Pruebas biológicas para la evaluación ecotoxicológica de las

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INFORME FINAL
PRUEBAS BIOLÓGICAS PARA LA EVALUACIÓN
ECOTOXICOLÓGICA DE LAS SUSTANCIAS QUÍMICAS
TERCERA ETAPA
DESARROLLO DE PRUEBAS BIOLÓGICAS CON ESPECIES
NATIVAS Y EJERCICIO DE INTERCALIBRACIÓN
DICIEMBRE, 2007
Elaboró:
Dra. Patricia Ramírez Romero, Universidad Autónoma Metropolitana, Iztapalapa.
M. en C. Yolanda Pica Granados, Instituto Mexicano de Tecnología del Agua, (IMTA).
Dr. Fernando Martínez Jerónimo, Escuela Superior de Ciencias Biológicas, IPN
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Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592
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CONTENIDO
1. Resumen Ejecutivo
2. Antecedentes
3. Justificación
4. Objetivos
5. Metodología
6. Resultados
7. Propuesta de estudios y/o investigaciones de seguimiento
8. Recomendaciones
9. Conclusiones
10. Referencias
11. Anexos
I.
II.
III.
IV.
V.
VI.
Programa de Trabajo del Taller de Transferencia de Tecnología para el
Proyecto “Pruebas biológicas para la evaluación ecotoxicológica de
sustancias químicas, Tercera Etapa”
Instructivo para el manejo de muestras ciegas
Instructivo para el manejo de muestras ciegas sólidas
Cartas Control
Resultados del ejercicio de intercalibración
Resultados de las pruebas con muestras sólidas
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1. RESUMEN EJECUTIVO
Los bioensayos de toxicidad permiten medir las respuestas de los organismos ante los
contaminantes y complementan los análisis fisicoquímicos para tener una visión integral de
los daños que se ocasionan sobre los ecosistemas, adicionalmente se pueden utilizar
como instrumentos de control para la descargas de sustancias tóxicas en los cuerpos de
agua o en el ambiente en general. En este contexto, el Instituto Nacional de Ecología inició
en 2005 un proyecto con la finalidad de formular una batería de bioensayos para la
evaluación ecotoxicológica de las sustancias que fuera aplicable en México. En 2006 se
comenzó a trabajar con dos especies estándar de agua dulce con buenos resultados. En
esta tercera etapa se incorporaron dos especies presentes en los ecosistemas mexicanos
(Daphnia exilis y Ankistrodesmus falcatus) y se comparó su sensibilidad con respecto a las
especies subrogadas utilizadas en la etapa anterior (Daphnia magna y Selenastrum
capricornutum ), asimismo se evaluó la variabilidad de los resultados entre laboratorios así
como al interior de los mismos a través de una intercalibración con muestras ciegas.
Adicionalmente el Laboratorio de Bioensayos del CENICA se capacitó en la generación de
extractos orgánicos y elutriados de suelos y sedimentos para su análisis en ensayos de
toxicidad
Los resultados demostraron que tanto D. exilis como A. falcatus son adecuadas para su
uso en pruebas de toxicidad, ya que su sensibilidad a las sustancias probadas es
comparable o incluso mayor que la de D. magna y S. capricornutum respectivamente. Los
laboratorios participantes se encuentran en un proceso de avance para lograr la óptima
capacidad analítica, ya que estos son capaces de generar resultados reproducibles,
especialmente para el protocolo de D. magna, D. exilis y en menor medida para S.
capricornutum, procedimiento que aún requiere de ajustes metodológicos y de continuidad
en su uso para el mejoramiento de las capacidades analíticas de los laboratorios
participantes. Las pruebas con muestras ciegas sólidas demostraron que la capacidad
adquirida por el CENICA para procesar muestras no tóxicas es adecuada, sin embargo es
necesario extender estas pruebas a muestras tóxicas.
Los resultados de este proyecto en sus tres fases (2005, 2006 y 2007) demuestran que es
factible desarrollar las capacidades necesarias para contar con laboratorios competentes
en la evaluación toxicológica de muestra ambientales y sustancias específicas en México,
si se cuenta con cepas de organismos y se trabaja en el control de calidad de las pruebas.
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EXECUTIVE SUMMARY
Toxicity bioassays are tools to evaluate the response of organisms to contaminants, they
also provide information, that in conjunction with physical and chemical analysis, result in
an integral view of the damage caused to ecosystems; moreover, this assays can be used
to control the discharge of toxic substances to aquatic bodies or he environmental in
general. In this context, the National Institute of Ecology (INE by its acronym in Spanish)
started a project in 2005 to put together a bioassay battery for the ecotoxicological
evaluation of substances applicable to Mexico. Work with two fresh water standardized
species started in 2006 with good results. In this third phase two species present in
Mexico’s ecosystems were included (Daphnia exilis y Ankistrodesmus falcatus) and their
sensibility was compared to that of the species used in the previous phase (Daphnia magna
y Selenastrum capricornutum ), at the same time the variability within and among
laboratories was assessed through an intercalibration with blind samples. In addition
CENICA’s Bioassays Laboratory learned a technique to obtain organic extracts and
elutriates from soils and sediments for their analysis in toxicity assays.
Results showed that D. exilis and A. falcatus are adequate for use in toxicity tests because
their sensibility to the used substances was comparable or even higher than that of D.
magna y S. capricornutum respectively. Participant laboratories are making progress
toward an optimal analytical capacity, since they are capable of generating reproducible
results, specially with D. magna, D. exilis and a little bit less with S. capricornutum; this last
protocol requires methodological adjustments as well as continued used to better the
analytical capabilities of the laboratories. Tests with blind non-toxic samples showed
CENICA’s solid samples analytical capacities are adequate, however a run with toxic
samples in necessary.
The results of the three phases of this project demonstrate that it’s feasible to develop the
necessary analytical capacities to have competent laboratories for the toxicological
evaluation of environmental samples and specific substances in Mexico, as long as
organisms strains are available and work is done under a quality control regime.
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2. ANTECEDENTES
La protección del medio ambiente es una tarea que requiere conocer cuál es el estado en
el que se encuentran los diferentes ecosistemas, así como las medidas pertinentes para
evitar su contaminación o degradación y para promover su remediación y conservación.
Para ello es necesario contar con instrumentos que permitan medir los efectos de las
diferentes actividades humanas sobre los elementos bióticos y abióticos de los
ecosistemas. Para los elementos abióticos como el agua, el aire y el suelo, existen
numerosas herramientas analíticas que permiten medir las concentraciones de agentes
contaminantes y las alteraciones que producen en estos medios. Sin embargo, para el
caso de los componentes bióticos, es decir los organismos, poblaciones o comunidades,
existen menos herramientas de evaluación. Una alternativa viable para determinar los
efectos biológicos son los bioensayos de toxicidad. Estas pruebas permiten medir las
respuestas de los organismos ante los contaminantes y complementan los análisis
fisicoquímicos para tener una visión integral de los daños que se ocasionan sobre los
ecosistemas.
En este contexto, el Instituto Nacional de Ecología inició en 2005 un proyecto con la
finalidad de formular una batería de bioensayos para la evaluación ecotoxicológica de las
sustancias que fuera aplicable en México. Para ello se contó con la participación de
investigadores expertos en el tema, tanto de instituciones académicas como del gobierno.
Después de una amplia discusión de los criterios de selección y de las posibles especies
candidatas, se propuso un listado final de bioensayos tanto para ambientes acuáticos
como terrestres, cuyos protocolos de prueba detallados se han integrado para su
publicación.
Como segunda etapa de este proyecto, durante 2006 se llevó a cabo la capacitación de
laboratorios académicos y de gobierno para el manejo de bioensayos seleccionados así
como un ejercicio de intercalibración con dos especies de agua dulce, el cladócero
Daphnia magna y el alga Selenastrum capricornutum (Pseudokirchneriella subcapitata).
Los resultados de dicho ejercicio evidenciaron el logro de la generación de capacidades
analíticas de los laboratorios participantes.
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Las especies empleadas para los fines de la segunda fase del proyecto seleccionadas por
ser especies subrogadas cuya aplicación en la evaluación de toxicidad es ampliamente
aceptada a nivel internacional. Respecto a la experiencia nacional, es suficientemente
basta en los grupos de trabajo que fueron involucrados como corresponsables en este
proyecto, razón por la que su misión fue orientar y conducir adecuadamente el desarrollo
de capacidades en los grupos asociados como participantes.
No obstante el buen desempeño logrado hasta el momento en el manejo de la estas
especies de prueba antes mencionadas, es importante hacer notar que estas especies no
se distribuyen naturalmente en México y por ello su empleo en el análisis ambiental de
nuestro país debe ser reforzado con especies representativas de los ecosistemas
mexicanos las cuales podrían resultar ser de mayor sensibilidad a los tóxicos.
Considerando lo anterior, como tercera etapa de este proyecto, se propuso la realización
de un nuevo ejercicio de intercalibración encaminado a involucrar el uso de especies de
prueba de distribución en México, y la estandarización de un procedimiento de extracción
de constituyentes tóxicos de suelos y sedimentos, con el fin de poder solubilizarlos y
efectuar su análisis a través de las pruebas ya intercalibradas.
3. JUSTIFICACIÓN
En México el deterioro de los ecosistemas acuáticos ha estado relacionado a la falta de
políticas económicas consistentes que impulsen la conservación del agua, así como a la
carencia de programas educativos y de apoyo tecnológico orientados al ahorro, tratamiento
y reuso del agua entre los sectores urbano, agrícola e industrial. De acuerdo a estadísticas
recientes de la Comisión Nacional del Agua, tan sólo 8% del agua que utiliza la industria es
tratada o reusada y el resto es descargada en ríos, lagos y mares. En ese mismo sentido,
en nuestro país también enfrentamos la falta de programas permanentes de monitoreo de
la calidad del agua y de sistemas de control de la contaminación que operen bajo un
estricto marco regulatorio enfocado a proteger los recursos hídricos y a garantizar el
abasto de agua. Las actuales Normas Oficiales Mexicanas que regulan las descargas de
aguas residuales consideran únicamente la evaluación de 7 metales y algunos parámetros
físico-químicos básicos (pH, demanda bioquímica de oxígeno, contenido orgánico, de
gradas y aceites y de sólidos suspendidos, disuelto y sedimentables) excluyendo la
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detección de contaminantes de naturaleza orgánica, que constituyen todo un universo de
sustancias tóxicas nocivas para la salud humana y para los ecosistemas (Pica et, al ,
2000).
Por lo anterior, avocarse al desarrollo de herramientas analíticas para evaluar la
contaminación química del agua, basada en pruebas de toxicidad, contribuye al
establecimiento de instrumentos de control para la descargas de sustancias tóxicas en los
cuerpos de agua o en el ambiente en general.
Bajo esta perspectiva, se ha vislumbrado la importancia de contar con una serie de
pruebas biológicas estandarizadas que incluya especies representativas de los
ecosistemas mexicanos, las cuales a su vez, sean aplicables a la evaluación de extractos
de suelos y sedimentos contaminados.
4. OBJETIVOS
Objetivo General
Efectuar un ejercicio de intercalibración entre laboratorios universitarios y de gobierno para
el desarrollo de pruebas de toxicidad con especies estándar como Daphnia magna y
Selenastrum capricornutum (Pseudokirchneriella subcapitata), y calibrar los métodos de
análisis para su empleo con especies de algas y cladóceros de distribución en los sistemas
acuáticos de México
Objetivos Particulares
•
Seleccionar, entre las especies de algas y cladóceros de distribución en México,
identificadas como organismos con potencialidades para su empleo en pruebas de
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toxicidad, durante las etapas anteriores del proyecto, las más convenientes para su
calibración.
•
•
•
Realizar un taller de discusión y de transferencia de tecnología para ampliar la
capacitación de los laboratorios participantes
Llevar a cabo el ejercicio de intercalibración con los organismos seleccionados.
Calibrar un protocolo para la generación de extractos y elutriados de suelos y
sedimentos de utilidad para el desarrollo de pruebas de toxicidad.
5. METODOLOGÍA
1. Selección de especies de pruebas y laboratorios participantes
1.1 Especies
Para la selección de especies de prueba de distribución en México, se analizaron
los listados de cladóceros y algas preseleccionados en la 1ª Etapa de este proyecto,
en el año 2005. Entre los aspectos que se tomaron en cuenta para dicha
preselección se encuentran:
• Conocimiento amplio de su biología
• Representatividad ecológica
• Conocimiento de las condiciones de cultivo y manejo
• Disponibilidad de cepas, caracterizadas y controladas
• Existencia de un protocolo de ensayo de toxicidad aguda que pueda
apegarse a las nuevas especies
En el caso de los Daphnidos las especies preseleccionadas fueron Daphnia exilis,
Daphnia pulex, Simocephalus mixtus, Ceriodaphnia dubia y Moina macrocopa, y para las
microalgas dulceacuícolas, se consideraron a las especies: Scenedesmus acutus,
Chlorella vulgaris y Ankistrodesmus falcatus.
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Durante la segunda etapa del proyecto, realizada en 2006, se efectuaron pruebas con la
mayoría de los organismos mencionados a fin de determinar sus atributos analíticos y
evaluar la conveniencia técnica y metodológicas de su empleo, a fin de discernir cuales
especies de distribución en México resultarían las más adecuadas para su aplicación y
para el consecuente desarrollo de una intercalibración.
A partir de dicho análisis, se definió que las especies propuestas serían Daphnia exilis
(cladócero) y Ankistrodesmus falcatus (microalga), considerando, para esta última, la
necesidad de que los grupos participantes mejoraran el desempeño y aplicación del
protocolo de prueba para microalgas con S. capricornutum. En función de ese avance, se
evaluaría la posibilidad de proceder con el trabajo de intercalibración empleando también
a Ankistrodesmus falcatus.
1.2 Laboratorios
Se contactó a todos los laboratorios participantes que concluyeron exitosamente la
fase anterior de intercalibración, realizada en el año 2006, con el fin de conocer su
disponibilidad de tiempo, recursos humanos, y financieros. Y así mismo, a aquellos
que fungen como corresponsables y colaboradores de este proyecto en las fases
previas. Y que representan a las siguientes instituciones:
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Tabla 1. Instituciones y personas participantes en el ejercicio de Intercalibración.
Colaboradores y corresponsables
Instituciones
M.C. Yolanda Pica Granados
Instituto Mexicano de Tecnología del Agua
Dr. Fernando Martínez Jerónimo
Escuela Nacional de Ciencias Biológicas
IPN.
Participantes
I.I.Q. Gissel Trujillo Domínguez
Biól. Homero Hernandez Salgado
Instituto Mexicano de Tecnología del Agua
M.C. Sandra Luz Guerra
Escuela Nacional de Ciencias Biológicas
Biól. Isabel Romero Terán
Biól. Sonia González Rebollar
Centro Nacional de Investigación y
Capacitación Ambiental (CENICA)
M. en C. Juan Cayetano Cid Núñez
Biól. Lucia Salazar Coria
Instituto Mexicano del Petróleo (IMP)
M. en C. Ivonne J. Cuesta Zarco
Sonia Rangel Villafranco
Gerencia de Saneamiento y Calidad del
Agua. Comisión Nacional del Agua (CNA)
Dra. Alma Socorro Sobrino Figueroa
Universidad Autónoma Metropolitana,
Unidad Iztapalapa (UAM-I)
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2) Taller de transferencia y capacitación en los protocolos de prueba
Los días 14 y 15 de junio del presente año se llevó a cabo un Taller de Transferencia de
Tecnología coordinado por el personal del Instituto Mexicano de Tecnología del Agua
(IMTA). Este taller se realizó en el Centro de Capacitación del IMTA y fue instruido por
especialistas de este mismo Instituto así como de la Escuela Nacional de Ciencias
Biológicas (IPN).
Al inicio del taller, les fue proporcionado a los participantes una carpeta informativa
conteniendo los manuales de procedimientos para la realización de los ensayos con
Daphnia magna y Pseudokirchneriella subcapitata (Selenastrum capricornutum) cuya
aplicación se haría extensiva para
Daphnia exilis
y Ankistrodesmus falcatus,
respectivamente. Así mismo, se incluyó la información adecuada para el mantenimiento
óptimo del cultivo de las especies mencionadas y el procedimiento de control de calidad
(ver Anexo I).
Adicionalmente, y solo para el personal del CENICA, la carpeta incluyó también el
procedimiento para la Generación de Extractos Orgánicos y Elutriados de Suelos y
Sedimentos para su Análisis en Ensayos de Toxicidad, mismo que durante su instrucción
en las instalaciones del IMTA, fue llevado a cabo por los participantes de CENICA durante
un día adicional agendado para tal fin (ver Programa de Trabajo en Anexo I).
El Taller se enfocó principalmente al manejo de las pruebas con Selenastrum
capricornutum (Pseudokirchneriella subcapitata) y su posible aplicación para
Ankistrodesmus falcatus, haciendo énfasis en la detección de los pasos metodológicos que
requieren un mayor control a fin de reducir la variabilidad analítica observada en fase
previas del proyecto. En forma paralela también se instruyó sobre las particularidades del
cultivo para D. exilis y A. falcatus, esta última con fines de realizar una calibración inicial
entre el laboratorio del IMTA y el de la ENCB (IPN).
Al término del taller, a cada laboratorio le fueron entregados materiales de utilidad en el
desarrollo de pruebas, así como cepas de D. magna y S. capricornutum (cepa pura en
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agar, cepa pura en medio líquido propio para resiembra y en medio líquido para
alimentación de cladóceros).
El IPN, por su parte, efectuó la entrega de la cepa de Ankistrodesmus falcatus y
posteriormente, hizo llegar un lote de hembras adultas de D. exilis a cada uno de los
distintos participantes.
3) Intercalibración
Desarrollo de cultivos y pruebas de auto entrenamiento (calibración interna)
Con los materiales y cepas proporcionados por el IMTA y ENCB, cada laboratorio reinició
de forma inmediata, después del taller de transferencia, las actividades de mantenimiento y
optimización del desarrollo de los cultivos. Una vez lograda la adecuada proliferación de
los cladóceros y de las algas, los laboratorios retomaron la tarea de ampliar las cartas
control para las especies ya en uso, e iniciaron la realización de la correspondiente carta
para D. exilis empleando como tóxico de referencia Cr+6 a partir de K2Cr2O7
El registro de los resultados de las cartas control es la principal evidencia a partir del cual
es posible demostrar el manejo óptimo de los métodos de prueba dentro de un contexto de
aseguramiento y gestión de la calidad, y asimismo sirve de evidencia para discernir la
posibilidad de la aplicación del procedimiento de prueba desarrollado para Daphnia magna,
en el empleo de otros cladócero de distribución en México, como es Daphnia exilis.
Análisis de muestras ciegas líquidas
El IMTA efectuó la preparación del paquete de cuatro muestras ciegas de esta fase del
proyecto denominado “tercer grupo” ya que en la fase previa (2006) se manejaron dos
grupos más de muestras ciegas.
Las muestras fueron enviadas a cada uno los laboratorios, acompañadas de un instructivo
detallado para su manejo (ver Anexo II) hasta la obtención de una solución patrón inicial. A
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partir de ella, se dejó en manos del laboratorio la decisión de las concentraciones que
procedían para el cálculo de la CE50 de cada muestra.
Durante este evento de intercalibración, la identidad de los compuestos tóxicos presentes
en las muestras no fue revelada a los laboratorios participantes, por ello los resultados de
la CE50 fueron reportados en porcentaje en los registros del análisis Probit. Estos datos
fueron posteriormente transformados para obtener los valores de las concentraciones
correspondientes, los cuales pueden observarse acompañados del nombre del compuesto
tóxico en la tabla 2.
Tabla 2. Características de las muestras ciegas empleadas en el primer
ejercicio de intercalibración.
Identificación de la Muestra
Muestra 10
Muestra 11
Muestra 12
Muestra 13
0.4 mg/L Cr +6
1 mg/L Hg+2
8 mg/L As+5
0.4 mg/L Cu+2
Para la conversión de los resultados de porcentaje a concentración se empleó el valor de
la concentración inicial de cada solución de prueba, la que sería equivalente al 100%. A
partir de ella se calculó el valor correspondiente en términos de concentración (mg/L) de
acuerdo al siguiente ejemplo:
CE50 (mg/L) =_________0.2 mg(L X 100%________
22.15 (CE50 reportada en por ciento)
Los compuestos tóxicos seleccionados fueron preparados con reactivos de pureza ≥ 99.5
% (certificados). El Cr+6 se obtuvo a partir de K2Cr2O7, el Hg+2 a partir del HgCl2, el Cu+2 a
partir de CuSO4 y el As+5 a partir de Na2HAsO4. En todos los casos se prepararon las
soluciones pesando los reactivos en una balanza semi-microanalítica calibrada y
posteriormente se disolvieron en agua desionizada en volúmenes de 500 mL, aforando en
matraces clase A. Con ello se obtuvieron soluciones con una concentración de 100 mg/L
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de Cr+6, 250 mg/L de Hg+2, 100 mg/l de Cu+2 y 2000mg/L de As+5, las cuales fueron
transferidas a viales cromatográficos de vidrio borosilicato en volúmenes de 2 mL. Tapadas
herméticamente fueron enviadas los distintos laboratorios.
En cada laboratorio los 2 mL de cada solución fueron llevados a un volumen de 500 mL,
diluyendo con agua dura hasta el volumen de aforo, logrando así las concentraciones
iniciales que se señalan en la tabla 2.
La muestra 11, conteniendo mercurio, se empleó como muestra replicada con el objetivo
de verificar la evolución de la precisión de los análisis efectuados por los laboratorios
participantes, comparándose su respuesta con aquellos resultados obtenidos en las fases
previas del proyecto. Las muestras 10 y 13 corresponden a la comparación y verificación
de consistencia analítica en relación a los registros de CE50 obtenidos para las cartas
control.
Muestras para calibración de protocolo para la generación de extractos y elutriados
El laboratorio de CENICA fue el único grupo involucrado en esta tarea, la cual consistió en
aplicar el procedimiento para la generación de extractos orgánicos y elutriados de suelos y
sedimentos, para su análisis en ensayos de toxicidad. Para ello les fue enviado un paquete
con dos muestras de material sedimentario acompañado de su instructivo (ver Anexo III),
para su procesamiento y posterior análisis en pruebas de toxicidad empleando a las
especies D. magna, D. exilis y S. capricornutum.
En este procedimiento una de las mayores preocupaciones en su manejo, es evitar la
generación de falsos positivos o la interferencia ocasionada por el uso de solventes. Si
bien el método indica cómo evitar estas situaciones, es indispensable demostrar que en su
aplicación efectivamente no se incurre en esta clase de errores.
Por las causas antes mencionadas, el laboratorio recibió, junto con el lote de muestras
ciegas líquidas, dos paquetes de sedimento que correspondían a una muestra previamente
evaluada por el IMTA y cuyos extractos y elutriados resultaban inocuos para las especies
antes mencionadas, de modo que para este primer ensayo del método de generación de
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extractos y elutriados el laboratorio de CENICA recibió un material apto para considerarse
control negativo.
El objetivo de este lote fue que el laboratorio ejercitara el protocolo y afinara los detalles
técnicos correspondientes.
6. RESULTADOS
1. Selección de especies y laboratorios participantes.
1.1.
Especies
De acuerdo con los resultados obtenidos en la segunda fase de este proyecto (Ramírez
Romero P , et al , 2006), y presentados en una reunión de iniciación de este proyecto con
los laboratorios participantes el 13 de abril del presente año, las especies de distribución
en México, Daphnia exilis, Simocephalus mixtus, Ceriodaphnia dubia y Moina macrocopa,
en ese orden de importancia, presentaron características de sensibilidad y consistencia
analítica muy similares a la de la especie de referencia Daphnia magna, atributos que las
definieron como posibles especies candidatas para su empleo en pruebas de toxicidad.
Actualmente se cuenta con cepas aisladas y adecuadamente identificadas por la ENCB
(IPN); asimismo, su manejo en cultivo se conoce y está descrito a detalle, aún más el
protocolo para el desarrollo del método de prueba con Daphnia magna es apto para su
aplicación extensiva con las demás especies
Con base en los resultados mencionados, se seleccionó a la especie, Daphnia exilis, para
el desarrollo de esta tercera etapa ya que los análisis de toxicidad para el cromo
hexavalente, empleado como compuesto de referencia, mostró una CL50 de 0.098 mg/L, la
cual es menor a la que caracteriza a Daphnia magna (LC50 = 0.1567 mg/L), lo que la
califica como una especie de mayor sensibilidad respecto a la de referencia. Este dato
resalta la importancia que tiene el ampliar el estudio de esta especie para reconocer el
ámbito de su sensibilidad y sustentar su empleo con fines de monitoreo ambiental y de
análisis de sustancias y productos sintéticos de aplicación en México.
Respecto a la selección de una especie de microalga dulceacuícola, también de
distribución en México, diferente de Selenastrum capricornutum, se analizó la posibilidad
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Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592
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del empleo de tres especies: Scenedesmus acutus, Chlorella vulgaris y Ankistrodesmus
falcatus. De estas, A falcatus fue seleccionada por ser una especie cuyo cultivo puede
también realizarse en el medio AAP, empleado para S. capricornutum, lo cual ofrece la
posibilidad de la aplicación del protocolo de prueba ya calibrado, para ambas especies. De
otra forma, el método de prueba tendría que ser radicalmente transformado y se requeriría
reiniciar un nuevo y largo proceso de calibración, ajeno a los posibles alcances de este
proyecto. Otras bondades de la especie que la ubicaron como candidata son sus
características morfológicas gracias a las cuales se facilitan su cultivo y la lectura de su
densidad, al no constituirse en agregados celulares o presentar polimorfismo.
En relación al segundo punto, fue necesario que los laboratorios corresponsables probaran
las alternativas técnicas para lograr niveles de densidad algal del orden de 3 x 106 cel /mL,
para la preparación del inóculo requerido para el desarrollo de pruebas, antes de poder dar
cualquier instrucción al resto de los laboratorios participantes, a fin de poder efectuar
algunos ejercicios de intercomparación. Debido a lo anterior, solo los laboratorios
corresponsables trabajaron en la definición de la solución metodológica a esta limitante.
Como parte de este proyecto fue necesario trabajar en la definición de dos aspectos del
procedimiento de prueba con S. capricornutum, a fin de poder ser aplicado para A.
falcatus. El principal de ellos fue competencia de los laboratorios corresponsables (IPN e
IMTA), quienes probaron alternativas técnicas para lograr los niveles de densidad algal
requerido para el desarrollo de pruebas, sin que los cambios metodológicos influyeran en
el método de prueba, generando un aumento de la variabilidad analítica. Solo hasta
después de lograr dicho ajuste o solución técnica sería posible dar cualquier instrucción al
resto de los laboratorios participantes, a fin de poder efectuar algunos ejercicios de
intercomparación.
La ENCB (IPN) instrumentó la generación del cultivo de A. falcatus empleando medio Bold
Basal para su proliferación, el cual se mantuvo hasta alcanzar la fase máxima de
crecimiento. Con este medio se logran densidades algales superiores al mínimo necesario,
ya que es un medio de cultivo eutrófico útil para proveer densidades algales elevadas; esta
formulación ocupa nutrientes en forma de sulfatos en niveles superiores al medio AAP. Sin
embargo, el medio AAP ha sido empleado para la proliferación de algas para pruebas de
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toxicidad debido a su formulación basada en cargas limitadas de nutrientes en forma de
cloruros, en lugar de sulfatos, ya que de esta forma se evita la interferencia que estos
pudieran tener con los contaminantes tóxicos presentes en las muestras por evaluar.
