Crecimiento y formación de productos en

INSTITUTO TECNOLÓGICO DE ZACATEPEC
CRECIMIENTO Y FORMACIÓN DE PRODUCTOS EN
CULTIVOS AERÓBICOS Y ANAERÓBICOS DE Bacillus
subtilis CON GLUCOSA, XILOSA Y CELOBIOSA
OPCIÓN I
T
E
S
I
S
QUE PARA OBTENER EL TITULO DE:
INGENIERO BIOQUÍMICO
P R E S E N T A
CLAUDIA IBETH HERNÁNDEZ BUSTOS
ZACATEPEC MOR
Septiembre, 2003
i
El presente trabajo se realizó bajo la asesoría del
Dr. Alfredo Martínez Jiménez en el Departamento de
Ingeniería
Celular
y
Biocatálisis
del
Instituto
de
Biotecnología de la Universidad Nacional Autónoma de
México.
Para la realización del mismo se contó con el
financiamiento del Consejo Nacional de Ciencia y
Tecnología (CONACyT) a través del proyecto Z-003 y de
la beca de tesis de licenciatura No. 4323.
ii
A ti por ser mi apoyo y mi guía en todo momento.
A mis padres: Javier y Toña por todo el apoyo incondicional que
siempre me han brindado, por todo lo que han hecho por mí y de mí.
A Nancy por ser siempre el ejemplo a seguir
A Blanquis por ser así, como solo tú puedes ser y por tu enorme
capacidad de dar y ver por los demás.
A mis chiquitas Dany y Lucy por ser siempre mi motivación y
apoyo.
Y a una pequeña personita que dio un giro importante en mi vida:
Eduardo Javier.
A todos gracias por creer en mi
iii
AGRADECIMIENTOS
Al Dr. Alfredo Martínez Jiménez por haberme dado la oportunidad de trabajar con él,
por todos los conocimientos y la experiencia adquirida pero sobre todo por la amistad
que me brindo.
A Q. Georgina Hernández por todo el apoyo técnico en el manejo y análisis de
muestras por HPLC.
A MC Ramón de Anda por haberme proporcionado las cepas utilizadas en este trabajo
y por el apoyo técnico en la instalación y manejo del equipo de fermentación.
A todos y cada uno de los integrantes del laboratorio Bolívar/Gosset por la amistad
incondicional que me brindaron, especialmente a Mechita, Ponchito, Naty, Gerardo,
Victor, Saida y Noemi.
A todos mis profesores, especialmente al Ing. Benjamín Aguilar, Ing. Jose Luis Morales,
Ing. Rodolfo López Bailón, Ing. Carlos Cano, Ing. Francisco Hernández, Dr. Jesús
Porcayo por todos los conocimientos y consejos compartidos, pero sobre todo por
motivarnos a ser profesionistas integros.
A todos mis amigos, a Nelly, Cinthya, Odette, Nayelli, Sandra, Anita, Carmen, Luis
Arturo, Mario, Victor Hugo, Alfonso, Leandro y Odon por todos los momentos que
compartimos juntos.
iv
ÍNDICE GENERAL
_________________________________________________________________________________________________________
ÍNDICE GENERAL
ÍNDICE DE FIGURAS ................................................................................................... viii
ÍNDICE DE TABLAS .......................................................................................................ix
NOMENCLATURA .......................................................................................................... x
1. RESUMEN .................................................................................................................. 1
2. INTRODUCCIÓN Y JUSTIFICACIÓN ......................................................................... 3
3. ANTECEDENTES ....................................................................................................... 5
3.1 Características de Bacillus subtilis......................................................................... 5
3.2 Metabolismo de azúcares ...................................................................................... 7
3.3 Fermentación......................................................................................................... 9
3.4 Respiración de Nitratos ....................................................................................... 12
4 PREGUNTAS RELEVANTES DEL PROYECTO ....................................................... 14
5 HIPÓTESIS ................................................................................................................ 15
6. OBJETIVOS DEL PROYECTO ................................................................................. 16
7. MATERIALES Y MÉTODOS ..................................................................................... 17
7.1 Microorganismos. ................................................................................................ 17
7.2 Generación de un banco de células. ................................................................... 18
7.3 Medios de cultivo. ................................................................................................ 18
7.4 Condiciones de cultivos. ...................................................................................... 19
7.4.1 Cultivos aeróbicos......................................................................................... 19
7.4.2 Cultivos anaeróbicos..................................................................................... 20
7.4.3 Desarrollo de inóculos................................................................................... 20
7.5 Transformación de B. subtilis WB700. Eliminación de auxotrofia a triptófano. .... 21
7.6 Generación de mutantes de B. subtilis Xil+.......................................................... 22
7.7 Concentración Celular ......................................................................................... 22
7.8 Determinación de azúcares. ................................................................................ 22
7.8.1 Método de azúcares reductores (DNS) ......................................................... 23
7.8.2 Cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) ................................... 23
7.8.3 Determinación enzimática de glucosa........................................................... 23
7.9 Determinación de ácidos orgánicos..................................................................... 23
v
ÍNDICE GENERAL
_________________________________________________________________________________________________________
8. INSTALACIÓN DE EQUIPO DE FERMENTACIÓN .................................................. 24
8.1 Descripción del equipo ........................................................................................ 24
8.2 Instalación y puesta en marcha de 6 sistemas de fermentación.......................... 27
8.3 Operación de equipo de fermentación................................................................. 30
9 PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS................................................ 32
9.1 Evaluación del crecimiento de Bacillus subtilis WB700 ....................................... 32
9.2 Eliminación de auxotrofía a triptófano en la cepa WB700 ................................... 33
9.3 Evaluación de B. subtilis WB700CH1 en condiciones aeróbicas......................... 36
9.4 Generación de mutantes de B. subtilis xil+ (Cepa WB700CH2)........................... 40
9.5 Evaluación de B. subtilis WB700CH2 en condiciones aeróbicas......................... 41
9.6 Evaluación de B. subtilis WB700CH2 en condiciones anaeróbicas..................... 44
9.6.1 Evaluación del crecimiento en medio mineral suplementado........................ 53
9.6.2 Producción de L-lactato en cultivos anaerobios con 50 g/l de glucosa. ........ 58
9.6.2.1 Comparación de la producción de L-lactato en B subtilis WB700CH2 con
reportes de la literatura de otros microorganismos............................................. 61
9.7 Evaluación del crecimiento de B. subtilis en mezclas de azúcares ..................... 64
9.8 Evaluación de la tolerancia a etanol y furfural sobre el crecimiento de B. subtilis
en condiciones anaeróbicas. ..................................................................................... 72
10 CONCLUSIONES..................................................................................................... 76
11 PERSPECTIVAS...................................................................................................... 78
12 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................................... 79
13 ANEXOS .................................................................................................................. 87
13.1 Determinación de peso seco de Bacillus subtilis. .............................................. 87
13.2 Extracción de ADN cromosomal. ....................................................................... 88
13.3 Operación de un sistema de mini-fermentadores no aireados. ......................... 89
13.4 Determinación de azúcares y ácidos orgánicos por HPLC. ............................... 92
13.4.1 Preparación del equipo ............................................................................... 92
13.4.2 Preparación de estándares ......................................................................... 92
13.5 Preparación de Amortiguador y estándares para analizador enzimático YSI. ... 95
13.5.1 Amortiguador YSI 10x: ................................................................................ 95
13.5.2 Estándar de D-glucosa (2.5 g/l)................................................................... 95
vi
ÍNDICE GENERAL
_________________________________________________________________________________________________________
13.5.3 Estándar de L-láctico (0.5 g/l) ..................................................................... 95
13.6 Cálculos. ............................................................................................................ 95
13.6.1 Estimación de la velocidad especifica de crecimiento................................. 95
13.6.2 Corrección de biomasa por factor de dilución. ............................................ 96
13.6.3 Cálculo de rendimientos y velocidades de consumo de azúcares y
formación de productos.......................................................................................... 96
13.6.4 Cálculo de la velocidad especifica de consumo de azúcar y de producción
de L-lactato. ........................................................................................................... 97
13.6.5 Cálculo de la productividad volumétrica de L-lactato. ................................. 97
13.6.6 Cálculo de la concentración mínima inhibitoria de etanol y furfural............. 97
vii
ÍNDICE DE FIGURAS
___________________________________________________________________________________________________
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 3.1 Rutas metabólicas de fermentación propuestas para Bacillus subtilis. ........ 12
Figura 8.1 Sistema de fermentación Applikon............................................................... 25
Figura 8.2 Diagrama de tuberías e instrumentación para seis sistemas de fermentación
Applikon. .................................................................................................................... 28
Figura 8.3 Preparación del Bioreactor para esterilización. ............................................ 31
Figura 9.1 Conservación del genotipo proteasas menos en WB700CH1...................... 35
Figura 9.2 Crecimiento aeróbico de B. subtilis WB700CH1 en medio Luria.................. 37
Figura 9.3 Crecimiento aeróbico de B. subtilis WB700CH1 en medio mineral.............. 38
Figura 9.4 Crecimiento aeróbico de B subtilis WB700CH2. .......................................... 42
Figura 9.6 Crecimiento anaeróbico de B. subtilis WB700CH2 en medio mineral.......... 47
Figura 9.7 Balance de ATP y NADH en el metabolismo de azúcares en Escherichia coli.
................................................................................................................................... 49
Figura 9.8 Crecimiento anaeróbico de B. subtilis WB700CH2 en medio mineral
suplementado con extracto de levadura industrial..................................................... 55
Figura 9.9 Crecimiento anaeróbico de B. subtilis WB700CH2 en medio mineral
suplementado con sólidos de licor de maíz. .............................................................. 56
Figura 9.10 Producción de L-lactato en cultivos de B. subtilis con 50 g/l de glucosa.... 60
Figura 9.11 Cultivo aeróbico de B. subtilis en mezclas de glucosa-xilosa..................... 67
Figura 9.12 Cultivo aeróbico de B. subtilis en mezclas de glucosa-celobiosa............... 68
Figura 9.13 Cultivo anaeróbico de B. subtilis en mezclas de azúcares: A) Mezcla
glucosa-xilosa y B) Mezcla glucosa-celobiosa........................................................... 70
Figura 9.14 Crecimiento relativo en cultivos de B. subtilis WB700CH2 con furfural...... 73
Figura 9.15 Crecimiento relativo en cultivos de B. subtilis con etanol. .......................... 74
Figura 13.1 Curva de peso seco de células para B subtilis a 600 nm ........................... 87
Figura 13.2 Sistema de minifermentadores o fleakers. ................................................. 90
Figura 13.3 Preparación de fleaker para esterilización. ................................................ 91
Figura 13.4 Curva de calibración de azúcares por Índice de refracción........................ 93
Figura 13.5 Curva de calibración de ácidos orgánicos por el detector de arreglo de
diodos a 210 nm. ....................................................................................................... 94
viii
ÍNDICE DE TABLAS
_________________________________________________________________________________________________________
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 3.1 Características del genero Bacillus. ................................................................ 6
Tabla 3.2 Azúcares catabolizados por B. subtilis. ........................................................... 9
Tabla 6.1 Cepas de Bacillus subtilis.............................................................................. 17
Tabla 9.1 Datos sobre el crecimiento aerobio de distintas cepas de B. subtilis. ........... 33
Tabla 9.2 Velocidad específica de crecimiento de colonias de B. subtilis protótrofas a
triptófano obtenidas por transformación. ................................................................... 35
Tabla 9.3 Resumen de resultados de cultivo aeróbicos de B subtilis WB700CH1........ 39
Tabla 9.4 Resumen de formación de acético con B. subtilis WB700CH1 en cultivos
aeróbicos utilizando glucosa como fuente de carbono. ............................................. 40
Tabla 9.5 Parámetros de crecimiento y de consumo de xilosa de B subtilis WB700CH2.
................................................................................................................................... 43
Tabla 9.6 Resumen de resultados de cultivos anaeróbicos de B subtilis WB700CH2. . 46
Tabla 9.7 Resumen de resultados de la producción de L-láctico con B subtilis
WB700CH2 con 10 g/l de azúcar............................................................................... 52
Tabla 9.8 Resumen de cultivos anaeróbicos en medio mineral-glc 10 g/l suplementado.
................................................................................................................................... 57
Tabla 9.9 Resumen de resultados de la producción de L-láctico con B subtilis
WB700CH2 en medio mineral-glucosa 10 g/l suplementado..................................... 58
Tabla 9.10. Producción de L-lactato con B. subtilis con alta concentración de glucosa.
................................................................................................................................... 61
Tabla 9.11 Microorganismos reportados recientemente para la producción de ácido
láctico. ....................................................................................................................... 62
Tabla 9.12 Parámetros cinéticos de B subtilis WB700CH2 en cultivos con medio
mineral en mezclas de azúcares. .............................................................................. 72
Tabla 9.13 Concentración de etanol y furfural requerida para inhibir el crecimiento de B
subtilis WB700CH2.................................................................................................... 75
ix
NOMENCLATURA
_________________________________________________________________________________________________________
NOMENCLATURA
Símbolo
Definición
Unidades
Cel
Celobiosa.
DCW
Peso seco de células (por sus siglas en inglés: Dry
gDCW/l
Cellular Weight).
ELI
Extracto de levadura industrial.
Em
Eritromicina.
Glc
Glucosa.
IC50
Concentración que causa un 50 % de inhibición en el
g/l
crecimiento.
Lm
Lincomicina.
MIC
Concentración mínima inhibitoria.
P
Producto.
qp
Velocidad específica de formación de producto.
gP/gDWC.h
qS
Velocidad específica de consumo de sustrato.
gS/gDWC.h
QP
Productividad volumétrica de lactato.
glactato/ l.h
S
Sustrato, fuente de carbono, azúcares: glucosa, xilosa
g/l
o celobiosa.
SLM
Sólidos de licor de maíz.
Trp
Triptófano.
Xyl
Xilosa.
XMAX
Biomasa máxima alcanzada durante la fase de
gDCW/l
crecimiento exponencial.
YP/S
Rendimiento producto / sustrato.
gP/gS
YX/S
Rendimiento biomasa / sustrato.
gDWC/gS
µ
Velocidad específica de crecimiento.
-1
h
RESUMEN
_________________________________________________________________________________________________________
1. RESUMEN
El desarrollo de nuevas tecnologías para obtener productos químicos de gran volumen
están basadas en el uso de sustratos abundantes y económicos, tales como los
residuos agroindustriales, los cuales contienen principalmente mezclas de xilosa,
glucosa y celobiosa. Bacillus subtilis puede utilizarse para estos fines por su capacidad
de metabolizar una amplia variedad de azúcares. Sin embargo sus características
metabólicas para usar xilosa y celobiosa en aerobiosis y para fermentar glucosa, xilosa
y celobiosa no han sido estudiadas. En este trabajo se evaluó esta capacidad en medio
rico y mineral suplementado son glucosa, xilosa y celobiosa, y mezclas binarias de
glucosa-celobiosa y glucosa-xilosa en condiciones aeróbicas y anaeróbicas.
Para el desarrollo de este proyecto inicialmente se instalaron dos sistemas de
fermentación, con tres unidades de 1 litro, los cuales se controlan de manera
automática: temperatura, velocidad de agitación, aireación, pH, eliminación de espuma
y oxígeno disuelto. El control se lleva a cabo por técnicas de control proporcionalintegral-derivativo, el cual puede ser sustituido por un control inteligente adaptativo.
Cada sistema de tres unidades esta enlazada a una computadora personal la cual,
además de registrar los eventos de los cultivos, puede tomar el control de las unidades
de fermentación.
B. subtilis sintetiza todas las enzimas para metabolizar xilosa, pero no puede
trasportarla. Como primera etapa de este proyecto se obtuvieron mutantes en medio
mineral y en condiciones aeróbicas, las cuales adquirieron la habilidad para transportar
xilosa.
En aerobiosis, las velocidades de crecimiento y de consumo de azúcar son menores
con celobiosa y xilosa para ambos medios en comparación con glucosa, sin embargo el
rendimiento de formación de biomasa es similar con los tres azúcares. Bajo estas
condiciones el único producto obtenido fue ácido acético con rendimiento de conversión
de glucosa en acético de 0.48 y 0.16 gacético/gglc, para medio rico y mineral,
1
RESUMEN
_________________________________________________________________________________________________________
respectivamente. En el caso de celobiosa y xilosa, no se detectaron cantidades
apreciables de producto.
En
condiciones
de
fermentación
con
xilosa,
el
crecimiento
se
reduce
considerablemente en ambos medios. En medio rico las velocidades de consumo de
glucosa y celobiosa son similares a los de aerobiosis. En medio mineral el crecimiento
y la velocidad de consumo de azúcar se reducen considerablemente, posiblemente por
un desbalance energético. La adición de extracto de levadura grado industrial o de
sólidos de licor de maíz al medio mineral permitió obtener velocidades de crecimiento y
de consumo de glucosa y celobiosa similares a los obtenidos con medio rico,
obteniendose como producto único ácido láctico. El gen presente en B. subtilis codifica
para una L-lactato deshidrogenasa. En las condiciones evaluadas en este estudio se
logró obtener L-lactato, óptimamente puro, con un rendimiento de conversión mayor al
70% de glucosa o celobiosa en este producto.
Estos resultados muestran que la mutante de B. subtilis, obtenida en este trabajo,
puede metabolizar celobiosa y xilosa con eficiencias similares a la glucosa en
aerobiosis. La misma cepa en condiciones de fermentación convierte eficientemente
glucosa y celobiosa en L-lactato óptimamente puro y, en consecuencia, potencialmente
puede ser utilizada para obtener L-lactato a escala de producción o bien ser
modificado, por técnicas de ingeniería de vías metabólicas, para obtener otros
productos de fermentación, tales como etanol a partir de hidrolizados de residuos
agroindustriales. Para ello, como parte de este trabajo, se evaluó la toxicidad del etanol
y furfural (producto de deshidratación de pentosas que se encuentra en hidrolizados de
la fracción hemicelulósica de residuos agroindustriales), como inhibidores del
crecimiento de Bacillus subtilis en medio rico en condiciones anaeróbicas. De acuerdo
a los resultados obtenidos se concluye que B. subtilis presenta tolerancias similares a
las obtenidas con otros catalizadores etanologénicos, tales como Escherichia coli, ya
que las concentraciones mínimas inhibitorias fueron de 50 y 2.5 g/l para etanol y
furfural, respectivamente.
2
INTRODUCCIÓN
_________________________________________________________________________________________________________
2. INTRODUCCIÓN Y JUSTIFICACIÓN
Actualmente la mayoría de los productos químicos de gran volumen son obtenidos a
partir del petróleo. Desafortunadamente para la industria y economía de muchos
países, las reservas de este producto se agotarán en el presente siglo (Ingram et al.,
1998). Este hecho plantea la necesidad de desarrollar nuevos procesos con
tecnologías renovables para generar energéticos y productos químicos en general.
