimioluminicencia
(ECLTM, Amersham Pharmacia Biotech ), en una sala oscura, en donde fue mezclado en un tubo
volúmenes iguales de reactivo 1 y 2, esta mezcla fue colocada sobre la membrana de
nitrocelulosa esperándose un minuto, pasado este tiempo se secó la membrana con papel filtro,
luego de colocar sobre ella una película y ésta
se colocó en el cassette, exponiéndose
aproximadamente 30 minutos. Posteriormente la película fue revelada con una solución
reveladora hasta que fueron visualizadas las bandas de las proteínas, después esta película se
lavó con agua, pasándola posteriormente en una solución fijadora y nuevamente se volvió a
lavar con agua y se dejo secando a Tº ambiente.
Para tener un control de la cantidad de proteínas en el gel, fue necesario remover los anticuerpos
de la membrana de nitrocelulosa que fue utilizada anteriormente, mediante un Stripping, para
15
ello está membrana se incubó con una solución de Stripping (ver anexo 13) por 30 minutos a Tº
ambiente y agitación constante, enseguida se incubó por 1 hora en la estufa a 50ºC, trascurrido
este tiempo, se elimino la solución en la campana. Nuevamente fue incubada la membrana de
nitrocelulosa con solución Stripping por 30 minutos a Tº ambiente y agitación constante, se
eliminó la solución en la campana y se lavó con buffer de lavado TBS-T cada 10 minutos
aproximadamente por 2 horas hasta que salió el olor de β- mercaptoetanol. Una vez realizado
esto, la membrana de nitrocelulosa se bloque con 5 ml de buffer de bloqueo por 2 horas a Tº
ambiente y agitación constante, transcurrido este periodo se siguió el protocolo del Western
Blotting descrito anteriormente, con la única diferencia que tanto el primer anticuerpo, como el
segundo anticuerpo fueron utilizados para determinar la cantidad de ERK 1/2 totales (Santa Cruz
Biotechnology).
7. Expresión de resultados
En cada medición de citoquina se realizó una curva de calibración, por la cual haciendo una
conversión de los valores de absorbancia obtenidas por el lector de ELISA, en la ecuación de la
recta, se obtiene valores de concentración. Finalmente, los resultados fueron expresados en
unidades de concentración del orden de ρg / ml.
En cuanto al número de células vivas encontradas a las 0 y 24 horas de cultivo e incubación,
determinadas mediante la técnica de tinción con Azul de Tripan, fueron expresadas como
porcentaje de viabilidad celular.
Las señales obtenidas a través de Western Blotting
corresponden a pERK1/2
densitometría
con su determinado Stripping, que
y a ERK1/2 totales respectivamente, fueron analizadas por
mediante el programa SCION-IMAGE, del NIH.
Finalmente los resultados
fueron expresados como porcentaje de la razón entre pERK1 y pERK2 estandarizadas con
ERK1 y ERK2 totales respectivamente.
8. Análisis estadístico
Los gráficos fueron realizados en el programa GRAPH PAD PRISM 3.0. Los resultados de la
concentración de citoquina “in vitro” y la actividad de MAP quinasa ERK1/2 son presentados en
16
gráficos de barra. La viabilidad celular es presentado en un grafico de punto. Ambos tipos de
gráficos están con su respectiva media aritmética y su desviación estándar.
17
3. RESULTADOS
1. Efecto de 14-DAP en la producción de citoquinas en células de
ganglio
linfático,
cultivadas
en
presencia
o
ausencia
de
Concanavalina A por 24 horas
Grupos de ratones fueron sacrificados y una vez obtenidas las células en medio RPMI 1640
completo, fueron cultivadas en presencia o ausencia del mitógeno Concanavalina A por 24 horas.
Como se muestra en la figura 1 en las células de ganglio linfático cultivadas con distintas
concentraciones de 14-DAP en presencia o en ausencia de mitógeno, la producción de IL-2
(citoquina Th1) se mantuvo a un nivel estable de producción a medida que se aumentaba la
concentración de 14-DAP, ocurriendo la misma situación en la producción de IL-4 (citoquina
Th2), sin embargo ésta citoquina no reaccionó a la presencia de Con A, no viéndose estimulada
su producción, a lo contrario a la producción de IL-2. En la figura 2 se observa que en las células
cultivadas con distintas concentraciones de 14-DAP y en presencia del mitógeno, hay una clara
disminución en la producción de INF-γ (citoquina Th1) a medida que se va aumentando la
concentración de 14-DAP, pero se puede observar un nivel estable en la producción de ésta
citoquina en las células que fueron cultivadas en ausencia de Con A.