Asimismo, permite el desarrollo de protocolos miniaturizados, los cuales no serian posibles
si se emplearan medios eutróficos, ya que a consecuencia de un rápido crecimiento, se
agotaría rápidamente el medio y generaría la necesidad de espacios aéreos de mayor
volumen para evitar la acidificación del medio líquido por la producción de CO2, lo cual
provocaría interferencias en las pruebas. Es por esto que, si bien las algas fueron
proliferadas por el IPN en medio Bold Basal, este medio, al momento del desarrollo de las
pruebas, se sustituyó por el medio AAP 18x como se indica en el procedimiento de rutina
definido para S: capricornutum .Los resultados de este experimento se muestran en la
figura 1
Por su parte, el IMTA proliferó a A. falcatus haciendo uso del medio de cultivo AAP, de la
misma manera que se procede para S. capricornutum. La densidad algal lograda fue de
entre 2.5 a 3 x 106 cel. /mL, de forma que en algunas ocasiones el inoculo pudo ser
preparado de forma directa mientras que en otras, cuando el número de células era menor
a 2.6 x 106 cel. /mL, se empleó como alternativa mantener el cultivo en refrigeración y en
oscuridad para su sedimentación; posteriormente se eliminó parte del volumen del medio
lográndose de esa manera densidades del orden de 5 x 106 cel. /mL. Cantidades
suficientes para la preparación del inoculo algal y para proceder con el desarrollo de rutina
del método de prueba sin hacer uso de ningún medio o sustancia adicional. Los resultados
obtenidos por el IMTA a partir de este manejo se presentan en la figura 2.
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Organismo: Ankistrodesmus falcatus 72h inhibición
Tóxico de referencia: Cu+2 en medio mineral AAP
0.14
Promedio +2Π.= 0.1293
0.13
CL 50 (mg/L)
0.12
0.11
0.1
0.09
Promedio = 0.0985
0.08
0.07
Promedio -2Π.= 0.0676
0.06
0.05
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Número de experimento
Media
0.0985
D.E.
0.0187
C.V.
15.6833
Media + 2 D.E.
0.1293
Media – 2 D.E.
0.0676
Figura 1. Resultados de las pruebas de toxicidad aguda con Cobre a 72 hrs
de Ankistrodesmus falcatus proliferada en medio Bold Basal.
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Organismo: Ankistrodesmus falcatus 72h inhibición de
crecimiento. Tóxico de referencia: Cu II
CL 50 (mg/L)
0.04
Promedio +2σ.= 0.0391
0.035
Promedio = 0.0339
0.03
Promedio -2σ= 0.0286
0.025
1
2
3
4
5
6
7
Número de experimento
Media
0.0339
D.E.
0.00261
C.V.
7..71
Media + 2 D.E.
0.0391
Media – 2 D.E.
0.0286
Figura 2. Resultados de las pruebas de toxicidad aguda con Cobre a 72 hrs
de Ankistrodesmus falcatus proliferada en medio AAP.
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Con base en estos resultados, se observa una gran consistencia interna para cada uno de
los laboratorios, sin embargo existen diferencias significativas entre los valores de la CE50
obtenidos por cada institución, indicando la posibilidad de que el empleo del medio Bold
Basal para el cultivo pueda causar cambios en la sensibilidad de la especie, haciéndola
menos sensible que S. capricornutum, cuya CE50 para el Cu+2 empleado como tóxico de
referencia, es de 0.0317 mg/L, de acuerdo con la carta global de los diversos laboratorios
participantes de la fase dos de este proyecto en el año 2006 (figura 3). Sin embargo, en
relación a los resultados obtenidos por el IMTA se observa que la sensibilidad al Cu+2 de A.
falcatus no presentan diferencias significativas respecto a la observada para S.
capricornutum
El segundo aspecto por resolver referente al procedimiento de prueba, fue la definición de
un sistema de iluminación alternativo distinto al propuesto inicialmente. El protocolo base
propone el diseño de una cámara de iluminación piramidal cuyo montaje garantiza la
homogeneidad de la luz en el campo de exposición de pruebas con 4000 luxes; asimismo
se ahorra en el consumo de energía al emplear solo un foco de luz fría. El objetivo de
presentar esta propuesta de diseño de cámara de iluminación fue el ofrecer a los
laboratorios participantes un prototipo calibrado, apto para el desarrollo de pruebas, el cual
brinda la estabilidad de iluminación necesaria para minimizar la variabilidad en los
crecimientos algales producto de una posible heterogeneidad del campo iluminado. Este
prototipo es de utilidad, sobre todo, para laboratorios que no cuentan con equipamiento
adecuado para medir la intensidad de luz, de forma que al construirlo se garantiza el logro
de los niveles en luxes, y la homogeneidad de iluminación conveniente para el desarrollo
experimental.
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Media
D.E.
C.V.
Media +2 D.E.
Media – 2 D.E.
0.0317
0.00754
23.78
0.0468
0.0166
Figura 3. Carta control integrada para S. capricornutum con los resultados de los
cinco laboratorios participantes en el ejercicio de intercalibración del año 2006.
Sin embargo, en casos donde la medición de la intensidad de luz puede efectuarse y en
consecuencia controlarse, puede ser empleado cualquier sistema de iluminación
alternativo como el de iluminación horizontal propuesto por la ENCB (IPN). Una
demostración técnica a este respecto fue efectuada por la ENCB (IPN), quién desarrolló
experimentos comparativos entre ambos diseños de cámaras de iluminación. Para ello se
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empleó el montaje de pruebas con Ankistrodesmus falcatus en ambos sistemas y se
demostró que la CE50, LOEC, NOEC y MATC obtenida para la evaluación del tóxico de
referencia, Cu+2, no presentaban diferencias significativas (Fig. 4). De modo que cualquiera
de los sistemas de iluminación propuestos puede ser elegido para el desarrollo de pruebas
con este organismo o con S. capricornutum.
Organismo: Ankistrodesmus falcatus 72h
inhibición
0.14
Promedio +2σ.= 0.1293
0.13
0.12
CL 50 (mg/L)
0.11
0.1
0.09
Promedio =
0.08
0.07
0.06
Promedio -2σ.=
0.05
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Número de experimento
Media
D.E.
C.V.
Media +2 D.E.
Media – 2 D.E.
0.0985
0.01544
15.68
0.1293
0.0676
Figura 4. Resultados de pruebas de toxicidad con A. falcatus en de dos sistemas de
iluminación (◊ horizontal;
pirámide)
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1.2.
Capacitación en los protocolos de prueba y logística del ejercicio de intercalibración
Durante el Taller de Transferencia de Tecnología (14 y 15 de junio) realizado en las
instalaciones del Centro de Capacitación del IMTA), se reunieron los representantes de
todos los laboratorios participantes en este proyecto (Figura 5) para efectuar mesas de
discusión y desarrollos prácticos para afinar detalles metodológicos, con el fin de lograr la
optimización del procedimiento de evaluación de toxicidad con el alga S. capricornutum y
de aprender los detalles del mantenimiento, cultivo y manejo de la especie Daphnia exilis
para su uso en pruebas de toxicidad.
Con estos objetivos, en este taller se atendieron algunas problemáticas detectadas en el
manejo de la prueba con S. capricornutum (Pseudokirchneriella subcapitata). Se hicieron
algunas prácticas de conteo de células, se calibraron las pipetas utilizadas en la prueba y
se dieron algunas otras recomendaciones para un mejor manejo de la técnica de análisis
(figuras 6 y 7). Asimismo, se hizo una amplia discusión de la nueva especie a probar:
Ankistrodesmus falcatus, de sus similitudes y diferencias y se acordó que habría que
trabajar la segunda con un medio de cultivo diferente, ya que el utilizado con S.
capricornutum no es suficientemente nutritivo para la segunda especie.
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Figura 5. Grupo de trabajo del Taller “Pruebas biológicas para la
evaluación de sustancias químicas”, Tercera Etapa.
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Figura 6. Lectura de prueba con S.
capricornutum por personal de la
CNA
Figura 7. Calibrando pipetas
Personal del IMP.
En cuanto a las pruebas con Cladóceros, el Dr. Fernando Martínez Jerónimo explicó todos
los detalles del cultivo y de la prueba con Daphnia exilis (Fig. 8). Los participantes tuvieron
también la oportunidad de intercambiar las pocas experiencias que hasta ese día habían
tenido en el manejo de esta cepa, ya que ésta se les hizo llegar a sus laboratorios con
anterioridad. Despejaron sus dudas con respecto al instructivo previamente entregado y se
comentaron los detalles en el manejo de estos organismos que no se describen en el
protocolo, pero que son de importancia para lograr un manejo óptimo.
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Figura 8. Explicación del protocolo para la determinación de
toxicidad con Daphnia exilis
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En forma simultánea, personal del CENICA fue entrenado en el manejo del procedimiento
de extracción para la generación de extractos y elutriados para el análisis de toxicidad de
suelos (Figuras 9 y 10)
Figura 9 Uso del rotovaporador
para concentración del extracto
orgánico
Figura 10. Trasvasado de extractos
orgánicos de suelos
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2. Resultados de la intercalibración.
2.1 Elaboración de cartas control
Las cartas control de las pruebas con D. magna, D. exilis y S. capricornutum fueron las
primeras informaciones generadas por los laboratorios. Para los casos de D. magna y S.
capricornutum los participantes ya contaban con un número superior a 10 datos, los cuales
fueron generados a lo largo de la segunda fase de este proyecto, durante el año 2006.
Respecto a las cartas control de D. exilis, estas contienen menos dato ya que esta prueba
se incorporó a partir del desarrollo de esta tercera fase.
Las cartas control de cada institución puede consultarse en el Anexo IV y los resultados
generales de las mismas se presentan en la Figura 11. En ella se observa que los
resultados obtenidos para los tóxicos de referencia Cr+6, empleado para los cladóceros, y
Cu+2 de utilidad para las microalgas, presentan valores de CE50 cuya variación entre
laboratorios es, por lo general, menor al 20%, definido por los valores de coeficiente de
variación (CV), con valores de entre 1.18 y 1.75 para D. magna, de 0.076 a 1.48 para D.
exilis y de 0.025 a 0.048 para S. capricornutum. Esto indica que la reproducibilidad de los
análisis obtenida por los laboratorios participantes es aceptable.
Carta control de D. magna
Al integrar los resultados individuales, obtenidos durante el 2007 por los seis laboratorios,
en una sola carta control para cada organismo de prueba (fig. 12-14), se puede observar
que la CE50 para D. magna presentó un valor de 0.149 mg/L, con un coeficiente de
variación del 14.97%. Estos valores son ligeramente menores a los obtenidos durante el
año 2006 en que la CE50 fue de 0.189 mg/L y el coeficiente de variación de 19.61.
D. magna comparativo CC
0,200
0,180
POLI
0,160
IMP
0,140
0,120
CNA
UAM-I
IMTA
CENIICA
0,100
Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
0
1
2
3
4
5
6
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7
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(CENICA)
Carta control D. magna
CENIICA
IMP
CNA
UAM-I
ENCB (POLI)
IMTA
CE50 Cr+6
0,118
0,150
0,156
0,148
0,175
0,156
C.V
23,00
5,91
4,73
7,96
13,18
6,19
Carta control D. exilis
+6
CENIICA
IMP
CNA
UAM-I
ENCB (POLI)
IMTA
CE50 Cr
0,085
0,148
0,138
0,076
0,121
0,107
D. exilis comparativo CC
C.V
22,00
5,50
10,27
8,18
20,00
10,00
0,160
IMP
0,140
0,120
POLI
0,100
0,080
CENIICA
CENIICA
IMP
CNA
UAM-I
ENCB (POLI)
IMTA
CE50 Cu
0,031
0,038
0,025
0,037
0,048
0,035
IMTA
UAM-I
0,060
0,040
0
1
2
Carta control S. capricornutum
+2
CNA
3
4
5
6
7
Selenastrum, comparativo CC
C.V
14,74
16,87
31,77
10,43
12,00
11,31
Organismo: .D .
0,040
IMP
UAM-I
0,035
IMTA
CENIICA
0,030
0,025
CNA
0,020
0
1
2
3
4
5
6
m agna 48h Toxic idad A guda. Interlaboratorio
Tóxic o de refer enc ia: C r( IV )
CL 50 (mg/L)
Figura 11. Resumen de los valores de CE50 de las Cartas Control de los tres organismos
P ro m e d io + 2 .= 0 .1 9 4 2
0 ,1 8
de prueba intercalibrados.
2007
Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P.
de la Ciencia y
P ro09340
m e d ioUAM-I
= 0 .1 4Edificio
94
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0 ,1 3
Correo electrónico cenica@ine.gob.mx
P ro m e d io -2 .= 0 .1 4 7 7
0 ,0 8
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
N úm e ro d e e ns ayo
11
12
13
14
15
16
7
DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE
INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL
(CENICA)
2006
14.97
Media + 2
DE
0.1942
Media – 2
DE
0.1477
19.61
0.26
0.12
Media
D.E.
C.V.
2007
0.1494
0.0224
2006
0.189
0.037
Figura 12. Comparativo de las cartas control integradas para D. magna con los resultados
de los laboratorios participantes en los ejercicios de intercalibración de 2006 y 2007. Los
valores de CL50 fueron calculados a partir de los datos de mortalidad a las 48 h, usando
Cr+6 en agua dura como tóxico de referencia
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(CENICA)
2007
Organismo: P. s ubc apitata 72h Toxic idad Aguda. Interlaboratorio
Tóxic o de referenc ia: Cu(II)
0,0600
CL 50 (mg/L)
P ro m ed io +2⎯ .= 0.056
P ro m ed io = 0.0367
P ro m ed io -2⎝ .= 0.0172
0,0100
0
5
10
15
Núm e ro d e e ns ayo
O rg a n i s m o : S . c a p ri c o rn u tu m 7 2 h i n h i b i c i ó n d e c re c i m i e n to
T ó xi c o d e re fe re n c i a : C u + 2 e n m e d i o m i n e ra l
2006
0,05
P r o m e d io + 2 s .= 0 .0 4 7 2
0,045
0,04
CL 50 (mg/L)
0,035
0,03
P r o m e d io = 0 .0 3 1 5
0,025
0,02
0,015
P r o m e d io -2 s .= 0 .0 1 5 8
0,01
0,005
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
32
34
N ú m e ro d e e xp e ri m e n to
26.55
Media + 2
DE
0.056
Media – 2
DE
0.0172
24.92
0.0472
0.0158
Media
D.E.
C.V.
2007
0.0367
0.0097
2006
0.0317
0.0078
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Figura 13. Comparativo de las cartas control integradas para S. capricornutum con los
resultados de los laboratorios participantes en los ejercicios de intercalibración de 2006 y
2007. Los valores de CL50 fueron calculados a partir de los datos de mortalidad a las 72h,
usando Cu+2 en agua dura como tóxico de referencia
Carta control de S. capricornutum
Con relación a la microalga S. capricornutum (P. subcapitata), y la integración de los
resultados de los seis laboratorios en una sola carta control (fig. 13) se observa que la CE50
para el Cu +2 es del orden de 0.0367 mg/L con un coeficiente de variación interlaboratorios
de 26.55%. Este valor es superior a los mostrados de manera individual por los
laboratorios, los cuales no exceden del 16% (fig. 11). Los valores que describen a la carta
control para S. capricorrnutum, son muy similares a los obtenidos durante el año de 2006,
en el que la CE50 fue de 0.0317 mg/L y el coeficiente de variación de 24.92%
Carta control D. exilis
Con relación a la carta control general (fig. 14), que se deriva de la integración de los
resultados de todos los laboratorios participantes, se observa que la CE50 para el Cr+6 es
de 0.1043 mg/L con un C.V. de 28.20 %. Al igual que en el caso de S. capricornutum, el
coeficiente de variación se incrementa ligeramente respecto a los valores individuales de
cada laboratorio (fig. 11), los cuales no exceden del 22%; este tipo de incrementos en la
variabilidad interlaboratorios es un resultado común en este tipo de ejercicios, y se
encuentra dentro del rango de lo aceptable.
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Organismo: .D. exilis 48h Toxicidad Aguda. Interlaboratorio
Tóxico de referencia: Cr(IV)
Promedio +2 .= 0.1631
CL 50 (mg/L)
0,17
0,12
Promedio = 0.1043
0,07
Promedio -2¬.= 0.0455
0,02
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Número de ensayo
11
12
13
14
15
Media
D.E.
C.V.
Media + 2 D.E.
Media – 2 D.E.
0.1043
0.02941
28.20
0.1631
0.00455
16
Figura 14. Carta control integrada para D. exilis con los resultados de los laboratorios
participantes en el ejercicio de intercalibración del año 2007. Los valores de CL50 fueron
calculados a partir de los datos de mortalidad a las 48 h, usando Cr+6 en agua dura como
tóxico de referencia
Los resultados logrados durante esta tercera fase, no solo muestran una reducción de la
variabilidad interlaboratorio para las pruebas de D. magna y S. capricornutum, también
indican una mejor distribución de los valores, la cual es aleatoria y no agregada, como lo
que se evidenció durante el 2006, año en el que los datos de cada laboratorio constituían
pequeños cúmulos aislados unos de otros. Esta mejora en la distribución de los valores de
la CE50 en conjunto con el coeficiente de variación, nos sugiere que los participantes han
mejorado, en general, en el desempeño de la metodología de análisis para pruebas de
toxicidad intercalibradas.
Los Coeficientes de Variabilidad logrados por el grupo de trabajo, son bastante aceptables
y tienden a ser similares a los valores obtenidos como antecedentes en el año 2006 por el
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propio grupo de trabajo, así como a aquellos reportados por laboratorios miembros de la
red Watertox, como Ronco et ál. (2000), Castillo y Schafer (2000) y Pica-Granados et ál.
(2000), quienes obtuvieron valores de CE50 para Cr+6 de 0.155 a 0.17 mg/L y C.V. de 10 a
17% para D. magna y CE50 para Cu+2 de 0.029 a 0.35 mg/L y C.V. de 13 a 23% para S.
capricornutum
2.2 Análisis de muestras ciegas
Los resultados del tercer grupo de muestras ciegas se emplearon para evaluar la evolución
de la precisión intralaboratorio de las pruebas efectuadas, a través del análisis de la
consistencia de los resultados de las muestras ciegas, conteniendo a los tóxicos de
referencia, respecto a las cartas control elaboradas; y de la comparación de los resultados
obtenidos para el Hg (muestra 11), que es la sustancia de seguimiento, respecto a los
registros logrados durante el año 2006. Asimismo se analizó la consistencia interlaboratorio
mediante el análisis de los CV obtenidos para cada muestra y para cada organismo de
prueba.
2.2.1 Precisión intralaboratorio
Cartas control vs. Muestra ciega (tóxico de referencia)
Para el desarrollo de las cartas control se emplean como tóxicos de referencia: Cr+6 para
los cladóceros y Cu+2 para las microalgas; compuestos con los que cada laboratorio
efectuó pruebas de forma continua, a fin de lograr un número de datos suficiente para
determinar la variabilidad de la respuesta de los organismos manejados y controlados bajo
las condiciones de cada institución, pero en apego a los procedimientos de prueba en los
que han sido instruidos.
Los resultados individuales de las cartas control han sido discutidos y presentados en la
figura 11, con resultados muy consistentes; sin embargo es importante verificar que esta
consistencia se mantiene, a través de la evaluación de muestras ciegas.
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El empleo de un tóxico de referencia como contenido de una muestra adicionada o ciega
es de enorme utilidad para lograr incluir en la evaluación del desempeño de los protocolos
a fase que compete al manejo de muestra, situación que queda excluida del campo
experimental cuando se emplea una solución patrón que contiene al tóxico de referencia y
que es el que se utiliza para la construcción de la carta control. Es en este sentido, se
decidió incluir en el grupo de muestras ciegas, a los metales mencionados que constituyen
las muestras 10 y 13.
Los resultados comparativos entre el valor de la CE50 promedio de las cartas control y el
obtenido para las muestras adicionadas se presentan en las figuras 15 y16; en esta última
se observa que la prueba con Daphnia magna fue la que mayor consistencia presentó ya
que las diferencias porcentuales entre el valor de la CE50 para la muestra ciega y la
obtenida para la carta control fue menor al 25%, variación que fue similar para los distintos
laboratorios.
Con relación a las pruebas con D. exilis y S. capricornutum, las diferencias porcentuales
son muy variables entre los laboratorios, el IMP y la UAM-I presentan los mayores valores
de variación de entre 60 y 80%, respecto a la CE50 de las cartas control, mientras que
CENICA, CNA, IMTA y la ENCB (POLI) presentan diferencias menores al 37%. Una
excepción es la de la ENCB (POLI) para la prueba con S. capricornutum para la que
presenta una diferencia elevada de 68%.
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CE50 Cr
+6
mg/L
D. exilis. Com parativo Carta Control vs M uestra ciega
con Cr +6
0.2
0.15
0.1
0.05
0
CENIIC
IMP
CNA
UAM-I
POLI
IMTA
Carta control
0.085
0.148
0.138
0.076
0.121
0.107
CE50 CrVI
0.06
0.026
0.086
0.133
0.093
0.145
CE50 Cr
+6
mg/L
D. magna. Com parativo Carta Control vs M uestra ciega
con Cr +6
0.2
0.15
0.1
0.05
0
CENIICA
IMP
CNA
UAM-I
POLI
IMTA
Carta control
0.118
0.15
0.156
0.148
0.175
0.156
CE50 CrVI
0.088
0.112
0.128
0.13
0.156
0.168
S. capricortunum. Com parativo Carta Control vs Muestra
CE50 Cu
+2
mg/L
ciega con Cu
+2
0.06
0.04
0.02
0
CENIICA
IMP
CNA
UAM-I
POLI
IMTA
Carta control
0.031
0.038
0.025
0.037
0.048
0.035
CE50 Cu II
0.02
0.01
0.025
0.014
0.015
0.037
Figura 15. Comparativo de los valores de la CE50 promedio de cartas control con la
muestras ciegas adicionadas con tóxicos de referencia.
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D. exilis. Diferencia porcentual del resultado de Muestra ciega
con Cr+6 respecto a la CE 50 de la Carta Control
100.000
%
50.000
0.000
-50.000
-100.000
Diferencia porcentual
CENIIC
IMP
CNA
UAM-I
POLI
IMTA
29.412
82.432
37.681
-75.000
23.140
-35.514
D. magna. Diferencia porcentual del resultado de Muestra
ciega con Cr
+6
respecto a la CE 50 de la Carta Control
100.000
%
50.000
0.000
-50.000
-100.000
Diferencia porcentual
CENIICA
IMP
CNA
UAM-I
POLI
IMTA
25.424
25.333
17.949
12.162
10.857
-7.692
S. capricornutum. Diferencia porcentual del resultado de
Muestra ciega con Cu+2 respecto a la CE 50 de la Carta Control
100.000
%
50.000
0.000
-50.000
-100.000
Diferencia porcentual
CENIICA
IMP
CNA
UAM-I
POLI
IMTA
35.484
73.684
0.000
62.162
68.750
-5.714
Figura 16Diferencias porcentuales de muestras ciegas respecto a las CE50 de las cartas
control.
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Comparativo de muestra de seguimiento
Las muestras de mercurio (Hg+2) preparadas como solución de seguimiento nos brindó otro
elemento analítico para evaluar la replicabilidad inter e intralaboratorios.
Los resultados para D. magna y S. capricornutum se presentan en las tablas 3 y 4 en las
que se pueden observar valores de C.V intralaboratorio < 40%, los cuales en general son
menores a aquellos observados en la comparación interlaboratorios, que en promedio es
del 50% para ambas especies.
Algunos datos que, sin duda, se identificaron como anómalos, fueron sustraídos del
análisis estadístico, al igual que los correspondientes al primer ejercicio de intercalibración,
a fin de evitar una sobreestimación de la variabilidad inter e intralaboratorio.
Tabla 3. Análisis de la variabilidad de la muestra ciega en los ejercicios de intercalibración
2006-2007, empleada para seguimiento. Resultados de la CE50 de Hg+2 para Daphnia
magna
2006
CENIICA
IMP
CNA
UAM-I
ENCB (POLI)
IMTA
Hg 1
0.015a
0.039 a
0.009 a
0.1 ab
Hg 2
0.019
0.033
0.013
0.047b
2007
Hg 3
0.017
0.045
0.04
0.026
Hg 4
0.006 b
0.031
0.02
0.079b
0.025
0.022
Intralaboratorio
Media
0.018
0.0363
0.0243
0.0365
0.025
0.022
Dst
C.V.
0.0014
0.0076
0.0140
0.0148
7.86
20.84
57.58
40.68
Interlaboratorios
Media
Dst
C.V.
0.04075
0.0217
0.032
0.0255
0.0416
0.0152
0.0128
0.0078
b
102.02
70.10
40.10
30.50
Dato no considerado para la estadística intralaboratorio
b
Dato no considerado para la estadística interlaboratorio
a
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Tabla 4. Análisis de la variabilidad de la muestra ciega en los ejercicios de intercalibración
2006-2007, empleada para seguimiento. Resultados de la CE50 de Hg+2 para Selenastrum
capricornutum
2006
CENIICA
IMP
CNA
UAM-I
ENCB (POLI)
IMTA
Hg 1
0.06 a
0.059 a
0.022
0.092 a
Hg 2
0.011
0.042
0.055 ab
0.039
2007
Hg 3
0.016
0.048
0.012
0.02
Hg 4
0.002 ab
0.042
0.03
0.023
0.169 b
0.043
Intralaboratorio
Media
0.0135
0.044
0.0213
0.0273
0.169
0.043
Dst
C.V.
0.0035
0.0035
0.0090
0.0102
26.19
7.87
42.27
37.37
Interlaboratorios
Media
Dst
C.V.
0.0583
0.0307
0.0240
0.0317
0.0286
0.0171
0.0163
0.0097
49.1274
55.7536
68.0414
30.5626
Dato no considerado para la estadística intralaboratorio
b
Dato no considerado para la estadística interlaboratorio
a
Este ámbito de variación interlaboratorio es propio de esta clase de ejercicios de
intercalibración (Lewis et al., 1994; De Graeve et al., 1990) respecto a lo cual sirven como
ejemplo algunos valores presentados por Forget et al (2000), quién para los resultados de
intercalibración de la red WaterTox, señala para el mercurio II, coeficientes de variación
interlaboratorio del 64 %; sin embargo la variabilidad intralaboratorio observada para
ambas especies es elevada, ya que para algunos laboratorios es mayor al 40%, por lo que
se hace necesario fomentar un mejor desempeño de estos grupos, a fin de que logren una
replicabilidad aceptable con niveles de CV por debajo del 25%.
El comportamiento de los C.V interlaboratorio señalan una tendencia en el tiempo a su
reducción. En la medida en que se resuelvan los detalles técnicos, para ambos métodos de
prueba, que persisten e inciden en la variabilidad intralaboratorio, se mejorará la
confiabilidad analítica de algunos de los laboratorios participantes.
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2.2.2 Consistencia interlaboratorio,
Para el análisis de la variabilidad interlaboratorio de los resultados analíticos de las
pruebas con D. magna, D. exilis y S. capricornutum, se emplearon los datos globales de
la CE50 de las cuatro muestras ciegas, que constituyeron el tercer ejercicio de
intercalibración y que se presentan en las figuras 17, 18 y 19, respectivamente.
Daphnia magna
Para la prueba con D. magna, los laboratorios en su conjunto manifiestan, para todas las
muestras, C.V muy similares, los cuales en promedio refieren un valor de 23.04% lo cual
indica un buen desempeño analítico de éste protocolo de prueba, con una variabilidad bien
controlada y homogénea para la población de datos analizados, sustentando la
confiabilidad analítica de los mismos.
Daphnia exilis
Los resultados interlaboratorio para la especie D. exilis, de distribución en México, presenta
un valor de C.V. igualmente aceptable, con un promedio de 38.4%, que describe la
variación analítica de la mayoría de las determinaciones efectuadas por los laboratorios
participantes, con la excepción del mercurio, en el que el C.V. es mayor, con 47.03%.
Estos resultados muestran el potencial analítico de la especie D. exilis y la posibilidad
técnica de hacer extensivo el empleo del protocolo de prueba ensayado para ambas
especies (D. magna y D. exilis).
Los resultados analíticos refieren un manejo adecuado del protocolo y de su aplicación con
D. exilis, ya que se observa una variabilidad interlaboratorio aceptable que tenderá a
reducirse en la medida en que el manejo del método se intensifique, tarea que es
especialmente importante para los laboratorios del IMP y de la UAM en donde se requiere
fortalecer su reproducibilidad analítica a través de mejorar el desempeño del protocolo de
prueba y de cultivo para D. exilis (fig. 16).