Los materiales lignocelulósicos son una fuente abundante y renovable que han sido
propuestos como alternativa para su uso como materia prima en la producción de
biocombustibles y plásticos (Ingram et al., 1998; Dien et al., 2001). Estos materiales
son altamente heterogéneos y están compuestos principalmente por hemicelulosa,
celulosa, lignina y pectinas, los cuales para su bioconversión, requieren ser
hidrolizados en azúcares solubles utilizando métodos químicos (hidrólisis con ácidos
minerales) y/o enzimáticos. Sin embargo, estos procesos conllevan la aparición de
compuestos tóxicos para la mayoría de los microorganismos empleados en procesos
de fermentación. Dentro de estos tóxicos se encuentra compuestos como el furfural,
hidroximetilfurfural y ácido acético entre otros (Taherzadeh et al., 1997; Larsson et al.,
1999; Martínez et al., 2000; Martínez et al., 2001)
La fracción hemicelulósica está compuesta principalmente de pentosas (xilosa) y
hexosas (glucosa) y una pequeña fracción de otros azúcares (arabinosa y manosa;
Ingram et al., 1999). De la hidrólisis enzimática de la fracción celulósica se obtiene una
mezcla de glucosa y celobiosa. La mayoría de los microorganismos en la naturaleza
utilizan glucosa para llevar acabo sus actividades metabólicas. No obstante, la variedad
de microorganismos que metabolizan pentosas y hexosas es restringida, más aún, no
existen microorganismos silvestres que puedan catabolizar eficientemente xilosa o
arabinosa o mezclas de glucosa-xilosa o glucosa-celobiosa, en productos de
fermentación (Hernández-Montalvo et al., 2001)
Actualmente la biotecnología moderna cuenta con herramientas que permiten
modificar, modular y diseñar vías metabólicas en una amplia variedad de
3
INTRODUCCIÓN
_________________________________________________________________________________________________________
microorganismos, obteniendo de esta manera cepas para aplicaciones industriales con
rendimientos elevados de conversión de sustratos en productos. Además, por su
capacidad para secretar grandes cantidades de enzimas extracelulares directamente al
medio de cultivo, Bacillus subtilis es un microorganismo usado ampliamente a nivel
industrial en condiciones aeróbicas (Ye et al., 1996). Se sabe que naturalmente
metaboliza una amplia variedad de azúcares incluyendo xilosa, arabinosa, manosa,
sacarosa, celobiosa y glucosa (Stülken y Hillen, 2000). Sin embargo, a pesar del
extenso conocimiento genético y bioquímico de B. subtilis, sorprendentemente existe
poca información de aspectos bioenergéticos, metabólicos, de crecimiento y de
formación de productos en condiciones aeróbicas para la utilización de xilosa y
celobiosa y bajo condiciones anaeróbicas, sea por respiración de nitratos o por
fermentación para el catabolismo de glucosa, xilosa y celobiosa (Sauer et al., 1996;
Espinosa de los Monteros et al., 2001). Esto plantea la necesidad de generar
conocimiento básico del metabolismo y consumo de glucosa, xilosa y celobiosa en
condiciones anaeróbicas, y de xilosa y celobiosa en condiciones aeróbicas de B.
subtilis, que sirvan de base a futuros proyectos que conlleven al desarrollo de cepas de
B. subtilis con aplicaciones para nuevos bioprocesos.
4
ANTECEDENTES
_________________________________________________________________________________________________________
3. ANTECEDENTES
3.1 Características de Bacillus subtilis.
El genero Bacillus incluye a una variedad de especies utilizadas ampliamente en la
industria de fermentación (Zukowski, 1992). Los microorganismos representativos son
bacterias aerobias, Gram positivas formadoras de endoesporas (Slepecky, 1992;
Devine, 2000). Este genero comprende mas de 50 especies y esta subdividido dentro
de 6 grupos considerando la variedad morfológica y metabólica de cada especie (Tabla
3.1; Priest 1993). La mayoría de las cepas de Bacillus son microorganismos mesófilos
que crecen satisfactoriamente, produciendo colonias de buen tamaño en 24 h, a 37ºC.
Sin embargo especies como B. stearothermophilus crecen en rangos de temperatura
de 50 a 70ºC, mientras que para B. larvae y B popilliae su temperatura óptima de
crecimiento es de 25-30ºC.
El grupo II, también conocido como grupo de Bacillus subtilis, esta formado por
bacterias que catabolizan un amplio rango de carbohidratos por las vías de EmbdenMeyerhof-Parnas (glicólisis) y de pentosas fosfato. La mayoría de estas bacterias
crecen en condiciones anaeróbicas por respiración de nitratos a excepción de B.
megaterium y B. pumilus, mientras que algunas como B. cereus, B. licheniformis y B.
thuringiensis fermentan azúcares en ausencia de un aceptor final de electrones
(Shariati et al., 1995).
En lo que se refiere a B. subtilis, este fue considerado por mucho tiempo como un
microorganismo aerobio estricto, sin embargo fue hasta 1993 cuanto Priest dio a
conocer la habilidad de B. subtilis para crecer en condiciones anaeróbicas. Esta
reportado que en ausencia de oxígeno, B. subtilis puede crecer bajo respiración de
nitratos o, en contados reportes, por fermentación en medios ricos con glucosa y
piruvato (Hoffmann et al 1995; Nakano et al., 1997; Nakano y Zuber, 1998; Espinosa de
los Monteros et al., 2001).
5
ANTECEDENTES
_________________________________________________________________________________________________________
Tabla 3.1 Características del genero Bacillus.
(Priest, 1993)
Grupo
Características del grupo
I
Anaerobios facultativos, crecen rápidamente en ausencia de
oxígeno. Producen ácidos a partir del metabolismo de una amplia
variedad de azúcares.
Ej. B. polymyxa y B. macerans.
II
Producen ácidos a partir del metabolismo de una amplia variedad de
azúcares, incluyendo glucosa. La mayoría es hábil para crecer, al
menos lentamente, en ausencia de oxígeno, particularmente en
presencia de nitratos. Las esporas son elipsoides y no hinchan la
célula progenitora.
Ej. B. subtilis.
III
Aerobios estrictos, no producen ácidos a partir del metabolismo de
azúcares. Producen esporas que hinchan a la célula progenitora.
Ej. B. brevis.
IV
Producen esporas esféricas que pueden hinchar a la célula
progenitora y contienen L-lisina u ornítina en la pared celular.
Aerobios estrictos, algunos presentan una habilidad limitada para
producir ácidos a partir del metabolismo de azúcares.
Ej. B. sphaericus.
V
Especies termófilas, con temperaturas de crecimiento menores a
50°C. Fisiológica y morfológicamente son heterogéneos, pero
producen esporas ovales que hinchan a la célula progenitora.
Ej. B. stearothermophilus, B. thermocloacae, B. kaustophilus y B.
coagulans.
VI
Especies termófilas y acidófilas con ácidos grasos alicíclicos en la
membrana.
Ej. B. acidocaldarius, B. acidoterrestris y B. cycloheptanicus.
No
B. benzoevorans, B. fastidiosus y B. naganoensis.
Clasificados
B. subtilis, después de E. coli y Saccharomyces cerevisiae, es uno de los
microorganismos mejor caracterizados dentro de la investigación microbiológica básica
y aplicada y en aspectos de biología molecular (Nakano y Hulett, 1997), es
6
ANTECEDENTES
_________________________________________________________________________________________________________
ampliamente utilizado en la industria alimenticia por ser considerado (por la FDA),
como un organismo seguro para su uso en alimentos (GRAS, generally regarded as
safe; Zukowski, 1992, Devine, 2000). Sin embargo, un factor limitante para su uso en la
producción de proteínas heterologas, es la síntesis y excreción de proteasa
extracelulares en el medio de cultivo (Ye et al., 1996; Stephenson et al., 1999). Hasta la
fecha son ocho las proteasas que se han identificado en B. subtilis, las cuales están
clasificadas en dos grandes grupos: serinoproteasas y metaloproteasas (Stephenson et
al., 1999). La síntesis de estas proteasas extracelulares esta fuertemente regulada y la
inducción usualmente ocurre durante la etapa de transición de la fase de crecimiento
exponencial a la fase estacionaria (Stephenson et al., 1999). No obstante el desarrollo
tecnológico en la biología molecular ha permitido que varios grupos de investigación se
dediquen al diseño y construcción de nuevas cepas de B. subtilis deficientes en la
producción de proteasas, las cuales se pueden utilizar para su aplicación en nuevos
procesos biotecnológicos (Ye et al., 1996)
3.2 Metabolismo de azúcares
Las principales fuentes de carbono para los organismos vivos son los carbohidratos.
Estos constituyen la clase más abundante de moléculas biológica, las cuales por
oxidación, proveen a la célula de esqueletos de carbono y la energía necesaria para
llevar acabo los procesos metabólicos. La fuente natural de carbohidratos más
abundante para los microorganismos lo constituye la biomasa vegetal. Las plantas
producen una gran cantidad de polisacáridos, los cuales sirven como sustratos a los
hongos y bacterias del suelo. Bacillus subtilis es un organismo aislado del suelo, que
participa conjuntamente con otras bacterias en las primeras etapas de descomposición
de la biomasa vegetal (Mota et al., 1999) y que mediante el uso de carbohidrolasas
extracelulares degrada varios polisacáridos presentes en estos materiales, produciendo
oligo, di o mono sacáridos que son transportados, fosforilados y subsecuentemente
catabolizados vía glicólisis o pentosas fosfatos (Stülken y Hillen, 2000; Rodionov et al.,
2001).
7
ANTECEDENTES
_________________________________________________________________________________________________________
B. subtilis puede utilizar un intervalo amplio de carbohidratos (alrededor de 18
diferentes mono o disacáridos; tabla 3.2) como fuente de carbono y energía (Krispin y
Allmansberger, 1998; Stϋlken y Hillen; 2000, Rodionov et al., 2001). Sin embargo, dos
azúcares que frecuentemente se encuentran en la naturaleza, la D-xilosa y la Dgalactosa, no pueden ser utilizados por B. subtilis como únicas fuentes de carbono, lo
cual es sorprendente ya que este microorganismo sintetiza todas las proteínas
necesarias para metabolizar ambos azúcares. En 1998, Krispín y Allmansberger,
investigando el efecto tóxico de la galactosa en cepas de B. subtilis (galE negativo),
obtuvieron mutantes espontáneas de B. subtilis 168, las cuales eran hábiles para
crecer en D-galactosa como única fuente de carbono. La caracterización de esas
mutantes revelaron que el transportador para arabinosa (AraE) funcionaba como
transportador para 3 diferentes azúcares: arabinosa, xilosa y galactosa, y en
consecuencia podían ser metabolizados.
Estos investigadores concluyeron que una simple mutación era suficiente para convertir
una cepa de B. subtilis 168 en una derivada capaz de importar galactosa y xilosa, y que
además en presencia de L-arabinosa se induce la utilización de xilosa y galactosa, lo
cual parece lógico sabiendo que en la naturaleza los tres azúcares forman parte de la
pared celular de las plantas y raramente se encuentran solos como única fuente de
carbono (Krispin y Allmansberger, 1998).
8
ANTECEDENTES
_________________________________________________________________________________________________________
Tabla 3.2 Azúcares catabolizados por B. subtilis.
(Stϋlken y Hillen, 2000)
Azúcar
Ruta metabólica
Celobiosa
Glicólisis
Fructosa
Glicólisis
Glicerol
Glicólisis
Glucitol
Glicólisis
Glucosa
Glicólisis
Glucosamina
Glicólisis
Maltosa
Glicólisis
Manitol
Glicólisis
Manosa
Glicólisis
Sacarosa
Glicólisis
Trehalosa
Glicólisis
N-Acetil-glucosamina
Glicólisis
Oligo- β- glucósido
Glicólisis
Oligo- β- manósido
Glicólisis
β-glucósido
Glicólisis
Inositol
Ruta metabólica especial
Arabinosa
Pentosas Fosfato
Galactosa
Pentosas Fosfato
Gluconato
Pentosas Fosfato
Ribosa
Pentosas Fosfato
Xilosa
Pentosas Fosfato
3.3 Fermentación
Los microorganismos frecuentemente se enfrentan con cambios drásticos en su
hábitat, siendo la disponibilidad de nutrientes y de oxígeno una de las más importantes.
Estas fluctuaciones traen consigo cambios en su metabolismo celular, tales como
9
ANTECEDENTES
_________________________________________________________________________________________________________
ajustes en las rutas metabólicas y en las velocidades de utilización de las fuentes de
carbono, en el flujo de electrones para el mantenimiento del balance redox, en los
mecanismos para la producción de energía y en ciertas reacciones biosintéticas
(Nakano y Zuber, 1998). Los principales cambios en el metabolismo ocurridos debido a
la
presencia
o
ausencia
de
oxigeno,
están
dados
al
nivel
de
glicólisis,
fundamentalmente en el destino de los dos productos de esta vía: el piruvato y el
NADH.
La glicólisis juega un papel clave dentro del metabolismo energético de los
microorganismos, pero con esta vía solo se puede aprovechar una pequeña fracción de
la energía, suficiente para sintetizar 2 moléculas de ATP por cada molécula oxidada de
glucosa, la mayor parte de la energía permanece almacenada en forma de piruvato y
NADH + H+. Este último debe ser continuamente regenerado para el mantenimiento del
flujo glicolítico. En presencia de oxigeno, el NADH + H+ es reoxidado por medio de la
cadena respiratoria, con la formación de una fuerza protón motriz la cual permite
generar ATP. Por otro lado, el piruvato es convertido a CO2 y Acetil CoA, este último es
subsecuentemente oxidado a dióxido de carbono, generando ATP, GTP y poder
reductor (NADH + H+ y FADH + H+) mediante el ciclo de Krebs. En ausencia de un
aceptor de electrones, por ejemplo el oxígeno (en respiración aerobia) o nitratos (en
respiración anaerobia), el NADH + H+ es regenerado por fermentación, mediante la
conversión del piruvato en varios productos finales (alcoholes, ácidos orgánicos y
solventes) mientras que el ATP es generado a nivel de fosforilación de sustrato. Los
productos finales generados a partir del piruvato son específicos para cada
microorganismo, característicos de cada especie, de las condiciones y de la fase de
crecimiento.
E. coli es un microorganismo anaerobio facultativo, que en condiciones anaeróbicas
presenta una fermentación mixta de ácidos orgánicos a partir del metabolismo de
glucosa con la formación de etanol, succinato, D-lactato, acetato, fórmico, hidrógeno y
dióxido de carbono como productos finales (Böck y Sawers, 1996; Chang et al., 1999,
Cruz Ramos et al., 2000). En el caso de Bacillus subtilis, este fue considerado por gran
10
ANTECEDENTES
_________________________________________________________________________________________________________
tiempo como un microorganismo estrictamente aerobio, sin embargo en 1993, Priest
reporto la capacidad de B. subtilis para crecer en condiciones anaerobias respirando
nitratos. A partir de esa fecha algunos grupos de investigación se han enfocado en el
estudio del crecimiento de B. subtilis en condiciones anaeróbicas. Estos estudios han
demostrado la presencia de dos diferentes tipos de crecimiento anaeróbico: la
respiración de nitratos y la fermentación (Hoffmann et al 1995; Nakano y Hulett, 1997;
Nakano et al., 1997; Nakano y Zuber, 1998; Cruz Ramos et al., 2000; Espinosa de los
Monteros et al., 2001).
Cuando se utilizan medios minerales con glucosa como única fuente de carbono, se ha
demostrado la existencia de un crecimiento deficiente por fermentación en B. subtilis,
sin embargo se ha logrado incrementar el crecimiento bajo estas condiciones mediante
la adición de piruvato o mezcla de aminoácidos a dichos medios (Nakano et al., 1997;
Cruz Ramos et, al 2000; Espinosa de los Monteros et al., 2001). Esto debido
probablemente a que la cantidad de piruvato acumulado por el metabolismo de glucosa
no es suficiente para la inducción de la expresión de los genes involucrados en el
catabolismo de piruvato (inducción por sustrato), o para activar algunas enzimas
involucradas en este proceso, o problemas en la regeneración de cofactores oxidados,
y por ello sea necesario la adición de piruvato exógeno o de mezclas de aminoácido ya
que algunos aminoácidos sirven como precursores de piruvato (Nakano et al., 1997)
Aún se desconoce el sistema fermentativo de B. subtilis y varios grupos de
investigación han propuestos rutas metabólicas posiblemente involucradas, en base a
los productos finales identificados y a la secuencia de genes reportados a partir del
proyecto de secuenciación del genoma completo de B. subtilis (figura 3.1. Kunst et al.,
1997; Nakano et al., 1997; Nakano y Zuber, 1998; Cruz Ramos et al., 2000). En medios
minerales en presencia de glucosa y piruvato, se han identificado acetato, etanol,
lactato y pequeñas cantidades de acetoina y 2,3-butanodiol como principales productos
de fermentación (Nakano et al., 1997; Nakano y Zuber, 1998), sin embargo bajo las
mismas condiciones de cultivo, Cruz Ramos et al (2001) identificaron la presencia de
lactato, acético y 2,3-butanodiol como únicos productos de fermentación. En medios
11
ANTECEDENTES
_________________________________________________________________________________________________________
ricos con glucosa se reporta la presencia de lactato como único producto de
fermentación (Espinosa de los Monteros et al., 2001). Lo anterior sugiere la presencia
de varias rutas metabólicas involucradas en el proceso de fermentación de B. subtilis,
las cuales aún no han podido ser identificadas completamente.
Lactato
NAD+
(LDH)
NADH + H+
Acetolactato
(ALS)
(ALDC)
(PYC)
Piruvato
NAD+
(PDH)
NADH + H+
Acetoina
NADH + H
NAD
+
+
NADH + H+
(AR)
NAD+
(ALDH)
Acetaldehído
NADH + H+
(ADH)
NADH + H+
(MDH)
NAD+
Malato
Acetil CoA
2,3-Butanodiol
NAD+
Oxalacetato
(FUM)
(PTA)
Acetil-fosfato
ADP
(ACK)
ATP
Fumarato
(FRD)
Succinato
FADH + H+
FAD+
Acetato
Etanol
Figura 3.1 Rutas metabólicas de fermentación propuestas para Bacillus subtilis.
(Nakano et al., 1997).
Las letras en paréntesis indican las enzimas que catalizan la reacción correspondiente: ACK,
acetato quinasa; ADH, alcohol deshidrogenasa; ALCD, acetolactato descarboxilasa; ALDH,
aldehido deshidrogenasa; ALS, acetolactato sintasa; AR, acetoina reductasa; FRD, fumarato
reductasa; FUM, fumarasa; LDH, lactato deshidrogenasa; MDH, malato deshidrogenasa; PDH,
piruvato deshidrogenasa; PTA, fosfotransacetilasa; PYC, piruvato carboxilasa.
3.4 Respiración de Nitratos
Los microorganismos aeróbicos emplean oxigeno molecular para extraer energía a
partir del NADH+ H+ y FADH + H+ obtenidos en la glicólisis y el ciclo de Krebs, sin
12
ANTECEDENTES
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embargo el sistema respiratorio esta diseñado para oxidar una amplia variedad de
sustratos y utilizar algunos de estos compuestos como aceptores finales de electrones
en ausencia del oxígeno. En E. coli se han identificado una amplia variedad de
compuestos utilizados como aceptores finales de electrones entre ellos oxígeno,
fumarato, nitrato, nitrito, S y N-oxidos, tetratinatos y tiosulfatos (Gennis y Stewart,
1996). Uno de los aceptores preferentemente utilizado por los microorganismos,
cuando el oxígeno esta ausente, es el nitrato. La respiración de nitrato (NO3-) esta
ampliamente distribuida entre las especies bacterianas, incluyendo las enterobacterias
(Gennis y Stewart, 1996), debido a su alto potencial redox (E°=+430mV), además de
que inhibe la síntesis de enzimas involucradas en la respiración de otros aceptores de
electrones (Gennis y Stewart, 1996; Nakano y Zuber, 1998).
Como otros miembros del género Bacillus, B. subtilis tiene la habilidad de utilizar
nitratos como un aceptor alternativo de electrones (Cruz Ramos et al., 2000). En el
caso de B. subtilis, cuyo hábitat es el suelo, las fluctuaciones en la disponibilidad de
oxígeno son derivadas por los cambios en el contenido de agua de este, por ello la
utilización de nitrato o nitrito como aceptor terminal de electrones es razonable,
considerando que estos están presentes normalmente en el suelo en altas
concentraciones (Nakano y Zuber, 1998). La utilización de otros aceptores de
electrones durante el crecimiento anaeróbico no ha sido reportada, siendo la
respiración de nitratos o nitritos la única forma anaeróbica de respiración conocidas
para B. subtilis. (Nakano y Hulett, 1997; Nakano y Zuber, 1998; Espinosa-de-losMonteros, 2001).