FIGURA 1. Producción de citoquinas por las células de ganglio linfático, cultivadas con
distintas concentraciones de 14-DAP o con sólo medio de cultivo como control.
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FIGURA 2. Producción de citoquina por células de ganglio linfático, cultivadas con distintas
concentraciones de 14-DAP o con sólo medio de cultivo como control.
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2. Efecto de 14-DAP, sobre la viabilidad de las células de ganglio
linfático cultivadas por 24 horas en presencia de Concanavalina A
Las células de ganglio linfático fueron cultivadas en presencia de mitógeno en un medio de RPMI
1640 completo estéril por 24 horas, correspondiendo esta a las 0 horas de cultivo y pasado el
periodo de 24 horas fue tomada otra muestra, correspondiendo esta última a las 24 horas de
cultivo e incubación. Como se muestra en la figura 3 las células cultivadas con las distintas
concentraciones de 14-DAP presenta un nivel estable de porcentaje de viabilidad celular en
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alrededor del 100 % a las cero 0 horas de cultivo.
Con respecto a las muestras tomadas a las
24 horas de cultivo e incubación, presentan una leve disminución hasta un 75% aproximadamente
de viabilidad celular a medida que aumenta la concentración del 14-DAP.
FIGURA 3. Porcentaje de viabilidad celular de las células de ganglio linfático, incubadas en
presencia de Con A 3,3μg/ml y con distintas concentraciones de 14-DAP o con sólo medio de
cultivo como control. La grafica muestra el nº de células vivas estandarizadas a 100%. Cada
punto
representa el promedio de tres experimentos en duplicado con su respectiva media
aritmética y desviación estándar.
3. Efecto de 14-DAP en la actividad de MAP quinasa ERK1/2
Se sacrificó un grupo de ratones, y
las células obtenidas fueron cultivadas con 14-DAP,
eligiéndose para el cultivo sólo tres concentraciones de este compuesto, además fueron utilizado
dos control, uno que sólo contenía medio de cultivo (RPMI 1640 completo) y otro que contenía
medio de cultivo más Con A 3,3μg/ml. Las células fueron primeramente incubadas por 30
minutos en ausencia de Con A 3,3μg/ml, trascurrido este periodo se le agregó el mitógeno a las
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muestras que le correspondían, incubándose por 30 minutos más. Como se muestra en la figura
4, las células incubadas con distintas concentraciones del producto, presentó claramente una
inhibición de la actividad MAP quinasa ERK1/2 hasta una concentración de 14-DAP de 10μM,
lo que se traduce, que hasta esta concentración haya disminución en el porcentaje de pERK1 y
pERK2.
FIGURA 4. Porcentaje de pERK1/2 en las células de ganglio linfático, cultivadas con 14-DAP,
sólo con medio de cultivo o sólo con Concanavalina A como control. La grafica A y B muestran
el efecto de 14–DAP sobre las pERK1 y pERK2, respectivamente. Cada barra representa la
densitometría de las bandas estandarizadas con ERK1 y ERK2 totales y el promedio de tres
experimento en duplicado con su respectiva media aritmética .
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4. DISCUSION
Los resultados presentados en esta Tesis, permiten afirmar que el compuesto 14 -DAP en
presencia de Con A inhibe la producción de INF-γ, por lo tanto, inhibiría la producción de
citoquinas del tipo Th1, siendo factible pensar que disminuiría la respuesta inmune celular. Los
resultados obtenidos en los experimentos en que se determinó IL-2 son un tanto contradictorios,
debido a que éste compuesto no presenta ninguna influencia sobre la producción de ésta
citoquina. El efecto inhibitorio de 14-DAP no fue evidente para IL-4 unas de las principales
citoquinas Th2, pudiéndose pensar que no afectaría la respuesta inmune humoral.
Por otra
parte, la producción de IL-4 no se vio estimulada por la presencia de Con A, a diferencia de las
otras citoquinas.