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(CENICA)
Daphnia magna Cr
0,2
IMTA
POLI
0,15
0,1
IMP
CENIICA
UAM-I
CNA
0,05
0
0
1
2
3
4
5
6
7
Daphnia magna As
10
8
6
4
2
0
Daphnia magna Cu
UAM-I
0.050
0.040
0.030
IMTA
CNA
POLI
IMP
1
2
CENIICA
0.020
0.010
0.000
CENIICA
0
IMTA
3
4
5
6
7
POLI
UAM-I
IMP
CNA
0
1
2
3
4
5
Daphnia magna
Institución
CENIICA
IMP
CNA
UAM-I
POLI
IMTA
a
Cr
0.088
0.112
0.128
0.130
0.156
0.168
Hg
0.006
0.031
0.020
0.079 a
0.025
0.022
As
ND
4.548
7.378
9.230
7.044
9.271
Cu
0.026
0.011
ND
0.018
0.021
0.046
Dato no considerado para la estadística intralaboratorio
Media
Dst
C.V.
0.130
0.029
22.343
0.021
0.005
22.036
7.494
1.941
25.898
0.024
0.006
25.108
Figura. 17. Resultados del tercer ejercicio de intercalibración. CE50 en mg/L para Daphnia
magna.
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6
7
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(CENICA)
D. exilis Cr
D. exilis Hg
0,2000
0,1500
IMTA
UAM-I
0,1000
0,0350
0,0300
0,0250
0,0200
0,0150
0,0100
0,0050
0,0000
POLI
CNA
CENIICA
0,0500
IMP
0,0000
0
1
2
3
4
5
6
7
UAM-I
IMP
IMTA
CNA
POLI
CENIICA
0
1
2
3
4
5
6
7
D. exilis Cu
D. exilis As
5,0000
0.0300
CNA
4,0000
0.0250
POLI
UAM-I
UAM-I
CENIICA IMP
2,0000
0.0150
0.0100
IMTA
1,0000
CENIICA
0.0050
0,0000
0
1
2
3
4
5
6
7
POLI
CNA
0.0200
3,0000
IMTA
IMP
0.0000
0
1
2
3
4
5
6
Daphnia exilis
Institución
CENIICA
IMP
CNA
UAM-I
POLI
IMTA
Cr
0.060
0.026 a
0.086
0.133
0.093
0.145
a
Media
Dst
C.V.
Hg
0.003 a
0.024
0.021
0.033
0.012
0.021
As
2.291
2.331
4.002
3.731
3.810
1.721
Cu
0.006 a
0.009
0.021
0.025
0.022
0.012
Dato no considerado para la estadística intralaboratorio
0.103
0.035
33.89
0.022
0.010
47.03
2.981
0.978
32.80
0.018
0.007
39.92
Figura. 18. Resultados del tercer ejercicio de intercalibración. CE50 en mg/L para Daphnia
exilis.
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7
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(CENICA)
Selenastrum capricornutum
Respecto a los resultados obtenidos para la microalga S. capricornutum, la variabilidad
interlaboratorio promedio fue del 47.66 % para la mayoría de las determinaciones
efectuadas en este ejercicio. Para el caso del Cr.VI., si bien el C.V no aumenta
exageradamente, es importante hacer notar que los resultados para este compuesto
presentaron un comportamiento muy errático, registrándose CE50 desde concentraciones
tan pequeñas como 0.033 mg/L hasta incluso verificarse registro de toxicidad No
Detectable (ND), sin tendencia definida, por lo que el Cr VI puede ser un compuesto
inadecuado para el desarrollo de intercalibraciones con especies algales, ya que es posible
que su biodisponibilidad se vea alterada como resultado del uso de medio mineral en el
protocolo de prueba.
A pesar de la aparente consistencia de la variabilidad para la mayoría de las muestras en
un valor de alrededor del 50%, se considera conveniente continuar en la búsqueda de los
aspectos metodológicos que puedan reducirla a niveles del orden de un 30%, tomando
como base el C.V observado en las cartas
control de S. capricornutum (fig. 13), en el
Selenastrum As
análisis de la consistencia intralaboratorio
3
(tabla 4).y en los resultados para mercurio
POLI
2,5
indicados en la figura 19, o en su defecto
2
1,5
continuar con el desarrollo de experimentos
1
que permitan establecer ese valor como el
UAM-I
0,5
ámbito de variación aceptable para este
CNA
IMTA
CENIICA
0
protocolo de prueba.
0
1
2
3
4
5
6
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(CENICA)
Selenastrum Cr
0,14
0,12
0,1
0,08
0,06
0,04
0,02
0
UAM-I
CNA
SelenastrumCu
IMTA
0.040
CENIICA
0
1
2
3
4
5
6
7
IMTA
0.030
CNA
0.020
Selenastrum As
3
2,5
CENIICA
0.000
POLI
2
1,5
1
POLI
UAM-I
IMP
0.010
0
1
2
3
4
5
UAM-I
0,5
0
CNA
CENIICA
0
1
2
3
IMTA
4
5
6
7
Selenastrum capricornutum
Institución
CENIICA
IMP
CNA
UAM-I
POLI
IMTA
Cr
0.003 a
ND a
0.062
0.131
ND a
0.047
a
Media
Dst
C.V.
Hg
0.0002 a
0.042
0.030
0.023
0.169*
0.043
As
0.026
ND a
0.086
0.789 a
2.592 a
0.087
Cu
0.002 a
0.010
0.025
0.014
0.015
0.037
Dato no considerado para la estadística intralaboratorio
0.0800
0.035
0.066
0.020
0.0448
55.9994
0.010
28.053
0.035
52.663
0.011
53.935
Figura. 19. Resultados del tercer ejercicio de intercalibración. CE50 en mg/L para
S. capricornutum.
2.3 Intercalibración con especies nativas
Cladóceros
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6
7
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(CENICA)
Los resultados logrados hasta el momento para las especies de cladóceros D. magna y D.
exilis, refieren un buen manejo del procedimiento y confiabilidad analítica, por lo anterior,
los valores de toxicidad obtenidos para los compuestos involucrados en esta
intercalibración, pueden ser de utilidad para la definición de los ámbitos de sensibilidad de
estas especies, lo cual es de especial importancia para poder determinar si además de la
consistencia analítica del protocolo, la especie es lo suficientemente sensible para su
empleo en el monitoreo ambiental y en la evaluación de contaminantes químicos de interés
para nuestro país.
Con este fin se efectuó el análisis comparativo de la sensibilidad entre ambas especies de
daphnias empleando los valores promedio de los resultados interlaboratorio obtenidos para
cada compuesto, cuyos resultados pueden ser observados en la figura 20.
El análisis comparativo de la sensibilidad indica diferencias insignificantes entre ambas
especies, sobre todo para el cromo, mercurio y cobre; sin embargo, con relación a la CE50
del arsénico, D. exilis resulta significativamente más sensible a sus efectos.
Los valores de toxicidad (CE50 mg/L) obtenidos para ambas especies definen el siguiente
gradiente de sensibilidad.
D. magna
D. exilis
Hg > Cu > Cr >>>>As
Cu > Hg >Cr >>As
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Análisis comparativo de la sensibilidad entre
de cladóceros.
10.000
1.000
0.100
0.010
Cr+6
Hg+2
As+5
Cu+2
Daphnia magna
0.130
0.021
7.494
0.024
Daphnia exilis
0.103
0.022
2.981
0.018
Figura 20. Análisis comparativo de la sensibilidad de D. magna y D. exilis para cuatro
metales pesados.
La sensibilidad equivalente o incluso mayor de D. exilis y D. magna, aunada a la
consistencia analítica que ha sido evaluada en este estudio, sugiere que D. exilis puede
ser una especie adecuada para pruebas de toxicidad con fines de análisis ambiental o para
el control de contaminantes químicos solubles de interés para México, sin embargo aún es
necesario ampliar la variedad de compuestos tóxicos probados, para así determinar si su
potencial de detección o sensibilidad comprende incluso a compuestos orgánicos solubles.
Microalgas
El análisis de muestras ciegas con A. falcatus fue realizado por el IMTA, con algas
proliferadas en medio AAP, como ya se explicó en la sección de selección de especies,
para evitar la interferencia de los componentes del medio Bold Basal. Estos resultados
fueron comparados con los obtenidos con S. capricornutum.
Los resultados obtenidos para ambas especies de microalgas, refieren un buen manejo del
procedimiento por parte de dicha institución y una amplia confiabilidad analítica, por lo
anterior, los valores de toxicidad obtenidos para los metales involucrados en esta
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intercalibración fueron de utilidad para la definición de los ámbitos de sensibilidad y la
comparación de estas especies. Estos resultados se presentan en la figura 21.
El análisis comparativo de la sensibilidad entre ambas especies indica diferencias
significativas para el cromo, el mercurio y el cobre, señalando que S. capricornutum es
más sensible a estos metales. En el caso del arsénico ambas especies tienen una
sensibilidad equivalente que no refiere diferencias significativas.
Los valores de toxicidad (CE50 mg/L) obtenidos para ambas especies definen el mismo
gradiente de sensibilidad en el que el Cu es el metal que refiere mayor toxicidad,
especialmente para A. falcatus cuya CE50 es de solo 0.001mg/L,
S. capricornutum
A. falcatus
Cu > Hg > Cr>As
Cu >>> Hg > Cr >As
Los resultados anteriores permiten recomendar el uso de A. falcatus en pruebas de
toxicidad con fines de análisis ambiental o para el control de contaminantes químicos
solubles. Sin embargo, es necesario robustecer el manejo metodológico de forma que un
mayor número de laboratorios logren un buen desempeño del protocolo de prueba para
poder proceder a la intercalibración del protocolo de prueba con A. falcatus.
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Análisis comparativo de la sensibilidad entre
de microalgas.
0.100
0.080
0.060
0.040
0.020
0.000
Cr+6
Hg+2
As+5
Cu+2
S. capriconutum
0.061
0.034
0.066
0.020
A. falcatus
0.082
0.057
0.059
0.001
Figura 21. Análisis comparativo de la sensibilidad de S. capricornutum y A. falcatus para
cuatro metales.
Muestras para calibración de protocolo para la generación de extractos y elutriados.
Los resultados obtenidos en el análisis de las muestras ciegas sólidas por el CENICA
demostró la capacidad de este laboratorio en la generación de extractos y elutriados, ya
que en las pruebas de toxicidad con D. magna, D. exilis y S. capricornutum, la muestra
resultó no tóxica (ver anexo IV); sin embargo será necesario probar la capacidad de este
laboratorio para el manejo de muestras tóxicas, a través de un ejercicio en el que se
involucren muestras ciegas con toxicidad conocida.
7. PROPUESTA DE ESTUDIOS Y/O INVESTIGACIONES DE SEGUIMIENTO
a. Para el caso de las pruebas con microalgas será necesaria una práctica más
intensiva que permita disminuir la variabilidad intralaboratorio que hasta ahora se
ha observado.
b. La capacidad analítica de los laboratorios participantes y otros más que deseen
adherirse a este grupo, debe ser probada al menos una vez al año con ejercicios
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de intercalibración, que pueden incluir las sustancias ya utilizadas y otras de
interés nacional.
c. La incorporación de pruebas con otras especies, tanto subrogadas, como
presentes en los ecosistemas de México, es necesaria para contar con una
batería de pruebas que incluya organismos de al menos tres niveles tróficos, que
permitan la identificación de la toxicidad de diversas muestras ambientales y de
una amplia variedad de sustancias químicas.
d. El desarrollo de baterías de pruebas para suelos y aguas marinas es necesario
para poder responder a los problemas de contaminación que se presentan en
estos ecosistemas.
8. RECOMENDACIONES
a. Llevar a cabo al menos un ejercicio de intercalibración al año con los laboratorios
participantes y otros que deseen incorporarse, con las especies utilizadas en
este proyecto.
b. Comprobar la capacidad del CENICA en el manejo y determinación de la
toxicidad de muestras sólidas a través de un ejercicio que involucre muestras
ciegas con toxicidad conocida.
c. México debe contar con al menos un cepario en el que se mantengan, con
estricto control, las cepas necesarias para las pruebas de toxicidad.
d. Ampliar el número de laboratorios con capacidad para el desarrollo de pruebas
de toxicidad con daphnidos y microalgas de agua dulce y otras.
9. CONCLUSIONES
La consistencia de los datos obtenidos por las diferentes instituciones participantes en el
ejercicio de intercalibración para la construcción de cartas control indican que los
laboratorios se encuentran en un proceso de avance para lograr la óptima capacidad
analítica. Asimismo, demuestran la nobleza de los procedimientos analíticos transferidos,
ya que estos laboratorios son capaces de generar resultados reproducibles, especialmente
para el protocolo de D. magna, D. exilis y en menor medida para S. capricornutum,
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procedimiento que aún requiere de ajustes metodológicos y de continuidad en su uso para
el mejoramiento de capacidades analíticas en los laboratorios participantes
Vinculando la información obtenida de la CE50 promedio de los tóxicos de referencia de las
cartas control, con los resultados de las muestras ciegas conteniendo a estos mismos
tóxicos, se observa que la variación interlaboratorio es del orden del 40% lo cual es
aceptable en esta clase de ejercicios de intercalibración en los que un valor del 60% puede
aún ser permitido, (Lewis et al., 1994; De Graeve et al., 1990), sin embargo en lo que
respecta a la variabilidad intralaboratorio lo deseable es manejarse en una variabilidad
<25%, sin embargo en este ejercicio resultó ser mayor al 40% para algunos laboratorios,
los cuales deben fomentar un mejor desempeño del protocolo a fin de lograr una
replicabilidad y confiabilidad analítica aceptables.
Los resultados de la calibración del procedimiento de prueba de D. magna, empleando
como organismo de prueba a D. exilis, y el de Selenastrum empleando A. falcatus,
indicaron que ambos protocolos son aptos para su uso con las especies alternativas
mencionadas, efectuando los ajustes necesarios al protocolo,
indicados en este
documento.
La comparación de las respuestas (CE50) de los organismos de prueba a los distintos
metales indica la siguiente escala de sensibilidad:
Para cladóceros:
D. magna
Hg > Cu > Cr >>>>As
D. exilis
Cu > Hg >Cr >>As
Para microalgas:
S. capricornutum
A. falcatus
Cu > Hg > Cr>As
Cu >>> Hg > Cr >As
Estos resultados indican que la sensibilidad a los metales analizados con las especies de
distribución en México, Daphnia exilis y Ankistrodesmus falcatus es equivalente a la
observada para Daphnia magna y Selenastrum capricornutum, respectivamente, e incluso
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en algunas ocasiones como el caso del Arsénico y Cu, estas pueden ser mucho más
sensibles que las especies subrogadas.
Por ello éstas especies pueden considerarse como candidatos adecuados para su empleo
en el monitoreo ambiental o de sustancias químicas solubles cuyo control sea de interés
para México, sin embargo es necesario ampliar el análisis de su ámbito de sensibilidad al
análisis de orgánicos solubles o solubilizadles, a fin de perfilar su ámbito de detección de
tóxicos.
El manejo de muestras sólidas demostrado por el CENICA fue adecuado, ya que la
muestra ciega no debía mostrar toxicidad al ser analizada, y este laboratorio obtuvo el
resultado esperado de toxicidad no detectada con las tres especies utilizadas. Sin embargo
será necesario continuar haciendo pruebas, especialmente con muestras tóxicas.
Los resultados de este proyecto en sus tres fases (2005, 2006 y 2007) demuestran que es
factible desarrollar las capacidades necesarias para contar con laboratorios competentes
en la evaluación toxicológica de muestra ambientales y sustancias específicas en México,
si se cuenta con cepas de organismos y se trabaja en el control de calidad de las pruebas.
10. REFERENCIAS
Castillo G. C., Schafer L. 2000. Evaluation of a bioassay battery for water toxicity testing: A
Chilean experience. Environ. Toxicol. 15(4): 331-337.
Díaz,-Báez, C., Ronco A. yPica-Granados Y. 2004. Ensayo de toxicidad aguda con Daphnia
magna. En: Ensayos Toxicológicos y Métodos de Evaluación de Calidad de Aguas:
estandarización, intercalibración, resultados y aplicaciones. Castillo G. (eds.). IDRCIMTA pag. 52-64.
Díaz,-Báez, Pica-Granados Y , Sobrero M.C. 2004. Aseguramiento y Control de Calidad de
Ensayos de Toxicidad. En: Ensayos Toxicológicos y Métodos de Evaluación de
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(CENICA)
Calidad de Aguas: estandarización, intercalibración, resultados y aplicaciones.
Castillo G. (eds.) IDRC-IMTA pag. 125-140.
Pica-Granados, Y.; Trujillo, D.G.; Hernandez, S. H. Bioassay standardization for water
quality monitoring in Mexico. Environ. Toxicol. 2000, 15(4), 322-330.
Pica-Granados Y., Ronco A. y Díaz,-Báez, C., 2004. Ensayo de toxicidad crónica con
Selenastrum capricornutum (Pseudokirchneriella subcapitata). Método de enumeración
celular basado en el uso de hemocitómetro Neubauer. En: Ensayos Toxicológicos y
Métodos de Evaluación de Calidad de Aguas: estandarización, intercalibración,
resultados y aplicaciones. Castillo G. (eds). IDRC-IMTA pag. 80-98.
Pica-Granados Y. y Trujillo-Domínguez G. 2008. Procedimiento para la Generación de
Extractos Orgánicos y Elutriados de Suelos y Sedimentos para su Análisis en Ensayos de
Toxicidad. En: Ensayos toxicológicos para la evaluación de sustancias químicas en agua
y suelo. La experiencia en México, Ramírez Romero P. y A. Mendoza Cantú.
(eds.).INE/SEMARNAT. 416 pp.
Ramírez Romero P , Pica-Granados Y. y Martínez -Jerónimo F. 2006 . Informe final del
Proyecto. Pruebas biológicas para la evaluación ecotoxicológica de sustancias químicas.
Segunda etapa. INE-UAM-I-IMTA, 135 pp,
Ronco A, Gagnon P, Díaz-Báez M C, Arkhipchuk V, Castillo G, Castillo L E, Dutka B J,
Pica-Granados Y, Ridal J, Srivastava R C, Sánchez A. (2002) Overview of results from the
WaterTox intercalibration and environmental testing phase II program: Part1, Statistical
analysis of blind simple testing. Environ. Toxicol. 17: 232-240.
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11.
ANEXOS
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(CENICA)
TALLER DE TRANSFERENCIA DE TECNOLOGIA
“ Pruebas biológicas para la evaluación ecotoxicológica de sustancias
químicas”
Proyecto: Pruebas biológicas para la evaluación ecotoxicológica de
sustancias químicas TERCERA ETAPA
14-15 de junio, 2007.
Jiutepec, Morelos, México.
UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA,
UNIDAD IZTAPALAPA
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(CENICA)
INSTITUTO MEXICANO DE TECNOLOGÍA DEL AGUA
Coordinación de Tratamiento y Calidad del Agua
Subcoordinación de Hidrobiología y Evaluación Ambiental
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
Escuela Nacional de Ciencias Biológicas
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(CENICA)
INSTRUCTORES
Biól. Homero Hernández Salgado. IMTA
I.I.Q. Gissel Trujillo Domínguez. IMTA
M.C Yolanda Pica Granados IMTA
Dr. Fernando Martínez Jerónimo. IPN
INSTITUCIONES QUE FINANCIAN Y COORDINAN EL PROYECTO
Centro Nacional de Investigación y Capacitación Ambiental (CENICA)
Universidad Autónoma Metropolitana., Unidad Iztapalapa. (UAM-I).
PARTICIPANTES EN EL PROYECTO DE INTERCALIBRACIÓN:
Gerencia de Saneamiento y Calidad del Agua. CNA México D.F.
Instituto Mexicano del Petróleo (IMP). México D.F.
Universidad Autónoma Metropolitana, Unidad Iztapalapa (UAM-I) México D.F
Centro Nacional de Investigación y Capacitación Ambiental (CENICA)
Escuela Nacional de Ciencias Biológica,(IPN).
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(CENICA)
PROGRAMA GENERAL
“Taller de Transferencia de Tecnología: Pruebas biológicas para la
evaluación ecotoxicológica de sustancias químicas”. Tercera Etapa
JUEVES 14
Sala de juntas Edificio 9
9:00 – 9:15. Presentación del Taller (Patricia Ramírez Romero)
09:15 – 11:00 Discusión y revisión de resultados de pruebas de avance por parte de los
laboratorios participantes (IMP, CNA, y CENICA)
11:00-13:00 Manejo del cultivo de Daphnia exilis, verificación del protocolo (Fernando Martínez
Jerónimo, IPN)
13:00-14.15 Comida en el Centro de Capacitación del IMTA.
14:15-14:45 Revisión del protocolo para análisis de toxicidad con algas, con énfasis en el manejo
del inóculo de prueba, conteo de pruebas u cultivo (Yolanda Pica Granados, IMTA)
14:45-15:15 Discusión de problemáticas
15:15-16:15. Revisión sobre montaje de cultivos (método de medición de concentración de
nutrientes, aforos, conservación de soluciones, inóculo inicial para desarrollo de cultivos (Homero
Hernández, IMTA).
16:15-17:15 Preparación de inóculo algal para pruebas de toxicidad con S: capricornutum, así
como la generación de criterios sobre manejo y cuantificación de algas con la cámara Neubauer y
cálculos. (Homero Hernández, IMTA).
17:15- 18:15 Revisión de procedimientos de prueba con S. capricornutum (Homero Hernández,
IMTA)
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VIERNES 15
Los participantes se dividirán en equipos para realizar las actividades de medición señaladas
09:00 – 13:00
Equipo 1 Actividades prácticas de conteo algal (asignado 1:30 h) .(Homero Hernández)
Equipo 2. Montaje de prueba por parte de los participantes (asignado 1:00 h)(Gissel Trujillo D)..
Equipo 3: Calibración de pipetas (Yolanda Pica)
13:00 – 14:00 Comida
14:00 – 14:30 Análisis comparativo de la toxicidad crónica con Ankistrodesmus falcatus vs S.
capricornutum (Sandra Luz Guerra, IPN)
14.30-16:00 Conclusiones de las observaciones efectuadas durante la experimentación y
desarrollo del taller.
16:00-17:00 Acuerdos sobre continuidad del proyecto
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el
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PROGRAMA CENICA
“ANÁLISIS DE MUESTRAS SÓLIDAS”
MARTES 13:
Laboratorio de Calidad del Agua, Edificio 10
09:00- 9:30am: Bienvenida y presentación del grupo. CENICA
9:30-10:00 . Definición General de la Metodología para análisis en sedimentos. M.C. Yolanda Pica
Granados
Actividad Práctica
10:00 – 11:00
Domínguez)
preparación de muestras para procesamiento. Molido, tamizado (Gissel Trujillo
11:00 -12:30. Preparación y montaje de los sistemas de extracción de fases orgánica y elutriados
(Gissel Trujillo Domínguez)
12:30 – 13:30 Centrifugación de elutriados y concentración de extractos orgánicos
13:30 – 14:30 Comida. Comedor IMTA
14:30 – 16:00 Manejo de extractos, transferencia a reservorios y aforo.
JUEVES 14
8:30 – 9:00 Retiro de muestras del sistema soxhlet
13:45 – 14:15 Rotovaporación de muestras montadas
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VIERNES
15 8:30 – 9:00 Vaciado de extractos a viales.
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ENSAYO DE TOXICIDAD CRONICA CON Selenastrum
capricornutum (Pseudokirchneriella Subcapitata). MÉTODO DE
ENUMERACIÓN CELULAR BASADO EN EL USO DE
HEMOCITÓMETRO NEUBAUER.
Yolanda Pica Granados
Instituto Mexicano de Tecnología del Agua, Cuernavaca, Morelos, México
Alicia Ronco
Centro de Investigaciones del Medio Ambiente, CIMA, Facultad de Ciencias Exactas,
Universidad Nacional de La Plata, La Plata, Argentina
Maria Consuelo Díaz Báez
Unidad Académica de Ingeniería Ambiental, Facultad de Ingeniería,Universidad
Nacional de Colombia, Bogotá, Colombia
_______________________________________________________________
Este protocolo se reproduce con permiso, del libro G. Castillo (ed.). 2004. Ensayos Toxicológicos y Métodos de Evaluación de Calidad
de Aguas. Estandarización, intercalibración, resultados y aplicaciones. IDRC/IMTA. 202 pp.
PRINCIPIO DE LA PRUEBA
El género y la especie de Selenastrum capricornutum fueron modificados formalmente a
Pseudokirchneriella subcapitata (Hindak, 1990), sin embargo, para mantener consistencia
con la literatura que la refiere, se empleará en éste procedimiento su nombre original:
Selenastrum capricornutum.
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Selenastrum capricornutum, es una alga verde (clorofita) unicelular con forma de media
luna (Figura 1) y un volumen aproximado de entre 40 y 60 μm3, que puede encontrarse en
sistemas acuáticos epicontinentales eutróficos u oligotróficos. Este método puede ser
utilizado por sí mismo o como parte de una batería para estimar la potencial fitotoxicidad
de aguas dulces superficiales o subterráneas, aguas servidas y otro tipo de muestras
líquidas, tales como: eluriados o lixiviados, agua intersticial de sedimentos o cualquier
compuesto puro soluble en agua. La prueba es especialmente adecuada para ser
practicada en laboratorios que cuenten con una infraestructura básica, siendo un ensayo
sencillo y de bajo costo.
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Figura 1. Microfotografìa de Selenastrum capricornutum
Cuando las células son expuestas a muestras que contienen contaminantes tóxicos su
reproducción se afecta alterando la tasa de crecimiento de la población de las algas. El
efecto de inhibición de la población causada por los agentes tóxicos en una muestra luego
de 96 h de exposición, bajo condiciones de temperatura controlada (24 ± 2º C), se determina
comparándolo con el crecimiento normal observado en un sistema libre de agentes
contaminantes conocido como control. Dependiendo del número de concentraciones y
réplicas preparadas para el desarrollo del experimento, se determina la CI50 (concentración
de inhibición media), la LOEC (concentración mínima a la cual se observa efecto) y la
NOEC (concentración a la cual no se observa efecto).
El protocolo de prueba con el alga Selenastrum. capricornutum presentado en este manual,
es una modificación del método estándar publicado por la Agencia de Protección Ambiental
de Canadá (Environment Canada, 1992 EPS1/RM/25). Los cambios introducidos (Blaise et
al., 2000) corresponden al uso de volúmenes reducidos (2.6 mL en viales de borosilicato de
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vidrio de 20 mL) y la cuantificación de las células mediante una cámara de conteo
(Neubauer) utilizando un microscopio óptico.
REACTIVOS, SOLUCIONES Y CULTIVO DEL ORGANISMO DE PRUEBA
Todos los reactivos utilizados deben tener calidad ACS, o al menos de 99% de pureza.
Para su preparación se emplea agua destilada en vidrio o Millipore Super Q
(USEPA,1992).
Medio de cultivo para proliferación de algas (1X)
El medio de cultivo se basa en la preparación de una serie de cinco soluciones: la primera
de ellas conteniendo micronutrientes y las cuatro restantes con macronutrientes; todas
ellas con las concentraciones adecuadas para asegurar un crecimiento óptimo de las algas
durante el periodo de incubación.
a. Preparación de soluciones
Para la preparación de las cinco soluciones stock, rotular cinco frascos de 500 ml
(preferentemente material aforado) de la siguiente manera: solución 1, 2, 3, 4 y 5,
respectivamente. Agregar 350 ml de agua a cada uno de ellos.
Solución 1. Micronutrientes:
Se elabora adicionando las diversas sales y soluciones enlistadas en la tabla 1, las cuales
deberán agregarse al frasco de 500mL etiquetado como solución 1. micronutrientes, en el
orden fijado en dicha tabla sin alterar la secuencia de adición ya que se formarán
precipitados difíciles de solubilizar. Asegúrese que antes de adicionar el siguiente
compuesto químico o solución las sales se encuentren completamente disueltas.