13
PREGUNTAS RELEVANTES DEL PROYECTO
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4 PREGUNTAS RELEVANTES DEL PROYECTO
Bacillus subtilis es un microorganismo del cual se conoce su habilidad para metabolizar
una amplia variedad de azúcares. No obstante, solo se ha estudiado y caracterizado su
crecimiento aerobio y parcialmente anaerobio utilizando glucosa como fuente de
carbono. Si se pretende utilizar este microorganismo en cultivos en los cuales se
empleen fuentes de carbono renovables y de bajo costo, tales como los azúcares
mayoritarios presentes en hidrolizados, químicos o enzimáticos, de las fracciones
hemicelulósica y celulósica del bagazo de caña, es necesario responder:
Cual es la eficiencia de B. subtilis para consumir y metabolizar celobiosa y xilosa
como únicas fuentes de carbono en condiciones aeróbicas.
Si tiene la capacidad de fermentar glucosa, celobiosa y xilosa con medios ricos y,
principalmente, con el uso de medios minerales.
Cuales son los principales productos que se obtiene en condiciones de
fermentación con medios minerales-glucosa, celobiosa y xilosa.
Determinar las velocidades específicas de crecimiento y de consumo de azúcares,
así como de formación de productos que se obtienen tanto en condiciones aeróbicas
como anaeróbicas.
Cómo es su crecimiento aerobio y anaerobio en mezclas binarias de glucosacelobiosa y glucosa-xilosa.
HIPÓTESIS
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5 HIPÓTESIS
Por reportes de la literatura, se sabe que las cepas silvestres de Bacillus subtilis tienen
la capacidad para metabolizar una amplia variedad de azúcares, entre ellos glucosa y
celobiosa. El metabolismo de glucosa esta documentado para condiciones aerobias,
sin embargo la utilización de celobiosa en procesos de fermentación no lo esta. Al ser
la celobiosa un dimero de glucosa, conociendo que B. subtilis posee una β-glucosidasa
y que requiere de dos ATPs para fosforilar las dos moleculas producto de la hidrólisis
de la celobiosa, se plantea que este microorganismo puede utilizar y metabolizar este
azúcar con eficiencias similares a la glucosa. Por otro lado, reportes previos indican
que las cepas silvestres de B. subtilis 168 carecen de un sistema de trasporte
especifico para xilosa, por lo cual no crecen en presencia de dicho azúcar como única
fuente de carbono. No obstante B. subtilis posee todos los genes necesarios y por
consiguiente enzimas para su metabolismo. En consecuencia, aprovechando la
capacidad de este microorganismo para mutar, en el presente proyecto planteamos
generar y aislar mutantes, que potencialmente transporten y metabolicen xilosa con
eficiencias similares a glucosa.
Es sabido que en condiciones aeróbicas B. subtilis produce acético como producto del
metabolismo primario de glucosa, y en condiciones anaeróbicas en medios ricos
mezclas de láctico, acético, acetoina y 2, 3-butanodiol. En este sentido planteamos que
este
microorganismo
potencialmente
metabolizando celobiosa o xilosa.
producirá
los
productos
citados
arriba
OBJETIVOS
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6. OBJETIVOS DEL PROYECTO
GENERAL
Caracterizar a nivel fermentador parámetros cinéticos de crecimiento y de formación de
productos con Bacillus subtilis en condiciones aerobias y anaerobias utilizando como
fuentes de carbono glucosa, xilosa y celobiosa.
PARTICULARES
Instalar y realizar pruebas de arranque de control automático de 6 fermentadores de
1 litro.
Evaluar el crecimiento, la velocidad específica de crecimiento y de consumo de
azúcares, rendimientos y velocidades específicas de formación de productos de
Bacillus subtilis en condiciones aeróbicas y anaeróbicas con glucosa, xilosa, celobiosa
y mezclas de glucosa-xilosa y glucosa-celobiosa.
Evaluar el potencial de Bacillus subtilis para fermentar glucosa.
Evaluar la tolerancia a etanol y furfural de Bacillus subtilis WB700CH2 en condiciones
anaeróbicas.
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MATERIALES Y MÉTODOS
_________________________________________________________________________________________________________
7. MATERIALES Y MÉTODOS
7.1 Microorganismos.
Los microorganismos utilizados en el presente estudio se presentan en la tabla 6.1.
Tabla 6.1 Cepas de Bacillus subtilis
Designación
168
BB80
WB700
Genotipo Relevante
Referencia
TrpC2
Cepario del Laboratorio
∆nprE glyB hisA
Cepario del Laboratorio
TrpC2 nprE aprE epr bpf ∆mpr::ble
Ye et al., 1996
∆nprB::bsr ∆vpr::ery
WB700CH1
WB700 Trp+
Este trabajo
WB700CH2
WB700 Trp+ xil+
Este trabajo
Inicialmente se seleccionó la cepa de B. subtilis WB700 debido a que tiene eliminados
y/o interrumpidos los genes que codifican para las siete proteasas mayoritarias de este
microorganismo, disminuyendo de esta manera su actividad proteolítica a tan solo
0.32% con respecto a su cepa progenitora (Ye et al., 1996). Esta cepa se esta
utilizando en el Laboratorio de Ingeniería Metabólica del Departamento de Ingeniería
Celular y Biocatálisis del Instituto de Biotecnología para expresar proteínas
heterólogas. Es bien sabido que B. subtilis es buen productor de proteasas y que éstas
tienen la capacidad de hidrolizar varias proteínas heterólogas, por lo cual se considera
que WB700 constituye una buena cepa receptora para expresar de manera estable
proteínas recombinantes heterólogas dada las manipulaciones realizadas en WB700
(Ye et al., 1996). Esta cepa presenta resistencia a eritromicina, lincomicina y
cloranfenicol. En la mayor parte de los estudios realizados se utilizaron las cepas
WB700CH1 y WB700CH2, las cuales se obtuvieron en el presente trabajo a partir de
WB700 y se describen en secciones posteriores.
17
MATERIALES Y MÉTODOS
_________________________________________________________________________________________________________
7.2 Generación de un banco de células.
Para obtener inóculos bajo las mismas condiciones a lo largo de todo el estudio, y
disminuir variaciones en los cultivos, se generaron bancos de células con las cepas
168, WB700, WB700CH1 y WB700CH2.
Las cepas se crecieron en medio sólido con agar (15 g/l) utilizando los componentes
indicados en la siguiente sección (6.3). Las cajas se incubaron a 37°C hasta obtener
colonias de tamaño mayor a 1mm de diámetro (aprox. 24 horas). De estas cajas se
transfirieron de 3 a 5 colonias aisladas a un tubo de ensaye estéril conteniendo 1 ml del
medio respectivo, resuspendiéndolas mediante agitación con la ayuda de un vortex.
Esta suspensión se utilizó como semilla para el desarrollo de los preinóculos. Con ésta
se inocularon 100 ml de medio de cultivo y se incubaron hasta que se alcanzó la fase
de crecimiento exponencial, a aproximadamente 22 horas de cultivo, alcanzando una
DO600
nm
≈ 3.5. Muestras de 2 ml se almacenaron en crioviales con glicerol al 40% a
–70°C. Las cepas, a excepción de la WB700CH2, se crecieron en medio Luria y
mineral 10 g/l de glucosa. La cepa WB700CH2 se creció con 10 g/l de xilosa.
7.3 Medios de cultivo.
En la evaluación del metabolismo de azúcares en condiciones aeróbicas y anaeróbicas
se utilizaron dos medios de cultivo: medio Luria Bertani (Wang, 1992) y medio mineral
(Martínez et al., 1997), ambos suplementados con 10 g/l de azúcar.
En la evaluación de crecimiento en mezclas de azúcares se utilizó medio mineral con 5
g/l para cada uno de los azúcares evaluados.
Para la evaluación de la tolerancia a etanol y furfural, los cultivos se llevaron acabo en
condiciones anaeróbicas utilizando medio LB suplementado con 10 g/l de glucosa. Las
concentraciones de los inhibidores utilizadas se detallan en la sección de resultados.
En condiciones anaeróbicas, para algunos casos el medio mineral fue suplementado
con diferentes concentraciones de extracto de levadura industrial (ELI) o sólidos de
licor de maíz (SLM), tal y como se detalla en la sección de resultados.
18
MATERIALES Y MÉTODOS
_________________________________________________________________________________________________________
En todos los casos los azúcares se esterilizaron por calor húmedo (121oC, 20 min) por
separado y se mezclaron, una vez fríos y previo a la inoculación, con los otros
componentes del medio.
La composición del medio Luria Bertani fue (por litro) 10 g de Bacto-Triptona, 5 g de
extracto de levadura y 5 g de cloruro de sodio.
La composición del medio mineral fue (por litro) 10 g de azúcar, 4 g de (NH4)2SO4, 5.32
g de K2HPO4, 6.4 g de KH2PO4, 10 mg de ácido cítrico, 0.4 g de MgSO4.7H2O, 5 mg de
MnCl2, 40 mg de CaCl2, 30 mg de FeSO4.7H2O. El sulfato de amonio y las sales de
fosfato se esterilizaron juntos (por calor) y se prepararon soluciones patrón de los otros
componentes del medio, los cuales se esterilizaron por filtración (0.22 µm) y se
adicionaron al medio base antes de inocular los cultivos.
7.4 Condiciones de cultivos.
7.4.1 Cultivos aeróbicos
Los cultivos aeróbicos se realizaron en fermentadores Applikon (Capitulo 8.1) con un
volumen de trabajo de 500 ml, equipados con turbina tipo Rushton de 6 paletas planas.
La temperatura fue controlada a 37°C. El pH se mantuvo a 7.0 mediante adiciones
automáticas de KOH 1N y 2N, y cuando fue necesario se llevaron acabo adiciones
automáticas de ácido fosfórico 0.5 M. La espuma fue controlada mediante adiciones
manuales de Silicón grado alimenticio al 10% (Droguería Cosmopolita). El oxígeno
disuelto fue controlado por arriba del 20% (con respecto al valor de saturación en aire)
mediante
un
control
Proporcional-Integral-Derivativo
(PID),
por
incrementos
automáticos en la velocidad de agitación. Los parámetros de control fueron
determinados empíricamente y se ajustaron a valores de 3, 1500 y 0 para el
proporcional, integral y derivativo, respectivamente. La velocidad de agitación inicial fue
de 600 rpm con un flujo constante de aire, 1 vvm. Los cultivos fueron monitoreados y
controlados mediante el Biocontrolador ADI 1010, la adquisición de datos se llevó a
cabo con la ayuda de una computadora personal mediante el software Bioexpert 1.20x
de Applikon.
19
MATERIALES Y MÉTODOS
_________________________________________________________________________________________________________
7.4.2 Cultivos anaeróbicos
Los cultivos anaeróbicos se realizaron en sistemas de mini-fermentadores o minifleakers (Beall et al., 1991; Anexo 12.3), con un volumen de trabajo de 200 ml. La
temperatura fue controlada a 37°C y el pH se mantuvo a 7.0 mediante la adición
automática de KOH 2N. Los cultivos se mantuvieron a una velocidad de agitación de
100 rpm para garantizar el mezclado de los nutrientes.
7.4.3 Desarrollo de inóculos
Para el desarrollo de inóculos se adicionó 1 ml del preinóculo en glicerol por cada 100
ml de medio. Los inóculos se incubaron durante 22 h, hasta alcanzar una DO600 de
aproximadamente 2.5, a 37°C y a 250 rpm para los cultivos en condiciones aeróbicas y
a 120 rpm para los cultivos anaeróbicos. Todos los cultivos fueron inoculados
centrifugando (5000 rpm; 10 min; 25°C) la cantidad suficiente de inóculo para obtener
una DO600 inicial ≈ 0.5, las células fueron transferidas a cada cultivo resuspendiéndolas
en una pequeña cantidad de NaCl 10 mM en el caso de los cultivos aeróbicos y en el
medio respectivo en el caso de los cultivos anaeróbicos (la variación de la
concentración inicial celular en todos los cultivos se debe al error experimental).
La evaluación de los cultivos se realizó en medio Luria y mineral con 10 g/l de azúcar.
Todos los cultivos se realizaron por duplicado y en los resultados se presentan los
promedios de los mismos.
Los parámetros evaluados fueron: velocidad específica de crecimiento (µ); rendimiento
Biomasa / sustrato (YX/S); velocidad específica de consumo de azúcar (qS); producto
final, así como la velocidad específica de formación de producto (qP), los cuales se
determinaron durante la fase de crecimiento exponencial y fueron corregidos por factor
de dilución en función de la base o ácido adicionado a los cultivos para el control de pH
(Ver anexo 12.6).
20
MATERIALES Y MÉTODOS
_________________________________________________________________________________________________________
7.5 Transformación de B. subtilis WB700. Eliminación de auxotrofia a
triptófano.
La eliminación de la auxotrofia a triptófano presentada por la cepa WB700, se llevó a
cabo mediante técnicas de biología molecular empleadas en el Laboratorio de
Ingeniería Metabólica del Departamento de Ingeniería Celular y Biocatálisis del Instituto
de Biotecnología. La misma se basa en la capacidad que tiene B. subtilis para alcanzar
un estado de competencia naturalmente. La competencia es la habilidad de las células
para incorporar y unir ADN exógeno, presente en el medio, a su cromosoma. Esta
capacidad se desarrolla cuando existe una limitación de nutrientes (principalmente de
la fuente de carbono) y se presenta durante la etapa de transición de la fase
exponencial de crecimiento a la fase estacionaria (Devine, 2000).
Para llevar acabo esta transformación se requirieron las siguientes soluciones: Sales
10x, solución de TBI, solución de TBII y medio Luria.
La composición de las sales 10x fue (para 100 ml) 14 g de K2HPO4, 6.0 g de KH2PO4,
2.0 g de (NH4)2SO4, 1.0 g de citrato de sodio. La solución TBI contiene (por cada 2.5 ml
de sales 10x): 0.05% de glucosa, 5mM de MgSO4, 0.02% de casa aminoácidos, 50
µg/ml de Trp. La solución TBII contiene (por cada 2.5 ml de sales 10x): 0.05% de
glucosa, 5mM de MgSO4, 0.01% de casa aminoácidos, 5 µg/ml de Triptófano.
Se inoculó 1 ml de solución TBI en un tubo de 150 x 15 mm, con colonias frescas de B.
subtilis WB700 y se incubaron a 37°C hasta que las células alcanzaron el estado de
competencia (9 h aproximadamente). Se transfirieron 250 µl de cultivo a 2.25 ml de
solución TBII y se agregaron 10 µl de ADN cromosomal extraído de la cepa BB80 (Trp+;
anexo 12.2). Se incubaron durante 1.5 h a 37°C. Una vez concluido el tiempo de
incubación, se procedió a estriar cajas de medio mineral sin Trp, con 200 µl de medio
de cultivo e incubándose a 37°C durante 48 h, de esta forma solo se desarrollaron y
aislaron aquellas colonias que adquirieron la habilidad para crecer en ausencia de
triptófano. Adicionalmente, para evitar tener colonias que hubieran recuperado los
genes para la producción de proteasas, las colonias obtenidas se purificaron realizando
21
MATERIALES Y MÉTODOS
_________________________________________________________________________________________________________
un pase a cajas de medio mineral sin triptófano con eritromicina (Em) 5 µg/ml y
lincomicina (Lm) 5 µg/ml, debido a que WB700 fue seleccionada mediante la
resistencia presentada a estos antibióticos y de esta manera se aseguró seguir
conservando el genotipo original. Una vez probado que las cepas no habían perdido la
resistencia a Em y Lm, a manera de comprobación, las colonias purificadas se
sembraron en cajas de medio sólido de leche descremada (Skim milk) con Em 5 µg/ml
y Lm 5µg/ml, incubándose durante 12 h a 37°C.
7.6 Generación de mutantes de B. subtilis Xil+.
Se siguió el procedimiento descrito por Schiedel y Hillen (1996). La cepa WB700CH1
se sembró en cajas de medio mineral con xilosa (10 g/l), a partir de colonias obtenidas
de cajas de medio mineral con glucosa. Las cajas se incubaron a 37°C durante 72 h,
observándose poco crecimiento (colonias muy pequeñas). Estas colonias fueron
resembradas nuevamente en cajas medio mineral con xilosa. Después de varios pases
se logró observar un crecimiento similar al presentado en cajas de medio mineral con
glucosa con la misma cepa, obteniéndose colonias grandes (1 mm) y homogéneas a un
tiempo de incubación aproximado de 36 h.
7.7 Concentración Celular
La concentración celular se midió en un espectrofotómetro Perkin Elmer Lambda 11 y
fue convertido a peso seco de células (DWC) de acuerdo con una curva de calibración
realizada: 1 DO600nm = 0.35 gDWC /l (Anexo 12.1). El monitoreo de los cultivos se llevó
acabo tomando dos muestras de 1 ml cada una, centrifugándolas a 5,000 rpm durante
5 min. Los sobrenadantes se almacenaron a –70°C hasta su análisis.
7.8 Determinación de azúcares.
El consumo de azúcares se determinó mediante el método de azúcares reductores del
ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS; Chaplin y Kennedy, 1987) y por técnicas de
cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC). En el caso de medio mineral
suplementado con extracto de levadura industrial o sólidos de licor de maíz, la
determinación de glucosa se realizó mediante un analizador enzimático.
22
MATERIALES Y MÉTODOS
_________________________________________________________________________________________________________
7.8.1 Método de azúcares reductores (DNS)
Este consiste en agregar 1.0 ml del reactivo de DNS a un volumen de 0.1 ml de
muestra o estándar, calentar a ebullición durante 10 min, una vez terminado el tiempo
de reacción enfriar durante 5 min en un baño de agua a temperatura ambiente y leer la
absorbancia a 570 nm. Las mediciones se realizaron en un espectrofotómetro (Perkin
Elmer Lambda 11).
El reactivo de DNS se prepara disolviendo 75 g de tartrato de sodio y potasio en 100 ml
de agua destilada, agregando después 50 ml de NaOH 2M y 75 ml de agua destilada
caliente, entonces se adiciona lentamente 0.25 g de ácido 3,5-dinitrosalicílico hasta
disolver por completo.
7.8.2 Cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC)
La determinación por HPLC, se llevó acabo por cromatografía isocrática con H2SO4 5
mM como fase móvil a un flujo de 0.5 ml/min en una columna Aminex HPX-87H a 50
°C. La detección se hizo simultáneamente con un detector de arreglo de diodos
(Waters 996) y un detector de índice de refracción (Waters 410). El análisis y
procesamiento de datos se realizó con el sistema Milenium Versión 3.01 Waters).
7.8.3 Determinación enzimática de glucosa
La determinación enzimática de glucosa se llevó acabo en un analizador Bioquímico
YSI mod. 2700, utilizando D-glucosa oxidasa inmovilizada.
7.9 Determinación de ácidos orgánicos
La concentración de acético y lactato fue obtenida por técnicas de HPLC, utilizando las
mismas condiciones que para la determinación de azúcares. En el caso de lactato,
también fue cuantificado mediante un analizador Bioquímico (YSI modelo 2700),
utilizando L-lactato oxidasa inmovilizada.
23
INSTALACIÓN DE EQUIPO DE FERMENTACIÓN
_________________________________________________________________________________________________________
8. INSTALACIÓN DE EQUIPO DE FERMENTACIÓN
8.1 Descripción del equipo
El equipo de fermentación para cultivos aerobios que se instaló y puso en marcha,
consiste de 6 fermentadores de la compañía Applikon (Dependable Instrument, B.V
Schiedam, Holanda). Para llevar a cabo la adquisición de datos en línea y estrategias
avanzadas de control automático, los fermentadores, en grupos de tres, están
conectados por medio de tres puertos seriales (RS232) a dos computadoras
personales. Cada sistema (figura 8.1), esta integrado por:
a)
Bioreactor
Constituido por una jarra de fermentación, con volumen nominal de 1,250 ml, volumen
de trabajo mínimo de 350 ml y máximo de 900 ml La relación altura de líquido/diámetro
interno del reactor (H/D) es de 1.5 para un volumen de operación de 900 ml. El sistema
de agitación está integrado por 2 turbinas Rushton de 45 mm de diámetro total con 6
paletas planas y un motor de velocidad variable (mod. P100; rango de velocidad: 01250 rpm), cuenta además con 2 deflectores, dispersor de aire de orificio, sistema de
enfriamiento mediante recirculación de agua a través de los deflectores, calentamiento
por medio de una mantilla térmica de 110 W, sensores de pH (rango: 0-14), de oxígeno
disuelto (rango: 0-500% de saturación en aire) y de temperatura (rango: 0-150ºC).
b)
Biocontrolador ADI 1010
El cual lleva acabo la medición y control de las variables de proceso: pH, temperatura,
oxígeno disuelto, nivel de líquido o adición de antiespumante y velocidad de agitación.