Como Con A se une a determinados residuos de azúcar de las glucoproteinas de la superficie de
las células T, entre ellas, las proteínas TCR y CD3 estimula las células T, específicamente
estimula la producción de IL-2, INF-γ e incluyendo IL-4, hecho que se ha evidenciado en cepas
de ratones diferente a la utilizada en este trabajo, como ratones C57BL/6, BALB/c y C3 H/HcJ
(Cunard et al, 2002; Keen et al, 2001).Explicándose en parte el porqué Con A , en este caso no
estimulo la producción de IL-4.
Al analizar los resultados se puede apreciar que 14-DAP inhibe la producción de INF -, lo que
conllevaría a una disminución de la citotoxicidad de TNF (factor de necrosis tumoral) y
expresión de moléculas de clases I y II de MHC en muchas células linfoides o líneas celulares de
diversos orígenes (Gerrard et al, 1988), además se vería afectada la diferenciación de las células
T a la subpoblación Th1. Por otra parte, al analizar la producción de IL-2 simplemente no se
aprecia efecto del principio activo en su producción, no afectando el crecimiento en general de la
población de células T, ya que, actúa como un factor de crecimiento (autocrino ) sobre éstas
células y es responsable de su expansión clonal tras el reconocimiento del antígeno (Abbas et al,
2002). La ausencia de efecto de 14-DAP sobre la producción de IL-4, no afectaría la
diferenciación a células Th2 que depende de la producción de ésta citoquina (Noble et al, 1995),
además no afectaría la estimulación del crecimiento y diferenciación de los linfocitos B.
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Por otro lado, resultados de viabilidad celular, permiten descartar que la disminución en la
producción de IFN- no se debe a muerte celular, por lo tanto, se deduce que esta disminución
se debería a un efecto directo del compuesto en estudio sobre la producción de ésta citoquina.
En cuanto a la actividad MAP quinasa ERK1/2, se observó que 14-DAP producía un efecto
inhibitorio hasta una concentración de 10μM, lo que se tradujo en una disminución en el
porcentaje de pERK1 y pERK2, a su vez la activación MAP quinasa estaría regulando procesos
que inducen la apoptosis en células T (Dumot et al, 1998; Zhu et al, 1999), lo que estaría
asociado a una leve disminución en el porcentaje de viabilidad celular a concentraciones sobre
los 10μM. Por lo tanto, el efecto inhibitorio de éste compuesto en parte actuaría, sobre la vía de
transducción de señal que lleva a la activación de ERK1/2, éstas a su vez fosforilan a una
proteína denominada Elk, el Elk fosforilado estimula la transcripción de Fos uno de los dos
componentes del factor de transcripción AP-1 (Cantrell,1996). No se descartaría el efecto sobre
las otras vías que llevan a la activación de las PKC y Calcineurina, que finalmente llegan a la
activación de los factores de transcripción NF-κB y NFAT respectivamente. Estos factores de
transcripción juegan un rol importante en la transcripción de muchos de los genes de citoquinas
en las células T activadas, de esta forma, los genes de INF-γ son regulados en parte por la
actividad coordinada entre NFAT y NF-κB (Sica et al, 1997; Mahalingan et al, 2001), además
NFAT es esencial para la transcripción del gen IL-2 y probablemente de IL-4 (Terada et al,
1992), en cuanto al factor de transcripción AP-1 es necesario para la activación del gen de IL-2,
pero estudios han demostrado que la formación de complejo con NFAT juega un rol critico en la
activación de éste gen (Koike et al, 2003).
Por lo tanto, de estos resultados podemos concluir que 14-DAP disminuye la actividad de las
células Th1, disminuyendo la respuesta inmune mediada por células, por otro lado, 14-DAP no
afecta a la citoquina Th2 encargada de co-activar a las células B que participan en la generación
de la respuesta inmune humoral. Además se observó que 14-DAP no influyó en la viabilidad
celular, por lo que, la disminución de la producción del INF-γ se debería sólo al efecto de 14DAP, la que estaría directamente asociada a una inhibición de MAP quinasa sólo hasta a una
concentración de 10μM. Concentraciones superiores de 14-DAP no inhibiría la actividad de
MAP quinasa, lo que podría estar asociado a una leve disminución en el porcentaje viabilidad
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celular, por lo tanto, a éstas concentraciones el efecto inhibitorio de 14-DAP estaría relacionada
con la activación de otras vías de transducción de señal.