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Para la preparación de las soluciones de cloruro de zinc, cloruro de cobalto, molibdato de
sodio y cloruro de cobre, emplear 5 frascos de 100 ml de capacidad, que deben ser
previamente etiquetados con el nombre de cada compuesto químico disuelto. En el caso
del cloruro de cobre se etiquetan dos frascos, diferenciándolos con los números I y II.
Posteriormente seguir las instrucciones que se señalan a continuación.
Tabla 1. Reactivos utilizados en la preparación de solución de micronutrientes
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Compuesto
Fórmula
Masa en gramos (g)
o Volumen (mL) de
solución stock
Cloruro de Magnesio
Cloruro de Calcio
Ácido Bórico
Cloruro de Manganeso
Cloruro de Zinc (solución)
Cloruro Férrico
Cloruro de Cobalto (solución)
Molibdato de Sodio (solución)
Cloruro de Cobre (solución)
Etilen diaminotetracético: sal
disódica
MgCl2·•6H2O
CaCl2·•2H2O
H3BO3
MnCl2·•4H2O*
ZnCl2*
FeCl3·•6H2O*
CoCl2·•6H2O*
Na2MoO4·•2H2O
CuCl2·•2H2O
Na2EDTA·•2H2O
6.08
2.20
0.0928
0.208
1 mL de la solución
0.0799
1 mL de la solución
1 mL de la solución
1 mL de la solución
0.150
* Estos compuestos pueden ser sustituidos por sulfatos. Por ejemplo, ZnCl2 o ZnSO4. Si
así se hiciera, recalcular estequiométricamente las masa a utilizar.
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Solución de cloruro de zinc
Verter en el frasco 70 ml de agua, agregar luego 164 mg de cloruro de zinc (ZnCl2). Llevar
a volumen final de 100 mL con agua y mezclar bien.
Solución de cloruro de cobalto
Verter en el frasco 70 mL de agua, agregar 71.4 mg de cloruro de cobalto (CoCl2•·6H2O).
Llevar a volumen con agua hasta completar 100 mL y mezclar bien.
Solución de molibdato de sodio
Verter en el frasco 70 mL de agua, luego agregar 363 mg de molibdato de sodio
(Na2MoO4·•2H2O). Finalmente completar el volumen hasta 100 mL con agua y mezclar
bien.
Solución de cloruro de cobre
Verter 70mL de agua en dos de los frascos de 100 mL; en el primero de ellos agregar
60.0 mg de cloruro de cobre (CuCl2·• 2H2O), luego llevar a volumen de 100 mL con
agua y mezclar bien. Una vez lista esta primera solución de cloruro de cobre, tomar 1
mL, verter en el segundo frasco y completar el volumen de 100 mL con agua;1 mL de
esta segunda solución es el que se emplea para la preparación de la solución núm.1
de micronutrientes.
Después de haber agregado todos los componentes al frasco de la solución núm. 1 de
micronutrientes, llevar a volumen de 500 mL con agua (Tabla1).
Soluciones de Macro-nutrientes:
Adicionar en los frascos respectivos de 500mL restantes las cantidades de las sales
indicadas a continuación (Tabla 2).
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Tabla 2. Reactivos utilizados en la preparación de solución de macro-nutrientes
Frasco
Compuesto
Solución 2 Nitrato de Sodio
Solución 3 Sulfato de
Magnesio
Solución 4 Fosfato de
Potasio
Solución 5 Bicarbonato de
Sodio
Fórmula
Masa (g)
NaNO3
MgSO4·•7H2O
25.5
14.7
K2HPO4
1.044
NaHCO3
15.0
Mezclar bien hasta disolver y, posteriormente, adicionar agua hasta alcanzar el volumen de 1
000mL en cada uno de los recipientes.
Las soluciones stock pueden ser conservadas refrigeradas (sin congelar) durante dos
meses.
Este medio de proliferación también puede ser empleado para otras especies de algas
tales como Ankistrodesmus sp, Scenedesmus sp, entre otras. Por cada litro de medio de
cultivo que se desee preparar, se adiciona en agua destilada 1 mL de cada una de las
cinco soluciones en forma ordenada. Así, se debe iniciar con la 1 hasta terminar con la 5,
llevando a volumen de 500 mL al finalizar. Se sugiere no alterar el orden de adición de las
soluciones ya que se pueden formar precipitados difíciles de eliminar. Mezclar bien
después de la adición de cada solución.
Al final, el pH del medio deberá ser 7.5 ± 0.1, por lo que es necesario ajustarlo, ya sea con
NaOH o HCl 1 N. Inmediatamente, filtrar el medio bajo condiciones asépticas (mechero o
campana de flujo laminar) a través de una membrana de éster de celulosa de 0.22 µm de
abertura de poro y 47 mm de diámetro. El sistema de filtración y el matraz de captación
deben estar estériles. Para la filtración se puede utilizar una bomba de vacío. El medio
nutritivo esterilizado se inocula con las algas.
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b. Cultivo y propagación de las algas
La inoculación se realiza bajo condiciones de esterilidad ya sea mediante el trabajo cerca
de un mechero, o utilizando una campana de flujo laminar. El cultivo se puede iniciar a
partir de cepas mantenidas en medio sólido tomando las células con un asa y
esparciéndolas en el medio nutritivo líquido, o a partir de un cultivo líquido de algas que
haya alcanzado la fase estacionaria y tenga una densidad celular entre 1 y 3 millones de
células/mL. Cuando los cultivos alcanzan esta densidad se caracterizan por presentar un
color verde intenso, que se logra entre los cinco y siete días después de la inoculación. En
el caso que se seleccione esta última opción, se debe tomar 50 mL del cultivo por cada litro
de medio estéril.
El medio inoculado, se coloca a 24°C ± 2°C dentro de una cámara con iluminación superior
a 2 000 lux, manteniendo aireación permanente. En el caso que no se cuente con el
sistema de iluminación se puede utilizar un sistema similar al presentado en el Anexo de
este protocolo. Para la aireación, se puede emplear una bomba de aire para acuarios, o se
utiliza directamente el aire de la línea del laboratorio. En este último caso, se debe eliminar
las impurezas intercalando filtros entre la fuente y el recipiente de cultivo. Los filtros
permiten mantener condiciones axénicas, y eliminan las partículas sólidas o líquidas (polvo
del aire, emulsiones de aceite, etc). Existen filtros especiales disponibles en el mercado de
artículos para laboratorio, en el caso de no contar con ellos puede fabricarse en el
laboratorio, empacando carbón activado y lana de vidrio.
La manguera se conecta a un tubo hueco de vidrio o a una pipeta despuntada previamente
esterilizados. El tubo se introduce en el medio inoculado cuidando de que el extremo llegue
cerca del fondo del recipiente para que el burbujeo evite la formación de depósitos de
algas. El extremo opuesto, se conecta a la manguera, y deberá sobresalir del recipiente;
para ello, se fija a la boca de la botella de cultivo con un tapón estéril.
Una vez que el cultivo alcanza la fase estacionaria (cinco a siete días), se retira de la
cámara de incubación y se deja reposar a 4º C. Esto puede hacerse en el refrigerador o en
el interior de un cuarto frío, bajo condiciones de oscuridad de 48 a 72 h. El cultivo
sedimentado es separado del sobrenadante por decantación, lo cual permite obtener el
concentrado de algas que se utilizará en las pruebas de toxicidad, o en la alimentación de
otros organismos como es el caso de Daphnia magna.
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Reactivación de algas inmovilizadas
Alternativamente al mantenimiento de un cultivo de algas, algunos laboratorios mantienen
las algas inmovilizadas sobre alginato en la forma de perlas, las cuales pueden
conseguirse comercialmente. En este caso, cuando se van a realizar pruebas de toxicidad,
es necesario liberar las células de la matriz de alginato, para lo cual se sigue el
procedimiento que se describe a continuación.
Para la desinmovilización, se toman entre 10 y 12 perlas con algas asegurándose de que
estén libres de medio líquido. Se transfieren a un tubo cónico de 50 mL, se adiciona 5 mL de
citrato de sodio 0.1 M, y se sella el recipiente. A continuación se agita vigorosamente durante
treinta segundos, repitiendo el procedimiento cada dos minutos hasta que la matriz se haya
disuelto completamente (de veinte a treinta minutos). Con ayuda de un agitador o vortex (a
intensidad moderada), se puede reducir el tiempo de proceso a cinco minutos. Una vez
disueltas las perlas, centrifugar a 3 000 rpm durante 10 minutos. Eliminar el sobrenadante,
conservar las algas sedimentadas, resuspender las células en 5 mL de la solución
amortiguadora utilizada para las pruebas (0.15 mg NaHCO3/L).
Medio nutritivo enriquecido (18X) para las Pruebas de Toxicidad
Este medio se prepara a partir de las soluciones 1, 2, 3, 4, y 5 empleadas en la elaboración
del medio nutritivo para la proliferación de algas. Para la preparación se recomienda utilizar
un recipiente aforado de 1 L debidamente rotulado. Se coloca 800 mL de agua a los cuales
se adiciona 18 mL de cada una de las soluciones ordenadamente como ya se indicó.
Terminada la adición de las soluciones, llevar a volumen con agua destilada y ajustar el pH
a 7.5 ± 0.1 con NaOH o HCl 1 N.
Solución amortiguadora para las Pruebas (15 mg NaHCO3/L)
Para su preparación se toma un matraz aforado de 1L y se coloca 900 mL de agua
destilada, se adiciona 1 mL de la Solución 5 empleada anteriormente, se mezcla y se
completa a volumen.
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Medio sólido para mantenimiento de las cepas
Disolver 1 g de agar-agar en 100 mL del medio nutritivo para desarrollo de Selenastrum
capricornutum, y llenar con medio los tubos de ensayo hasta la mitad de su volumen.
Cerrar los tubos y esterilizar en autoclave u olla de presión a 120° C, 15 lb durante quince
o veinte minutos. Al término del período, sacar los tubos, apretar sus tapas y dejar enfriar
en posición inclinada hasta que el medio se solidifique. El medio sólido puede conservarse
en refrigeración hasta por un mes.
Inoculación de las algas en medio sólido Bajo condiciones de esterilidad, transferir con un asa bacteriológica las algas cultivadas en
medio sólido al tubo con medio fresco, esparciendo las células en estría sobre la superficie
del medio. La inoculación se inicia en zona más profunda del tubo, y se continúa hacia el
exterior.
Una vez inoculado los nuevos medios, incubar a 24 ± 2 ºC, con iluminación continua e
intensidad de luz superior a 2 000 lux por un periodo entre 48 y 72 h. Cuando se observe
crecimiento se retiran los tubos de la cámara y se almacenan en oscuridad a 4 ± 2 ºC. Bajo
estas condiciones, las algas continuarán creciendo pero de forma lenta.
MATERIALES Y EQUIPOS
Materiales
•
•
Pipetas de vidrio graduadas (5 y 10mL)
Pipeta automática de 100µL con puntas estériles
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•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Pipeta automática de 100-1 000 µL con puntas estériles
Viales de centelleo de vidrio borosilicato claro de 20 mL de capacidad
Papel (film) transparente
Cámaras de iluminación (ver en Anexo 1, como opción, un diseño de cámara para
pruebas
Gasa y algodón
Tubo de vidrio o pipeta de vidrio despuntada
Manguera de acuario
Botellas de 1L o matraces aforados de igual capacidad
5 Botellas de 500 mL o matraces aforados de igual capacidad
6 Botellas de 100 mL o matraces aforados de igual capacidad
Recipiente de vidrio claro para cultivo de boca angosta, preferentemente
esterilizable, de 10-20L de capacidad
• Asas bacteriológicas
•
•
•
•
•
Tubos de centrífuga (opcional)
Tubos de cultivo con tapa de rosca.
Tubos de centrífuga de 50 mL, plásticos con tapa de rosca y estériles (opcional)
Hemocitómetro o Cámara Neubauer (ver en punto 4.5.6, indicaciones de manejo)
Matraz de Filtración de 4L
EQUIPOS
• Microscopio óptico con aumento de 100x
• Potenciómetro
• Balanza Analítica
• Bombas de acuario
• Bomba de vacío
• Sistema de filtración
• Mechero o Campana de flujo laminar
• Centrífuga (opcional)
• Base de agitación o Vortex (opcional)
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PROCEDIMIENTO PARA EL DESARROLLO DE LA PRUEBA
Preparación del inóculo de algas para desarrollo de pruebas
Conocido el número células presentes en el inóculo mediante cámara de Neubauer, se debe
hacer una dilución con el fin de obtener en cada vial de prueba una concentración inicial de
10 000 células./mL. Como el volumen final en cada vial incluyendo el inóculo es de 2.6 mL
(Figura 2), se prepara 2 mL de una suspensión de algas que contenga 2.6 x 106 células/mL
de la siguiente manera:
Factor de dilución (FD) = Número células./mL en el concentrado/2.6x106
células./mL.
Volumen (mL) del cultivo de algas para 2mL = 2mL / Factor de dilución
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1. PREPARACION DE INOCULO
Conteo del número de células por
microscopía óptica con cámara Neubauerl
Dilusión del cultivo para obtener 2mL
6
con 2.6 x 10 células
Cultivo de S. capricornutum de 4 a 7 días
en desarrollo de fase exponencial
Adición de 18ml de medio de
enriquesimiento
2. PREPARACION DE
Inóculo con
5
2.6 x 10 células
CONTROL
2.5mL agua moderadamente dura
5mL Muestra
2.5 mL buffer
Transferencia secuencial de 2.5mL
Mezclar Mezclar Mezclar
Mezclar
Descartar 2.5 mL
REPLICA 1
REPLICA 2
Av. SanREPLICA
Rafael Atlixco
No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
3
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3662 y10µL
5804
4600
Ext. 2592
a cada
celdilla
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100
50 %
3. DESARROLLO DE PRUEBA
25
12.5%
6.25%
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Figura 2. Esquema del procedimiento de prueba con S. capricornutum La preparación del inóculo que será utilizado en las pruebas debe provenir de un cultivo en
fase exponencial. La densidad del cultivo será determinada con ayuda de un celda de conteo
o Cámara de Neubauer. La densidad celular del cultivo se obtiene para poder calcular el
factor de dilución necesario para asegurar una concentración de 2.6 millones de células por
mililitro (2.6 x 106 células./mL) en un volumen de 2 mililitros.
Con el fin de ilustrar este cálculo se presenta el siguiente ejemplo:
1. Cálculo del factor de dilución (FD):
FD = No. de células./mL en el cultivo algal / 2.6 x 106 células. /mL
Si la concentración de células por mililitro en el cultivo fue de 2.9 x 106 células./mL, entonces:
FD = 2.9 x 106 células/mL / 2.6 x 106 células/mL = 1.115
2. Cálculo del volumen de cultivo de algas en 2 mL (V):
V (mL) = 2mL / Factor de dilución
Sustituyendo en el ejemplo, el volumen de cultivo en 2 mL será:
V (mL) = 2mL / 1.115 = 1.79 mL
El resultado indica que deberá tomarse 1.79 mL del concentrado de algas y adicionar
solución amortiguadora hasta completar un volumen de 2mL. Esta dilución se puede realizar
en tubos cónicos de centrífuga de 50 mL con ayuda de una pipeta automática.
Los 2 mL tendrán una concentración de algas de 2.6 x 106 células./mL, la cual nuevamente se
diluye adicionando 18 mL del medio nutritivo enriquecido (18x) para tener una densidad final
de 2.6 x 105 células/mL .
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Método de dilución de muestras
Se recomienda que el sistema experimental incluya las diluciones de la muestra problema,
así como las correspondientes al control positivo que contiene al tóxico de referencia y una
serie de cinco viales que serán de utilidad como control o control negativo (ver
Aseguramiento y control de calidad de bioensayos).
Los cinco viales rotulados como control (C1 hasta C5) deben llenarse solo con 2.5 mL de la
solución amortiguadora (NaHCO3 15 mg/L). Para el caso de las muestras problema o de
control positivo, se requiere por lo menos 15 viales de borosilicato de vidrio de 20 mL
similares a los utilizados en contadores de centelleo (Arensberg et al.,1995) organizados en
series de 5 viales cada una. Cada serie constituye una réplica. Se rotulan los viales de la
primera serie de la siguiente manera: P1, Q1, R1, S1, y T1, la segunda, deberán rotularse de la
misma forma pero con el subíndice 2, y la tercera con el subíndice 3. En los viales rotulados
P1, P2, y P3 se colocan 5mL de solución más concentrada de la muestra (100%). Los
restantes viales se utilizarán para la preparación de las diluciones seriadas de la muestra (ver
figura 2).
Para iniciar el proceso de dilución de la muestra, en cada uno de los viales restantes se
coloca 2.5 mL de solución amortiguadora (NaHCO3 15 mg/L). A continuación, se transfiere
2.5 mL de la muestra (100%) del vial rotulado como P1 al vial Q1, la concentración en este vial
corresponde a la primera dilución 1:2 o 50% (v/v). Se mezcla y se continúa el proceso
tomando 2.5 mL del vial Q1 y pasándolo al R1 en cual se tiene la segunda dilución 1:2 y una
concentración de 25% (v/v), y así sucesivamente hasta llegar al vial T1 , como al finalizar en el
vial T1 se tiene un volumen de 5mL se toman 2.5 mL y se descarta. Se sigue el mismo
procedimiento para las series 2 y 3 y al finalizar el proceso de dilución, se mezcla el contenido
de cada uno de los viales del sistema de prueba.
Terminado el proceso de dilución de la muestra, se procede a adicionar 100µL del inóculo de
algas anteriormente preparado y cuya concentración es 2.6 x 105 células/mL, a cada uno de
los viales de la prueba. La concentración final de las algas en cada uno de los viales será 10
000 células/mL.
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Se colocan los viales en la cámara con iluminación fluorescente (luz blanca fría), con una
intensidad luminosa entre 60-80 µE/m2s (aproximadamente 4 000 lux). Anexo al presente
se presenta el diseño y procedimiento de elaboración de un modelo piramidal de cámara
que puede ser construido con materiales de bajo costo y permite que en toda el área se
tenga una distribución homogénea de luz.
Tabla 3. Resumen de las condiciones recomendadas para las pruebas de toxicidad con S.
capricornutum
1. Tipo de Ensayo
2. Temperatura
3. Calidad de Luz
4. Intensidad Luminosa
5. Fotoperíodo
6. Volumen del Recipiente
7. Volumen de la Solución de Prueba
8. Edad del Cultivo usado como Inóculo
9. Densidad Celular Inicial
10. Número de Réplicas
11. Velocidad de Agitación
12. Agua de Dilución
13. Factor de Dilución
14. Duración de la Prueba
15. Efecto Medido
16. Resultado Final
17. Aceptabilidad de los Resultados
18. Control positivo
Estático
22 ± 2°C
Fluorescente, blanco-frío
60-80 μE / m2/ s (4 000 ± 10% lux)
Iluminación continua
Viales de 20 mL
2.6 mL
4 a 7 días
104 células/mL
Tres
Manual, discontinua
Solución amortiguadora (NaHCO3
15 mg/L)
0.3 ó 0.5
96 h
Crecimiento (conteo)
IC50
Densidad celular en el control >500,000
cél/ml
Cu(II) a partir de una solución de Cu SO4
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La incubación de los viales se lleva a cabo durante 72 h. Si no se cuenta con un sistema
de agitación orbital, se debe hacer agitación manual de cada uno de los viales tres veces
durante el día. La agitación contribuye a promover el adecuado desarrollo de la población
de las algas. El resumen general de las condiciones de la prueba se presenta en la Tabla
3 y en las Figuras 2 y 3.
Diagrama de flujo ensayo S. capricornutum
Cultivo de S capricornutum
en medio sólido
Subcultivo en medio líquido
3 días, 24°C, 100rpm
Sustancias Tóxicas
Subcultivo en medio líquido
3 días, 24°C, 100rpm
Preparación de
Diluciones
Inóculo
BIOENSAYO
No. Células/mL Inicial
pH inicial
Registro de Datos
No. Células./mL diaria (72 h)
pH final
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Cálculo de la Biomasa
% de Inhibición
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Figura 3. Ensayo de toxicidad crónica con S. capricornutum
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ANÁLISIS DE DATOS
Al finalizar el tiempo de exposición se inicia el conteo del número de algas en cada vial.
Para el conteo se toman entre 20 a 50 µl de la suspensión con ayuda de una pipeta
automática, y se coloca en la celda de conteo o la cámara Neubauer.
La cuantificación se efectúa siguiendo el método de manejo recomendado para este tipo
de celdas, y que se describe más adelante.
Conocidos los recuentos del número de algas, se procede a establecer el porcentaje de
inhibición (% I) en cada una de las diluciones, el cual se cuantifica de la siguiente manera:
% I = 100 – [(promedio céulasl/mL de las réplicas en la dilución / promedio células/mL de las réplicas del control)] x 100
Conteo con la Cámara Neubauer
La cámara Neubauer, también conocida como hemocitómetro, consta de un cubre-objetos
de cuarzo y un porta-objetos de un grosor mayor a los de uso común (Figura 4). En la parte
superior del porta-objetos se encuentran cuatro canales longitudinales y uno transversal
central. En la parte superior e inferior del canal transversal están grabadas dos rejillas de 9
mm2 de superficie, las cuales están a su vez subdivididas en una cuadrícula más pequeña
(Figura 4. A-B) (UNAM, 1986).
Usando el objetivo de 10x de un microscopio óptico, se enfoca de forma que en el campo
se cubra un cuadrado cuya área corresponde a 1 mm2, generalmente se trabaja con el
cuadro central. El área del cuadro central es de 1mm2 y se encuentra subdividida en 25
cuadrados. Cada uno de estos cuadrados mide 0.2 mm de lado, por lo que el área de cada
uno será 0.04 mm2 (Figura. 4. C)
Al colocar el cubre-objetos sobre el porta-objetos se tiene una profundidad de 0.1mm de
forma que el volumen contenido en cada uno de los cuadrados grandes será 0.1 mm3 (1.0
mm2 x 0.1 mm = 0.1 mm3).
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El conteo con la cámara se lleva a cabo de la siguiente forma:
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•
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Limpiar con papel de arroz la cámara de Neubauer.
Colocar el cubre-objetos sobre los canales tal como se indica en la Figura 4.
Agitar manualmente el frasco con la solución de algas a evaluar hasta observar
coloración homogénea o disolver los agregados celulares.
Con ayuda de una pipeta serológica de 1mL o con una pipeta automática de 100µL
tome 0.1 mL de la suspensión de algas y colocando la punta de la pipeta en el borde
del cubre-objetos dejar que la solución ingrese a la cámara por capilaridad, sin que ella
pase a los canales laterales
(Figura 4.D). Si se forman burbujas se debe repetir
la operación, lavando y secando la cámara previamente.
Colocar la cámara Neubauer en la platina del microscopio y enfocar con el objetivo 10x.
Localizar el cuadro central de la rejilla de 25 cuadros de 0.04 mm2, hacer un cambio
de lente al objetivo de 40x y contar las células que se encuentran sobre el mismo
(Figura 4.C).
Contar el número de células en el cuadrado central tomando precauciones para evitar
contar dos veces la misma célula u omitir alguna.
Para obtener resultados más exactos se recomienda tener un conteo entre doscientas y
trescientas células por muestra. Cuando en el cuadro central existen menos de
doscientas células, es necesario revisar más cuadros para el conteo. Se sugiere
continuar el conteo en los cuatro cuadros que forman las esquinas de la cuadrícula. Si
aún así no se alcanza las doscientas células, se debe contar el total en los 25 cuadros.
Anotar el número de cuadros contados.
En caso opuesto, en que el número de células sea muy elevado y se dificulte su conteo,
será necesario diluir la suspensión en una proporción conocida, la que deberá ser
tenida en cuenta en la estimación final.
Determinación de la densidad celular
La densidad celular de la suspensión de algas se calcula de la siguiente forma:
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1. En caso de haber empleado los cuadrantes de 0.04 mm2 :
No. células en 0.1 mm3 = No. total células contadas / No. cuadros 0.04 mm2
Esto dará el número total de células por 0.1 mm3 (volumen obtenido de multiplicar el área
de 1mm2 x 0.1mm profundidad de la cámara).
El número de células por mL, se obtendrá de multiplicar el valor obtenido anteriormente por
10000.
No. células por mL = No. células en 0.1 mm3 x 10 000
2. En caso de haber empleado los cuadrantes de 1 mm2 :
Núm. células en 0.1 mm3 =Núm. total células contadas / Núm. cuadros 1 mm2 en
conteo
Este valor corresponderá al número total de células en 0.1 mm3. Para obtener el número
por mL, se multiplica por 10 000.
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Cámara
A
Neubauer
B
1 mm
Canal transversal
Canales longitudinales
C
1 mm
Colocar cubreobjeto
2
3
1
5
4
0.2
Conteo por cuadrantes
Adicionar 0.01mL
mL
de solución algal
Figura. 4. Conteo Celular mediante la utilización de la Cámara de Neubauer
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REFERENCIAS
Arensberg, P., Hemmingsen, V. H., Nyholm, N., 1995. A. Miniscale Algal Toxicity Test . Chemosphere,
30:2103-2115.
Blaise C., Forget, G. & Trottier, S., 2000. “Toxicity Screening of Aqueous Samples Using a
Cost-Effective 72-hour Exposure Selenastrum capricornutum Assay. Environ Toxicol.,
15:352-359.
Environment Canada. 1992. Biological Test Method: Growth Inhibition Test Using the Freshwater alga
Selenastrum capricornutum. Environmental Protection Series EPS 1/RM/24.
Hindak, F., 1990. “Studies of the Clorococcal Aalgae (clorophyta)”, V. Biologicke Prace
(Slovenskej
Akademic
Vied),
Bratislava,
36:1-225
UNAM, 1986. “Biología Celular”. Manual de Prácticas. Departamento de Biología,
Facultad de Ciencias, Universidad Nacional Autónoma de México. pp. 20-28
U.S EPA. 1992. Short -term Methods for Estimating the Chronic Toxicity of Effluents and Receiving Waters to
Freshwater Organisms. EPA-600/4-91-022. 3th ed. Philip L ewis, A., L.; Klem, D.. J. & Lazorchak, J. M.
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Construcción de Una Cámara de Iluminación Casera para el Ensayo de Toxicidad
con S. capricornutum
Homero Hernández Salgado
Instituto Mexicano de Tecnología del Agua, Cuernavaca, Morelos, México
Patente en registro
_______________________________________________________________
Este protocolo se reproduce con permiso, del libro G. Castillo (ed.). 2004. Ensayos Toxicológicos y Métodos de Evaluación de
Calidad de Aguas. Estandarización, intercalibración, resultados y aplicaciones. IDRC/IMTA. 202 pp.
MATERIALES
•
•
•
•
•
•
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•
•
•
•
•
Dos Pliegos de papel empleado para construcción de maquetas, color blanco, rígido y
resistente (ej. cascarón), de aproximadamente 1.40 x 0.60 m.
Cinta adhesiva de 5 a 7 cm ancho
Tijeras o navaja
Papel aluminio
Carrete de hilo nylon
Marcador indeleble color azul o amarillo
Guantes de látex
Embudo de tallo largo de plástico transparente o vidrio de 10.5cm de abertura de boca
y 10 de fondo
30 cm de alambre de 1mm de diámetro
extensión eléctrica
Socket para foco con entradas para clavija de conexión
Bombilla de luz halógena fría 20W/11-860-120V.-350mA, 1 155 lumen 50/60Hz, de
triple foco (ej. Osram Dulux)
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•
Conexión para anterior
Preparación de la pantalla de iluminación
De los pliegos de papel para construcción, cortar cuatro triángulos de 60cm por lado,
posteriormente cortar una de las esquinas de tal forma que se obtenga un polígono de 60
cm de base por aproximadamente 57cm de altura. (Figura 5. A)
Forrar con papel aluminio los primeros 20 cm de la base de cada triángulo a manera de
banda, la cual quedará en el interior de la cámara una vez armada (Figura 5. B).
Formar la cámara uniendo los triángulos por sus lados, para estructurar una pirámide
trunca en su punta (Figura 5. C) con ayuda de la cinta adhesiva. Pegar por la parte
exterior.