Este funciona mediante un control de tipo Proporcional-Integral-Derivativo (PID). El
control PID funciona por medio de actuadores. Los actuadores para cada variable son:
Para el control del oxígeno disuelto:
Velocidad de agitación.
Flujo de aire (válvula de aire)
Flujo de oxígeno (válvula de oxigeno)
Flujo de nitrógeno (válvula de Nitrógeno)
24
INSTALACIÓN DE EQUIPO DE FERMENTACIÓN
_________________________________________________________________________________________________________
Biocontrolador
ADI 1010
Bioconsola
ADI 1025
Ro támetros
Bombas
Bioreactor
Figura 8.1 Sistema de fermentación Applikon.
Para el control de pH:
Adición de ácido (bomba de ácido).
Adición de base (bomba de base).
Flujo de CO2 (válvula de CO2)
Para el control de temperatura:
Flujo de agua de enfriamiento (válvula de agua)
Elemento calefactor.
c)
Bioconsola ADI 1025
25
INSTALACIÓN DE EQUIPO DE FERMENTACIÓN
_________________________________________________________________________________________________________
La bioconsola consta esencialmente de los actuadores y recibe las señales del
biocontrolador para llevar a cabo el control de las variables del proceso. La bioconsola
está equipada con:
i) Tres bombas de adición para ácido, base y control del nivel, las cuales pueden ser
operadas de forma manual o automática.
ii) Dos rotámetros, en los cuales se controla de forma manual, mediante una válvula
de aguja, el flujo de aire u oxígeno
iii) Dos válvulas solenoides para controlar la entrada de agua al sistema de
enfriamiento
iv) . Una fuente de poder para la mantilla de calentamiento
d)
Sistema de computo
Mediante un programa de control y de adquisición de datos (Software BioXpert versión
1.20x), cada computadora lleva acabo el monitoreo simultáneo y de ser necesario el
control remoto de 3 sistemas de fermentación. El Software permite llevar acabo:
i) Sí se requiere, el control remoto de los parámetros del cultivo (pH, oxígeno
disuelto, temperatura, nivel, control de espuma) por medio de algoritmos de
control y algoritmos de tipo apagado/encendido (ON/OFF).
ii) El monitoreo del cultivo mediante un registro de datos y gráfico del
comportamiento de cada uno de los parámetros del cultivo.
La adquisición de datos se lleva acabo por periodos de tiempo determinados por el
usuario, en función del tiempo de operación del sistema los periodos de adquisición
pueden variar desde 1 hasta 60 min.
26
INSTALACIÓN DE EQUIPO DE FERMENTACIÓN
_________________________________________________________________________________________________________
8.2 Instalación y puesta en marcha de 6 sistemas de fermentación.
Para la operación adecuada de los sistemas de fermentación, se instalaron válvulas de
alimentación de agua y aire así como la adaptación de una toma de gas LP para la
instalación de un mechero Bunsen auxiliar en el mantenimiento del área estéril durante
la inoculación y toma de muestra. Lo anterior se representa en la figura 8.2
Los Biocontroladores ADI 1010 fueron conectados a fuentes de poder ininterrumpibles
(no-breaks), mientras que las Bioconsolas 1025 fueron conectadas a tomas de
corriente directa de 120 V.
Una vez instalados los seis sistemas de fermentación se realizaron cultivos control
sobre los cuales se llevó acabo la capacitación en el manejo y operación del equipo.
Durante estos se monitoreó la respuesta y el control del biocontrolador.
Los sensores de pH fueron calibrados utilizando amortiguadores certificados de pH 7.0
y 4.0. El sistema de medición de oxígeno disuelto se calibró, con la ayuda de un
simulador de oxÍgeno disuelto (Metler-Toledo, Inc.), a valores de 0 y 100%. Es
importante mencionar que para cada cultivo es necesario, antes de agregar el inóculo
al reactor, calibrar los sensores de oxígeno disuelto a 100% de saturación en aire, esto
es solo con el medio completo a utilizar y a las condiciones operacionales del mismo
(pH, temperatura, flujo de aire y velocidad de agitación).
Los sensores de temperatura se calibraron a temperatura de fusión del hielo y de
ebullición del agua, con la ayuda de un termómetro de mercurio de referencia,
colocando tanto el sensor como el termómetro, en primer lugar en hielo y
posteriormente en agua a ebullición, se tomaron las lecturas del termómetro y con esas
se realizó la calibración respectiva.
27
INSTALACIÓN DE EQUIPO DE FERMENTACIÓN
R
S
P
Colector de agua
de enfriamiento
TF
M
B4
B5
B6
_________________________________________________________________________________________________________
B3
TC
R
FF
R
B1
Aire
Agua
Gas
B2
FC
R
R
D
TF
S
Figura 8.2 Diagrama de tuberías e instrumentación para seis sistemas de fermentación
Applikon.
28
INSTALACIÓN DE EQUIPO DE FERMENTACIÓN
_________________________________________________________________________________________________________
Simbología
Dirección de flujo
Controlador de flujo másico
S
Válvula solenoide
R
P
Válvula de No Retorno
Válvula reguladora de presión
Válvula de compuerta
Nomenclatura
B
Bioconsola
M
Mechero
TF
Flujo hacia el fermentador
TC
Flujo hacia el condensador
FF
Flujo del fermentador
FC
Flujo del condensador
D
Flujo de agua de enfriamiento hacia el
drenaje
Conectores rápidos en T
Manómetro de presión
Manguera de Neopreno No. 15
para agua
Manguera de Silicón flexible No. 15
para agua de enfriamiento
Manguera rígida para aire
Manguera de látex de ¼ para gas
Durante los cultivos control se observó que la respuesta y control automático del
biocontrolador ADI 1010, no eran adecuadas, debido a que no se tenía un control fino y
existía una gran variación de los parámetros de temperatura y oxígeno disuelto. Para
encontrar los valores adecuados de PID se llevó acabo la determinación y el ajuste de
valores PID como se menciona a continuación:
a) Temperatura: el ajuste empírico fue por prueba y error, utilizando agua como
fase líquida. Se emplearon 3 sistemas probando valores arbitrarios. El
Biocontrolador 1010 es un controlador adaptativo que automáticamente realiza
ajustes de los valores PID en función del historial de los cultivos. Sin embargo, la
estabilidad de los parámetros no era buena para un proceso biológico, es decir
se tenía variaciones elevadas en la temperatura, pH, velocidad de agitación y de
oxígeno disuelto de los cultivos. No obstante, los valores obtenidos de manera
automática, en corridas previas, se tomaron como referencia para llevar a cabo
29
INSTALACIÓN DE EQUIPO DE FERMENTACIÓN
_________________________________________________________________________________________________________
las pruebas iniciales. Estas se iniciaron solicitando la misma temperatura a los
tres sistemas y variando el valor de control proporcional (P) de la siguiente
manera: al sistema 1 se le dieron valores menores que el valor determinado de
forma automática, al sistema 2 un valor mayor y el sistema 3 conservó el valor
automático. Se observo por un periodo de tiempo de 1 hora, la variación de la
temperatura requerida como punto de control para diferentes valores de P,
eligiéndose aquel valor con el cual la variación fuera menor. Una vez obtenido
este valor se prosiguió a evaluar el valor integral (I). Este se realizó de la misma
manera que con el valor P. Se observó que con solo el uso de estos dos
parámetros era suficiente para lograr un control adecuado de la temperatura con
variaciones de +/-0.1ºC para temperaturas de 30-37ºC, corroborándose después
con lo observado durante los cultivos realizados. De esta manera los valores PID
determinados para el control de la temperatura fueron 10, 2700 y 0, para las
constantes P, I y D, respectivamente.
b) Oxígeno disuelto: para este caso los valores fueron determinados con cultivos
de Bacillus subtilis en medio mineral durante la fase de crecimiento exponencial.
Se emplearon dos sistemas de fermentación, llevando acabo el ajuste de los
parámetros PID de igual forma que para la temperatura. Los valores obtenidos
fueron 3, 1500 y 0 para P, I y D, respectivamente.
c) pH: Los valores PID obtenidos de forma automática presentaron un mejor control
de este parámetro, por lo que en este caso no fue necesario realizar ningún
cambio.
8.3 Operación de equipo de fermentación
La jarra de fermentación se prepara para su esterilización de acuerdo al esquema
presentado en la figura 8.3 y se esteriliza por calor húmedo a 121°C durante 20 min,
con el medio de cultivo. Para el caso del medio mineral, la jarra se esteriliza solo con
las sales de fosfato y el sulfato de amonio y una vez estéril se adicionan las sales
30
INSTALACIÓN DE EQUIPO DE FERMENTACIÓN
_________________________________________________________________________________________________________
restantes previamente esterilizadas por filtración como se indica en el capitulo 6.3,
esterilizando por separado la fuente de carbono (glc, xil o cel). Una vez estéril y a
temperatura ambiente se adiciona la fuente de carbono y los demás componentes del
medio según sea el caso y se ajusta el volumen de trabajo a 500 ml con agua destilada
estéril. Se ajusta el pH, la agitación y la temperatura a las condiciones de trabajo y una
vez estables se calibra el sensor de oxígeno al 100 % de saturación y se procede
inocular.
Sensor de oxigeno
Sensor de pH
Venteo
Puertos de
adición
Toma de muesta
Puerto de toma
de muestra
Matraz para venteo
Figura 8.3 Preparación del Bioreactor para esterilización.
31
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
9 PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
9.1 Evaluación del crecimiento de Bacillus subtilis WB700
Bacillus subtilis WB700 tiene eliminados o interrumpidos, en el cromosoma, los genes
que codifican para sus 7 proteasas mayoritarias (Ye et al., 1996). En el presente
proyecto se seleccionó la cepa WB700 para ser utilizada posteriormente en la
expresión intra y extracelular de proteínas recombinantes y evitar el efecto de hidrólisis
de las mismas por las proteasas nativas de B. subtilis. La cepa WB700 proviene de la
cepa silvestre de B. subtilis 168 y ambas presentan auxotrofía a triptófano (Trp; tabla
6.1).
Las primeras evaluaciones se realizaron en medio Luria y medio mineral bajo
condiciones aeróbicas. Debido a la auxotrofía presentada, el medio mineral fue
suplementado con 100 µg Trp/ml, requerimiento superior a lo reportado para cepas que
presenta auxotrofía a este aminoácido en E. coli (20 µg/ml de L-triptófano) y para B.
subtilis 168 (40 µg Trp/ml; Schmiedel y Hillen, 1996). En el caso del medio Luria,
debido a su composición, contiene aproximadamente 139 µg Trp/ml (The Difco manual,
11th Edition). Sin embargo, a pesar de que el triptófano se encontraba en exceso tanto
en el medio rico como en el medio mineral empleado, las primeras 4 cinéticas
realizadas con B. subtilis WB700 en medio mineral mostraron velocidades de
crecimiento menores a las reportadas para otras cepas de B. subtilis (tabla 8.1).
Además el porcentaje de azúcar residual al inicio de la fase estacionaria era del 32%,
es decir que la fuente de carbono no era lo que estaba limitando el crecimiento ya que
con medio rico también se observaba ese comportamiento. En cultivos con medio Luria
y mineral, la XMÁX alcanzada fue en promedio 50% menor a lo reportado para otras
cepas derivadas de B. subtilis 168 (BB804), pero que no presentan auxotrofía a ningún
aminoácido (Martínez et al., 1997; tabla 9.1).
Para dilucidar a que se debía el comportamiento presentado en el párrafo anterior, se
llevaron a cabo cinéticas de comparación en medio rico glucosa entre la cepa WB700 y
su progenitora (B. subtilis 168). El objetivo de esta comparación fue determinar si la
32
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
biomasa máxima alcanzada se debía a cambios en el fondo genético (genotipo) de
WB700 o si estaba relacionado con deficiencias en el transporte de triptófano.
La variación entre las velocidades de crecimiento observadas y la biomasa máxima
alcanzada fueron menores al 5% (tabla 9.1), lo cual indica que el fondo genético
(integración de marcadores de selección, e interrupciones y eliminación de genes) de
WB700 no son la causa por la cual la cepa crece deficientemente. Esto permitió sugerir
que la auxotrofía a triptófano en las cepas WB700 y 168 está relacionada con el
crecimiento limitado, probablemente ocasionado por deficiencias en el transporte del
aminoácido. En consecuencia se decidió eliminar la auxotrofía a triptófano en WB700 y
evaluar el crecimiento de las cepas obtenidas en medio mineral con glucosa, a nivel
matraz, con el fin de corroborar dicha hipótesis.
Tabla 9.1 Datos sobre el crecimiento aerobio de distintas cepas de B. subtilis.
Cepa de
B. subtilis
Medio
µ
a
XMAX.
b
(h-1)
0.44
(g/l)
5.21
Glucosa
residual
(g/l)
0.0
Referencia
BB804
Mineral
Glucosa
inicial
(g/l)
11.2
WB700
Mineral
9.5
0.35
2.14
3.0
Este trabajo
WB700
Luria
11.5
0.73
2.84
7.8
Este trabajo
168
Luria
11.6
0.70
2.86
6.9
Este trabajo
Martínez et al.,1997
a
Biomasa máxima obtenida al termino de la fase de crecimiento exponencial.
Glucosa residual al termino de fase de crecimiento exponencial.
b
9.2 Eliminación de auxotrofía a triptófano en la cepa WB700
Se extrajo y purificó ADN cromosomal de otra cepa de B. subtilis, la BB80, la cual no
presenta auxotrofía a triptófano (tabla 6.1). El ADN extraído fue resuspendido en 125 µl
de amortiguador TE. Para conocer su concentración, se corrieron tres distintas
cantidades del extracto de ADN en un gel de agarosa al 1%, el ADN se separó por
técnicas de electroforesis utilizando un marcador de 1kilobase (1 kb DNA ladder
33
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
Fermentas). La concentración del ADN extraído se estimó en base a la intensidad
presentada por las bandas obtenidas. La concentración estimada fue de 16 µg/µl.
Para complementar la auxotrofía a triptófano se llevó acabo una transformación con
células competentes de B. subtilis WB700, de acuerdo al procedimiento descrito en
materiales y métodos, utilizando el ADN cromosomal extraído de la cepa BB80.
Para poder aislar y seleccionar las colonias transformadas que hubieran adquirido la
capacidad para crecer en ausencia de triptófano, se estriaron 5 cajas de medio mineral
sin triptófano con 200 µl de cultivo cada una. Después de 48 h solo se observo el
crecimiento de 8 colonias.
Con el fin de purificar colonias y evitar contaminaciones posibles, que pudiesen
provenir de la transformación, las colonias obtenidas se resembraron en cajas de
medio mineral-glucosa 10 g/l, usando dos de los marcadores de selección (antibióticos)
que se usaron para construir la cepa WB700, es decir Em 5 µg/ml y Lm 5 µg/ml. El
crecimiento de las colonias obtenidas, en cajas de medio mineral sin triptófano fue
mayor comparado con la cepa WB700, ya que en las primeras se observó crecimiento
a las 24 h, mientras que en la progenitora el crecimiento se observaba después de 48 h
usando triptófano.
Esta mismas colonias se picaron en medio sólido de leche descremada (skim milk),
para probar la conservación del genotipo proteasas menos, utilizando como controles a
la cepa WB700 (control negativo para la producción de proteasas) y a BB80 (control
positivo para la producción de proteasas). El medio skim milk es empleado para la
detección de hidrólisis de proteínas, particularmente de la caseína de la leche.
Como se observa en la figura 9.1, después de 24 horas de incubación a 37oC, la cepa
BB80 mostraba la formación de un alo alrededor de las colonias, lo cual no se
observaba para las cepas WB700 y las 8 protótrofas aisladas mediante el
procedimiento antes descrito. Este resultado en conjunción con el de crecimiento en
34
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
medio mineral sólido en presencia de los marcadores de selección, permitió concluir
que las 8 cepas aisladas son protótrofa a triptófano y que conservan la propiedad de no
producir proteasas.
BB80
Transformantes protótrofas a
triptófano
WB700
Figura 9.1 Conservación del genotipo proteasas menos en WB700CH1.
Para seleccionar la colonia que se emplearía en el presente proyecto, se realizó una
cinética de crecimiento, con las 8 colonias aisladas, en matraces con medio mineralglucosa 10 g/l sin triptófano. De acuerdo a los resultados (tabla 9.2), la colonia 2
presentó una mayor velocidad de crecimiento, en consecuencia fue seleccionada para
futuras evaluaciones y se denomino WB700CH1.
Tabla 9.2 Velocidad específica de crecimiento de colonias de B. subtilis protótrofas a
triptófano obtenidas por transformación.
Colonia
1
2
3
4
5
6
7
8
µ (h-1)
0.148
0.168
0.118
0.111
0.109
0.106
0.108
0.118
35
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
9.3 Evaluación de B. subtilis WB700CH1 en condiciones aeróbicas.
Con el fin de conocer y determinar los parámetros de crecimiento de B. subtilis en
condiciones anaeróbicas y poder tener un patrón de comparación, se llevaron a cabo
cultivos a nivel fermentador de 1 litro, bajo condiciones aeróbicas, con tres diferentes
azúcares: glucosa, xilosa y celobiosa. En las figuras 9.2 y 9.3 se presentan las cinéticas
de crecimiento, consumo de azúcar y formación de producto, para los cultivos
realizados con medio Luria y medio mineral en aerobiosis, respectivamente, con la
cepa de B. subtilis WB700CH1.
Como puede observarse en la figura 9.2 y Tabla 9.3, en medio rico la velocidad de
crecimiento presentada para cultivos con glucosa fue 20% mayor que para los cultivos
con celobiosa y xilosa, a pesar de esto, en los tres casos se llegó a la fase estacionaria
prácticamente en el mismo tiempo de cultivo (4-5 h) y la biomasa obtenida en este
tiempo fue mayor con glucosa. No obstante en ninguno de los casos se consumió todo
el azúcar siendo esto más notorio en los cultivos con celobiosa y xilosa, en los cuales el
consumo de azúcar fue mínimo. En el caso de glucosa, solo el 35% de este azúcar fue
consumido durante la fase de crecimiento con una velocidad específica de 1.31
gS/gDWC.h. Todo lo anterior indica que B. subtilis utilizó parte de los componentes
(aminoácidos) del medio para crecer y que aproximadamente a las 4 h de cultivo,
alguno de estos componentes (probablemente un aminoácido ú otro microcomponente)
se agotó e impidió un mayor crecimiento celular.
En medio mineral (figura 9.3) solo se observó crecimiento en los cultivos con glucosa y
celobiosa y no así con xilosa. Esto al parecer se debe, como se menciono en los
antecedentes, a que B subtilis presenta una deficiencia en el transporte de xilosa,
impidiéndole metabolizar y utilizar este azúcar como única fuente de carbono
(Schmiedel y Hillen, 1996; Krispin y Allmansberger, 1998; Mota et al., 1998). En
consecuencia se decidió obtener mutantes que pudiesen transportar y metabolizar
xilosa, lo cual es presentado a detalle en el capitulo 9.4.
36
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
A)
14
12
10
8
1
6
4
Glucosa (g/l)
Acético x 4 (g/l)
Biomasa (g/l)
10
2
0.1
0
14
B)
12
10
8
1
6
4
Celobiosa (g/l)
Acético (g/l)
Biomasa (g/l)
10
2
0.1
0
C)
14
12
10
8
1
6
4
Xilosa (g/l)
Acético (g/l)
Biomasa (g/l)
10
2
0.1
0
2
4
6
8
10
0
12
Tiempo (h)
Figura 9.2 Crecimiento aeróbico de B. subtilis WB700CH1 en medio Luria.
A) Glucosa; B) Celobiosa y C) Xilosa.