BIBLIOGRAFIA
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ANEXO
SOLUCIONES UTILIZADAS EN MATERIALES Y METODOS
1.- DMSO 0,4 %
Para 50 ml:
DMSO 100 %
RPMI 1640 completo estéril
0,2 ml
49,8 ml
2.- MEDIO COMPLETO RPMI 1640
Para 100ml:
1ml piruvato de sodio 100 x estéril
1ml Pen –Strep 100 x estéril
1ml anfotericina B 100 x estéril
10 ml suero bovino fetal ( SBF ) estéril
86 ml RPMI 1640 incompleto estéril
Almacenar a 4ºC hasta seis semanas después de su preparación .
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3.- BUFFER CARBONATO 0,1 M pH 9,5
Para 1000ml:
NaHCO3
8,40 grs.
Na2CO3
3,56 grs.
H2O c.s.p
1000 ml
Ajustar a pH 9,5 con NaOH 5M o HCl 2N .Guardar a 4ºC .
Esta solución debe usarse dentro de siete días después de su preparación .
4.- BUFFER FOSFATO SALINO ( PBS ) pH 7,0
Para 1000ml:
NaCl
80,0 grs.
Na2HPO4
11,6 grs.
KH2PO4
2,0 grs.
KCl
2,0 grs.
H2O c.s.p
1000 ml
Ajustar a pH 7,0 con NaOH 5M o HCl 2N .Guardar a 4ºC .
Esta solución debe usarse dentro de tres días después de preparada.
5.- SOLUCION DE LAVADO
Para 1000 ml:
Tween 20 0,05 %
PBS 10X
H2O c.s.p
6.- SOLUCION DE BLOQUEO
0,5 ml.
100 ml.
1000 ml
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Para 100 ml:
Leche descremada 5%
PBS 10 X
H2O c.s.p
5 grs.
10 ml.
100 ml.
7.- SOLUCION REVELADORA
Para 100 ml:
TMB 0,4 g/ l
50 ml.
H2O2 0,02 %
50ml.
Preparar en el momento de utilizar . El kit de solución reveladora es estable por un año a
4ºC . Es altamente inestable a la luz .
8.- BUFFER DE EXTRACCION DE PROTEINAS
Para 5 ml:
0,5 M Tris HCl
0,5 M EDTA
0,5 M EGTA
10 mg / ml Inhibidor de proteínas
0,5 M NaF
0,2 M Na2VO4
100 mM PMSF
100 mM DTT
10 % Triton X-100
H2 O
500μl
10 μl
100 μl
25 μl
250 μl
50 μl
5 μl
1250 μl
750 μl
2060μl
9.- GEL SEPARADOR 10%
Para 9 ml:
Acril-Bis 30: 0.8 %
Tris HCl 1.5 M – 0.4 % SDS (pH 8.8)
Persulfato 1 %
2,997 ml.
2,25 ml.
0,27 ml.
30
H2 O
3,479 ml.
TEMED
9 μl.
Después de colocar el gel entre los vidrios agregar agua inmediatamente y esperar que
polimerice.
10.- GEL ESPACIADOR
Para 4 ml:
Acril-Bis 30: 0.8 %
0,520 ml.
Tris HCl 0.5 M – 0.4 % SDS (pH 6.8 )
1 ml.
Persulfato 1 %
0,4 ml.
H2 O
2,08 ml.
TEMED
4 μl.
Agregar el gel sobre el separador y colocar inmediatamente la peineta (se puede dejar
hasta la tarde , a 4 ºC ).
11.- BUFFER DE BLOQUEO PARA WESTERN BLOTTING
Para 500 ml:
TBS 10 X
Leche descremada 5 %
Tween –20
H2O c.s.p
50 ml
25 grs.
2,5 ml
500 ml
12.- BUFFER DE LAVADO TBS –T
Para 1000 ml:
TBS 1 X
Tween -20 0,1 %
13.- SOLUCION STRIPPING
100 ml
1ml
31
Para 200 ml:
SDS
5 grs.
Tris
1,893 grs.
β - mercaptoetanol
1,7 ml.
Ajustar a pH 6,7 con NaOH 5M o HCl 2N . Se puede mantener a Tº ambiente .