Colocación del sistema de iluminación
a. Sistema de filtrado
A 20cm de la boca superior introduzca en una esquina hilo nylon resistente y cruce a la
esquina opuesta, repita la operación en otra de las esquinas de tal forma que se forme una
cruz o red de soporte (Figura 6. D).
Trozar el tallo del embudo hasta su base.
Cortar el guante de cirujano conservando la banda de aproximadamente 8cm de la muñeca
del mismo. Eliminar el resto.
Colocar la banda de látex, obtenida del guante de cirujano, en la boca del embudo sin tallo,
de forma que cubra solo 5 cm, y dejar un espacio traslúcido de 5 cm (Figura 6. D).
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Enderezar el alambre y enrollar uno de los extremos de tal forma que se fije en el interior
del embudo. Introducir el alambre por el orificio dejado por el tallo del embudo. Dar un
espacio de 5cm, y en el extremo saliente formar un gancho (Figura 6. D). Colgar el
embudo del centro de la red de sostén (Figura 6. E).
Colocación de lámpara
Atornillar la bombilla de luz halógena de triple barra en el porta-lámpara correspondiente.
Introducir el sistema por el interior de la pirámide de tal forma que la rosca del portalámpara salga por la punta de la pirámide. Tomar la conexión múltiple y enroscar al resto
del sistema por el exterior. Esto dará estructura y soporte a la lámpara (Figura 6. E).
a. Base de la cámara
Cortar un cuadrado de papel para construcción de 62 cm2. Forrar una cara con papel
aluminio.
Ubicar el centro del cuadrado y en torno a él dibujar un cuadrado de 10cm, después
marcar dos más de forma concéntrica, el primero de 40 cm por lado y el segundo de 60 cm
por lado (Figura 6. F).
Trazar líneas diagonales con el marcador, en la banda que se forma entre el cuadrado 1 y
3. El área marcada señalará la zona donde siempre deberán ser colocados los viales de
prueba dentro de la cámara. En esta banda, bajo el diseño antes mencionado, la
iluminación será homogénea proporcionando una intensidad luminosa de entre 2 800 y 3
000 lux.
El borde del recuadro 3 es el sitio donde la pantalla de la cámara de iluminación deberá ser
colocada (Figuras. 6. F y 7. G).
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Preparación de la Pantalla
Vista Lateral
2.5 cm
2.5 cm
A
B
cm
cm
60
cm
cm
60
60
60
20
cm
57 cm
60 cm
Papel Aluminio
60 cm
Vista interior
C
60 cm
60 cm
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Figura 5. Preparación de pantalla de iluminación
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Sistema de filtrado de luz
D
5 cm de alambre
Colocación de la lámpara
Extensión
eléctrica
Socket para foco con entradas
para clavija de conexión
Cono de vidrio
Cubierta de
látex
E
10 cm
Socket para bombilla
de luz fría, halógena
5 cm
Bombilla de luz fría,
halógena
10.5 cm
Base de la cámara
Forro de
aluminio
3
2
F
1
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Area5613
de 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592
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iluminación
10 cm
10 cm
40 cm
10 cm
Borde de unión
para la pantalla
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Figura 6. Colocación de sistema de iluminación
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G
Socket para foco con entradas para clavija de
conexión
Extensión eléctrica
Socket para bombilla de luz fría, halógena
Bombilla de luz fría, halógena
20
cm
Alambre
Red de sostén
5
cm
Trampa de luz
20 cm
Forro de
aluminio
Area de iluminación
homogénea
Figura 7. Vista tridimensional de la cámara de iluminación
Sugerencias
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Cambiar la lámpara de iluminación de triple barra de forma regular, cada 45 días si es que
el uso es continuo, o calcule las horas de uso equivalentes. El cambio debe efectuarse ya
que el brillo de la lámpara tiende a disminuir con el uso reduciendo la intensidad luminosa,
lo que puede reducir significativamente el crecimiento de las algas durante el desarrollo de
pruebas
ENSAYO DE TOXICIDAD AGUDA CON DAPHNIA MAGNA
Maria Consuelo Díaz Báez Unidad Académica de Ingeniería Ambiental, Facultad de Ingeniería, Universidad Nacional de Colombia, Bogotá, Colombia Yolanda Pica Granados Instituto Mexicano de Tecnología del Agua, Cuernavaca, Morelos, México Alicia Ronco Centro de Investigaciones sobre el Medio Ambiente, CIMA, Universidad Nacional de La Plata. Argentina Este protocolo se reproduce con permiso, del libro G. Castillo (ed.). 2004. Ensayos
Toxicológicos y Métodos de Evaluación de Calidad de Aguas. Estandarización,
intercalibración, resultados y aplicaciones. IDRC/IMTA. 202 pp.
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PRINCIPIO DE LA PRUEBA
Dentro del grupo de cladóceros, las especies del género Daphnia son las más utilizadas
como organismos de prueba o de referencia en pruebas de toxicidad. La amplia
distribución geográfica, el importante papel que cumplen al interior de la comunidad
zooplanctónica, la facilidad de cultivo en el laboratorio, la reproducción partenogenética (lo
cual asegura una uniformidad de respuesta), y el corto ciclo de vida con la producción de
un alto número de crías, han hecho de este grupo un ideal para la evaluación de toxicidad,
a nivel universal.
El género Daphnia se ubica dentro del orden cladócera de la clase crustácea, y especies
como Daphnia magna, Daphnia pulex, y Daphnia similis, son utilizadas extensivamente en
pruebas de toxicidad, por lo cual existe una extensa información sobre las técnicas de
cultivo, los requisitos de temperatura, luz y nutrientes, así como su respuesta a muchos
tóxicos. Específicamente, los ensayos de toxicidad con Daphnia magna (figura 1), permiten
determinar la letalidad potencial de sustancias químicas puras, aguas residuales
domésticas e industriales, lixiviados, aguas superficiales o subterráneas, agua potable, y
agua de poro de sedimentos, entre otros.
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Figura 1. Vista general de Daphnia magna
En las pruebas de toxicidad con D. magna, neonatos menores de 24h de edad son
expuestos a la muestra o compuesto a probar, por un perÍodo de 48h, al término del cual
se cuantifica el número de organismos muertos. Con estos resultados se establece la
proporción o porcentaje de mortalidad producida.
Materiales, Reactivos y Equipos
Material Biológico Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
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Las hembras partenogenéticas de
D. magna pueden obtenerse directamente de
compañías proveedoras de materiales biológicos, quienes certifican la especie. También
pueden ser obtenidas de otras fuentes como laboratorios especializados donde se llevan a
cabo pruebas de toxicidad con este cladócero o por medio de su recolección en campo; en
estos casos la especie deberá ser taxonómicamente identificada.
Materiales de laboratorio •
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Acuarios de 3 L de capacidad.
Vaso de precipitado de 2 000, 1 000 y 600 mL.
Pipetas volumétricas y graduadas de 1, 2, 5, 10 y 20 mL.
Matraz aforado de 100 mL.
Pipetas pasteur y bulbos de latex
Pipetas volumétricas de 1, 2, 5 y 10 mL, peras para pipetas
Pipetas automáticas de 250, 500 y 1 000 μL; puntas para micropipetas.
Recipientes plásticos de 30, 50mL, 100 mL
Papel aluminio.
Garrafón o bidón de 20 litros
Manguera delgada para bombas de acuario.
Matraz Kitasato de 2 L.
Platos para pesar reactivos.
Espátulas
Hielera y hielo o geles refrigerantes.
Papel parafilm
Tubos de ensayo
Reactivos •
•
•
NaHCO3
MgSO4
KCl
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•
•
•
•
•
•
•
CaSO4.•2H2O
Biotina
Tiamina
Vitamina B12
Na2SeO4
K2Cr2O7
Agua deionizada o destilada
Equipos • Microscopio Estereoscópico
• Balanza Analítica
• Plancha de Agitación con magneto.
• Bombas para acuario
• Controlador de temperatura ambiente (equipo de aire acondicionado u otro).
• Refrigerador (4 ± 2 °C)
• Bomba de vacío
• Mechero de Bunsen
• Autoclave o equivalente
• Medidor de oxígeno disuelto
• Potenciómetro
• Tituladores para dureza y alcalinidad.
• Termómetro.
• Sistema purificador de agua (deionizador, sistema Milli-Q) o una fuente de
abastecimiento de agua destilada.
• Centrífuga
CULTIVO Y MANTENIMIENTO DE LOS ORGANISMOS DE PRUEBA
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Los cultivos de D. magna pueden mantenerse en recipientes de uno, dos o tres litros, o
cualquier otro sistema que resulte funcional. Con el fin de mantener condiciones óptimas
para el crecimiento de los individuos, se recomienda mantener una densidad poblacional
de no mayor de 12 individuos por litro.
Los organismos se mantienen en agua reconstituida con una dureza entre 160 y 180 mg
CaCO3 /L. El agua se prepara en el laboratorio (APHA,1998), y puede suplementarse con
una solución de vitaminas y selenio, cuando se detecten problemas en la reproducción, o
se presente una alta mortalidad entre los 14 y 21 días por malformación de las antenas
(figura. 2).
Ojo
Corazón
Antenas
Ovario y
Bolsa incubatriz
Intestino
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Figura 2. Principales rasgos morfológicos de Daphnia magna
Los cultivos se mantienen a una temperatura de 21 ± 2ºC, un fotoperíodo aproximado de
16 h luz /8 h oscuridad y una intensidad lumínica de alrededor de 800 lux (ver
condiciones en tabla 1).
Agua dura reconstituida (APHA,1998):
Para su preparación se recomienda colocar en un garrafón: 19L de agua deionizada o
destilada, y adicionar 2.4 g de MgSO4, 3.84 g de NaHCO3 y 0.16 g de KCl. Agitar hasta
disolver completamente las sales. Paralelamente, disolver 2.4 g de CaSO4 •2H2O en 1L de
agua deionizada o destilada. Es necesario tener en cuenta que la disolución de esta sal
puede requerir un período de tiempo prolongado. Terminada la solubilización de la sal,
incorporar la solución de CaSO4•2H2O al garrafón, lo cual permitirá obtener 20L de agua
dura reconstituida.
Suplementos (adicionar solo en caso de un crecimiento deficiente del cultivo):
Cuando se determine la necesidad de suplementar el agua dura, debe prepararse por
separado las soluciones de Biotina, Vitamina B12, Tiamina y Selenito de Sodio (Na2SeO4 )
(Elendt & Bias,1990), de la siguiente forma:
Solución de Biotina:
Solución de Vitamina B12
Solución de Tiamina:
Selenito de Sodio (Na2SeO4):
0.0075 g/L
0.010 g/L
0.075 g/L
0.010 g/L
Tabla 1. Resumen de las Condiciones Recomendadas para el Mantenimiento
de Cultivos de Daphnia magna
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Temperatura
Calidad de Luz
Intensidad Luminosa
Fotoperíodo
Recipientes
Mantenimiento
Alimentación
Dosis de Alimento
21 ± 2oC
Fluorescente, blanco-frío
≤ 800 lux (luz blanca fría) en la superficie del liquido
16 horas luz - 8 oscuridad
de Los cultivos se mantienen en recipientes de 2L de
vidrio transparentes, y deben permanecer tapados
Cultivos puros
de Selenastrum capricornutum
u otras algas verdes unicelulares.
La cantidad de alimento suministrada se calcula de
la siguiente manera:
V= A x B / C
donde:
V= volumen a ser adicionado
A= número de
organismos
B= número de células por daphnia (1.5 x106
células por daphnia /día)
C = densidad celular de la suspensión algal
El alimento es suministrado diariamente.
Suplemento Alimenticio
Densidad Poblacional
Limpieza
Los cultivos pueden suplementarse con las
soluciones de vitaminas y selenito.
No mayor de 12 individuos/L
Diariamente se debe retirar las exubias (mudas) y
los restos que se encuentren en el fondo de los
recipientes. Cada viernes se cambia el agua de los
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acuarios que deben lavarse con una esponja o un
paño de tela, enjuagar varias veces con agua desionizada. No se debe emplear jabón ni otros
detergentes.
Recolección de Neonatos Diariamente se retiran los neonatos con una pipeta
Pasteur de plástico con una abertura lo
suficientemente ancha para no ocasionar daños a
los neonatos.
Las soluciones preparadas se deben mantener refrigeradas (4°C ± 2), y pueden
almacenarse por un período de hasta seis meses. Para un volumen de veinte litros de
agua dura reconstituida, se adicionan los siguientes volúmenes de cada una de las
soluciones: tiamina (20 mL), vitamina B12 (4 mL), biotina (2 mL), y selenito de sodio (4 mL).
Una vez terminada la preparación del agua reconstituida, se mide el pH, el cual deberá
oscilar entre 7.6 y 8.0. Posteriormente, se airea el líquido de forma permanente hasta el
momento de su uso (mínimo 24 h). El aire utilizado debe estar libre de grasas y aceites.
Se recomienda que antes de utilizar el agua se determine: 1) la concentración de oxígeno
(la cual debe estar por encima de 6 mg/L), y 2) y la dureza (que debe encontrarse dentro
del intervalo preestablecido de 160-180 mg CaCO3/L). En caso de que alguno de los
parámetros de control se encuentre fuera de los intervalos mencionados, el agua deberá
desecharse.
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Igualmente, con cada lote de agua dura preparada, antes de su utilización, ya sea como
medio de cultivo y/o para la dilución de las muestras, se debe realizar un bioensayo que
permita comprobar que no se presenta ningún efecto sobre la supervivencia de las
daphnias. Para esta prueba, se colocan en tres recipientes un volumen de 30 mL de agua
y 10 neonatos/recipiente. Al cabo de las 48 h la supervivencia deberá ser mayor del 90%,
en caso contrario se debe descartar el agua reconstituida.
Limpieza y mantenimiento
Para el mantenimiento del cultivo se sugiere aplicar un ciclo de renovación definido a
criterio del analista. El ciclo permite mantener un cultivo de organismos en etapas óptimas
de reproducción. Algunos autores (CETESB/L5.018, 1991) recomiendan mantener lotes de
individuos separados por edad, desde 0-1 semana hasta 4 ó 5 semanas de la siguiente
forma:
Madurez sexual
0-24h
1
semana
2
semana
Inicio de partos
3
semana
4
semana
5
semana
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Neonatos con los que se reinicia un nuevo cultivo
Hembras que se descartan
Figura 3. Cultivo de organismos—ciclo de renovación
Diariamente o cada tercer día dependiendo del desarrollo del cultivo, deben retirarse los
neonatos, los cuales pueden ser destinados al desarrollo de pruebas o eliminados.
Con igual periodicidad se deberá efectuar la limpieza y el suministro de alimento. Para la
limpieza se emplea un sifón con el cual se remueve las exubias y los restos de alimento
depositados en el fondo de los recipientes. Al finalizar, se recupera el volumen de agua en
cada recipiente, adicionando y/o haciendo el recambio de 1/3 del volumen con agua
reconstituida fresca.
Una vez por semana (por ejemplo el viernes), después del retiro de los neonatos y antes
del suministro de alimento, se transfieren las hembras adultas a recipientes limpios
conteniendo partes iguales del agua antigua y agua de dilución fresca
Se recomienda desechar los organismos mayores a 4 o 5 semanas, y reemplazarlos e
iniciar un nuevo cultivo con los neonatos colectados ese día.
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Cuando se van a realizar pruebas, el día previo se extraen los neonatos presentes en el
cultivo, para de esa forma garantizar que los neonatos encontrados al día siguiente tengan
menos de 24 h de nacidos.
Alimentación
Para la alimentación de los cultivos, se puede emplear suspensiones de diferentes
especies de algas (Selenastrum capricornutum, Ankistrodesmus falcatus, Chlorella sp.
Scenedesmus sp., etc.). Para el cultivo de los dos primeros géneros, se recomienda utilizar
medio AAP cuyos detalles de preparación se presenta en el protocolo de prueba para S.
capricornutum (US EPA 1991); para las restantes especies se puede utilizar medio Bristol,
cuya composición se detalla en la tabla 2 .
La alimentación con cultivos de S. capricornutum se realiza cada tercer día, después de la
limpieza. Para determinar la cantidad de alimento (cultivo algal) que debe suministrarse a
cada recipiente del cultivo, calcular el volumen de la siguiente manera:
V = (AxB)/C
donde:
V = volumen del concentrado algal,
A= número de daphnias por acuario,
B = dosis óptima recomendada (1.5 x 106 células por daphnia / día)
C= concentración (Número de células/mL) de la suspensión de algas (para su
determinación se utiliza una cámara de Neubauer cuyo manejo se presenta en el protocolo
de prueba con Selenastrum capricornutum).
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Tabla 2. Medio de Cultivo o Medio Bristol
Solución de macronutrientes:
Compuesto
Solución núm.
Solución Madre
(g/L)
1
2
3
4
5
6
8
25
2.5
7.5
7.5
2.5
17.5
3.1 g/100mL
5.0 g/100mL
NaNO3
CaCl2•H2O
MgSO4 • 7H2 O
K2HPO4
NaCl
KH2PO4
Mezcla 1:1*
KOH
EDTA
Mezcla 1:1*
FeSO4•7H2O
H2SO4
H3BO3
9
10
mL de la solución
madre por L de
solución
10
10
10
10
10
10
1
0.498 g/100mL
0.1 mL/L
1
1.142 g/100mL
1
Solución de elementos traza:
Compuesto
ZnSO4 .7H2 O
MnCl2 . 4H2 O
MoO3
CuSO4 .5H2O
Co(NO3 )2 .6H2O
1 mL/L
Solución Madre (g/100 mL)
0.882
0.144
0.071
0.157
0.049
*Estas mezclas deben ser preparadas hasta el momento previo de su adición al medio
Bristol
PROCEDIMIENTO DE LA PRUEBA
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Para el desarrollo de pruebas de toxicidad aguda con D. magna se emplean neonatos (<
24h de nacidos) expuestos a diferentes concentraciones de una muestra o de un agente
tóxico durante un periodo de 48 h. Como resultado de dicha exposición, es posible
determinar la concentración de la muestra o compuesto problema, que produce la muerte
al 50 % de la población de neonatos expuestos (concentración letal media o CL50), con un
nivel de confiabilidad del 95%.
También puede determinarse la concentración mínima donde aún se observa efecto de
mortalidad (Lower Observable Effect Concentration, LOEC), así como aquella donde la
muestra no produce la muerte de neonatos (No observable Effect Concentration, NOEC).
Cuando no hay un conocimiento de la toxicidad de las muestras, es recomendable llevar a
cabo una prueba preliminar, en la cual se prepara un amplio número de concentraciones
sin réplicas (por ejemplo: 0.001, 0.01, 0.1, 1,10, y 100 %). Para la prueba se coloca 30 mL
de cada una de las diluciones en los vasos de prueba, se transfieren 10 neonatos, y a las
24 h se registra el número de organismos muertos. Con esta información podrá
establecerse el intervalo de concentración en el cual se puede esperar el 0 y el 100% de
mortalidad. Este intervalo, se utiliza como guía para la preparación de las diluciones en las
pruebas definitivas.
Para la preparación de las diluciones de las muestras, se utiliza como medio de dilución
agua dura reconstituida (180 y 160 mg/L CaCO3), sin ningún suplemento. En la
preparación del agua, se debe determinar los parámetros señalados anteriormente
(APHA, 1998).
Preparación de las soluciones de Prueba: muestras ambientales (efluentes y aguas
superficiales)
Para preparar la diluciones de la muestra se recomienda utilizar un factor de dilución de
0.5, el cual permite cubrir un amplio intervalo de dilución (por ejemplo, 100, 50, 25, 12.5,
6.25% etc.). Si se observa un alto porcentaje de mortalidad durante las primeras horas del
bioensayo, es necesario realizar más diluciones de a muestra y repetir el bioensayo.
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Las pruebas definitivas, requieren por lo menos 5 diluciones, por lo que es necesario preparar un mínimo de 100 mL por dilución. Este
volumen será suficiente para el llenado de las tres réplicas (25 ml en cada uno) de cada concentración. Como recipientes se pueden
emplear vasos de polietileno desechables (figura 5) de 30 mL, o vasos de precipitado de vidrio de 50 mL .
Además de las diferentes concentraciones de la muestra, se debe preparar junto con las
respectivas réplicas, un control negativo con agua dura reconstituida sin suplementos, y un
control positivo con una solución del tóxico de referencia (Cr VI) en la concentración que,
según la carta control previamente elaborada, corresponda a la CL50
Una vez preparadas cada una de las soluciones, se transfieren diez neonatos de menos de
24h de nacidos a cada uno de los recipientes. Para realizar este procedimiento se puede
utilizar una pipeta despuntada. Terminada la transferencia se cubren los vasos con papel
Parafilm y se colocan bajo condiciones controladas de iluminación y temperatura (tabla 2)
por un periodo de 48h.
Transcurrido el tiempo establecido, se revisan los vasos de prueba y se registra el número
de organismos muertos en cada uno. La muerte se reconoce, por la carencia de movilidad
o la ausencia de ritmo cardíaco. Antes de efectuar las lecturas se agitan los recipientes en
forma circular para reactivar el movimiento de los organismos que se posan inmóviles en
el fondo. Aquellos que no presenten movilidad pueden observarse con un microscopio
estereoscópico para confirmar la ausencia de ritmo cardíaco.
1. PREPARACION DE DILUCIONES
Aforar a
100mL
AGUA DURA
MUESTRA
Concentración
100%
6,25 mL
12,5 mL
25 mL
50 mL
100 mL
100 mL
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100 mL A
100 mL A
100 mL A
100 mL A
100 mL A
100 mL A
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Figura 4 Procedimiento de la prueba
Tabla 3. Resumen de las condiciones recomendadas para las pruebas de toxicidad con D.
magna
1. Tipo de Ensayo
2. Temperatura
3. Calidad de Luz
4. Intensidad Luminosa
5. Fotoperíodo
6. Volumen del Recipiente
7. Volumen de la Solución de Prueba
8. Edad de los organismos de prueba
9. No de organismos en cada vaso
10. Número de Réplicas
11. Agua de Dilución
12. Factor de Dilución
13. Duración de la Prueba
14. Efecto Medido
15. Resultado Final
16. Aceptabilidad de los Resultados
17. Control positivo
Estático
20 ± 2°C
Fluorescente, blanco-frío
10-20 μE / m2/ s (800 ± 10% lux)
16 horas luz - 8 oscuridad
Vasos de 50 mL
30 mL
< 24h
diez
Tres
Agua Dura
0.3 ó 0.5
48 h
Mortalidad (inmovilidad)
CL50
Mortalidad en el control negativo < 10%
Cr(VI) a partir de una solución de K2Cr2O7
El resumen general de las condiciones de la prueba con Daphnia magna se presenta en la
tabla 3 y en las figuras 4 y 5.
Cultivos de
Sustancias Tóxicas/
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Mantenimiento
Muestra
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Neonatos
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Preparación de
Diluciones
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Figura 5. Diagrama de flujo de las actividades vinculadas al desarrollo del protocolo de
prueba de Daphnia magna
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EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS
Calculo de la CL50
Para el cálculo de la CL50 y sus respectivos límites de confianza al 95%, se utiliza el
método Probit, ya sea manualmente o con ayuda de paquetes estadísticos que tengan
este procedimiento.
El método de análisis PROBIT permite estimar la CE50 o CL50 ajustando los datos de
mortalidad mediante una técnica de probabilidad para estimar los valores que siguen una
distribución logarítmica de tolerancias. El porcentaje de organismos afectados, o muertos
por la acción tóxica de una sustancia, se transforma a unidades Probit. Esta
transformación, permite el ajuste a una línea de regresión, en la cual la concentración
correspondiente al Probit 0.5, corresponderá a la cantidad de sustancia capaz de generar
el efecto estudiado en la mitad de la población.
Una de las restricciones del método es que para el cálculo de la CE50 o CL50 deben
obtenerse valores intermedios entre 0 y 100% de mortalidad.
Aceptabilidad de los resultados
•
•
•
La mortalidad en el control negativo no debe exceder el 10%
La concentración final de oxígeno disuelto debe ser mayor de 2 mg/L.
La CL50 para el tóxico de referencia deberá estar dentro de los límites de confianza
preestablecidos en la carta control. En caso de emplear un control positivo de
concentración cercana a la CL50, los valores de mortalidad obtenidos deberán
encontrarse cercanos al 50%. Se puede considerar aceptable el encontrar mortalidades
entre el 33 y 57% .
REFERENCIAS
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Procedimiento para la Generación de Extractos Orgánicos y
Elutriados de Suelos y Sedimentos para su Análisis en Ensayos de
Toxicidad
Yolanda Pica Granados
Gissel Trujillo Domínguez
Instituto Mexicano de Tecnología del Agua, Cuernavaca, Morelos, México
Campo de aplicación
La toxicidad medida a través de los ensayos con organismos como Daphnia magna, Vibrio
fischeri, Pseudokirchneriella subcapitata y algunos otros, está referida a los efectos
causados por compuestos en la fase soluble o solubilizados, de tal modo que en el caso de
matrices sólidas es necesario llevar a esta fase los materiales contaminantes contenidos en
los sólidos que se desean analizar (por ejemplo sedimentos, suelos y productos industriales)
aplicando un procedimiento controlado que permita el análisis de su toxicidad empleando
diversas especies de organismos de prueba sin la generación de falsos positivos. Causados
por la interferencia del tratamiento de las muestras.
Este procedimiento es aplicable en el análisis de matrices sólidas (por ejemplo suelos,
sedimentos, productos químicos, etc.) con el objetivo de extraer los compuestos tóxicos
solubilizables en los disolventes de extracción seleccionados por su posibilidad de aplicarse
en volúmenes controlados, para el desarrollo de pruebas de toxicidad.
Los resultados de toxicidad que surjan de esta clase de manejo de muestra ya sea por
medio de elutriados, de extractos orgánicos o ambos, pueden ser aplicables para
comparaciones de dosis efectos cuando se comparan con el contenido de contaminantes
(en casos en que las propiedades de polaridad de los disolventes empleados sea
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consistente para ambos), así mismo es de utilidad para zonificar los gradientes de afectación
en un sitio (por ejemplo suelos o sedimentos), o en su defecto, para el seguimiento del
comportamiento en el tiempo de un material que se sospecha tóxico (por ejemplo suelo,
sedimento o materiales diversos), entre otros. La aplicación de esta herramienta en estudios
ambientales más amplios también puede ser aplicable con fines de investigación ya que
brinda información sobre el potencial tóxico, sin embargo su interpretación requerirá de
conjuntar otras variables acordes a los objetivos de cada proyecto, de modo que la
integración y las implicaciones de dicha información deberán ser manejada por especialistas
en el tema.
Definiciones
Estas definiciones han sido adecuadas a las necesidades del procedimiento.
Elutriado: extracto acuoso
Blanco: es usado indistintamente con la palabra control.
Control negativo o blanco de procedimiento:- se asigna este término al lote o tratamiento,
dentro del diseño experimental, que replica las condiciones que afectan al conjunto de
tratamientos, excepto la sustancia o mezcla de ellas que son investigadas en la prueba.
Control positivo: se asigna este término a una muestra, dentro del diseño experimenta del
procedimiento de trabajo, cuya respuesta (CE50) y su variabilidad ha sido previamente
evaluada y calibrada a través de pruebas de toxicidad. Esta muestra se prepara tomando
como muestra materiales empleados como de referencia.
Material
Sistema de extracción Soxhlet
Vaso pp. 250 o 500 mL
Conos de papel filtro No.1 purificados
Pipetas Pasteur
Viales cromatográfico de 5 mL con tapa de rosca
Viales aforados de 5 mL
Tubos de centrífuga plástico, desechables, estériles y de fondo cónico de 50 mL con tapa
Tamiz de No. 60
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Morteros y mano de mortero
Equipo
Balanza analítica
Parrilla de extracción:
Evaporador Rotatorio Buchi
Horno de secado (40 ± 5 °C)
Plancha de calentamiento o Dispensador de nitrógeno
Refrigerador a temperatura de 4 ± 2°C
Pipetas automáticas de 1000 μL
Centrífuga
Baño ultrasónico
Reactivos
Metanol calidad HPCL, plaguicida o nanogrado
Agua destilada o desionizada
Procedimiento
Para el análisis de materiales sólidos (por ejemplo suelos, sedimentos u otros) se maneja el
material con base en peso seco para la producción de extractos orgánicos. Para la
generación de elutriados puede emplearse el material en su estado original (base húmeda o
seca).