37
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
12
A)
10
8
1
6
4
2
0.1
0
B)
12
10
8
1
6
4
2
0.1
Celobiosa (g/l)
Acético x 10 (g/l)
Biomasa (g/l)
10
0
10
C)
12
10
8
1
6
4
Xilosa (g/l)
Acético (g/l)
Biomasa (g/l)
Glucosa (g/l)
Acético x 8 (g/l)
Biomasa (g/l)
10
2
0.1
0
2
4
6
8
10
0
12
Tiempo (h)
Figura 9.3 Crecimiento aeróbico de B. subtilis WB700CH1 en medio mineral.
A) Glucosa; B) Celobiosa y C) Xilosa.
38
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
En medio mineral con glucosa, la velocidad específica de crecimiento y de consumo de
azúcar fueron mayores que las observadas con celobiosa (tabla 9.3), sin embargo con
celobiosa se obtuvo un mayor consumo de azúcar así como también una mayor
formación de biomasa durante la fase de crecimiento. A pesar de esto, el rendimiento
de conversión de sustrato en biomasa fue similar para ambos casos, ya que parte de la
glucosa consumida se canalizó a la formación de acético. Sin embargo, en los cultivos
con celobiosa no se detectó la formación de acético.
En comparación con los cultivos llevados a cabo con glucosa y celobiosa en medio rico,
se observa que las velocidades de crecimiento se reducen, aproximadamente en un
50% para los cultivos en medio mineral (tabla 9.3). Las velocidades específicas de
consumo de azúcar fueron similares en ambos medios en el caso de glucosa, pero
mayores para el medio mineral, en aproximadamente un 50%, para celobiosa. Esta
velocidad elevada de consumo de celobiosa en medio mineral, probablemente se deba
a que, en comparación con medio rico, la cepa requiere de una mayor síntesis de ATP
y aminoácidos para formar la biomasa, y el medio rico aporta una cantidad elevada de
aminoácidos reduciendo los requerimientos de ATP y de los mismos aminoácidos.
Adicionalmente, el consumo de azúcar durante la fase exponencial fue mayor en medio
mineral para glucosa y celobiosa.
Tabla 9.3 Resumen de resultados de cultivo aeróbicos de B subtilis WB700CH1.
b
YX/S
(gDWC/gS)
qS
(gS/gDWC.h)
Azúcar
consumida (g/l)
2.89
NA
1.31
4.52
Celobiosa
2.02
0.67
NA
0.47
1.44
Xilosa
2.04
0.65
NA
0.18
0.06
Glucosa
2.97
0.45
0.40
1.14
7.49
Celobiosa
3.69
0.36
0.40
0.90
9.26
Xilosa
----
0.0
----
----
---
Azúcar
Luria
Glucosa
Mineral
a
µ
-1
(h )
0.84
Medio
XMAX
(g/l)
a
Biomasa máxima obtenida al termino de la fase de crecimiento exponencial.
Azúcar consumida durante la fase de crecimiento exponencial, azúcar inicial ∼10g/l.
NA No aplica.
b
39
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
Adicionalmente, el único producto detectado, mediante la técnica de HPLC empleada,
fue ácido acético y la producción de éste esta asociado al crecimiento y se observa
solo en cultivos con glucosa, tanto en medio rico como en medio mineral, obteniéndose
concentraciones máximas, durante la fase de crecimiento, de 2.18 y 1.18 g/l
respectivamente (Tabla 9.4). Mientras que en cultivos con celobiosa y xilosa la
producción de acético es prácticamente nula en ambos medios. (Figura 9.2 y 9.3).
En B. subtilis, la producción de ácido acético como producto del metabolismo aeróbico
esta directamente relacionado con las velocidades específicas de crecimiento, de esta
manera a velocidades de crecimiento bajas se ha reportado la existencia de acético
como principal producto, sin embargo a velocidades específicas de crecimiento
mayores, el metabolismo tiene un cambio hacia la producción de ácido láctico. (Snay et
al., 1989). En el presente trabajo y en otros trabajos llevados a cabo con cepas
derivadas de la cepa 168 (Martínez el al. 1997), únicamente se ha encontrado acético
como producto, durante la fase de crecimiento exponencial, en condiciones aeróbicas.
Tabla 9.4 Resumen de formación de acético con B. subtilis WB700CH1 en cultivos
aeróbicos utilizando glucosa como fuente de carbono.
YP/S
YP/X
qP
Acético finala
(gP/gS)
(gP/gX)
(gP/gDWC.h)
(g/l)
Luria
0.48
0.75
0.63
2.18
Mineral
0.16
0.40
0.18
1.18
Medio
a
Producción de ácido acético al final de la fase de crecimiento exponencial.
9.4 Generación de mutantes de B. subtilis xil+ (Cepa WB700CH2).
Las cepas de B. subtilis sintetizan todas las proteínas necesarias para metabolizar
xilosa, pero no pueden utilizarla como fuente de carbono, debido aparentemente a una
deficiencia en el transporte de este azúcar (Schmiedel y Hillen, 1996; Krispin y
Allmansberger, 1998; Mota et al., 1998). Sin embargo, previamente se ha reportado
que se pueden obtener fácilmente mutantes espontáneas capaces de transportar xilosa
40
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
y que una mutación sencilla, con una frecuencia de 1x10-6/células, es suficiente para
convertirlas en derivadas capaces de transportar xilosa (Schmiedel y Hillen, 1996;
Krispin y Allmansberger, 1998).
Basados en estos reportes y al protocolo reportado por Schmiedel y Hillen (1996), se
generó una cepa mutante derivada de B subtilis WB700CH1. En resumen, WB700CH1
se sembró en cajas de medio mineral - xilosa 10 g/l con eritromicina 5 µg/ml y
lincomicina 5 µg/ml, incubándose a 37°C. Después de 72 h se observó crecimiento con
colonias muy pequeñas, estas se resembraron sucesivamente hasta que después de
varios pases se lograron obtener colonias grandes y homogéneas a un tiempo de
incubación de 36 h. Para corroborar que la cepa obtenida presentaba la mutación en el
transporte de xilosa y que su crecimiento no se debía a una fase larga de adaptación,
se seleccionó una colonia obtenida a partir de cajas de medio mineral-xilosa, se creció
en matraces con medio mineral - glucosa a 250 rpm y durante la fase de crecimiento
exponencial se traslado a matraces con medio mineral que contenía 10 g/l de xilosa
como única fuente de carbono, en los cuales se observó crecimiento similar al
observado en medio mineral - glucosa. De esta manera se comprobó la obtención de
una cepa mutante capaz de crecer en medios minerales con xilosa como única fuente
de carbono: Esta cepa fue denominada WB700CH2 (tabla 6.1).
A diferencia de la cepa WB700CH1, la cepa WB700CH2 crece en medio mineral xilosa 10 g/l y llega, en términos prácticos, a la misma cantidad de biomasa que la cepa
WB700CH1 cultivada en las mismas condiciones con medio mineral - glucosa 10 g/l.
9.5 Evaluación de B. subtilis WB700CH2 en condiciones aeróbicas.
Una vez obtenida la cepa mutante WB700CH2 y después de haber verificado que el
consumo de xilosa se debía a una mutación y no solo a una fase de adaptación que
pudiese haber presentar esta cepa, se llevaron a cabo las evaluaciones a nivel
fermentador en medio Luria y medio mineral. Las cinéticas de crecimiento y consumo
de azúcar se presentan en la figura 9.4.
41
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
(A) 10
8
6
1
4
Xilosa (g/l)
Biomasa (g/l)
10
2
0.1
0
(B) 10
8
6
1
4
Xilosa (g/l)
Biomasa (g/l)
10
2
0.1
0
4
8
12
16
0
20
Tiempo (h)
Figura 9.4 Crecimiento aeróbico de B subtilis WB700CH2.
(A) en medio mineral y (B) en medio Luria.
42
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
En medio rico (figura 9.4), WB700CH2 presenta una velocidad específica de
crecimiento 3 veces mayor que en medio mineral. Sin embargo, también se observa el
mismo comportamiento presentado en cultivos en medio rico con glucosa y celobiosa
(figura 9.2), en los cuales el consumo de azúcar fue mínimo. Para este caso, el
consumo de xilosa fue solo del 10% (tabla 9.5).
En medio mineral el consumo de xilosa durante la fase de crecimiento fue del 65% y la
velocidad específica de consumo de azúcar, como también se observó con celobiosa,
fue mayor (2.6 veces) que la obtenida en medio Luria (tabla 9.5). En ambos medios la
XMAX alcanzada fue similar.
Si se realiza una comparación con lo observado en cultivos en medio mineral con
glucosa (figura 9.3), los resultados obtenidos con xilosa en el mismo medio, muestran
una disminución aproximada del 50% en la velocidad específica de crecimiento y de
consumo de azúcar (tabla 9.3 y 9.5).
En cuanto a la formación de productos, tanto en medio rico como en medio mineral con
xilosa no se observa la producción de acético, ni se detecto ningún otro producto
metabólico con las técnicas de HPLC empleada.
Tabla 9.5 Parámetros de crecimiento y de consumo de xilosa de B subtilis WB700CH2.
Medio
-1
µ (h )
a
b
YX/S
qS
(gDWC/gS)
(gS/gDWC.h)
(g/l)
consumida (g/l)
XMAX
Azúcar
Luria
0.59
NA
0.19
3.17
1.05
Mineral
0.24
0.49
0.49
2.96
6.25
a
Biomasa máxima obtenida al termino de la fase de crecimiento exponencial.
Azúcar consumida durante la fase de crecimiento exponencial.
NA: No aplica.
b
43
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
9.6 Evaluación de B. subtilis WB700CH2 en condiciones anaeróbicas.
Las evaluaciones de crecimiento anaeróbico de B. subtilis WB700CH2 se llevaron
acabo en “fleakers”, en las condiciones que se indican en la sección de materiales y
métodos. Las cinéticas de crecimiento, consumo de azúcar y formación de producto,
para los cultivos con medio Luria y medio mineral se presentan en las figuras 9.5 y 9.6
respectivamente.
En cultivos con medio Luria (figura 9.5) se observa crecimiento con los tres azúcares
utilizados, sin embargo solo se presenta un consumo significativo de azúcar en los
cultivos con glucosa y celobiosa.
En cultivos con glucosa y celobiosa, la biomasa máxima alcanzada al final de la fase de
crecimiento fue menor a 1 g/l (0.92 y 0.61, respectivamente) y la velocidad de
crecimiento fue 2 veces mayor con glucosa que con celobiosa (tabla 9.6). En ambos
casos se observa el consumo total de los azúcares, siendo la mayor parte de este
consumo durante la fase estacionaria (figura 9.5).
En cultivos con xilosa en medio rico (figura 9.5), se observa una pequeña fase de
crecimiento retardado (2 h) y dos etapas con diferentes velocidades de crecimiento.
Al parecer, en la primera el crecimiento se debe al aprovechamiento de los
componentes del medio rico (aminoácidos) debido a que el consumo de xilosa es
prácticamente nulo (0.35 g/l). En ésta, la velocidad específica de crecimiento es 3
veces menor con respecto a la obtenida con medio Luria – glucosa bajo las mismas
condiciones. La segunda etapa inicia a las 10 h y en ésta la velocidad de crecimiento
es 50% menor que en la anterior, sin embargo el consumo de xilosa es tres veces
mayor que en la otra etapa. No obstante, el consumo total de azúcar fue mínimo
(menos del 20%). La biomasa promedio alcanzada durante la fase estacionaria fue
0.616 g
DWC/l,
similar a la obtenida al final del crecimiento en cultivos con medio Luria -
celobiosa.
44
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
12
1
10
Glucosa (g/l)
Láctico (g/l)
Biomasa (g/l)
A)
8
6
4
2
0.1
0
B) 10
1
8
6
4
Celobiosa (g/l)
Láctico (g/l)
Biomasa (g/l)
12
2
0.1
0
12
1
10
8
6
4
Xilosa (g/l)
Láctico (g/l)
Biomasa (g/l)
C)
2
0.1
0
12
24
0
36
Tiempo (h)
Figura 9.5 Crecimiento anaeróbico de B. subtilis WB700CH2 en medio Luria.
A) Glucosa; B) Celobiosa y C) Xilosa.
45
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
En cultivos con medio mineral (figura 9.6) solo se observa crecimiento cuando se utiliza
glucosa y celobiosa como fuentes de carbono, no así cuando se utilizó xilosa como
única fuente de carbono. En cultivos con glucosa y celobiosa, la fase estacionaria se
presenta aproximadamente en el mismo tiempo (24 h) y la velocidad específica de
crecimiento, de consumo de azúcar así como el rendimiento de conversión de sustrato
en biomasa fueron similares para ambos casos. Debido a que se presentó un mayor
consumo de azúcar durante la fase de crecimiento exponencial en cultivos con glucosa,
la biomasa alcanzada al final del crecimiento fue 30% mayor a la obtenida en cultivos
con celobiosa (tabla 9.6).
Es importante resaltar que en medio mineral con xilosa, a pesar de que no se observa
un cambio significativo en la densidad celular aún después de 48 h de cultivo, tampoco
se presentó una fase de muerte o de lisis celular, misma que se observa cuando B.
subtilis se enfrenta con alguna limitante de nutrientes o cuando se agota la fuente de
carbono o nitrógeno (ver figuras 9.6 y más adelante 9.11. Jolliffe et al.,1980; Martínez
et al., 1997). A pesar de ello, se observa un consumo, aunque no significativo, de
xilosa.
Tabla 9.6 Resumen de resultados de cultivos anaeróbicos de B subtilis WB700CH2.
Medio
Luria
Mineral
Azúcar
a
XMAX
µ
-1
YX/S
qS
b
Azúcar
(g/l)
(h )
(gDWC/gS)
(gS/gDWC.h)
consumida (g/l)
Glucosa
0.923
0.31
NA
1.16
2.33
Celobiosa
0.611
0.13
NA
0.61
2.91
Xilosa
0.159
0.09
NA
0.08
0.294
Glucosa
0.320
0.04
0.05
0.77
6.142
Celobiosa
0.223
0.05
0.06
0.72
3.455
Xilosa
---
0.00
---
---
---
a
Biomasa máxima obtenida al termino de la fase de crecimiento exponencial.
Azúcar consumida durante la fase de crecimiento exponencial.
NA: No aplica.
b
46
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
1
12
10
8
6
4
Glucosa (g/l)
Lactato (g/l)
Biomasa (g/l)
A)
2
0.1
0
1
B)
12
8
6
4
Celobiosa (g/l)
Lactato (g/l)
Biomasa (g/l)
10
2
0.1
0
1
12
10
8
6
4
Xilosa (g/l)
Biomasa (g/l)
C)
2
0.1
0
0
12
24
36
48
Tiempo (h)
Figura 9.6 Crecimiento anaeróbico de B. subtilis WB700CH2 en medio mineral.
A) Glucosa; B) Celobiosa y C) Xilosa.
47
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
Sin embargo, el escaso crecimiento puede atribuirse a la producción limitada de ATP
con xilosa, debido a que durante la fermentación con xilosa, los requerimientos
energéticos para su transporte y fosforilación son mayores en comparación con
glucosa. La glucosa es transportada y posteriormente fosforilada por el sistema de la
fosfotransferasa
(PTS),
utilizando
para
ello,
un
enlace
fosfato
–proveniente
delfosfoenolpiruvato- de alto contenido energético (Postma et al., 1996). En el caso de
xilosa es transportada por un simporte de protones o un sistema dependiente de ATP y
posteriormente es fosforilada por un quinasa intracelular dependiente de ATP
(Fraenkel, 1996; Lin, 1996; Underwood et al., 2002). De esta manera, para la
producción de una molécula glucosa-6-fosfato se requiere de un solo enlace fosfato de
alto contenido energético, mientras que para xilosa-fosfato, el requerimiento es de 2
enlaces fosfato de alto contenido energético, por lo cual el rendimiento neto de la
conversión de glucosa a piruvato es de 2 ATP, mientras que para xilosa es ~0.67 ATP
(Figura 8.7; Tao et al., 2001; Underwood et al., 2002). Lo anterior se ve reflejado
directamente en el crecimiento celular observado (figura 9.6).
En base a una reducción del 80% en las velocidades de crecimiento, con respecto al
medio rico (Figura 9.7; Tabla 9.6), el desbalance energético no solo se presenta en
medio mineral con xilosa, sino también cuando se utiliza glucosa y celobiosa. Datos en
la literatura muestran que B. subtilis presenta un deficiente crecimiento por
fermentación de glucosa, requiriendo del aporte de intermediarios metabólicos
(piruvato), o nutrientes adicionales como vitaminas y/o aminoácidos, mismos que están
presentes en medio rico (Nakano et al., 1997; Cruz Ramos et, al 2000; Espinosa de los
Monteros et al., 2001).
48
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
- 6 ATP
6 Xilosa
Ribosa-5P
- 6 ATP
Xilulosa
Xilosa
ATP ADP
Glucosa
PEP Piruvato
Sedoheptulosa-7P
GAP
Glucosa–6P
PTS
Ribulosa-5P
Xilulosa-5P
Eritrosa-4P
Fructosa-6P
- 1 ATP
- 1 ATP
ATP
ADP
Xilulosa-5P
- 4 ATP
Fructosa-1,6
bisfosfato
Gliceraldehído-3P (GAP)
Dihidroxiacetona-P
NAD +
NADH+H +
+2 NADH
+10 NADH
1,3-Difosfoglicerato
ADP
ATP
+2 ATP
+10 ATP
3-fosfoglicerato
Fosfoenolpiruvato (PEP)
Acetato
ATP
ADP
+2 ATP
+2 ATP
Acetil P
ADP
ATP
Acetil CoA
CoA
+10 ATP
Piruvato
NADH+H + NAD +
+2 NADH
Lactato
NADH+H +
NAD +
-2 NA DH
Balance de ATP
De Xilosa a Piruvato
De Glucosa a Piruvato
Por cada 6 moléculas de xilosa
-6 ATP por transporte
-10 ATP por activación
+20 ATP producidos
4 ATP por 6 moléculas de xilosa
Rendimiento neto: 0.67 ATP por xilosa
Por molécula de glucosa
-2 ATP por activación
+4 ATP producidos
2 ATP por molécula de glucosa
Rendimiento neto: 2 ATP por glucosa
Balance de NADH
De Xilosa a Láctico
De Glucosa a Láctico
+10 NADH en glicólisis
- 10 NADH en producción de láctico
+2 NADH en glicólisis
- 2 NADH en producción de láctico
Balance REDOXa
Balance REDOX
Figura 9.7 Balance de ATP y NADH en el metabolismo de azúcares en Escherichia coli.
Modificado de: Fraenkel (1996) y Tao et al. (2001)
49
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
a) Si la xilosa se canaliza hacia la formación de láctico, entonces se establece un balance
REDOX, en el caso de B. subtilis en donde no existe la formación de láctico, no se establece
dicho balace y consecuentemente el crecimiento es nulo.
- Simbología:
Consumo o producción de ATP
Consumo o producción de NADH
Los símbolos abiertos corresponden al metabolismo de glucosa y los rellenos al metabolismo
de xilosa.
Para estas condiciones, el único producto de fermentación detectado en cantidades
significativas
fue
ácido
láctico.
Este
producto
fue
obtenido
en
diferentes
concentraciones para los tres azúcares evaluados, tanto en medio rico como en medio
mineral, con la excepción de los cultivos con xilosa en medio mineral. La producción del
mismo se da durante la fase de crecimiento y la fase estacionaria, es decir que la
producción de lactato es constitutiva y esta parcialmente asociada a crecimiento bajo
las condiciones evaluadas
Bajo condiciones de fermentación, la energía se genera solo por fosforilación a nivel de
sustrato, mientras que el mantenimiento del balance redox es fundamental para
garantizar la continuidad del ciclo glicolítico. En este caso el balance redox se lleva
acabo por la conversión de piruvato en ácido láctico (Figura 9.7), reacción que
regenera el NAD oxidado en las células. En trabajos anteriores se había reportado, la
formación de láctico como uno de los principales productos de fermentación (Nakano et
al., 1997; Nakano y Zuber, 1998; Cruz Ramos et al., 2000; Espinosa de los Monteros et
al., 2001). Sin embargo, también se reportaba la presencia de otros subproductos del
metabolismo como acetoina y 2,3-butanodiol, mismos que no fueron detectados en el
presente trabajo
Como se observa en la figura 3.1, Nakano et al. (1997) han propuesto que la
generación de AcetilCoA con B. subtilis en condiciones anaeróbicas conlleva la
generación de NADH + H+; es decir una molécula de NADH + H+ por cada molécula de
AcetilCoA sintetizada, o desde el punto de vista de un balance 2 moléculas de NADH +
H+ por cada molécula de glucosa canalizada a la formación de AcetilCoA. El AcetilCoA
50
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
es un metabolito clave en la síntesis de precursores necesarios para el crecimiento
celular y por consiguiente debe ser sintetizado siempre para que las células puedan
sobrevivir. Sin embargo si el cofactor (NAD) no es oxidado, la síntesis de AcetilCoA no
puede llevarse a cabo y por tanto B. subtilis no crecería. Los resultados obtenidos
muestran que B. subtilis produce láctico en condiciones anaeróbicas cuando se usa
xilosa como fuente de carbono en medios ricos (Luria). En éstas condiciones los
componentes del medio rico proporcionan una cantidad limitada de los precursores
necesarios para que la bacteria crezca y el NADH+H+ generado por el metabolismo de
la xilosa en la glicólisis es regenerado a NAD oxidado al producir láctico. En el caso del
medio mineral ni se produce láctico ni las células crecen, sugiriendo que el exceso de
NADH + H+ potencialmente generado por la síntesis de AcetilCoA ocasiona un
desbalance redox y evita el crecimiento celular y por consiguiente la generación de
cualquier producto de fermentación. Una forma de evaluar dicha hipótesis sería crecer
a B. subtilis en condiciones anaeróbicas en medio mineral-xilosa y suplementar los
medios con AcetilCoA y piruvato, de tal manera que si se obtiene crecimiento cuando
se adiciona AcetilCoA y no hay crecimiento cuando se agrega piruvato la hipótesis
sería probada. Durante el transcurso de este proyecto no se evaluó dicha posibilidad y
se plantea como trabajos a realizar en el futuro.
Por otro lado, en condiciones anaeróbicas se formó poca biomasa, lo que se puede
explicar si consideramos que la mayor parte de los azúcares se canalizaron a la
formación de L-lactato. En los cultivos en medio mineral los rendimientos finales de
conversión de glucosa y celobiosa a lactato fueron mayores al 80% del teórico (tabla
9.7).
Cabe resaltar que en medio rico (Luria) los rendimientos de conversión de azúcar a
láctico fueron mayores al teórico, esto se debe a que B. subtilis puede utilizar a los
componentes del medio rico como precursores o intermediarios metabólicos y de esta
manera canalizar parte de ellos hacia la formación de láctico.
51
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
Tabla 9.7 Resumen de resultados de la producción de L-láctico con B subtilis
WB700CH2 con 10 g/l de azúcar.
Medio
Luria
Mineral
Azúcar
a
YP/S
b
c
qP
qP
d
QP
e
L-láctico
(gP/gS)
(gP/gDWC.h)
(gP/gDWC.h)
(gp/l h)
final (g/l)
Glucosa
0.89
1.25
0.11
0.49
8.42
Celobiosa
1.02
0.88
0.37
0.35
10.44
Xilosa
1.42
0.26
0.061
0.096
4.59
Glucosa
0.96
0.67
0.51
0.24
8.48
Celobiosa
0.82
0.54
0.38
0.17
8.05
a
Rendimiento final de conversión de azúcar a láctico.
qP: Velocidad específica de producción de L-láctico durante la fase de crecimiento
exponencial.
c
qP: Velocidad especifica de producción de L-láctico durante la fase estacionaria.
d
QP: Productividad volumétrica de láctico (g lactato/ l.h).
e
L-láctico al final en la fase estacionaria.
b
Esto fenómeno se puede observar claramente en cultivos en donde se utilizó xilosa
como fuente de carbono, ya que como se ha discutido anteriormente, en condiciones
anaeróbicas y en medio LB, B. subtilis crece utilizando los componentes del medio y no
solo la xilosa, por ello los valores del rendimiento son altos además de que la
productividad volumétrica es muy baja (tres veces menor en comparación con LBglucosa; Tabla 9.7).
La productividad volumétrica de láctico, cuando se utiliza glucosa es mayor en medio
LB en comparación con medio mineral–glucosa y con la obtenida en medio LB y
mineral con celobiosa.
Cabe resaltar que el gen de B. subtilis (lctE), codifica exclusivamente para una L-lactato
deshidrogenasa (Nakano y Zuber, 1998). De tal manera que el lactato producido fue
ópticamente puro y de la forma L. Este hecho se comprobó cuantificando el lactato
producido mediante la técnica de HPLC descrita en la sección de materiales y métodos
y verificada con un ensayo enzimático que permite detectar exclusivamente L-lactato.
Las
dos
metodologías
arrojaron
las
mismas
concentraciones
de
lactato.
52
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
Adicionalmente, se evaluó que el D-lactato producido por E.coli, y por la mayoría de los
microorganismos, no era detectado por el analizador enzimático pero si por la técnica
de HPLC empleada.
9.6.1 Evaluación del crecimiento en medio mineral suplementado.
Debido al poco crecimiento observado en medio mineral, se decidió suplementar este
medio con componentes ricos en vitaminas y aminoácidos, pero que además fuesen
económicos, por ello se recurrió al uso de sólidos de licor de maíz (SLM) y extracto de
levadura industrial (ELI).
Las evaluaciones con medio mineral suplementado se llevaron a cabo utilizando
glucosa como fuente de carbono. Se realizó un barrido de concentraciones con ambos
suplementos para determinar el valor adecuado que contrarrestara dicho desbalance,
para ello se utilizaron concentraciones de 8 a 12 g/l para extracto de levadura industrial
y de 5 a 30 g/l para sólidos de licor de maíz.
Cuando se utilizó extracto de levadura industrial, a concentraciones de 8, 10 y 12 g/l,
las velocidades de crecimiento observadas fueron similares entre sí (~0.23 h-1) y en los
tres casos se alcanzó la fase estacionaria aproximadamente a las 8 h de cultivo (figura
9.8).
El efecto de la concentración de ELI en el medio de cultivo, se observa claramente en
la biomasa máxima producida, así como en la cantidad de azúcar consumida, ya que
los valores de estos fueron ligeramente mayores a mayor concentración de ELI
utilizada (tabla 9.8). No obstante, al parecer 8 g/l de ELI son suficientes para
suplementar el medio mineral y alcanzar un crecimiento similar al obtenido con medio
rico-glucosa en condiciones anaeróbicas (8.9 gDWC/l; tabla 9.6)
En comparación con cultivos en medio rico con glucosa, las velocidades de crecimiento
fueron 25% menores, mientras que las velocidades de consumo de glucosa fueron
53
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
ligeramente mayores (17%), a pesar de ello, la cantidad de glucosa consumida durante
la fase de crecimiento fue 3 veces mayor utilizando 12 g/l de ELI (tabla 9.6)
Con las tres concentraciones probadas de ELI, se logró incrementar las velocidades de
crecimiento (6 veces), así como la biomasa máxima producida, con respecto a los
cultivos en medio mineral con glucosa (tabla 9.6 y 9.8).
Cuando el medio fue suplementado con sólidos de licor de maíz, las velocidades de
crecimiento fueron similares entre si, pero mayores en un 85 % con respecto a las
observadas en medio mineral y ligeramente mayores al medio mineral glucosa
suplementado con ELI (tabla 9.6y 9.8).
Al igual que cuando se utilizó el ELI, el efecto de la concentración de los SLM está
directamente relacionada con la generación de biomasa durante la fase de crecimiento
siendo mayor en cultivos con 20 y 30 g/l de SLM. Con respecto al medio mineral con
glucosa, el consumo de azúcar durante la etapa de crecimiento fue menor en las
concentraciones evaluadas por debajo de 30 g/l de SLM y similar con 30 g/l de SLM
(tabla 9.8, figura 9.9).
En cuanto a la formación de láctico, los rendimientos obtenidos fueron mayores al 80%
para todas las concentraciones evaluadas con ELI y para 20 y 30 g/l de SLM (tabla
9.9).
Sin embargo, el uso de SLM, para la producción de láctico, tiene como desventaja
principal el contenido de mezclas racémicas de lactato, lo cual contamina el producto
final disminuyendo la pureza del mismo (Atkinson y Mavituna, 1991; Akhtar et al.,
1997).
.
54
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
1
8
6
4
Glucosa (g/l)
Lactato (g/l)
Biomasa (g/l)
A) 10
2
0.1
0
1
8
6
4
Glucosa (g/l)
Lactato (g/l)
Biomasa (g/l)
B) 10
2
0.1
0
1
8
6
4
Glucosa (g/l)
Lactato (g/l)
Biomasa (g/l)
C) 10
2
0.1
0
6
12
0
18
Tiempo (h)
Figura 9.8 Crecimiento anaeróbico de B. subtilis WB700CH2 en medio mineral
suplementado con extracto de levadura industrial.
A) 8 g/l; B) 10 g/l y C) 12g/l.
55
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
10
10
8
6
1
4
Glucosa (g/l)
Lactato (g/l)
Biomasa (g/l)
A)
2
0.1
0
B)
10
8
6
1
4
Glucosa (g/l)
Lactato (g/l)
Biomasa (g/l)
10
2
0.1
0
6
12
0
18
Tiempo (h)
Figura 9.9 Crecimiento anaeróbico de B. subtilis WB700CH2 en medio mineral
suplementado con sólidos de licor de maíz.
A) 25 g/l y B) 30 g/l.
56
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
Esta misma estrategia ha sido reportada en trabajos anteriores para enriquecer los
medios minerales con nutrientes de bajos costos. Por ejemplo, Underwood et al. (2002)
y Martinez et al. (1999) emplearon SLM al 1% para cultivos en medio mineral con xilosa
con cepas etanologenicas de E. coli, logrando incrementar la productividad de etanol y
el crecimiento celular hasta valores similares a los obtenidos en medio Luria
Tabla 9.8 Resumen de cultivos anaeróbicos en medio mineral-glc 10 g/l suplementado.
Suplemento
a
XMAX
µ
-1
YX/S
qS
b
Azúcar
(g/l)
(h )
(gDWC/gS)
(gS/gDWC.h)
consumida (g/l)
8 g/l
0.89
0.23
0.17
1.36
5.30
10 g/l
0.95
0.23
0.17
1.31
5.48
12 g/l
1.25
0.21
0.17
1.19
7.18
5 g/l
0.30
0.24
0.21
1.17
1.45
10 g/l
0.40
0.31
0.26
1.21
1.55
15 g/l
0.68
0.27
0.18
1.49
3.73
25 g/l
1.25
0.25
0.27
0.96
4.70
30 g/l
1.18
0.28
0.20
1.38
5.77
ELI
SLM
a
b
Biomasa máxima obtenida al termino de la fase de crecimiento exponencial.
Azúcar consumida durante la fase de crecimiento exponencial.
Las concentraciones adecuadas para lograr velocidades de crecimiento y rendimientos
de formación de productos similares a las observadas en medio rico fueron de 8 a 12
g/l de ELI y de 25 a 30 g/l para SLM, con las cuales se reduce a la mitad los tiempos de
cultivo. De esta manera se puede decir que la adición de nutrientes de bajo costo al
medio provee a las células de los requerimientos necesarios para su crecimiento y para
llevar acabo sus actividades metabólicas, dándole el mismo aporte que los medios
complejos como el medio Luria.
57
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
Tabla 9.9 Resumen de resultados de la producción de L-láctico con B subtilis
WB700CH2 en medio mineral-glucosa 10 g/l suplementado.
Suplemento
a
YP/S
b
c
qP
qP
d
QP
e
L-láctico
(gP/gS)
(gP/gDWC.h)
(gP/gDWC.h)
(gP / l h)
final (g/l)
8 g/l
0.76
1.06
0.38
0.52
8.31
10 g/l
0.71
0.94
0.32
0.47
7.48
12 g/l
0.71
0.97
0.19
0.47
7.51
25 g/l
0.88
0.82
0.27
0.52
8.37
30 g/l
0.85
1.22
0.26
0.51
8.16
ELI
SLM
a
Rendimiento final de conversión de glucosa a láctico.
qP: Velocidad específica de producción de L-láctico durante la fase de crecimiento
exponencial.
c
qP: Velocidad específica de producción de L-láctico durante la fase estacionaria.
d
QP: Productividad volumétrica de Láctico.
e
L-láctico al final de la fase estacionaria.
b
9.6.2 Producción de L-lactato en cultivos anaerobios con 50 g/l de
glucosa.
Actualmente la producción global de ácido láctico es de aproximadamente 13,000
toneladas métricas/año y es destinado principalmente a la industria alimentaria,
farmacéutica y de cosméticos. Su demanda se está incrementando debido a la
introducción de dos nuevos productos derivados del lactato: el polilactato y el etillactato (Dien et al., 2002; Skory, 2003). El polilactato (PLA) es un plástico de alta
calidad, que tiene grandes ventajas sobre los plásticos ya existentes en el mercado,
principalmente debido a su carácter biodegradable, además de que puede ser
producido a partir de fuentes renovables. Las propiedades del PLA dependen de las
mezclas racémicas del ácido láctico, es por ello, que para la producción de PLA, se
requiere de ácido láctico ópticamente puro, preferentemente L-láctico en mayor
proporción (Dien et al., 2001; Bai et al., 2003).
58
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
Con el incremento en la demanda del ácido láctico, aumenta también el interés por
encontrar métodos mas eficientes para la producción de éste (Dien et al., 2002; Skory,
2003). Actualmente, el ácido láctico es producido por síntesis química y por
fermentación. Los procesos de fermentación tienen ventajas potenciales sobre la
síntesis química, ya que a partir de estos se pueden obtener solo los isómeros
deseables. El uso de materiales lignocelulósicos es una alternativa para reducir los
costos de producción de ácido láctico. Sin embargo, la conversión de estos materiales
presenta serios problemas, debido a que están compuesto por mezclas de azúcares,
principalmente de glucosa-xilosa y glucosa-celobiosa. La xilosa es una pentosa, que no
es fermentable por la mayoría de las bacterias lácticas utilizadas industrialmente para
la producción de ácido láctico (Dien et al., 2001). Otra desventaja, es que la mayoría de
los microorganismos empleados para este fin, requieren de medios de cultivos
complejos, incrementando los costos de producción por nutrientes, purificación del
producto, etc. Además la mayoría, sintetiza D-láctico o una mezcla de D y L-láctico,
siendo pocos los que producen únicamente L-láctico.
De esta manera se han iniciado el desarrollo de nuevas cepas, mediante ingeniería de
vías metabólicas, con la propiedad de crecer en medios minerales, producir ácido
láctico, fermentar los azúcares presentes en los materiales lignocelulósicos, además,
de que sinteticen solo una forma isomérica del ácido láctico, el L-lactato, disminuyendo
de esta forma los costos de producción y purificación del producto. A la fecha, las
bacterias lácticas, hongos, levadura y bacterias modificadas genéticamente han sido
investigadas como potenciales biocatalizadores para la producción de ácido láctico. En
la mayoría de los trabajos, indican el uso de medios complejos (ricos) para alcanzar
rendimientos cercanos al teórico de conversión de glucosa a láctico, siendo muy pocos
los trabajos hechos utilizando medios minerales con altos rendimientos de conversión
(Revisiones: Chang et al., 1999; Dien et al., 2001; Yun y Ryu, 2001; Dien et al., 2002;
Bai et al., 2003; Skory, 2003; Zhou et al., 2003a; Zhou et al., 2003b).
Basándose en los resultados obtenidos de las evaluaciones hechas en medio mineral
(sección 9.3 y 9.3.1), cuyo único producto de fermentación obtenido fue el ácido láctico,
59
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
y conociendo que B. subtilis posee una L-lactato deshidrogenasa funcional en
condiciones de fermentación (Nakano y Zuber, 1998), se planteó la posibilidad de
incrementar la productividad de L-láctico, suplementando el medio mineral con SLM y
utilizando 50 g/l de glucosa.
60
50
40
1
30
20
Glucosa (g/l)
Lactato (g/l)
Biomasa (g/l)
10
10
0
10
60
50
40
1
30
20
Glucosa (g/l)
Lactato (g/l)
Biomasa (g/l)
0.1
10
0.1
0
24
48
72
96
0
120
Tiempo (h)
Figura 9.10 Producción de L-lactato en cultivos de B. subtilis con 50 g/l de glucosa
A) Medio mineral y B) Medio mineral con 30 g/l de SLM
60
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
De acuerdo a las cinéticas presentadas en la figura 9.10, la glucosa (50 g/l) se
consumió aproximadamente en 107 h en el medio suplementado con sólidos de licor de
maíz, mientras que en medio mineral (sin suplementos) el consumo de glucosa fue solo
de 20 g/l en el mismo tiempo. Después de ese tiempo las células comenzaron a lisarse.
A pesar de ello, las velocidades especificas de producción de L-láctico fueron mayores
en medio mineral (tabla 9.8). Sin embargo la productividad volumétrica en el medio
suplementado fue 2.4 veces mayor que en el medio mineral (sin suplementos).
La producción final de ácido L-láctico fue de 17 g/l para medio mineral y 43 g/l para
medio mineral suplementado, siendo los rendimientos finales de conversión de glucosa
a L-láctico similares entre sí, con valores superiores al 70 % del teórico (1 g de lactato
/g de glucosa; Tabla 9.10).
Tabla 9.10. Producción de L-lactato con B. subtilis con alta concentración de glucosa.
glucosa inicial
µ
(g/l)
(h-1)
Mineral
53
0.031
Mineral-SLM 30 g/l
57
0.087
Medio de cultivo
a
XMAX
c
0.57
0.44
0.72
0.38
0.16
0.49
3.32
0.75
0.15
0.38
qP
b
YP/S
d
qP
e
QP
a
qP= Velocidad especifica de producción de láctico durante la fase de crecimiento exponencial
(gLactato/gDWC.h)
b
XMAX = Biomasa promedio durante la fase estacionaria (gDWC/l)
c
YP/S =Rendimiento final producto /sustrato (g L-láctico /g azúcar)
d
qP = Velocidad especifica de producción de láctico durante la fase de crecimiento estacionaria
(gLactato/gDWC.h)
e
QP: Productividad volumétrica de Láctico (glactato/l.h).
9.6.2.1 Comparación de la producción de L-lactato en B subtilis
WB700CH2 con reportes de la literatura de otros microorganismos.
En la tabla 9.11 se presenta un resumen que describe los microorganismos que han
sido reportados recientemente para la producción de láctico. Como puede observarse,
en la mayoría de los trabajos se ha trabajado principalmente con Escherichia coli. Este
microorganismo ha sido modificado mediante ingeniería de vías metabólicas,
61
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
eliminando genes específicos e incorporando otros que codifican para enzimas
específicas de microorganismo que naturalmente producen una sola forma de ácido
láctico.
Tabla 9.11 Microorganismos reportados recientemente para la producción de ácido
láctico.
d
a
QP
C
Medio de
Fuente de carbono,
Tiempo de
y referencias
cultivo
concentración (g/l)
cultivo (h)
A
Complejo
Glc, 50
90
0.46
NR
NR
B
Mineral
Glc, 65
67
0.70
NR
L
C
Mineral
Glc, 56
60
0.90
1.09
D
D
Complejo
Lac, 40
26
0.92
3.21
L
E
Complejo
Glc, 150
35
0.90
3.56
NR
Complejo
Fru, 150
35
0.96
4.12
NR
Complejo
Mal, 150
35
0.92
3.54
NR
Complejo
Glc, 100
30
0.93
2.33
L
Xyl, 100
100
0.78
0.73
L
F
YP/S
b
Microorganismo
Tipo de
láctico
G
Complejo
Glc, 50
500
0.85
NR
NR
H
Complejo
Glc, 50-Xyl, 50
150
0.77
NR
L
I
Mineral
Glc, 83
18-20
0.76
NR
L
J
Complejo
Glc, 92
30.5
0.45
NR
NR
K
Mineral
Glc, 50
120
0.95
0.65
L
Mineral
Xyl, 50
312
0.93
0.32
L
NR: No reportado
a
YP/S: Rendimiento final de conversión de la fuente de carbono a láctico.
b
QP : Productividad volumétrica máxima (glactato/l*h)
c
Tipo de estereoisómero del ácido láctico: L o D.
d
Descripción del microorganismo:
A) Kluyveromyces lactis: Interrupción de la piruvato descarboxilasa y expresión
heteróloga del gen de la enzima lactato deshidrogenasa de mamífero (bovino; Porro
et al., 1999).