Preparativos
Para muestras de suelo y sedimentos, y en otros casos en que esto aplique, el material es
secado a temperatura ambiente o, en su defecto, con ayuda de un horno de secado a una
temperatura de 40 ± 5 °C.
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Posteriormente el material se disgrega y se muele en mortero hasta que éste logre su paso
por un tamiz de malla del No. 60 (equivalente a 2mm de apertura de malla).
En caso de productos químicos o manufacturados cuya presentación sea en polvos, éstos
se procesan en su forma original sin molido o tamizado previo.
Una vez listo el material, se pesan idealmente 20 g, sin embargo de no haber muestra
suficiente puede emplearse cantidades de 10 gr. en adelante o incluso menores (5 g), sólo
si se sospecha que la muestra podría contener carga elevada de tóxicos.
El material, para la producción de los extractos orgánicos, se pesa llenando un cono de
papel filtro del No. 1 (12.5 cm.) donde quedarán empacados. El papel filtro se purifica con
días de anticipación empleando la extracción en Soxhlet en los mismos términos del manejo
indicado para muestras, dejándose secar a temperatura ambiente.
En el caso de la producción de elutriados, el material se pesa llenando un tubo de centrífuga
de 50 mL de material plástico esterilizado en el que se efectuará el elutriado.
Para ambos casos, extractos orgánicos o elutriados, el peso correspondiente
deberá registrarse en la bitácora del analista.
Extracción Soxhlet (extracto orgánico)
La muestra contenida en el cono de papel filtro se introduce en el vaso del sistema Soxhlet y
se monta junto con el refrigerante y el matraz de bola. El volumen del disolvente en el matraz
de bola puede variar dependiendo de la capacidad del sistema Soxhlet en uso, requerirá de
250 mL para el mas pequeño o hasta 350 mL para uno de mayor volumen.
Ajuste el volumen del disolvente considerando que al condensarse e ir goteando en el
interior del vaso del Soxhlet debe llegar al codo de vaciado sin que el matraz de bola se
vacíe. En él debe quedar siempre un excedente para evitar que el extracto se queme.
Montar el sistema Soxhlet en la parrilla de extracción. En el caso del uso de
metanol como disolvente de extracción, encender cada parrilla colocando el
indicador de temperatura en el número 5 o 6, conectar simultáneamente el
sistema de enfriamiento a una temperatura de 10 a 18 °C, cuanto más frío la
condensación será más eficiente.
En el caso de uso de metanol la extracción debe mantenerse en funcionamiento por un
tiempo de alrededor de 20 horas, que es equivalente a aproximadamente 10 o 12 ciclos de
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renovación. En caso del uso de otro disolvente, el tiempo de extracción puede variar, en
cuyo caso deberán hacerse los ajustes de tiempo, temperatura y ciclos adecuados
correspondientes.
Al término del periodo apagar las parrillas y dejar enfriar aun con el flujo de enfriamiento en
funcionamiento.
Desmontar los sistemas de extracción
Recuperar en el matraz de bola el disolvente aún contenido en el vaso.
Cubrir con papel aluminio la boca de los matraces de bola que contienen los extractos
orgánicos y mantener en refrigeración hasta que se proceda a la evaporación y
concentración del extracto. Por cada lote de muestras prepare un blanco y un control
positivo.
Evaporación
Llene el baño Maria del equipo de evaporación a un nivel que cubra los matraces de bola
una vez inmersos en él. Si el extracto es con base en metanol, caliente el baño a 40 ± 5 °C
y conecte la fuente de enfriamiento del refrigerante, cuidando que se logre una temperatura
de 10 a 18 °C.
En caso de la concentración de extractos metabólicos, acoplar una bomba de vacío
conectada al refrigerante del evaporador rotatorio.
Colocar el matraz de bola conteniendo el extracto, ajustar el seguro de la boca de
evaporador y girar a cierre la válvula de alivio del condensador del evaporador rotatorio.
Encienda la bomba de vacío y ajústela a una presión de 30 a 40 psi, simultáneamente gire la
perilla de rotación del equipo evaporador para que el matraz de bola empiece a girar. Elija
una velocidad media.
Ajuste su sistema de evaporación a fin de optimizar el proceso de concentración. Para ello
ajuste la presión, la temperatura del baño Maria y de la fuente de enfriamiento tomando
como base la siguiente información. Cuanto menor es la presión que se emplea se requiere
manejar la temperatura del baño en el límite máximo aceptable (45 °C) y la de enfriamiento
en los niveles más bajos mientras que cuando la presión es mayor podemos emplear una
menor temperatura en el baño y un enfriamiento de temperatura media dentro del ámbito
óptimo señalado.
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Cuando el volumen del disolvente sea alrededor de 2 mL, detenga la rotación
de la bola, apague la bomba de vacío y gire la válvula de alivio del condensador
para abrirla y liberar el vacío. Una vez hecho lo anterior podrá retirar el matraz
de bola y colocar el siguiente.
Trasvasado
Enjuague los viales de 5 mL con metanol y deje secar.
Transfiera el concentrado contenido en el matraz de bola a un vial de 5 mL empleando una
pipeta Pasteur (no las reutilice). Tome volúmenes adicionales de disolvente limpio (por
ejemplo metanol) para limpiar las paredes del matraz, recupérelo y adiciónelo también al vial
junto con el concentrado previamente trasvasado.
Reduzca los volúmenes del concentrado del extracto colocando los viales sobre una parrilla
tibia, logre la temperatura idónea sólo encendiendo la parrilla sin seleccionar niveles de calor
(aproximadamente 30- 45 °C). También puede hacerse uso de flujo de nitrógeno para su
concentración. Cuando el nivel del volumen en el vial se reduzca a la mitad de su capacidad,
podrán adicionarse los nuevos volúmenes que resulten de los enjuagues posteriores del
matraz de extracción. Enjuague este recipiente hasta que las paredes queden limpias,
siempre incorporando el disolvente al vial con el concentrado. Una vez terminada la limpieza
del matraz deje reducir el volumen del concentrado contenido en el vial hasta alcanzar
aproximadamente 3 mL.
Cubra y guarde los viales en refrigeración hasta su análisis en pruebas de toxicidad.
Preparativos para pruebas de toxicidad de extractos orgánicos
Transfiera el volumen de los viales conteniendo el concentrado a viales aforados. Emplee
enjuagues al vial original usando disolvente limpio (por ejemplo metanol), adicione al vial
aforado hasta alcanzar el nivel de 4 mL.
Para preparar su sistema de prueba emplee como volumen máximo del extracto orgánico, un
volumen menor o igual a la concentración de disolvente (% v/v) correspondiente al nivel de
efecto no observable (NOEC), el cual deberá haber sido previamente determinado. Dentro del
sistema de prueba, la manera de demostrar una adecuada selección de los volúmenes de
disolvente a niveles que no generan falsos positivos es a través de la respuesta obtenida del
análisis de toxicidad del Blanco de procedimiento, el cual deberá no presentar efecto en las
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pruebas de toxicidad, o en su defecto éste no deberá ser mayor al efecto observado en el
control negativo.
Para el caso del metanol, la concentración máxima de este disolvente en el sistema de
prueba que se establece como recomendable para D. magna, V. fischeri e Hydra attenuata,
debe ser ≤ 1.2%. En caso de P. subcapitata éste debe ser ≤ 0.1%.
Tomando como ejemplo el sistema de prueba con V. fischeri, cuyo volumen final en el
preparado de la concentración inicial es de 2750 μL, que se logra al adicionar 250μL de
solución de ajuste osmótico (MOAS) y 2500mL de la muestra, entonces se tendría que hacer
el siguiente preparado:
Adicionar los 250 μL de MOAS a la celdilla que contendrá la máxima concentración.
Posteriormente adicionar 2500 μL de agua de reconstitución. Mezclar con ayuda de la
micropipeta de 1000 μL, succionando y eyectando el líquido tres veces. Con ayuda de una
micropipeta de volumen variable ajustada a 30 μL, succionar ese volumen de la celdilla en
preparación, de modo que quede a 2720 μL su llenado.
Posteriormente restituir el volumen, nuevamente a 2750 μL, adicionando 30 μL del
concentrado del extracto orgánico.
Bajo este esquema de preparación de la muestra, se logra una concentración de metanol en
el sistema de prueba de 1.09% (v/v), menor al máximo recomendado.
Para efectuar los cálculos de la concentración inicial del sedimento en el sistema de prueba
ver la sección de manejo de resultados de este ensayo.
Elutriados
El material contenido en los tubos de centrífuga deberá asentarse al fondo del recipiente.
Esto se logra golpeando ligeramente la base del tubo sobre una superficie. Al terminar mida
el volumen que ocupa el material leyendo en la escala que presentan los tubos. Anote el
dato en la bitácora junto con el registro del peso correspondiente.
Mezclar el sedimento con agua destilada en una relación máxima de 1:4 (una parte de
sedimento por cuatro de agua) haciendo uso de la lectura del volumen que ocupa el material
de la muestra para establecer las proporciones. Puede elegir el uso de relaciones de
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volumen menores, tal como 1:2 o 1:3. Considere que la limitante será la capacidad del tubo a
50 mL.
Cierre los tubos y agite vigorosamente a fin de mezclar homogéneamente el material en el
agua y anote el volumen adicionado junto con los datos anteriormente señalados.
Posteriormente puede colocar los tubos en una parrilla de agitación o en su defecto emplear
un baño ultrasónico.
En caso de usar baño ultrasónico, llene la tina a la capacidad correspondiente, introduzca los
tubos y cúbralos manteniéndolos sumergidos en el agua hasta el nivel de la base de su tapa.
Ajuste el baño ultrasónico para su funcionamiento por 60 minutos sin calentamiento, tiempo
que los tubos deberán permanecer en su interior.
Al término de una hora de agitación o sonicación apague los instrumentos y saque los tubos.
Déjelos reposar en posición vertical dentro de un refrigerador para su sedimentación.
Por cada lote de muestras o número de control monte un blanco y un control positivo.
Previo al desarrollo de pruebas de toxicidad, coloque los tubos en
centrifugación por un tiempo de 15 minutos a una velocidad de 2000 a 4000
rpm hasta que aparezca el sedimento.
Detenga la centrifugación y emplee el sobrenadante acuoso (elutriado) para el desarrollo de
pruebas de toxicidad obteniendo los volúmenes necesarios succionando el líquido sin
resuspender el sedimentado.
Debido a que el elutriado es un extracto acuoso el procedimiento de prueba podrá
desarrollarse de la misma forma en que se llevan a cabo las pruebas de toxicidad rutinarias.
Para efectuar los cálculos para determinar la concentración inicial emplee las guías
correspondientes indicadas en la sección de manejo de resultados de este procedimiento,
haciendo los ajustes de volúmenes y pesos que correspondan.
Precauciones
Cuidar que los materiales empelados en la producción de extractos o elutriados estén
siempre libres de tóxicos.
Cuidar que a lo largo del procedimiento para la elaboración de extracto orgánico, no se
adicione a éste agua que puede incorporarse por condensación en los refrigerantes del
sistema Soxhlet o por un inadecuado secado de la muestra.
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Cuidar que durante la extracción, la cantidad de disolvente siempre sea la suficiente para
alcanzar el nivel de vaciado del vaso del Soxhlet, a fin de que se mantengan los ciclos de
renovación de extracción funcionando, de otra manera se quemará el extracto contenido en
el matraz de bola. En caso de que éste no alcance el nivel necesario puede adicionarse más
disolvente al matraz de bola cuidando de apagar la parrilla y dejar enfriar previamente.
Cuidar que la temperatura del agua empleada para enfriar los refrigerantes se mantenga en
un intervalo adecuado para promover la condensación del disolvente. En el caso de metanol
se recomienda manejar una temperatura de 10- 18 °C. De emplearse otro disolvente deberá
ajustarse a la temperatura que convenga de acuerdo a su volatilidad, evitando siempre la
pérdida del disolvente de extracción. Para el enfriamiento puede emplearse un baño de
recirculación de agua o en su defecto agua directa de la toma.
Cuidar que al término o al inicio de cada lote extraído o por extraer en el sistema Soxhlet, se
efectúe un enjuague con acetona (grado HPLC, nanogrado o plaguicidas) y posteriormente
con metanol (grado HPLC, nanogrado o plaguicida) con el objetivo de evitar contaminación
cruzada.
Cuidar que mientras el sistema Soxhlet no esté en uso, se protejan las entradas de los
refrigerantes con papel aluminio para aislar de polvos.
Cuide que durante el uso del evaporador rotatorio se maneje un balance de las variables de
presión y temperatura del baño María a fin de evitar que el extracto de la muestra se
proyecte en el interior del condensador y lo contamine, o en su defecto, se provoque la
pérdida del extracto.
Cuide que durante la reducción de volúmenes durante el trasvasado de la muestra a los
viales de 5 mL si emplea parrilla de calentamiento, ésta se encuentre sólo tibia, de lo
contrario el concentrado se proyectará y la muestra se perderá.
En el caso de la producción de elutriados, etiquete los tubos escribiendo
directamente sobre la pared o la tapa del mismo con plumón indeleble ya que
las etiquetas de papel pueden desintegrarse en el baño ultrasónico.
Manejo de resultados
Consideraciones para los cálculos de concentración.
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Tomando en cuenta que en el caso de la producción de extractos orgánicos, el volumen de
concentrado que se emplea para el análisis de toxicidad será sólo una porción del
concentrado, deberemos hacer los ajustes y cálculos necesarios para expresar
adecuadamente el resultado.
Continuando con el ejemplo de la prueba con V. fischeri, en el que se empleó una proporción
de 30 μL de un volumen total del concentrado de 4 mL obtenidos a partir de un peso inicial de
la muestra que para fines del ejemplo será de 20 g, entonces podemos decir que la
concentración inicial, expresada con mg Eq/mL, en la máxima concentración preparada sería
de 54.54 mg Eq/mL, a partir de los siguientes cálculos:
20 g
150mg
* 1000 =
4000 μL
ml
30 μL
150mg
mL = 54.54mgEq
2750mL
mL
Donde:
20 g = Peso inicial del material extraído
4000 μL = Volumen del concentrado del extracto
30 μL = Volumen del concentrado del extracto adicionado al sistema de prueba para análisis
de toxicidad
2750 mL = Volumen total de la solución en el sistema de prueba.
La concentración obtenida debe ser expresada anteponiendo el término “Equivalentes”, que
se expresa como Eq. (54.54 mg Eq/mL). Se introduce esta modalidad ya que debe
considerarse que la concentración obtenida está referida a una cantidad de material que fue
extraída, de modo que en realidad los organismos de prueba se exponen al material soluble o
extractado cuya cantidad no es posible determinar, sin embargo esta es relativa al peso
medido del material trabajado.
Las concentraciones de las diluciones subsecuentes tendrán que afectarse por el factor de
dilución empleado para su preparación.
Interpretación de resultados
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Los resultados de la prueba al concentrado del control negativo o blanco de procedimiento,
proveen información útil para detectar la posibilidad de falsos positivos, ya que a través de su
análisis se determina la contribución que el proceso de manejo de muestras, ya sea por
producción de extractos o elutriados, tiene sobre la respuesta tóxica obtenida en pruebas de
toxicidad, así como la del posible efecto que pueda causar la adición de volúmenes de
disolvente en el sistema de prueba.
Con fines de aceptación de los resultados, las pruebas de toxicidad del blanco de
procedimiento deberán demostrar que no hay efecto, o que éste no es mayor al efecto
observado en el control negativo. Esto indicará que el proceso de manejo de muestra así
como el volumen de disolvente adicionado al sistema de prueba no contribuye a la toxicidad
ni a la generación de falsos positivos.
El control positivo permitirá controlar la efectividad del proceso de extracción de tal manera
que la respuesta de la prueba de toxicidad del concentrado o elutriado deberá encontrarse
en una concentración previamente determinada para el material de referencia, tanto en el
caso del elutriado como del extracto orgánico.
Referencias
Ho. T.Y. H. y G. J. Quinn. 1993. Physical and Chemical Parameters of sediment extraction
and fractionation that influence toxicity as evaluated by Microtox. Environmental Toxicology
and Chemistry. 12:615-625.
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Jonson T. y E. R. Long. 1998. Rapid toxicity assessment of sedimets from estuarine
ecosystems, a new tandem in vitro testing aproach. Environmental Toxicology and
Chemistry. 17 (6) 1099-1106.
Pica-Granados Y., R.I. Huerto-Delgadillo, D. G. Trujillo, S. H. Hernández y O.U. Bucio.
1998. Control integral de lirio acuatico e implicaciones toxicologicas en el lago de Chapala.
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Proyecto CONACyT 0768P-B. Subcoordinación de Hidrobiología y Evaluación Ambiental.
Coordinación de Tratamiento y Calidad del Agua. Instituto Mexicano de Tecnología del
Agua. México. Vol II: 58pp
Secretaria de Comercio y Fomento Industrial. 1995. Norma Mexicana NMX-AA-112SCOFI. Análisis de agua y sedimentos. Evaluación de toxicidad aguda con Photobacterium
phosphoreum. Método de pruebas DGN. Pag. 36.
Sveson A., T. Vikor y M. Remberger. 1997. Toxicity of elemental sulfur in sediments 1998.
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Wang C., Y. Wang, Z. Mo y Z. Wang. 2003. Ecotoxicological Examination of sediment
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Aseguramiento y Control de Calidad de Ensayos de Toxicidad
María Consuelo Díaz Báez
Unidad Académica de Ingeniería Ambiental, Facultad de Ingeniería, Universidad Nacional
de Colombia, Bogotá, Colombia
Yolanda Pica Granados
Instituto Mexicano de Tecnología del Agua
Maria Cecilia Sobrero
Centro de Investigaciones del Medio Ambiente, CIMA, Facultad de Ciencias Exactas,
Universidad Nacional de La Plata. Argentina
Este procedimiento se reproduce con permiso, del libro G. Castillo (ed.). 2004. Ensayos
Toxicológicos y Métodos de Evaluación de Calidad de Aguas. Estandarización,
intercalibración, resultados y aplicaciones. IDRC/IMTA. 202 pp.
_________________________________________________________________
Campo de aplicación
Un elemento importante en el muestreo y análisis de muestras ambientales es utilizar
métodos aprobados y estandarizados; sin embargo, este hecho por si solo no es suficiente
para lograr resultados analíticos exactos y confiables. Interferencias de la matriz utilizada,
fallas de equipos y errores de los analistas pueden llevar a inexactitudes en los resultados.
En el caso de las pruebas de toxicidad, la calidad analítica es un reto complejo porque no
sólo los factores mencionados anteriormente afectan la confiabilidad de los resultados, sino
que además otra serie de factores como la variabilidad natural de las poblaciones de
prueba, el estado fisiológico de los individuos o las condiciones ambientales mantenidas
durante las determinaciones, pueden contribuir a aumentar la variabilidad de los
resultados.
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Pese a ello, es necesario contar con resultados confiables y reproducibles, por lo que los
laboratorios deben desarrollar programas de control de calidad que aseguren la exactitud
de los datos obtenidos. La validación y aprobación de los resultados obtenidos en
bioensayos requieren de un programa de aseguramiento y control de calidad (ACC) bien
diseñado y aplicado regularmente. Este programa debe generar valores que puedan
probarse técnicamente y defenderse legalmente.
En el presente capítulo se definen los procedimientos de control de calidad y las
actividades obligatorias que deben realizarse durante las pruebas de toxicidad. Estas
actividades son de dos tipos, unas de manejo y otras de funcionamiento. Las primeras se
refieren a los planes operativos donde se especifican los procedimientos estandarizados y
los resultados reportados con un alto nivel de confianza, y las segundas al conjunto de
medidas que se toman durante la aplicación de los protocolos de análisis. Estos
procedimientos permiten un adecuado aseguramiento y establecen la calidad de las
determinaciones del laboratorio a través de evaluaciones internas y externas de control.
Esto último incluye el análisis del comportamiento de las muestras evaluadas, así como la
comparación de los resultados entre laboratorios y la realización de auditorías.
Programas de aseguramiento de calidad
Un programa de aseguramiento de calidad, no sólo es necesario para la producción de
datos sino además debe ser la guía de operación del laboratorio. El programa debe
concretarse en el diseño de un plan de trabajo consignado en un manual operativo. El plan
debe ser suficientemente extenso para que pueda aplicarse a la mayoría de las actividades
que se llevan a cabo y a su vez suficientemente flexible para permitir cambios ocasionales
cuando sea necesario. En él se debe incluir la organización del laboratorio, los objetivos de
calidad en relación a precisión y exactitud, los procedimientos de muestreo y custodia de
las muestras, los protocolos de prueba, los procedimientos de calibración (especificando
los métodos utilizados para determinar la precisión y exactitud de los resultados, validación
y reporte de los resultados) y los sistemas de auditoria.
Protocolos de prueba
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Uno de los problemas relacionados con los programas de control de calidad de pruebas de
toxicidad es la existencia de un gran número de pruebas, muchas de las cuales no han
sido estandarizadas. Sólo algunas de ellas han sido aprobadas y validadas por
organizaciones como las agencias de Protección Ambiental de Estados Unidos (USEPA) y
Canadá (Environment Canada) que cuentan con metodologías que pueden ser
incorporadas al trabajo de rutina de cualquier laboratorio.
Aunque varios de los ensayos recomendados en el documento no han sido incorporados
oficialmente por las mencionadas agencias, en el presente capítulo se definen algunos
elementos de control necesarios para su aplicación a muestras de agua potable, aguas de
poro de sedimentos, suelos y lodos, aguas superficiales y subterráneas, aguas residuales
industriales y domésticas.
Varios de los métodos recomendados por la USEPA para análisis toxicológicos de
muestras de agua se consignan en los siguientes documentos:
Methods for measuring the Acute Toxicity of Effluents to Freshwater and Marine
Organisms, EPA 600/4-90/027F, 1993, 4th Edition.
Short Term Methods for Estimating the Chronic Toxicity of Effluents and Receiving Waters
to Freshwater Organisms, EPA 600/4-91-002, 1994, 3rd Edition.
También, la American Society for Testing Materials (ASTM) ha publicado un gran número
de métodos de aplicación en ecotoxicología, y la International Organization for
Standardization (ISO) y la Organization for Economic Co-operation and Development
(OECD), de la cual forman parte muchos países de Europa y Norteamérica, han publicado
un gran número de métodos de aplicación en ecotoxicología desde los primeros años de la
década de los ochenta.
En general, los trabajos realizados por estas agencias han permitido concluir que “los
análisis de toxicidad son herramientas que al ser usadas conjuntamente con las
mediciones químicas y ecológicas, permiten identificar, cuantificar y generar criterios para
el control de la descarga de contaminantes tóxicos”.
Países como Canadá han incorporado dentro de sus regulaciones la aplicación de ensayos
de toxicidad. Entre las principales se pueden mencionar: el Acta de Pesca (Fisheries Act),
el Acta de Protección Ambiental [Canadian Environmental Protection Act (CEPA)], el Acta
para Transporte de Productos Peligrosos (Transportation of Dangerous Goods Act), el Acta
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para los productos usados en el Control de Plagas (Pest Control Products Act), así como
muchas otras actas del gobierno federal.
Calibración de instrumentos y soluciones en el laboratorio
Un elemento importante en los programas de control de calidad es contar con instrumentos
confiables. Por ello, debe mantenerse un programa de mantenimiento, calibración y
verificación periódica para todos los equipos en uso.
Cuando se utilizan equipos o instrumentos en los que se requieren soluciones de
referencia, pesas u otros artefactos para su calibración, es necesario que estos medios de
calibración sean certificados.
En el caso de emplear estándares de referencia, la solución patrón debe ser previamente
valorada con referencia a una solución o reactivos certificados.
Materiales y reactivos del laboratorio
Material de vidrio
En el comercio es posible encontrar diferentes calidades de material de vidrio, por lo que
es importante tener en cuenta el tipo y grado requerido para cada una de las actividades
que se van a desarrollar. Igualmente, como en muchas de las pruebas se realizan
diluciones, es necesario contar con material volumétrico clase A calibrado que asegure la
medición de los volúmenes medidos en forma precisa.
Además del cumplimiento de las características requeridas del material de vidrio, debe
contarse con procedimientos adecuados de limpieza, que en muchos casos dependen de
los parámetros a determinar. Por esta razón, el laboratorio deberá contar con
procedimientos detallados para la limpieza, almacenamiento y protección del material.
Reactivos
A nivel comercial existe un gran número de reactivos que son fabricados con diferentes
grados de pureza. Por ello, la selección cuidadosa del grado requerido de los reactivos a
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utilizar en este tipo de pruebas es de gran importancia. En el desarrollo de pruebas de
toxicidad se recomienda utilizar reactivos que cumplan los requerimientos establecidos por
la American Chemical Society para reactivos analíticos, grado ACS.
Los reactivos empleados como compuestos tóxicos de referencia deberán ser de uso
exclusivo para la preparación de una solución patrón, tener un grado de pureza de cuando
menos 99.5%, con certificado.
La mayoría de las pruebas de toxicidad y el mantenimiento de cultivos, requiere, de agua
Tipo I, (APHA, 1998) la cual no contiene compuestos o elementos en concentraciones
detectables.
Compuestos tóxicos de referencia
Un compuesto tóxico de referencia es una sustancia orgánica o inorgánica utilizada en
pruebas de toxicidad con fines de control de calidad analítica de los organismos a utilizar
en las pruebas.
Para ello, en la etapa inicial del montaje de un método de prueba, debe seleccionarse un
compuesto soluble, de pureza igual o mayor al 99%, al cual se le realicen pruebas de
toxicidad para una especie determinada, con el fin de establecer el intervalo de
concentración del compuesto seleccionado que produce el efecto esperado. Una vez
definido el patrón de la relación dosis-respuesta para el compuesto elegido, puede ser
empleado como compuesto tóxico de referencia.
El registro histórico de la respuesta al compuesto tóxico de referencia, expresada a través
de los valores de CL50 /CI50 /CE50, es de utilidad para el control del estado fisiológico de los
organismos empleados y sirve de evidencia para demostrar la estabilidad de su respuesta
biológica.
En la literatura se mencionan muchos compuestos que pueden emplearse como
compuestos tóxicos de referencia. La USEPA (1993), cita el empleo de cloruro de sodio
(NaCl), cloruro de potasio (KCl), cloruro de cadmio (CdCl2), sulfato de cobre (CuSO4),
dodecil sulfato de sodio (SDS) y dicromato de potasio (K2Cr2O7). Otras agencias como
Environment Canada recomienda al Zinc(II) como compuesto tóxico de referencia
inorgánico y al fenol para sustancias orgánicas; sin embargo, estos compuestos pueden
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sustituirse por otros dependiendo de la especie de prueba, la matriz utilizada y los puntos
finales medidos.
La precisión de los resultados de las pruebas de toxicidad en el laboratorio es calculada a
través de la confección de cartas o gráficas de control. Estas gráficas, son una herramienta
que permite determinar la variabilidad de los resultados y en consecuencia definir la aptitud
de un laboratorio para obtener resultados confiables.
Cartas de control de calidad
La carta control es la herramienta de registro que brinda los elementos de juicio para
establecer los intervalos aceptables de variación de la respuesta de los organismos de
prueba a un compuesto tóxico de referencia, con un margen de confianza del 95%. Esta
carta es el medio de referencia para evidenciar el control de la sensibilidad de la especie
empleada, de la estabilidad de la respuesta biológica y de la repetibilidad (exactitud) de los
resultados obtenidos.
La carta control se genera a partir de los resultados de pruebas sucesivas con el
compuesto tóxico de referencia seleccionado, para el cual de obtiene el valor de la
concentración de efecto medio (CL50 /CI50 /CE50). Inicialmente ésta puede ser construida
con un mínimo de cinco datos y posteriormente se debe continuar realizando ensayos con
el compuesto tóxico para ingresar mensualmente nuevos valores hasta completar una
serie de veinte resultados.