62
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
B) Escherichia coli JP204: Cepa con interrupción de los genes que codifican para las
enzimas fosfotransacetilasa y D-lactato deshidrogenasa y la expresión heteróloga de
L-LDH de Lactobacillus caseii. Estrategias de cultivo: crecieron E. coli JP204 en
condiciones aeróbicas hasta alcanzar una concentración de biomasa igual a 7.2 g/l,
para después cambia a anaerobiosis y realizaron cultivos lote alimentado (Chang et
al., 1999).
C) Escherichia coli JP203: Cepa con deleción de los genes que codifican para las
enzimas fosfotransacetilasa y fosfoenolpiruvato carboxilasa. Estrategias de cultivo
similares a las reportadas para el crecimiento de JP204 (descripción anterior; Chang
et al., 1999).
D) Lactobacillus helveticus GRL89: Bacteria GRAS, homofermentativa, termo y ácido
láctico tolerante. La construcción de la cepa se llevó a cabo por inactivación del gen
ldhD mediante reemplazo por el gen ldhL. (Kylä-Nikkilä et al., 2000).
E) Enterococcus faecalis RKY1: Cepa silvestre. Produce L-láctico a partir de diferentes
fuentes de carbono: glucosa, fructosa y maltosa; así como en mezclas de éstos
azúcares, pero no en xilosa, galactosa y sacarosa (Yun y Ryu, 2001).
F) Escherichia coli: Expresión heteróloga del gen ldh de Streptococcus bovis.
Fermenta glucosa y xilosa (Dien et al., 2001).
G) Kluyveromyces lactis: Interrupción de la piruvato descarboxilasa y piruvato
deshidrogenasa y la expresión heteróloga del gen de la enzima lactato
deshidrogenasa de mamífero (bovino; Bianchi et al., 2001).
H) Escherichia coli: Expresión heteróloga del gen ldh de Streptococcus bovis e
interrupción de la piruvato formato liasa y D-lactato deshidrogenasa. Fermenta
mezclas glucosa - xilosa (Dien et al., 2002).
I) Rhizopus oryzae R1021: Los cultivos requieren de una alta transferencia de
oxígeno y son morfológicamente complejos. En este trabajo estudiaron la forma ideal
de micelio para obtener una alta productividad de ácido láctico (Bai et al., 2003).
J) Saccharomyces cerevisiae InvScl (pLdhA68X; diploide): Expresión heteróloga del
gen para la L-lactato deshidrogenasa de Rhizopus oryzae. Presenta bajos
rendimientos, además de presentar producción de etanol. Primer reporte sobre la
expresión de un gen de un hongo en una levadura (Skory, 2003).
63
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
K) Escherichia coli SZ85: Presenta 5 interrupciones cromosomales de lo genes que
codifican para las enzimas: piruvato formato liasa (pflB), acetato quinasa (ackA),
alcohol deshidrogenasa (adhE), lactato deshidrogenasa (ldhA) y fumarato reductasa
(frdBC) y la integración cromosomal del gen de la L-lactato deshidrogenasa (ldhL) de
Pediocooccus acidilactici (Zhou et al., 2003b)
En comparación con los resultados obtenidos en el presente trabajo, los rendimientos
finales de conversión de glucosa son similares a las reportadas para cepas de
Rhizopus oryzae y ligeramente menores a los obtenidos con cepas recombinantes de
E. coli. Lo que indica que B. subtilis potencialmente tiene la capacidad para ser
aplicado en la producción industrial de L-lactato, pero que además se requiere llevar a
cabo estudios adicionales para maximizar la concentración y velocidad de producción
de L-lactato con este microorganismo.
Una de las opciones para disminuir los tiempos de fermentación e incrementar la
producción de L-lactato, sería implementar estrategias de cultivo como las propuestas
por Chang et al., (1999). Estas estrategias consisten en crecer a B. susbtilis bajo
condiciones aeróbicas hasta alcanzar una biomasa elevada, entonces, cambiar las
condiciones del cultivo a anaerobiosis. De esta forma se lograría una productividad
específica similar a los cultivos en condiciones únicas de anaerobiosis, pero con una
productividad volumétrica mayor, debido a la alta concentración celular.
9.7 Evaluación del crecimiento de B. subtilis en mezclas de azúcares
Como se cita en la introducción de este proyecto, a futuro se pretende utilizar a B.
subtilis para metabolizar fuentes de carbono renovables y de bajos costos como los
hidrolizados de residuos agroindustriales, los cuales están compuestos por mezclas de
azúcares (glucosa-xilosa, glucosa-celobiosa y pequeñas cantidades de arabinosa,
galactosa y manosa). Con el propósito de evaluar el comportamiento de este
microorganismo se llevaron acabo cultivos en condiciones aeróbicas y anaeróbicas con
64
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
medio mineral (sin adición de suplemento en el caso de condiciones anaeróbicas) con
mezclas binarias de azúcares.
La concentración inicial total de azúcares fue de 10 g/l y las mezclas evaluadas fueron
glucosa-xilosa y glucosa-celobiosa en relación 1:1. En la figura 9.11, 9.12 y 9.13 se
presentan las cinéticas de crecimiento, consumo de azúcar y formación de productos
observados en estas evaluaciones.
Cuando se utilizan dos o más fuentes de carbono, estas son consumidas
subsecuentemente, presentando varias fases de crecimiento exponencial, las cuales
están separadas por fases de adaptación, lo cual comúnmente es denominado
crecimiento diáuxico. El consumo de cada una de las fuentes de carbono está
generalmente sujeto a represión catabólica por glucosa. Es decir que la glucosa es
metabolizada primeramente y el (los) otro (s) azúcar (res) es (son) metabolizado (s)
una vez que la glucosa se agota. Debido a esto, las mezclas de azúcares no pueden
ser metabolizadas de manera rápida y eficiente (Hernández-Montalvo et al., 2001). La
represión catabólica es un mecanismo de regulación por el cual la célula coordina el
metabolismo de las fuentes de carbono y energía para maximizar su eficiencia y regular
otros procesos metabólicos. En B. subtilis, como en la mayoría de las bacterias, la
represión catabólica por glucosa es un sistema global que regula fuertemente la
expresión de genes y operones involucrados en el metabolismo de otros carbohidratos
(Chambliss, 1993).
En las evaluaciones llevadas acabo tanto en cultivos aeróbicos como anaeróbicos, se
observa que la utilización de otras fuentes de carbono está fuertemente regulada por la
presencia de glucosa en el medio de cultivo. Además, no se presenta el crecimiento
tipo diáuxico esperado, si no que al agotarse la glucosa, B. subtilis experimenta una
fase de muerte acelerada (lisis celular), alcanzando, en algunos casos, densidades
celulares menores a las originalmente inoculadas (figura 9.11, 9.12 y 9.13). Al parecer
este comportamiento puede atribuirse parcialmente a la eliminación de los genes que
codifican para las 7 proteasas mayoritarias en la cepa utilizada (tabla 7.1). Varios
grupos de investigación han demostrado que la síntesis de proteasas extracelulares en
65
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
B. subtilis está directamente involucrada en el control de la autolisis mediante
modulación de la actividad de las enzimas autolíticas (Jolliffe et al., 1980, Stephenson
et al., 1999). Las mutantes deficientes en proteasas extracelulares evaluadas en dichos
trabajos, mostraron un incremento en la velocidad de cambio de peptidoglicanos e
incrementaron la susceptibilidad a la lisis celular debido a una actividad autolítica no
controlada (Stephenson et al., 1999).
Después de la fase de muerte acelerada se presenta una fase de adaptación y
posteriormente una segunda fase de crecimiento exponencial.
En ambas condiciones, no se puede decir que la segunda fase de crecimiento
observado se debe a un proceso de germinación-esporulación de B. subtilis durante la
fase de muerte acelerada debido a las siguientes razones:
1. El proceso de esporulación se lleva en ocho estadios en un periodo aproximado de
8 h (en medio rico) y se inicia durante la fase de crecimiento estacionario (Martínez,
1997), sin embargo para los casos evaluados, no se observa una fase estacionaria.
Además, el periodo de muerte y adaptación de las células tiene una duración
aproximada de 2-5 h para condiciones aeróbicas (figura 9.11 y 9.12), el cual no es
suficiente para el desarrollo de dicho proceso.
2. En condiciones anaeróbicas, en donde el proceso de muerte y adaptación tiene una
duración mayor a 24 h (figura 9.13), el proceso de esporulación no puede darse,
debido a que B. subtilis pierde la capacidad de esporular bajo estas condiciones.
(Hoffmann et al., 1995; Espinosa de los Monteros et al., 2001)
En cultivos aeróbicos con mezclas de azúcares (figura 9.11 y 9.12), después de la fase
de muerte acelerada, la fase de adaptación para la mezcla glucosa-xilosa fue mayor (3
h) que la presentada en la mezcla glucosa-celobiosa (1 h).
66
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
% de Oxigeno disuelto
100
80
60
40
20
0
10
4
1
3
2
0.1
Azúcar (g/l)
Acético (g/l)
Biomasa (g/l)
5
1
0.01
0
6
12
18
24
0
30
Tiempo (h)
Figura 9.11 Cultivo aeróbico de B. subtilis en mezclas de glucosa-xilosa.
Los símbolos abiertos corresponden a los datos obtenidos por la utilización de xilosa.
Las flechas indican el tiempo en el cual se da el cambio en la concentración de oxígeno
disuelto.
67
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
% de Oxigeno disuelto
100
80
60
40
20
0
10
4
1
3
2
0.1
Azúcar (g/l)
Acético (g/l)
Biomasa (g/l)
5
1
0.01
0
2
4
6
8
10
12
0
14
Tiempo (h)
Figura 9.12 Cultivo aeróbico de B. subtilis en mezclas de glucosa-celobiosa.
Los símbolos abiertos corresponden a los datos obtenidos por la utilización de
celobiosa. Las flechas indican el tiempo en el cual se da el cambio en la concentración
de oxígeno disuelto.
68
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
Después de la fase de muerte acelerada, el medio de cultivo se ve enriquecido por la
presencia de los componentes provenientes de la lisis del material celular. Al parecer
por ello en la mezcla glucosa-xilosa, el microorganismo utiliza a todos estos
componentes para crecer, lo cual es corroborado con el bajo consumo de xilosa
observado (Tabla 9.12; figura 9.11). A pesar de encontrarse en condiciones de cultivo
similares a cultivos con medio rico, las velocidades de crecimiento observadas fueron
similares a las obtenidas en medio mineral con xilosa como única fuente de carbono
(Tabla 9.3). En el caso de glucosa-celobiosa, en donde la fase de muerte fue menor
que para el caso anterior, la celobiosa es consumida totalmente durante la segunda
fase de crecimiento, además de que contrario a la mezcla con xilosa, presenta una
velocidad específica de crecimiento y de consumo de azúcar mayor que las observadas
para cultivos en medio mineral–celobiosa bajo las mismas condiciones (tabla 9.3 y
9.12).
En ambos casos, las velocidades de crecimiento observadas durante la primera fase de
crecimiento fueron similares a las obtenidas para medio mineral-glucosa (tabla 9.12).
Se observa la formación de ácido acético debido al metabolismo de glucosa y éste es
consumido totalmente durante la segunda fase de crecimiento exponencial en los
cultivos con glucosa-xilosa en anaerobiosis (figura 9.11 y 9.12).
En todos los cultivos aeróbicos la concentración de oxigeno disuelto fue mayor al 20%
de saturación. Como generalmente sucede, el cambio en la concentración del oxígeno,
como respuesta al agotamiento de la fuente de carbono es muy notorio. Observándose
un incremento drástico en el nivel de oxígeno disuelto en el medio precisamente en el
momento en que se agota la fuente de carbono, hasta llegar a valores cercanos del
100% de saturación (figuras 9.11 y 9.12). Cuando B. subtilis “cambia” de la fase de lisis
celular a una nueva fase de crecimiento, se observa de nuevo más consumo de
oxígeno y el nivel de oxígeno disuelto se incrementa de nuevo drásticamente cuando
se agota la segunda fuente de carbono (xilosa o celobiosa).
69
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
A) 8
6
0.1
4
Azúcar (g/l)
Láctico (g/l)
Acético (g/l)
Biomasa (g/l)
1
2
0.01
0
1
8
6
0.1
4
Azúcar (g/l)
Láctico (g/l)
Acético (g/l)
Biomasa (g/l)
B)
2
0.01
0
0
12
24
50
62
74
86
98
Figura 9.13 Cultivo anaeróbico de B. subtilis en mezclas de azúcares: A) Mezcla
glucosa-xilosa y B) Mezcla glucosa-celobiosa.
Los símbolos abiertos corresponden a los datos obtenidos por la utilización de la fuente
de carbono distinta a glucosa (xilosa o celobiosa)
70
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
En cultivos en condiciones anaeróbicas, se observa la formación de ácido láctico
durante la primera fase de crecimiento y ácido acético durante la segunda. Para el caso
de glucosa-xilosa, el ácido láctico formado durante la primera etapa del crecimiento es
consumido parcialmente por el microorganismo durante la segunda fase de crecimiento
Estos hechos sugieren que el crecimiento observado con xilosa se debe a que utiliza
los componentes del medio provenientes de la lisis celular y en menor proporción a las
fuentes de carbono: xilosa y ácido láctico (figura 9.13).
En resumen, podemos decir que en comparación con los parámetros obtenidos en
cultivos con una sola fuente de carbono y en medios minerales:
Las velocidades especificas de crecimiento presentadas en estos cultivos en
condiciones aeróbicas, fueron similares cuando el crecimiento se debe al consumo de
glucosa en la mezcla glucosa-xilosa y mayor en la mezcla glucosa-celobiosa. Con
xilosa la velocidad de crecimiento fue similar y mayor en un 70% en el caso de
celobiosa.
En condiciones anaeróbicas, las velociades especificas de crecimiento fueron en
promedio 75% mayores.
En condiciones aeróbicas, los rendimientos biomasa/sustrato fueron menores
durante el consumo de glucosa y similares durante el consumo de celobiosa. En
condiciones anaeróbicas los rendimientos fueron similares con glucosa y mayores con
xilosa y celobiosa.
Las velocidades de consumo de azúcar (qS) fueron mayores en todos los casos.
Todo lo anterior es resumido en la tabla 9.12.
71
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
Tabla 9.12 Parámetros cinéticos de B subtilis WB700CH2 en cultivos con medio
mineral en mezclas de azúcares.
Aeróbicas
µ
-1
(h )
0.49glc
0.24 xil
YX/S
(gDWC/gS)
0.20glc
0.90 xil
qS
(gS/gDWC.h)
2.52glc
0.26xil
Glc-cel
Aeróbicas
0.60 glc
0.61 cel
0.29glc
0.49 cel
2.04 glc
Glc-xil
Anaeróbicas
0.07glc
0.01 xil
0.07glc
0.11 xil
0.99glc
Glc-cel
Anaeróbicas
0.06 glc
0.06 cel
0.07glc
0.12 cel
0.84 glc
Mezcla
Condiciones
Glc-xil
1.23 cel
0.06xil
0.53 cel
Los subíndices indican el azúcar con el cual se evaluó cada parámetro.
9.8 Evaluación de la tolerancia a etanol y furfural sobre el crecimiento de B.
subtilis en condiciones anaeróbicas.
Con el fin de conocer las posibilidades y el potencial de B. subtilis para utilizarse en la
producción de etanol a partir de hidrolizados lignocelulósicos es necesario evaluar la
tolerancia a etanol y a los compuestos derivados de la hidrólisis ácida de dichos
materiales, tales como el furfural, hidroximetilfurfural y ácido acético entre otros.
Estudios previos han demostrado que entre los furanos presentes en los hidrolizados
de los materiales lignocelulósicos, el furfural presenta una mayor toxicidad en cepas
etanologénicas de E. coli (Zaldivar et al., 1999), siendo además el que se encuentra en
mayor proporción en dichos hidrolizados (Palmqvist et al., 1999), por ello se llevó acabo
la evaluación de la tolerancia de B. subtilis a dicho compuesto, así como también su
tolerancia a etanol.
Para ello, los cultivos se llevaron acabo en medio LB con 10 g/l de glucosa en
condiciones anaeróbicas, realizándose un barrido de concentraciones de 0 a 3 g/l de
furfural y de 0 a 50 g/l de etanol. Las curvas de dosis respuesta para furfural y etanol se
presentan en las figuras 9.14 y 9.15 respectivamente.
72
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
De acuerdo a los datos obtenidos, se observó para el caso del furfural que la respuesta
de inhibición no es lineal, con un comportamiento similar en ambos tiempos y que a la
concentración de 2.5 g/l de furfural se inhibe en un 100% el crecimiento de B subtilis
WB700CH2.
En el caso de etanol, los patrones de comportamiento fueron distintos para cada tiempo
evaluado, lo cual puede indicar, aparentemente, la presencia de un fenómeno de
adaptación, ya que los valores de inhibición aumentan conforme aumenta el tiempo de
cultivo (tabla 9.13). En este caso, la concentración mínima inhibitoria (MIC) para inhibir
Crecimiento Relativo (%)
el crecimiento en un 100% fue de 50 g/l (figura 9.15).
100
24 h
30 h
80
60
40
20
0
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
Furfural (g/l)
Figura 9.14 Crecimiento relativo en cultivos de B. subtilis WB700CH2 con furfural.
73
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
Crecimiento Relativo (%)
_________________________________________________________________________________________________________
12 h
24 h
36 h
100
80
60
40
20
0
0
10
20
30
40
50
Etanol (g/l)
Figura 9.15 Crecimiento relativo en cultivos de B. subtilis con etanol.
Varios grupos de investigación han reportado estudios de tolerancias realizados en
cepas de E. coli etanologénicas (KO11 y LYO1) y en diferentes levaduras. Estos
estudios muestran que la MIC de furfural para el caso de las cepas de E. coli KO11 y
LYO1 es de 3.0 g/l y 3.5 g/l respectivamente a 24 h de cultivo (Zaldivar et al., 1999).
Para Bacillus subtilis, no existen reportes de estudios de tolerancia a furfural, por ello,
comparando los datos obtenidos en el presente trabajo, con los trabajos reportados en
otros microorganismos podemos observar que B. subtilis WB700CH2 presenta una MIC
menor en un 20% a la de KO11 y en un 40% a la de LYO1. De igual forma, las IC50
obtenidas son menores que la reportada para LYO1 (IC50 =2.4 g/l; Zaldivar et al., 1999).
Lo anterior sugiere que B. subtilis es menos tolerante que E. coli al furfural.
Para el caso de la tolerancia a etanol en B. subtilis, Konopásek et al. (2000) reportaron
que a concentraciones de etanol cercanas de 40 g/l, los tiempos de duplicación
aumentaron 4.5 veces en comparación con cultivos realizados a 40ºC con cepas de B.
74
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
_________________________________________________________________________________________________________
subtilis 168 cuando el etanol fue agregado a la mitad de la fase de crecimiento
exponencial.
En comparación con cepas de E. coli etanologénicas, B. subtilis WB700CH2 presenta
tolerancias similares de etanol (Zaldivar et al., 1999), pero, como era de esperarse,
mucho menores en comparación a valores típicos para levaduras (MIC = 100 g/l).
Compuesto
Etanol
Furfural
Tiempo de
cultivo (h)
Concentración inhibitoria (g/l)
12
IC50
24
MIC
50
24
37
50
36
42
50
12
1.8
3.0
24
2.0
2.5
30
1.6
2.5
Tabla 9.13 Concentración de etanol y furfural requerida para inhibir el crecimiento de B
subtilis WB700CH2.
75
CONCLUSIONES
_________________________________________________________________________________________________________
10 CONCLUSIONES
De acuerdo a la hipótesis planteada y con los resultados obtenidos, se puede
concluir que en condiciones aeróbicas Bacillus subtilis metaboliza celobiosa con
eficiencia y velocidad similar a la glucosa. Además B. subtilis WB700CH2 asimila y
metaboliza xilosa como única fuente de carbono.
En condiciones aeróbicas con glucosa, el flujo de carbono se dirige hacia la
formación de biomasa y ácido acético, principalmente, y con celobiosa y xilosa se
producen cantidades mínimas de acético.
B. subtilis metaboliza celobiosa en condiciones aeróbicas y anaeróbicas con
eficiencias similares a la glucosa.
La glucosa reprime catabólicamente la utilización de celobiosa y xilosa en B. subtilis
WB700CH2. La velocidad de crecimiento y de consumo de azúcar aumenta, por un
mecanismo desconocido, cuando se utilizan medios minerales con mezclas de
glucosa-celobiosa
y
glucosa-xilosa,
tanto
en
condiciones
aeróbicas
como
aneróbicas.
Debido posiblemente a un desbalance energético, B. subtilis presenta problemas de
crecimiento en condiciones anaeróbicas en medios minerales. Esto puede ser
contrarrestado suplementando los medios con intermediarios metabólicos, tales
como mezclas de aminoácidos.
Con glucosa y celobiosa, en cultivos anaeróbicos se observa un metabolismo
fermentativo homoláctico, con rendimientos de conversión de glucosa en láctico
cercanos al 80% y con velocidades de formación de lactato elevadas.
El lactato obtenido en condiciones anaeróbicas es ópticamente puro y de la forma L.
76
CONCLUSIONES
_________________________________________________________________________________________________________
B. subtilis WB700CH2 no es capaz de crecer en anaerobiosis utilizando xilosa como
única fuente de carbono, probablemente por problemas de rendimiento energético
y/o desbalance redox.
A concentraciones de 50 g/l de etanol y 2.5 g/l de furfural se inhibe en un 100% el
crecimiento anaeróbico de B. subtilis WB700CH2.
Los resultados obtenidos permiten plantear el uso de B. subtilis WB700CH2 como
una alternativa biotecnológica para la producción de L-láctico ópticamente puro a
nivel industrial, o para la obtención de otros productos de fermentación, a partir de
glucosa y celobiosa, mediante la modificación de cepas por ingeniería de vías
metabólicas.
77
PERSPECTIVAS
_________________________________________________________________________________________________________
11 PERSPECTIVAS
El equipo de fermentación instalado ha permitido y permitirá el desarrollo de
investigación de parámetros ambientales, fisiológicos y de estrategias de cultivo en
proyectos básicos y de desarrollo tecnológico.
Evaluar si B. subtilis tiene la capacidad de fermentar otros sustratos más oxidados o
reducidos derivado de la glucosa: sorbitol, gluconato y glucoronato.
Evaluar si B. subtilis tiene la capacidad de fermentar sacarosa y otros azúcares
presentes en los hidrolizados de materiales lignocelulosicos como arabinosa y
manosa.
El uso de xilosa en condiciones anaeróbicas esta directamente relacionada con el
balance energético de las células, sin embargo existen microorganismos capaces de
utilizar xilosa con buenas eficiencias, por ello, se podrían generar cepas de B.
subtilis capaces de utilizar xilosa en dichas condiciones introduciendo los genes
necesarios para hacer más eficiente el transporte y metabolismo de este azúcar.
Basándose en el metabolismo presentado por B. subtilis utilizando celobiosa como
única fuente de carbono, se podría utilizar en cultivos cuya fuente de carbono fuese
la celulosa, únicamente con la adición al medio de endo o exo celulasas.
Evaluar la actividad especifica de la L-lactato deshidrogenasa, para nuevas
aplicaciones biotecnológicas.
Es claro, que con investigaciones respecto a la producción de ácido láctico, tanto a
nivel de estrategias de cultivo, como mediante el uso de herramientas de biología
molecular, se podrían mejorar la concentración, los rendimientos, así como la
productividad de L-láctico. Probablemente, producirlo a partir de xilosa o materiales
lignocelulósicos e implementar procesos de purificación o mediante el desarrollo de
procesos de sacarificación y fermentación simúltanea de celulosa, con adición o
expresión heteróloga de endo o exocelulasas.
78
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
_________________________________________________________________________________________________________
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86
ANEXOS
_________________________________________________________________________________________________________
13 ANEXOS
13.1 Determinación de peso seco de Bacillus subtilis.
El peso seco se determinó en base al método reportado por Martínez (1997).
Se llevaron a peso constante (24 h a 65°C) membranas de teflón Osmonics INC. con
un corte nominal de 0.45 µm. De un cultivo de B. subtilis WB700CH1 en medio mineral
con glucosa 10 g/l a una DO
600nm=
3.54, se realizaron diluciones para obtener 100 ml
de muestra con aproximadamente: 0.1, 0.2, 0.4, 0.6 y 0.8 unidades de densidad óptica.
Se filtraron al vacío utilizando las membranas de teflón y se secaron a 65°C por 24 h.
Se pesaron y por diferencia de peso y de acuerdo al volumen de la muestra, se calculó
la concentración celular en g/l.
Se relacionó por medio de una regresión lineal las lecturas de densidad óptica con el
peso seco determinado. La relación obtenida fue:
Peso seco de células
(g/l)
0.3
1 DO600nm = 0.35 g/l DWC
0.2
r2 = 0.995
0.1
0.0
0.0
0.2
0.4
DO
0.6
0.8
600 nm
Figura 13.1 Curva de peso seco de células para B subtilis a 600 nm
87
ANEXOS
_________________________________________________________________________________________________________
13.2 Extracción de ADN cromosomal.
La extracción de ADN cromosomal se llevó a acabo por el método descrito por Wilson
(2001).
Se utilizó la cepa de B. subtilis BB80 (∆nprE glyB hisA; protrótrofa a triptófano) como
cepa donadora de ADN cromosomal.
Para llevar acabo la extracción de ADN se utilizaron las siguientes soluciones:
amortiguador TE (Tris/EDTA), Dodecil sulfato de sodio (SDS) al 10%, NaCl 5M,
proteinasa
K
bromido/cloruro
20
de
mg/ml,
sodio
lisozima
10
mg/ml, solución de cetiltrimetilamonio
(CTAB/NaCl),
cloroformo/alcohol
isoamílico
24:1,
Fenol/Cloroformo/Alcohol isoamílico 25:24:1, isopropanol, etanol al 70%.
Se inocularon 5 ml de medio Luria con B. subtilis BB80 y se incubó por 12 h a 37°C y
300 rpm. Después se centrifugó durante 10 min a 5000 rpm, el paquete celular
obtenido se resuspendió en 567 µl de amortiguador TE y se agregaron 5 µl de
Lisozima, 30 µl SDS al 10% y 3 µl de proteinasa K 20 mg/ml, se mezclaron y se
incubaron durante 1 h a 37°C. Transcurrido el tiempo se agregaron 100 µl de NaCl 5M
y 80 µl de una solución de CTAB/NaCl, se mezclaron por inversión y se incubó durante
10 min a 65°C. Después de este tiempo se agregaron 700 µl de cloroformo/alcohol
isoamílico y se centrifugó durante 5 min a 5000 rpm. Se removió la fase acuosa y se
transfirió a un tubo ependorf, se agregó un volumen igual de fenol/cloroformo/alcohol
isoamílico, se mezcló mediante vortex y se centrifugó durante 5 min a 5000 rpm.
Nuevamente se removió la fase acuosa y se transfirió a un tubo ependorf y se agregó
0.6 volúmenes de isopropanol, se agitó suavemente por inversión y se centrifugó
durante 10 min a 500 rpm. Una vez adicionado el isopropanol y después de agitar
suavemente se pudo observar el ADN precipitado en forma de hebra. Se realizaron tres
lavados del ADN cromosomal con etanol al 70%. El paquete de ADN obtenido se
resuspendió en Amortiguador TE.
88
ANEXOS
_________________________________________________________________________________________________________
13.3 Operación de un sistema de mini-fermentadores no aireados.
El sistema de mini-fermentadores o Fleakers consta de:
a) Un control de temperatura, el cual esta integrado por un baño de agua, un sensor de
temperatura y un termo-circulador de agua.
b) Un control de pH, el cual esta integrado por 6 electrodos, 6 controladores y 6
válvulas (solenoides) de adición.
c) Un sistema de agitación o parrilla magnética para 6 magnetos (rango de 100-850
rpm)
d) 6 Mini-fermentadores o fleakers con un volumen nominal de 250 ml y de trabajo de
200 ml, cuyo sistema de agitación consiste en un agitador magnético en forma de
cruz de 1 pulgada.
Este sistema se describe en la figura 13.2.
Los fleakers, previamente calibrados a 200 ml. se esterilizan por calor húmedo a 121°C
durante 20 min, sin el medio de cultivo solo con la fuente de carbono disuelto en 100 ml
de agua destilada, preparados como se indica en la figura 12.3. Una vez estériles, se
adicionan 100 ml de medio 2X y se ajusta el volumen de trabajo con agua destilada
estéril. Estos se inoculan de acuerdo a lo descrito en la sección 6.4.3. Una vez
inoculados se colocan dentro del baño de agua, se enciende el sistema de agitación, se
colocan los electrodos de pH y se encienden los controladores de pH.
Los electrodos de pH se esterilizan por un método químico y se calibran antes de
esterilizarse. La calibración se realiza por métodos estándares de calibración utilizando
amortiguadores certificados de pH 7.0 y 4.0 respectivamente. Una vez calibrados, los
electrodos se lavan con agua destilada y se dejan sumergidos por al menos 12 horas
en una solución de KCl 3M-Formaldehído al 1%. Antes de utilizarse en los minireactores (fleakers), se enjuagan tres veces con agua destilada estéril y se colocan en
cada uno de los fleakers.
89
ANEXOS
_________________________________________________________________________________________________________
El baño de agua deberá contener aprox. 20 l de agua destilada y el ajuste de
temperatura se realiza 2 horas antes de iniciar el cultivo.
Válvulas de
adición de base
Termocirculador
Controladores
de pH
Baño de agua
Fleakers
Parrilla magnética
Figura 13.2 Sistema de minifermentadores o fleakers.
90
ANEXOS
_________________________________________________________________________________________________________
Toma de muestra
Venteo
Puerto para electrodo
de pH
Puerto para adición
de base
Agitador
magnético
Figura 13.3 Preparación de fleaker para esterilización.
91
ANEXOS
_________________________________________________________________________________________________________
13.4 Determinación de azúcares y ácidos orgánicos por HPLC.
13.4.1 Preparación del equipo
Todo el material utilizado para preparar las soluciones deberá estar perfectamente limpio
y enjuagado abundantemente con agua grado bi-destilada.
Para la fase móvil (H2SO4 5 mM) se prepara una solución patrón 10x, aforando 6.8 ml de
H2SO4 a 250 ml con agua grado bi-destilada recién recolectada y se filtra con membrana
de 0.45 µm.
El equipo se deja equilibrando por un periodo de 6-12 h a un flujo de fase móvil de 0.2
ml/min, las temperaturas interna y externa de la columna deberán ajustarse a 45 y 50ºC
respectivamente. Una vez transcurrido ese tiempo, se aumenta gradualmente el flujo de
fase móvil hasta 0.5 m/ml desde en controlador de la bomba (Waters 600 Controler) o con
la ayuda del software Milenium. Una vez alcanzado el flujo de trabajo, se enciende la
lámpara de UV (Water Photodiode array Detector 996) y se procede a trabajar con el
equipo.
El sobrenadante de las muestras a analizar se filtran con membrana de 0.45 nm y se
colocan en los viales especiales para el autoinyector. Las muestras se identifican y se se
inyectan automáticamente con ayuda del autoinyector (Waters 717). El sistema es
controlado por el software para cromatografía de Waters denominado Milenium Versión
3.01
13.4.2 Preparación de estándares
Para la determinación de productos por HPLC se inyectaron estándares de ácidos
orgánicos, alcoholes e intermediaros metabólicos.
Los diferentes estándares se prepararon disolviendo la cantidad requerida de los
compuestos en agua desionizada.
92
ANEXOS
_________________________________________________________________________________________________________
Los estándares inyectados fueron: cítrico (tiempo de elución: 9.2 min), pirúvico (11.4
min), succínico (14.65 min), láctico (14.8 min), fórmico (17.48 min), acético (17.7 min),
acetoina (19.75 min) y propiónico (22.32 min), todos estos determinados mediante el
detector de arreglo de diodos a 210 nm; y por índice de refracción: etanol (24.7 min),
butanodiol (22.7 min) y xilitol (12.9 min).
Se generaron curvas de calibración con soluciones patrón de lactato, acetato, y con los
tres azúcares empleados en este estudio: celobiosa (tiempo de retención: 8.8 min),
glucosa (10.6 min) y xilosa (11.3 min), las cuales fueron analizadas bajo las mismas
condiciones descritas anteriormente para las muestras. La figura 13.4 y 13.5 muestran
las curvas de calibración que se obtuvieron para la estimación de ácidos orgánicos por el
detector de arreglo de diodos y azúcar por índice de refracción. Los datos obtenidos de
las concentraciones de cada uno de los compuestos medidos, se calcularon con un
método de Calibración-Interpolado del mismo software.
1.2×10 07
Glucosa: r2 =0.99991
Celobiosa: r2 =0.99998
Xilosa: r2 =0.99854
Área
8.0×10 06
4.0×10 06
0.0×10 -00
0
1
2
3
Concentración (g/l)
4
5
Figura 13.4 Curva de calibración de azúcares por Índice de refracción.
93
ANEXOS
_________________________________________________________________________________________________________
Datos de la curva de calibración de azúcares:
Azúcar
Pendiente
Ordenada al origen
Glucosa
2019851±9167.951
23215.14±27757.135
Celobiosa
2040321±4285.688
118522.7±14214.02
Xilosa
1862328±35536.67
357706.5±107592.6
2.0×10 07
Área
1.5×10
Láctico: r2 =0.9994
07
Acético: r2 =0.9990
1.0×10 07
5.0×10 06
0.0×10 -00
0
2
4
6
Concentración (g/l)
8
10
Figura 13.5 Curva de calibración de ácidos orgánicos por el detector de arreglo de
diodos a 210 nm.
Datos de la curva de calibración de ácidos orgánicos:
Ácido orgánico
Pendiente
Ordenada al origen
Láctico
1534631±21672.20
265057.8±1110613.2
Acético
1145140±19923.38
196760.3±55821.03
94
ANEXOS
_________________________________________________________________________________________________________
13.5 Preparación de Amortiguador y estándares para analizador enzimático
YSI.
13.5.1 Amortiguador YSI 10x:
EDTA
5.88 g
Benzoato de Sodio
9.3 g
NaH2PO4
15.2 g
Na2HPO4
69.2 g
NaCl
27.4 g
Ajustar el pH a 7.3 con KOH o H3PO4 concentrado y aforar a 900 ml con
agua destilada.
13.5.2 Estándar de D-glucosa (2.5 g/l)
NaH2PO4
4.0 g
Na2HPO4
1.0 g
Glucosa
0.25 g
Aforar a 100 ml con agua destilada.
Intervalo de lectura: 0-25 g/l
13.5.3 Estándar de L-láctico (0.5 g/l)
Pesar 31.74 mg de L-lactato de sodio al 98% ópticamente puro y disolver
en 50 ml de agua destilada.
Intervalo de lectura: 0-2.5 g/l
13.6 Cálculos.
13.6.1 Estimación de la velocidad especifica de crecimiento.
La velocidad de crecimiento específica, fue calculada con la ayuda del software
GraphPad Prism 3.0 graficando el logaritmo de la biomasa (gDWC) vs el tiempo (h). La
velocidad específica de crecimiento se obtuvo durante la fase de crecimiento
95
ANEXOS
_________________________________________________________________________________________________________
exponencial mediante cálculo por regresión no lineal, utilizando la ecuación de
crecimiento
exponencial
(X=X0expµt)por
el
método
de
mínimos
cuadrados,
obteniéndose en todos los casos analizados correlaciones mayores a 0.95
13.6.2 Corrección de biomasa por factor de dilución.
La concentración de biomasa, azúcar consumida y productos obtenidos fueron
corregidos en función al volumen de base o ácido adicionado a cada tiempo mediante
un factor de dilución (FD).
Al tiempo (t) en que se toma la muestra, se mide el volumen de ácido/base adicionado
( Vb ) al cultivo y se suma al volumen inicial del cultivo ( Vi ), con estos datos se calcula
el factor de corrección ( FD ) de la siguiente forma:
FD =
Vi + Vb
Vi
A partir del valor de FD obtenidos para cada tiempo, los datos fueron corregidos de la
siguiente manera:
Biomasa = Biomasa ( g / l ) a Tx ∗ FD a Tx
Concentración de azúcar = Azúcar ( g / l ) a Tx ∗ FD a Tx
Producto = Pr oducto ( g / l ) a Tx ∗ FD a Tx
13.6.3 Cálculo de rendimientos y velocidades de consumo de azúcares
y formación de productos.
Los rendimientos YX/S, YP/S y YX/P, durante la fase de crecimiento exponencial fueron
calculados de la siguiente manera:
XMAX = Biomasa producida durante la fase de crecimiento exponencial.
YX/S =
g de Biomasa producida ( XMAX )
g de azúcar consumida
YP/S =
g de Pr oducto
g de azúcar consumida
96
ANEXOS
_________________________________________________________________________________________________________
g de Pr oducto
g de Biomasa ( XMAX )
YP/x =
13.6.4 Cálculo de la velocidad especifica de consumo de azúcar y de
producción de L-lactato.
La velocidad especifica de consumo de azúcar y de producción de láctico fueron
calculadas para las dos fases de los cultivos: La exponencial y la estacionaria.
Para la fase exponencial se calculó de la siguiente manera:
qS =
qP =
µ
Y XS
Y PS ∗ µ
En el caso de la fase estacionaria, se llevó acabo de la siguiente manera: se eligió el
intervalo de tiempo a evaluar y se calculó la concentración de biomasa promedio
( XPROM ) así como el consumo de azúcar o la producción de lactato en dicho intervalo
( T ), con los datos obtenidos, el calculó de qS y qP se llevó acabo de la siguiente
manera:
qS =
azúcar consumida
T (h) ∗ XPROM
qP =
lactato producido
T (h) ∗ XPROM
13.6.5 Cálculo de la productividad volumétrica de L-lactato.
La productividad volumétrica se calculó de la siguiente manera:
QP =
de lactato producidos
T (h) total del cultivo
g l
13.6.6 Cálculo de la concentración mínima inhibitoria de etanol y
furfural.
97
ANEXOS
_________________________________________________________________________________________________________
Para calcular la concentración mínima inhibitoria (MIC), es necesario conocer el
crecimiento relativo (en por ciento) de B subtilis: para cada concentración de inhibidor
evaluada:
Primero es necesario evaluar el crecimiento ( Xn ) obtenido en cada tiempo y en cada
una de las concentraciones de inhibidor evaluadas, incluyendo el cultivo control (cultivo
sin inhibidor):
Xn = Biomasa a TX − Biomasa inicial
A la concentración de Biomasa del cultivo control se denominara Yn .
Una vez obtenido Xn para cada concentración evaluada, entonces se calcula el
crecimiento relativo de la siguiente manera:
Crecimiento relativo (%) =
Xn
∗ 100
Yn
Una vez realizados todos los cálculos para cada una de las concentraciones del
inhibidor, se grafican los valores del crecimiento relativo obtenidos vs la
concentración de inhibidor evaluada correspondiente.
98