Los valores se van integrando a manera de puntos en un gráfico que relaciona el número
de ensayo, ubicado en el eje X o abscisa, y el valor de la concentración de efecto medio
(CL50 /CI50 /CE50), en el eje Y u ordenada (figura A.1). Posteriormente los valores son
empleados para el cálculo del valor promedio y la desviación estándar (σ) de la población
de datos. Con estos parámetros estadísticos se calculan los valores límite (superior e
inferior) que definen el intervalo de variación aceptable o intervalos de confianza (95%) en
el que deberán encontrarse los valores de CL50 /CI50 /CE50 obtenidos para futuros ensayos
con el compuesto tóxico de referencia.
Los valores del límite superior e inferior se obtienen al adicionar o sustraer,
respectivamente, del promedio dos desviaciones estándar de acuerdo a:
Concentración limite superior = Promedio + 2σ
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Concentración limite inferior = Promedio - 2σ
Para la elaboración de las cartas control se debe preparar una solución estándar del
compuesto tóxico de referencia seleccionado, empleando reactivos con pureza mínima del
99.5% y material volumétrico clase A calibrado.
Con la solución estándar del compuesto tóxico, se preparan diluciones para obtener una
serie de concentraciones de manera que se logre obtener al menos dos valores de efecto
mayores al 50 % y dos más menores a dicho porcentaje. En general, es de esperar que la
serie de concentraciones utilizada produzca a través del tiempo la misma respuesta en
cada concentración. Se procede a calcular el punto final de la prueba (CL50 /CI50 /CE50)
utilizando cualquiera de las técnicas estadísticas recomendadas. La carta control es
utilizada para evaluar la tendencia de los resultados, por lo que el promedio acumulado y
los límites de confianza son recalculados con cada nuevo dato obtenido. Después de dos
años de colección de datos, o de 20 evaluaciones, la carta control se mantiene usando
solamente los 20 datos más recientes. En general, se recomienda realizar pruebas
mensuales con los compuestos tóxicos seleccionados; sin embargo, algunos laboratorios
prefieren llevar a cabo ensayos con mayor frecuencia.
Los valores de la CL50/CI50/CE50 fuera del intervalo establecido son indicativos de algún
cambio en la consistencia metodológica o de alteración de la sensibilidad de los
organismos. En el caso de análisis de puntos finales como la CL50, CI50, y la CE50 se
espera que por azar y con una probabilidad asociada de P0.05, sólo uno de los veinte
ensayos caiga fuera de los límites establecidos.
Si en más de un ensayo con los compuestos tóxicos de referencia el valor cae fuera de los
límites, los resultados de las pruebas efectuadas deben considerarse provisionales y
sujetos a confirmación. Si el problema persiste y el valor de CL50 /CI50 /CE50 del compuesto
tóxico de referencia se aleja significativamente del intervalo esperado, deberá realizarse
una revisión de la sensibilidad de los organismos de prueba y eliminar los datos generados
bajo estas circunstancias.
En este caso, se debe revisar cuidadosamente el procedimiento y repetir las pruebas con
un nuevo lote de organismos.
El comportamiento de las gráficas de control puede cambiar en el tiempo, reduciéndose los
intervalos de variación en la medida en que se adquiere habilidad en el manejo de los
procedimientos de prueba. Bajo este esquema también es factible que se obtengan valores
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fuera de los nuevos límites; sin embargo, la incidencia de estos casos no deberá ser mayor
del 5%.
Considerando lo anterior es responsabilidad de cada laboratorio demostrar, a través de la
generación de estos gráficos, su capacidad para obtener resultados confiables, antes de
llevar a cabo pruebas con muestras de aguas o efluentes. En este sentido, la precisión
intra-laboratorio de cada procedimiento de prueba se debe expresar en términos del
coeficiente de variación (CV%), calculado a partir de:
⎡⎛ σ ⎞
⎤
CV = ⎢⎜
⎟ * 100⎥
⎣⎝ media ⎠
⎦
Este valor se establece realizando un mínimo de cinco o más ensayos con diferentes lotes
de organismos, el mismo compuesto tóxico de referencia, iguales concentraciones, las
mismas condiciones y el mismo análisis de datos.
En la tabla A.1 se presenta un ejemplo para la elaboración de una carta de control (figura
A.1) para pruebas con Daphnia magna utilizando como compuesto tóxico de referencia al
cromo (VI).
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Tabla A.1. Resultados de CL50 obtenidos a
(VI) como compuesto tóxico de referencia.
Número de
CL50-48h
(mg Cr(VI)/L)
Bioensayo
1
0.16
2
0.18
3
0.17
4
0.19
5
0.16
6
0.17
7
0.18
8
0.18
9
0.17
10
0.18
11
0.16
12
0.17
13
0.16
14
0.17
15
0.18
16
0.16
17
0.16
18
0.17
19
0.17
20
0.17
Promedio
0.1705
Desviación
0.0089
Estándar
CV (%)
5.20
48 horas con Daphinia magna utilizando cromo
Límites de confianza al 95%
(mg Cr(VI)/L)
0.15 – 0.18
0.16 – 0.19
0.16 – 0.19
0.18 – 0.20
0.15 – 0.17
0.16 – 0.19
0.17 – 0.19
0.16 – 0.19
0.16 – 0.18
0.17 – 0.19
0.15 – 0.18
0.16 – 0.18
0.15 – 0.17
0.16 – 0.19
0.16 – 0.19
0.15 – 0.17
0.15 – 0.18
0.15 – 0.18
0.16 – 0.18
0.16 – 0.18
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CL50-48h (mg Cr +6 /L)
0.2
0.19
Promedio + 2s= 0.18
0.18
0.17
Promedio = 0.17
0.16
0.15
Promedio - 2s= 0.15
0.14
0.13
0.12
0.11
0.1
0
5
10
15
20
Número del Bioensayo
Figura A.1. Carta control para Daphnia magna usando cromo VI) como compuesto tóxico
de referencia.
Preparación de soluciones de control
Control Positivo
Generalmente, como control positivo se utiliza una solución del compuesto tóxico de
referencia con una concentración cercana a la CL50/CE50/CI50. Para su elaboración, se
prepara inicialmente una solución estándar con una alta concentración, a partir de la cual se
preparan soluciones menos concentradas, utilizando como diluente agua dura reconstituida
(USEPA, 1993) o el medio recomendado para cada prueba. En todos estos procedimientos
se debe emplear para la preparación de los compuestos tóxicos de referencia reactivos con
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pureza mínima del 99.5% y material volumétrico clase A calibrado. Estas diluciones deben
prepararse hasta obtener una concentración cercana al valor promedio de la CL50/CE50/CI50
obtenida en cada laboratorio.
Preparación de las soluciones para determinación de la CL50/CE50/CI50 del compuesto tóxico
de referencia
Cada laboratorio debe conocer el patrón de respuesta de sus organismos al compuesto
tóxico de referencia, lo cual permitirá determinar las concentraciones óptimas para elaborar
la curva dosis-respuesta.
Para determinar el volumen de solución estándar necesario para la preparación de la
concentración de interés, puede emplearse la siguiente regla:
Vi * Ci =V f *C f
Donde:
Vi y Vf = volúmenes iniciales y finales
Ci y Cf = concentraciones iniciales y finales
Se recomienda hacer verificaciones periódicas de la concentración del compuesto tóxico,
dado que fenómenos de volatilización, evaporación, etc., pueden afectar la concentración del
compuesto en la solución.
Preservación de las soluciones del compuesto tóxico de referencia
Las soluciones del compuesto tóxico de referencia deben mantenerse en frascos ámbar o
protegidos de la luz con cubierta de papel aluminio a una temperatura de 4 ± 2 ºC
(refrigeración). En estas condiciones de preservación, la solución de prueba puede
perdurar por más de 45 días y la solución estándar por más de 6 meses. Mientras no se
detecten resultados fuera de los límites normales de respuesta indicado por la carta control
del compuesto tóxico de referencia, los patrones podrán usarse por un prolongado período
de tiempo. Sin embargo, se sugiere efectuar su renovación a los 45 días y 6 meses,
respectivamente. Es importante también, realizar la valoración química de la solución de
prueba.
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Preparación del control negativo
El control negativo corresponde a una solución del medio de cultivo del organismo, o puede
utilizarse agua reconstituida con las características de pH, dureza y alcalinidad óptimas para
el desarrollo de los organismos o agua salina, como en el caso de Vibrio fischeri. Cualquiera
que sea la solución seleccionada existe un porcentaje de efecto máximo que no debe ser
superado durante las pruebas. Para la preparación de estos controles se debe seguir los
procedimientos recomendados en cada una de las pruebas.
Blanco de procedimiento
Cuando las muestras son sometidas a un proceso de extracción o concentración previo a un
análisis de toxicidad, se recomienda incluir un blanco de procedimiento por cada lote de
muestras. La preparación del blanco depende del método aplicado; sin embargo, se debe
seguir todo el protocolo establecido para la muestra. La toxicidad resultante en este blanco
no debe exceder el 10% (APHA, 1998), en caso contrario los resultados quedan invalidados,
pues la respuesta estaría indicando interferencias producto del procesamiento de la muestra.
Replicabilidad y sensibilidad
La sensibilidad de las pruebas depende del número de réplicas por concentración, nivel de
significancia establecido y tipo de análisis estadístico que se lleve a cabo. Por esta razón,
cuando la variabilidad permanece constante, la sensibilidad de la prueba puede
incrementarse aumentando el número de réplicas. Sin embargo, el mínimo número de
réplicas variará con los objetivos de la prueba y el método estadístico seleccionado para el
análisis de los datos.
Existen muchos factores que pueden afectar el éxito y la precisión de un ensayo de
toxicidad, los más importantes son:
Experiencia y habilidad del analista
Edad, condición y sensibilidad de los organismos de prueba
Calidad del agua de dilución
Control de temperatura
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Calidad y cantidad de alimento suministrado a los organismos
Por tanto, los resultados dependen del origen y tipo de las especies utilizadas y de las
condiciones bajo las cuales se llevan a cabo las pruebas, tales como temperatura, oxígeno
disuelto, alimento y calidad del agua de dilución. Igualmente, la replicabilidad y precisión
serán función del número de organismos utilizados por concentración.
La capacidad del personal del laboratorio para obtener resultados consistentes y precisos
debe demostrarse con el compuesto tóxico de referencia, antes de llevar a cabo pruebas con
muestras. La precisión para cada prueba debe establecerse por lo menos con cinco ensayos
con el tóxico de referencia.
Muestras duplicada
Las muestras duplicadas corresponden a muestras colectadas al mismo tiempo en una
misma fuente. Cuando se colectan menos de cinco muestras no es necesario tomar
duplicados. Cuando el número de muestras está entre 5 y 10 se debe tomar una muestra por
duplicado; si son más de 10 se debe tomar el 10% del total de muestras como duplicados.
Cada muestra duplicada debe procesarse y ensayarse bajo las mismas condiciones de las
otras muestras.
Los resultados de CE50/CL50/CI50 obtenidos de muestras duplicadas de una muestra deben
ser analizados mediante una prueba estadística para establecer si las diferencias
observadas son o no estadísticamente significativas (APHA, 1992).
Este análisis puede efectuarse de forma manual siguiendo el desarrollo que se muestra a
continuación:
Cálculo de factores
Réplica1
CE 50 ⋅1
F1 =
Min ⋅ IC ⋅1
Réplica 2
CE 50 ⋅ 2
F2 =
Min ⋅ IC ⋅ 2
Donde:
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F = Factor para establecer los límites, con un 95% de confianza, del valor de CE50
CE50 = definido como CE50 en el reporte impreso de la prueba en caso de emplear los
programas de cálculo automáticos
Min IC = límite inferior del intervalo de confianza
Relación de factores
F1, 2,3 = Anti log (log F1 ) 2 + (log F2 ) 2 + (log F3 ) 2
Relación entre los valores de CE50 de las réplicas de acuerdo a:
CE50 max
CE50 min
Significancia
A partir de los cálculos anteriores, si la resultante de CE50 max/CE50 min excede el valor
obtenido para F1,2, entones las diferencia entre las CE50 de las muestras replicadas es
significativa, mientras que en el caso de ser menor o igual la diferencia será no significativa.
Puntos finales
El objetivo de un ensayo de toxicidad en una muestra de agua, efluente o compuesto puro es
estimar la concentración segura o concentración a la cual no se observa efecto; sin
embargo, este término es más un concepto biológico que un resultado estadístico, por lo que
los resultados aquí utilizados serán: la concentración más alta a la cual no se observa efecto
(NOEC); la concentración más baja a la que se observa efecto (LOEC), la concentración
efectiva (CE) la cual corresponde a una estimación de la concentración del compuesto tóxico
que puede causar un efecto adverso observable mediante una respuesta discreta en un
porcentaje dado de organismos; concentración letal (CL) la cual corresponde a la
concentración del tóxico o efluente o muestra que causa la muerte a un determinado
porcentaje de la población expuesta y concentración inhibitoria (CI) la cual corresponde a la
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concentración del compuesto tóxico, muestra o efluente que puede producir una reducción
de una respuesta biológica en una población expuesta.
El valor de la CL50/CE50/CI50 se debe obtener tanto para el compuesto tóxico de referencia
como para las muestras simples o duplicadas. Para el cálculo de la CL50/CE50/CI50 se puede
utilizar técnicas de estimación de punto como los métodos Probit, Spearman-Karber, Gráfico,
etc., para lo cual se puede utilizar programas computacionales especialmente diseñados. Un
ejemplo es la versión de la USEPA Probit 1.5.
Referencias.
American Public Health Association (APHA). 1992. Standard Methods for the Examination
of Water and Wastewater. 18th ed. Washington D.C.. Ap. 8010G. pag 8-20-8-23.
American Public Health Association (APHA). 1998. Standard Methods for the Examination
of Water and Wastewater. 20th ed. Washington D.C.
United Sates Environmental Protection Agency (USEPA). 1993. Methods for Measuring the
Acute Toxicity of Effluent and Receiving Waters to Freshwater and Marine Organisms. 4th ed.
Weber, C.I., Ed., EPA-600/4-90-027.
United States Environmental Protection Agency (USEPA). 1994. Short Term Methods for
Estimating the Chronic Toxicity of Effluents and Receiving Waters to Freshwater
Organisms. 3rd ed. EPA 600/4-91-002.
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PREPARACIÓN DE TOXICOS DE REFERENCIA
Proyecto:
Pruebas biológicas para la evaluación ecotoxicológica de sustancias químicas”,
1. Daphnia magna
Pesar 0.045 g de (K2Cr2O7) Dicromato de potasio y llevar a 100m L con AGUA DESTILADA para
el preparado de solución de 160 ppm como Cromo VI
A partir de esta concentración se prepararán soluciones de <2 ppm, ejemplo:
Si deseas preparar una serie de diluciones de 0.20, 0.16, 0.12 ppm etc.. la preparación de la
primera requerirá de tomar 2.5 mL de la solución de 160 ppm y llevar a 2L con AGUA DURA SIN
SELENITO DE SODIO NI VITAMINAS, la segunda tomaras 2 mL y la tercera 1.5 mL. Para llevar a
ese mismo volumen con agua dura.
Las diluciones distintas de aquella cercana a la que resulte la CE50 pueden prepararse en
volúmenes mucho menores, de 100mL, cada vez que se planea preparar curva para evaluación del
tóxico de referencia, sin embargo recuerde preparar por lo menos 2 L de aquella concentración
que resulte cercana a la CE50, ya que destinará 500mL para su valoración y el resto para la
preparación del control positivo que acompañara al análisis de las muestras problema a lo largo
de toda su intercalibración.
2. Selenastrum capricornutum
Pesar aproximadamente 0.2511 gr de Sulfato de Cobre y llevar a 100mL con AGUA DESTILADA,
esta solución tendrá una concentración de 1000 ppm como Cu II (A). A partir de esta solución
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madre (A) se prepara una segunda solución tomando 1 mL de (A) la primera y se afora a 100 mL
con AGUA DESTILADA, se obtendrá una concentración de 10 ppm como Cu II.
A partir de esta concentración se prepararán soluciones de < 0.1ppm , ejemplo:
Si se desea preparar una serie de diluciones de 0,08, 0.06, 0.04, 0.02 ppm, puede optar por hacer
la adición directa a los tres viales de centelleo.
En este caso para preparar la primera concentración (0.08 ppm)
tendría que adicionar 20 μL
(microlitros) de la solución B a cada uno de los viales adicionando el volumen que reste para
alcansar los 2.5 ml con MEDIO BUFFER DE NaHCO3 (ver desarrollo de prueba) y que este caso
seria 2480 μL, en el caso de la segunda 15 μL con 2885 μL de buffer, la tercera 10 μL y 2490 μL de
buffer y así sucesivamente.
Puede optar por preparar las soluciones en recipientes como matraz aforados de 10 mL en cuyo
caso, y siguiendo el mismo ejemplo de las concentraciones anteriores, requeriría de adicionar 80
μL (microlitros) y aforar a 10 mL con la solución BUFFER DE NaHCO3 , para la de 0.06 adicionar
60 μL y así sucesivamente.
Las diluciones distintas de aquella cercana a la que resulte la CI50 pueden prepararse en los
volúmenes mencionados o directamente en los viales de prueba, sin embargo recuerde que para
la concentración cercana a la CI50 requiere preparar por lo menos 2 L de la solución ya que
destinará 500mL para su valoración y el resto para las pruebas del tóxico de referencia que
acompañara la evaluación de las muestras problema a lo largo de toda la intercalibración.
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ASUNTO: Instructivo para manejo de muestras ciegas
Jiutepec, Mor., a 16 de julio de 2007
TERCER GRUPO DE MUESTRAS (FASE III)
Antes de iniciar cualquier actividad con el manejo de sus muestras PRIMERO LEA
ESTE INSTRUCTIVO
PREPARATIVOS PREVIOS:
1) Iniciar con la preparación de agua dura sin vitaminas ni Selenito de sodio, de acuerdo a
la guía señalada en su protocolo para el desarrollo de pruebas con Daphnia magna, 5 litros
bastara para efectuar los análisis con D.magna. D. exilis y Selenastrum capricornutum.
2) El agua dura antes mencionada se empleará como medio de dilución de los
volúmenes contenidos en los viales del 1al 4 que usted recibirá y que contienen 2mL de
una solución tóxica, MANEJELA CON CUIDADO.
3) Preparar 4 matraces aforados de 500mL lavados adecuadamente con ácidos y
enjuagues de agua destilada, de acuerdo al procedimiento indicado para manejo de
material destinado a pruebas toxicológicas (omita el paso del horneado). El material debe
garantizar el no estar contaminado, idealmente emplee material nuevo o cuyo uso previo
usted conozca.
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PREPARACIÓN DE SOLUCIÓN DE PRUEBA:
4) Adicionar un volumen de aproximadamente 200mL de agua dura (ver 1) en cada
matraz aforado previamente etiquetado con los números que correspondan (1, 2, 3 y 4)
posteriormente vacíe el contenido de lo viales en los matraces con ayuda de una pipeta
automática de volumen de 1mL o pipeta Pasteur u otros que le permitan transferir el
volumen sin derramarlo y sin escurrirlo por las paredes del matraz. Es importante que la
solución caiga directa sobre el agua dura contenida.
Una vez vacío el vial llénelo con agua dura (sin derramar) y repita la operación de vaciado
y transferencia al matraz empelando el mismo material usado en el vaciad o inicial.
Realice cinco veces esta operación a fin de lograr lo enjuagues suficientes para garantizar
la recuperación total de la solución trasferida al matraz.
Posteriormente tape y agite cuidadosamente el matraz en movimientos circulares (no lo
invierta). Una vez homogeneizada la solución adicione el resto de volumen de agua dura
hasta alcanzar la línea de aforo del matraz de 500 mL.
Tape el matraz asegurando el esmeril y agite, en esta ocasión invierta un par de veces
para homogeneizar la solución.
CUIDADOS
5) Una vez preparadas sus soluciones cúbralas con papel aluminio, etiquételas
externamente con los números correspondientes (10-13) y manténgalas cerradas siempre
en refrigeración después de cada uso.
6) Cada vez que emplee las soluciones, vacíe los volúmenes necesarios en copas
desechables o viales o cualquier material nuevo libre de tóxicos para de este transferir a
sus sistemas de prueba, NUNCA TOME VOLUMENES DIRECTO DEL MATRAZ
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(CENICA)
INSERTANDO PUNTAS O PIPETAS EN SU INTERIOR, SU SOLUCION SE PUEDE
CONTAMINAR.
PREPARACIÓN DE DILUCIONES PARA PRUEBA
En todos los casos realizar ensayos de búsqueda, con curvas
concentraciones
No. Muestra
10
11
12
13**
Daphnia magna
BUSQUEDA
BUSQUEDA
BUSQUEDA
BUSQUEDA
Daphnia exilis
BUSQUEDA
BUSQUEDA
BUSQUEDA
BUSQUEDA
S. capricornutum
BUSQUEDA
BUSQUEDA
BUSQUEDA
BUSQUEDA
con 4
Las diluciones de las muestras deben prepararse con base en los procedimientos
específicos para D. magna, D. exilis y S. capricornutum. Prepárelas de forma directa, es
decir ej:
Si pretende preparar una muestra al 6% en 100 mL, tome 6 mL con pipeta
preferentemente automática o en su defecto serológica de volumen adecuado, coloque
en matraz aforado y lleve a la marca de aforo en matraz de 100mL (para D. magna y/o D.
exilis) o use para S. capricornutum los volúmenes que correspondan con base a las
indicaciones de la preparación de prueba.
Precauciones :
•
No use la estrategia de preparar las diluciones de forma secuencial. Dilución
secuencial es la forma de preparación que se basa en el uso de un volumen de la
dilución previa para preparar la subsiguiente. NO USE ESTE MÉTODO
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(CENICA)
•
Utilice material nuevo o adecuadamente lavado.
•
Emplee material aforado y clase AA.
ENVIO DE RESULTADOS
Los resultados deberán ser enviados antes de 31 de agosto vía electrónica a
ypica@tlaloc.imta.mx o yolanda.pica@gmail.com, los cuales, SIN EXCEPCIÓN, deberán
enviarse en la forma en que se le indican a continuación.
A) Enviar en tres mensajes, cada uno conteniendo la información de cada prueba por
separado. Cada mensaje deberá contener los archivos correspondientes:
1. La carta control que corresponda (D. magna, D. exilis y Selenastrum capricornutum) con
datos actualizados. La carta deberá presentarse en el archivo Excel proporcionado a
ustedes previamente (se anexa nuevamente al presente mensaje).
2. Los archivos de datos tanto del PROBIT como del FORMATO CON LOS DATOS
EXPERIMENTALES obtenidos. Deberán ser un total de dos archivos por muestra para
cada prueba. Si el formato PROBIT lo pasan a Word abriéndolo con lo block de notas,
copiándolo e insertándolo en Word, pueden entonces generar un solo archivo para los
reportes probit que incluyan los cuatro resultados correspondientes al set de muestras
analizadas, sin embargo no olviden enviar el formato con datos (estos últimos se anexan
nuevamante a la presente).
3. Para fácil identificación, sus archivos deberán nombrarse de la siguiente manera:
ej. 10DmCENICA
10DeCENICA
10ScCENICA
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(CENICA)
Indica: Muestra 10 para Daphnia magna (Dm), Daphnia exilis (De) y Selenastrum
capricornutum (Sc) de CENICA (institución que corresponda).
ATENTAMENTE
M.C. YOLANDA PICA GRANADOS
Investigado Titular A.
Subcoordinación de Hidrobiología
y Evaluación Ambiental
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SUBCOORDINACIÓN DE HIDROBIOLOGÍA Y
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ASUNTO: Instructivo para manejo de muestras ciegas
Jiutepec, Mor., a 16 de julio de 2007
ANALISIS DE SÓLIDOS (FASE III)
PARA USO EXCLUSIVO DE CENICA
Antes de iniciar cualquier actividad con el manejo de sus muestras PRIMERO LEA
ESTE INSTRUCTIVO
Se envía a ustedes dos muestras de sedimentos, que acompañan a las cuatro muestras
ciegas, con el objetivo de que efectúen con ellas el procedimiento en el cual se
instruyeron durante el segundo taller del proyecto “Pruebas biológicas para la evaluación
ecotoxicológica de sustancias químicas”. Ambas muestras se encuentran secas, molidas
y tamizadas por lo que solo será necesario monten su sistema de extracción y realicen
dicho procedimiento así como el de generación de elutriados.
No olvide montar en paralelo su sistema control o blanco de procedimiento.
Una vez obtenido el extracto efectúe el análisis del mismo con D. magna no olvide que en
caso del extracto orgánico (metanol) la dosis de este solvente en el sistema de prueba
nunca podrá ser mayor al 1% para D. magna. En el caso del elutriado no existe tal
limitación salvo el control de la dureza del agua en el sistema de prueba .
Por favor si tiene dudas sobre el desarrollo de las pruebas no dude en comunicarse con
nosotros.
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(CENICA)
Agradecería, enviar a los resultados de estas muestras, así como las del blanco de
procedimiento para el día 17 de agosto.
Si bien puede emplear el formato de resultados de D.magna, aplicable a las muestras
ciegas será necesario que anote, en la parte de observaciones los siguientes datos: Peso
extraído, volumen al que fue llevado el extracto (aprox. 4ml) o el elutriado, volumen del
elutriado o del extracto adicionado al sistema de prueba en su concentración inicial y
volumen total de líquidos en el sistema de prueba.
No efectué los cálculos de probit, solo envié los datos obtenidos capturados en el formato
de la prueba que corresponda anotando las concentraciones o dosis trabajadas.
Precauciones :
•
No use la estrategia de preparar las diluciones de forma secuencial. Dilución
secuencial es la forma de preparación que se basa en el uso de un volumen de la
dilución previa para preparar la subsiguiente. NO USE ESTE MÉTODO
•
Utilice material nuevo o adecuadamente lavado.
Emplee material aforado y clase AA, así como pipetas automáticas previamente calibradas
en los volúmenes de uso en prueba.
ATENTAMENTE
M.C. YOLANDA PICA GRANADOS
Investigado Titular A.
Subcoordinación de Hidrobiología
y Evaluación Ambiental
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INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL
(CENICA)
CARTA CONTROL DE Daphnia exilis
bioensayos realizados en CENICA
FECHA
21-Ago-07
17-Sep-07
15-Oct-07
06-Nov-07
21-Nov-07
No. secuencial
1
2
3
4
5
+6
EC50 Cr
0.107
0.109
0.123
0.104
0.101
D. Exilis
0.1088
0.1088
0.1088
0.1088
0.1088
Media - 2sd
0.09
0.09
0.09
0.09
0.09
Media +2sd
0.13
0.13
0.13
0.13
0.13
0.17
0.15
L.S
0.13
PROM
0.11
0.09
0.07
L.I
0.05
0
Media
Dst
Media + 2sd
Media -2sd
No. secuencial
2
4
6
0.1088
0.00850
0.13
-0.09
Cr
+6
CE50 mg/L
Análisis Probit
1
2
3
4
5
Mean
St. Dev.
CV
Mean +2sd
Mean - 2sd
0.107
0.109
0.123
0.104
0.101
0.1088
0.008497058
7.809796245
0.18
0.12
Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592
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Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592
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INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL
(CENICA)
PROYECTO
“Pruebas biológicas para la evaluación ecotoxicológica de sustancias químicas
CARTA CONTROL Daphnia exilis
FECHA
02-Sep-07
06-Sep-07
06-Sep-07
13-Sep-07
13-Sep-07
CNA
No. secuencial
1
2
3
4
5
Media
Dst
Media + 2sd
Media -2sd
Coef. Variación
LC50 Cr VI
0.158
0.143
0.119
0.135
0.135
0.1380
0.01418
0.1664
0.1096
10.27
Organismo: Daphnia exilis 48h Letalidad
Tóxico de referencia: Cr IV
0.16
Promedio +2σ.= 0.166
CL 50 (mg/L)
INSTITUCIÓN:
0.14
Promedio = 0.138
0.12
Promedio -2σ.= 0.109
0.1
1
2
3
4
5
6
Número de experimento
FECHA
02-Sep-07
06-Sep-07
06-Sep-07
13-Sep-07
13-Sep-07
No. secuencial
1
2
3
4
5
Media
Dst
Media + 2sd
Media -2sd
Coef. Variación
LC50 Cr VI
0.158
0.143
0.119
0.135
0.135
0.1380
0.01418
0.1664
0.1096
10.27
Media - 2sd
0.1096
0.1096
0.1096
0.1096
0.1096
;edia
0.138
0.138
0.138
0.138
0.138
Media +2sd
0.1664
0.1664
0.1664
0.1664
0.1664
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Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592
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INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL
(CENICA)
PROYECTO
“Pruebas biológicas para la evaluación ecotoxicológica de sustancias químicas
CARTA CONTROL Daphnia exilis
INSTITUCIÓN: Instituto Mexicano del Petróleo
LC50 Cr VI
0.148
0.142
0.144
0.159
0.1483
0.00759
0.1634
0.1331
5.12
Organismo: Daphnia exilis 48h Letalidad
Tóxico de referencia: Cr VI
0.17
Promedio +2σ.= 0.1343
0.16
CL 50 (mg/L)
FECHA
No. secuencial
02-Ago-07
1
15-Ago-07
2
23-Ago-07
3
30-Ago-07
4
Media
Dst
Media + 2sd
Media -2sd
Coef. Variación
Promedio = 0.103
0.15
0.14
Promedio -2σ= 0.071
0.13
0.12
1
2
3
4
Número de experimento
FECHA
No. secuencial
02-Ago-07
1
15-Ago-07
2
23-Ago-07
3
30-Ago-07
4
Media
Dst
Media + 2sd
Media -2sd
Coef. Variación
LC50 Cr VI
0.148
0.142
0.144
0.159
0.1483
0.00759
0.1634
0.1331
5.12
Media
Media - 2sd Media + 2sd
0.1331
0.1480
0.1634
0.1331
0.1480
0.1634
0.1331
0.1480
0.1634
0.1331
0.1480
0.1634
Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592
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INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL
(CENICA)
PROYECTO
“Pruebas biológicas para la evaluación ecotoxicológica de sustancias químicas
CARTA CONTROL Daphnia exilis
INSTITUCIÓN. IMTA
LC50 Cr VI
0.085
0.084
0.098
0.114
0.096
0.085
0.084
0.098
0.114
0.096
0.101
0.123
0.125
0.115
0.128
0.1031
0.01562
0.1343
0.0718
15.16
Organismo: Daphnia exilis 48h Letalidad
Tóxico de referencia: Cr VI
Promedio +2σ.= 0.1343
0.14
0.13
0.12
CL 50 (mg/L)
No. secuencial
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Media
Dst
Media + 2sd
Media -2sd
Coef. Variación
0.11
Promedio = 0.103
0.1
0.09
0.08
0.07
Promedio -2σ= 0.071
0.06
0.05
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Número de experimento
No. secuencial
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Media
Dst
Media + 2sd
Media -2sd
Coef. Variación
LC50 Cr VI
0.085
0.084
0.098
0.114
0.096
0.085
0.084
0.098
0.114
0.096
0.101
0.123
0.125
0.115
0.128
0.1031
0.01562
0.1343
0.0718
15.16
Media
0.10306667
0.10306667
0.10306667
0.10306667
0.10306667
0.10306667
0.10306667
0.10306667
0.10306667
0.10306667
0.10306667
0.10306667
0.10306667
0.10306667
0.10306667
Media - 2sd
0.0718
0.0718
0.0718
0.0718
0.0718
0.0718
0.0718
0.0718
0.0718
0.0718
0.0718
0.0718
0.0718
0.0718
0.0718
Media +2sd
0.1343
0.1343
0.1343
0.1343
0.1343
0.1343
0.1343
0.1343
0.1343
0.1343
0.1343
0.1343
0.1343
0.1343
0.1343
No. secuencial
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Media
Dst
Media + 2sd
Media -2sd
Coef. Variación
LC50 Cr VI
0.085
0.084
0.098
0.114
0.096
0.085
0.084
0.098
0.114
0.096
0.101
0.123
0.125
0.115
0.128
0.1031
0.01562
0.1343
0.0718
15.16
Media
0.10306667
0.10306667
0.10306667
0.10306667
0.10306667
0.10306667
0.10306667
0.10306667
0.10306667
0.10306667
0.10306667
0.10306667
0.10306667
0.10306667
0.10306667
Media - 2sd
0.0718
0.0718
0.0718
0.0718
0.0718
0.0718
0.0718
0.0718
0.0718
0.0718
0.0718
0.0718
0.0718
0.0718
0.0718
Media +2sd
0.1343
0.1343
0.1343
0.1343
0.1343
0.1343
0.1343
0.1343
0.1343
0.1343
0.1343
0.1343
0.1343
0.1343
0.1343
Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592
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DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE
INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL
(CENICA)
Instituto Politécnico Nacional
Escuela Nacional de Ciencias Biológicas
Laboratorio de Hidrobiología Experimental
PROYECTO
“Pruebas biológicas para la evaluación ecotoxicológica de sustancias químicas
FECHA
No. secuencial LC50 Cr VI
12-Jun-07
1
0.106
13-Jun-07
2
0.108
14-Jun-07
3
0.101
19-Jun-07
4
0.101
20-Jun-07
5
0.163
20-Jun-07
6
0.153
21-Jun-07
7
0.115
21-Jun-07
8
0.104
21-Jun-07
9
0.075
22-Jun-07
10
0.137
25-Jun-07
11
0.125
25-Jun-07
12
0.106
26-Jun-07
13
0.148
26-Jun-07
14
0.164
27-Jun-07
15
0.141
27-Jun-07
16
0.111
27-Jun-07
17
0.115
28-Jun-07
18
0.096
28-Jun-07
19
0.107
03-Jul-07
20
0.135
Media
0.1206
Dst
0.02411
Media + 2sd
0.1688
Media -2sd
0.0723
Coef. Variación
20.00
Organismo: Daphnia exilis 48h Toxicidad Aguda
Tóxico de referencia: Cr(IV)
0.200
Promedio +2σ.= 0.1688
0.150
CL 50 (mg/L)
CARTA CONTROL Daphnia exilis
FECHA
No. secuencial LC50 Cr VI
12-Jun-07
1
0.106
13-Jun-07
2
0.108
14-Jun-07
3
0.101
19-Jun-07
4
0.101
20-Jun-07
5
0.163
20-Jun-07
6
0.153
21-Jun-07
7
0.115
21-Jun-07
8
0.104
21-Jun-07
9
0.075
22-Jun-07
10
0.137
25-Jun-07
11
0.125
25-Jun-07
12
0.106
26-Jun-07
13
0.148
26-Jun-07
14
0.164
27-Jun-07
15
0.141
27-Jun-07
16
0.111
27-Jun-07
17
0.115
28-Jun-07
18
0.096
28-Jun-07
19
0.107
03-Jul-07
20
0.135
Media
0.1206
Dst
0.02411
Media + 2sd
0.1688
Media -2sd
0.0723
Coef. Variación
20.00
Promedio = 0.1206
0.100
Promedio -2σ.= 0.0723
0.050
0.000
0
5
10
15
20
Número de ensayo
Media
Media - 2sd Media +2sd
0.1206
0.0723
0.1688
0.1206
0.0723
0.1688
0.1206
0.0723
0.1688
0.1206
0.0723
0.1688
0.1206
0.0723
0.1688
0.1206
0.0723
0.1688
0.1206
0.0723
0.1688
0.1206
0.0723
0.1688
0.1206
0.0723
0.1688
0.1206
0.0723
0.1688
0.1206
0.0723
0.1688
0.1206
0.0723
0.1688
0.1206
0.0723
0.1688
0.1206
0.0723
0.1688
0.1206
0.0723
0.1688
0.1206
0.0723
0.1688
0.1206
0.0723
0.1688
0.1206
0.0723
0.1688
0.1206
0.0723
0.1688
0.1206
0.0723
0.1688
Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592
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INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL
(CENICA)
PROYECTO
“Pruebas biológicas para la evaluación ecotoxicológica de sustancias químicas
CARTA CONTROL Daphnia exilis
INSTITUCIÓN: UAM-I
LC50 Cr VI
0.077
0.087
0.079
0.087
0.071
0.077
0.071
0.08
0.071
0.072
0.068
0.074
0.0762
0.00624
0.0886
0.0637
8.19
Organismo: Daphnia exilis 48h Letalidad
Tóxico de referencia: Cr VI
0.1
0.095
Promedio +2σ.= 0.0886
0.09
CL 50 (mg/L)
No. secuencial
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Media
Dst
Media + 2sd
Media -2sd
Coef. Variación
0.085
0.08
Promedio = 0.0762
0.075
0.07
0.065
0.06
Promedio -2σ= 0.0637
0.055
0.05
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
Número de experimento
No. secuencial
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Media
Dst
Media + 2sd
Media -2sd
Coef. Variación
LC50 Cr VI
0.077
0.087
0.079
0.087
0.071
0.077
0.071
0.08
0.071
0.072
0.068
0.074
0.0762
0.00624
0.0886
0.0637
8.19
Media - 2sd
0.06
0.06
0.06
0.06
0.06
0.06
0.06
0.06
0.06
0.06
0.06
0.06
Media
Media + 2sd
0.0762
0.09
0.0762
0.09
0.0762
0.09
0.0762
0.09
0.0762
0.09
0.0762
0.09
0.0762
0.09
0.0762
0.09
0.0762
0.09
0.0762
0.09
0.0762
0.09
0.0762
0.09
Media
Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592
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DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE
INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL
(CENICA)
CARTA CONTROL DE Daphnia Magna
bioensayos realizados en CENICA
FECHA
09-Jul-07
09-Jul-07
17-Jul-07
30-Jul-07
01-Ago-07
31-Ago-07
18-Sep-07
10/10/2007
05/11/2007
21/11/2007
No. secuencial
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
EC50 Cr
+6
0.169
0.104
0.097
0.171
0.099
0.109
0.123
0.104
0.101
0.107
D. Magna
0.118
0.118
0.118
0.118
0.118
0.118
0.118
0.118
0.118
0.118
Media - 2sd Media +2sd
0.17
0.17
0.17
0.17
0.17
0.17
0.17
0.17
0.17
0.17
0.06
0.06
0.06
0.06
0.06
0.06
0.06
0.06
0.06
0.06
0.18
0.16
L.S
0.14
0.12
0.1
PROM
0.08
0.06
L.I
0.04
0.02
0
0
Media
Dst
Media + 2sd
Media -2sd
No. secuencial
2
4
6
8
10
12
0.1184
0.02812
0.17
-0.06
Cr
+6
CE50 mg/L
Análisis Probit
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Mean
St. Dev.
CV
Mean +2sd
Mean - 2sd
0.169
0.104
0.097
0.171
0.099
0.109
0.123
0.104
0.101
0.107
0.1184
0.028123537
23.75298733
0.18
0.12
Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592
Correo electrónico cenica@ine.gob.mx
DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE
INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL
(CENICA)
No. secuencial
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Media
Dst
Media + 2sd
Media -2sd
EC50 Cr
+6
Media - 2sd
D. magna
0.16
0.153
0.167
0.153
0.157
0.156
0.168
0.156
0.15
0.15
0.161
0.163
0.151
0.15
0.14
0.1556
0.1556
0.1556
0.1556
0.1556
0.1556
0.1556
0.1556
0.1556
0.1556
0.1556
0.1556
0.1556
0.1556
0.1556
Media +2sd
0.14
0.14
0.14
0.14
0.14
0.14
0.14
0.14
0.14
0.14
0.14
0.14
0.14
0.14
0.14
0.17
0.17
0.17
0.17
0.17
0.17
0.17
0.17
0.17
0.17
0.17
0.17
0.17
0.17
0.17
0.155666667
0.00737
0.17
-0.14
PROYECTO
“Pruebas biológicas para la evaluación ecotoxicológica de sustancias químicas. Tercera etapa
INSTITUCIÓN CNA
No. secuencial
Cr
+6
CE50 mg/L
LABORATORIO
Análisis Probit
0.16
0.153
0.167
0.153
0.157
0.156
0.168
0.156
0.15
0.15
0.161
0.163
0.151
0.15
0.14
0.155666667
0.007374344
4.737266081
0.22
0.19
01-Sep-07
Organismo: Daphnia magna 48h mortalidad
Tóxico de referencia: Cr+6 en agua dura
0.18
Promedio +2σ.= 0.20
0.17
CL 50 (mg/L)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Mean
St. Dev.
CV
Mean +2sd
Mean - 2sd
FECHA:
CNA
0.16
0.15
Promedio = 0.155
0.14
0.13
Promedio -2σ.= 0.13
0.12
0
2
4
6
8
10
12
14
16
Número de experimento
Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592
Correo electrónico cenica@ine.gob.mx
DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE
INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL
(CENICA)
PROYECTO
“Pruebas biológicas para la evaluación ecotoxicológica de sustancias químicas
CARTA CONTROL Daphnia magna
INSTITUCIÓN: Instituto Mexicano del Petróleo
No. secuencial
2
3
4
6
7
Media
Dst
Media + 2sd
Media -2sd
Coef. Variación
LC50 Cr VI
0.162
0.163
0.157
0.142
0.148
0.1544
0.00913
0.1727
0.1361
5.91
Organismo: Daphnia magna 48h Letalidad
Tóxico de referencia: Cr IV
Promedio +2σ.= 0.1727
0.17
CL 50 (mg/L)
FECHA
27-Jul-07
10-Ago-07
17-Ago-07
25-Ago-07
30-Ago-07
Promedio = 0.1544
0.15
Promedio -2σ.= 0.1361
0.13
1
2
3
4
Número de experimento
FECHA
27-Jul-07
10-Ago-07
17-Ago-07
25-Ago-07
30-Ago-07
No. secuencial
1
2
3
4
5
Media
Dst
Media + 2sd
Media -2sd
Coef. Variación
LC50 Cr VI
0.162
0.163
0.157
0.142
0.148
0.1544
0.00913
0.1727
0.1361
5.91
Media
Media - 2sd Media +2sd
0.1544
0.1361
0.1727
0.1544
0.1361
0.1727
0.1544
0.1361
0.1727
0.1544
0.1361
0.1727
0.1544
0.1361
0.1727
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Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592
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5
DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE
INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL
(CENICA)
PROYECTO
“Pruebas biológicas para la evaluación ecotoxicológica de sustancias químicas
CARTA CONTROL Daphnia magna
INSTITUCIÓN: IMTA
No. secuencial
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
Media
Dst
Media + 2sd
Media -2sd
Coef. Variación
LC50 Cr VI
0.153
0.151
0.158
0.153
0.152
0.16
0.14
0.15
0.14
0.155
0.147
0.147
0.16
0.147
0.153
0.158
0.152
0.167
0.166
0.156
0.157
0.17
0.16
0.175
0.167
0.1558
0.00873
0.1732
0.1383
5.61
FECHA
May-06
May-06
May-06
May-06
May-06
Oct-06
Oct-06
Oct-06
Oct-06
Ene-07
Ene-07
Ene-07
Ene-07
Mar-07
Abr-07
Abr-07
Abr-07
Jul-07
Jul-07
Jul-07
Jul-07
Oct-07
Oct-07
Oct-07
Oct-07
No. secuencial
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
Media
Dst
Media + 2sd
Media -2sd
Coef. Variación
LC50 Cr VI
0.153
0.151
0.158
0.153
0.152
0.16
0.14
0.15
0.14
0.155
0.147
0.147
0.16
0.147
0.153
0.158
0.152
0.167
0.166
0.156
0.157
0.17
0.16
0.175
0.167
0.1558
0.00873
0.1732
0.1383
5.61
Organismo: Daphnia magna 48h Letalidad
Tóxico de referencia: Cr IV
0.18
Promedio +2σ.= 0.1727
CL 50 (mg/L)
FECHA
May-06
May-06
May-06
May-06
May-06
Oct-06
Oct-06
Oct-06
Oct-06
Ene-07
Ene-07
Ene-07
Ene-07
Mar-07
Abr-07
Abr-07
Abr-07
Jul-07
Jul-07
Jul-07
Jul-07
Oct-07
Oct-07
Oct-07
Oct-07
0.16
Promedio = 0.1544
0.14
Promedio -2σ.= 0.1361
0.12
1
2
3
4
Número de experimento
Media - 2sd
0.138
0.138
0.138
0.138
0.138
0.138
0.138
0.138
0.138
0.138
0.138
0.138
0.138
0.138
0.138
0.138
0.138
0.138
0.138
0.138
0.138
0.138
0.138
0.138
0.138
Media
0.1558
0.1558
0.1558
0.1558
0.1558
0.1558
0.1558
0.1558
0.1558
0.1558
0.1558
0.1558
0.1558
0.1558
0.1558
0.1558
0.1558
0.1558
0.1558
0.1558
0.1558
0.1558
0.1558
0.1558
0.1558
Media +2sd
0.1732
0.1732
0.1732
0.1732
0.1732
0.1732
0.1732
0.1732
0.1732
0.1732
0.1732
0.1732
0.1732
0.1732
0.1732
0.1732
0.1732
0.1732
0.1732
0.1732
0.1732
0.1732
0.1732
0.1732
0.1732
Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592
Correo electrónico cenica@ine.gob.mx
5
DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE
INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL
(CENICA)
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Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592
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DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE
INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL
(CENICA)
Instituto Politécnico Nacional
Escuela Nacional de Ciencias Biológicas
Laboratorio de Hidrobiología Experimental
PROYECTO
“Pruebas biológicas para la evaluación ecotoxicológica de sustancias químicas
CARTA CONTROL Daphnia magna ENCB, IPN
Organismo: Daphnia magna ENCB 48h Toxicidad Aguda
Tóxico de referencia: Cr(IV)
Promedio +2σ.= 0.1990
0.2
CL 50 (mg/L)
FECHA
No. secuencial LC50 Cr VI
07-Ago-07
1
0.15
07-Ago-07
2
0.14
08-Ago-07
3
0.16
09-Ago-07
4
0.17
14-Ago-07
5
0.16
15-Ago-07
6
0.18
15-Ago-07
7
0.17
16-Ago-07
8
0.19
03-Oct-07
9
0.13
21-Ago-07
10
0.17
22-Ago-07
11
0.19
25-Jun-07
12
0.19
26-Jun-07
13
0.19
26-Jun-07
14
0.16
26-Sep-07
15
0.19
03-Oct-07
16
0.18
10-Oct-07
17
0.21
18-Oct-07
18
0.22
Media
0.1750
Dst
0.02307
Media + 2sd
0.2211
Media -2sd
0.1289
Coef. Variación
13.18
Promedio = 0.1667
0.15
Promedio -2σ.= 0.1344
0.1
0
FECHA
No. secuencial LC50 Cr VI
Media - 2sd media
07-Ago-07
1
0.15
0.1289
0.175
07-Ago-07
2
0.14
0.1289
0.175
08-Ago-07
3
0.16
0.1289
0.175
09-Ago-07
4
0.17
0.1289
0.175
14-Ago-07
5
0.16
0.1289
0.175
15-Ago-07
6
0.18
0.1289
0.175
15-Ago-07
7
0.17
0.1289
0.175
16-Ago-07
8
0.19
0.1289
0.175
03-Oct-07
9
0.13
0.1289
0.175
21-Ago-07
10
0.17
0.1289
0.175
22-Ago-07
11
0.19
0.1289
0.175
25-Jun-07
12
0.19
0.1289
0.175
26-Jun-07
13
0.19
0.1289
0.175
26-Jun-07
14
0.16
0.1289
0.175
26-Sep-07
15
0.19
0.1289
0.175
03-Oct-07
16
0.18
0.1289
0.175
10-Oct-07
17
0.21
0.1289
0.175
18-Oct-07
18
0.22
0.1289
0.175
Media
0.1750
Dst
0.02307
Media + 2sd
0.2211
Media -2sd
0.1289
Coef. Variación
13.18
5
10
Número de ensayo
Media +2sd
0.2211
0.2211
0.2211
0.2211
0.2211
0.2211
0.2211
0.2211
0.2211
0.2211
0.2211
0.2211
0.2211
0.2211
0.2211
0.2211
0.2211
0.2211
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Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592
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INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL
(CENICA)
PROYECTO
“Pruebas biológicas para la evaluación ecotoxicológica de sustancias químicas
CARTA CONTROL Daphnia magna
INSTITUCIÓN: UAM-I
No. secuencial
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Media
Dst
Media + 2sd
Media -2sd
Coef. Variación
LC50 Cr VI
0.144
0.124
0.17
0.147
0.157
0.151
0.154
0.133
0.144
0.147
0.157
0.151
0.1483
0.01181
0.1719
0.1246
7.97
Organismo: Daphnia magna 48h Letalidad
Tóxico de referencia: Cr IV
Promedio +2σ.= 0.1727
0.17
CL 50 (mg/L)
FECHA
06-Sep-06
08-Sep-06
13-Sep-06
20-Sep-06
21-Sep-06
25-Sep-06
18-Ene-07
24-Ene-07
11-Oct-07
18-Oct-07
01-Nov-07
07-Nov-07
Promedio = 0.1544
0.15
0.13
Promedio -2σ.= 0.1361
0.11
1
2
3
4
5
Número de experimento
FECHA
06-Sep-06
08-Sep-06
13-Sep-06
20-Sep-06
21-Sep-06
25-Sep-06
18-Ene-07
24-Ene-07
11-Oct-07
18-Oct-07
01-Nov-07
07-Nov-07
No. secuencial
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Media
Dst
Media + 2sd
Media -2sd
Coef. Variación
LC50 Cr VI
Media - 2sd
0.144
0.12
0.124
0.12
0.17
0.12
0.147
0.12
0.157
0.12
0.151
0.12
0.154
0.12
0.133
0.12
0.144
0.12
0.147
0.12
0.157
0.12
0.151
0.12
0.1483
0.01181
0.1719
0.1246
7.97
Media
Media +2sd
0.148
0.17
0.148
0.17
0.148
0.17
0.148
0.17
0.148
0.17
0.148
0.17
0.148
0.17
0.148
0.17
0.148
0.17
0.148
0.17
0.148
0.17
0.148
0.17
Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592
Correo electrónico cenica@ine.gob.mx
DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE
INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL
(CENICA)
“Taller de transferencia de tecnología:
“Pruebas biológicas para la evaluación ecotoxicológica de sustancias químicas
CARTA CONTROL Selenastrum capricornutum
FECHA
07-Ago-07
07-Ago-07
10-Ago-07
10-Ago-07
13-Ago-07
13-Ago-07
No. secuencial
+2
EC50 Cu
1SCEN
2SCEN
3SCEN
4SCEN
5SCEN
6SCEN
Media
Dst
Media + 2sd
Media -2sd
CV
Media - 2sd
0.036
0.026
0.035
0.034
0.023
0.026
0.030
0.006
0.041
0.019
45.480
S. Capricorn Media +2sd
0.019
0.019
0.019
0.019
0.019
0.019
0.030
0.030
0.030
0.030
0.030
0.030
0.041
0.041
0.041
0.041
0.041
0.041
PROYECTO
“Pruebas biológicas para la evaluación ecotoxicológica de sustancias químicas. Tercera etapa
INSTITUCIÓN: CENICA
No. secuencial
Cr
+6
CE50 mg/L
Análisis Probit
07-Ago-07
07-Ago-07
10-Ago-07
10-Ago-07
13-Ago-07
13-Ago-07
1SCEN
2SCEN
3SCEN
4SCEN
5SCEN
6SCEN
Mean
St. Dev.
CV
Mean +2sd
Mean - 2sd
0.036
0.026
0.035
0.034
0.023
0.026
0.030
0.006
18.738
0.041
0.019
Organismo: Selenastrum capricornutum 96h inhibición
Tóxico de referencia: Cu+2 en medio mineral
0.046
LABORATORIO
FECHA:
CNA
01-Ago-06
Promedio
+2σ.= 0.04
0.041
CL 50 (mg/L)
FECHA
0.036
Promedio = 0.025
0.031
0.026
0.021
0.016
Promedio -2σ.= 0.009
0.011
0.006
0.001
1
3
Número de experimento
5
7
Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592
Correo electrónico cenica@ine.gob.mx
DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE
INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL
(CENICA)
“Taller de transferencia de tecnología:
“Pruebas biológicas para la evaluación ecotoxicológica de sustancias químicas
CARTA CONTROL Selenastrum capricornutum
FECHA
29-Sep-06
29-Sep-06
29-Sep-06
03-Nov-06
03-Nov-06
08-Dic-06
19-Ene-07
02-Feb-07
06-Ago-07
16-Ago-07
17-Ago-07
20-Ago-07
27-Ago-07
No. secuencial
+2
EC50 Cu
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
Media
Dst
Media + 2sd
Media -2sd
S. Capricornutum Media - 2sd
0.022
0.022
0.022
0.018
0.02
0.027
0.009
0.023
0.024
0.027
0.033
0.034
0.04
0.025
0.008
0.040
-0.009
0.025
0.025
0.025
0.025
0.025
0.025
0.025
0.025
0.025
0.025
0.025
0.025
0.025
Media +2sd
0.009
0.009
0.009
0.009
0.009
0.009
0.009
0.009
0.009
0.009
0.009
0.009
0.009
0.040
0.040
0.040
0.040
0.040
0.040
0.040
0.040
0.040
0.040
0.040
0.040
0.040
PROYECTO
“Pruebas biológicas para la evaluación ecotoxicológica de sustancias químicas. Tercera etapa
INSTITUCIÓN: CNA
No. secuencial
Cr
+6
CE50 mg/L
Análisis Probit
29-Sep-06
29-Sep-06
29-Sep-06
03-Nov-06
03-Nov-06
08-Dic-06
19-Ene-07
02-Feb-07
06-Ago-07
16-Ago-07
17-Ago-07
20-Ago-07
27-Ago-07
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
Mean
St. Dev.
CV
Mean +2sd
Mean - 2sd
0.022
0.022
0.022
0.018
0.02
0.027
0.009
0.023
0.024
0.027
0.033
0.034
0.04
0.025
0.008
31.776
0.040
0.009
Organismo: Selenastrum capricornutum 96h inhibición
Tóxico de referencia: Cu+2 en medio mineral
LABORATORIO
0.046
FECHA:
CNA
01-Ago-06
Promedio +2σ.= 0.04
0.041
CL 50 (mg/L)
FECHA
0.036
0.031
0.026
Promedio = 0.025
0.021
0.016
0.011
0.006
0.001
-1
Promedio -2σ.= 0.009
1
3
5
7
Número de experimento
9
11
13
15
Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592
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INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL
(CENICA)
“Taller de transferencia de tecnología:
“Pruebas biológicas para la evaluación ecotoxicológica de sustancias químicas
CARTA CONTROL Selenastrum capricornutum
INSTITUCIÓN IMP
11.09.06
14.09.06
14.09.06
15.09.06
15.09.06
26.09.06
28.09.06
29.09.06
30.10.06
10.11.06
20.11.06
26.01.07
26.01.07
24.02.07
01.03.07
09.03.07
02.07.07
02.07.07
02.07.07
13.07.07
13.07.07
23.07.07
23.07.07
30.07.07
06.08.07
13.08.08
13.08.08
No. secuencial
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
Media
Dst
Media + 2sd
Media -2sd
EC50 Cu
Organismo: Selenastrum capricornutum 96h inhibición
Tóxico de referencia: Cu+2 en medio mineral
0.0305
0.0336
0.0366
0.0328
0.0297
0.0357
0.0330
0.0284
0.0466
0.0390
0.0480
0.0404
0.0497
0.0437
0.0455
0.0403
0.0366
0.0469
0.0380
0.0340
0.0480
0.0390
0.0510
0.0350
0.0380
0.0310
0.0370
0.0600
0.0550
Promedio +2σ.= 0.0519
0.0500
0.0450
CL 50 (mg/L)
FECHA
+2
Promedio = 0.0388
0.0400
0.0350
0.0300
0.0250
Promedio -2σ.= 0.0257
0.0200
0.0150
0.0388
0.00655
0.0519
0.0257
0.0100
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
Número de experimento
FECHA
11.09.06
14.09.06
14.09.06
15.09.06
15.09.06
26.09.06
28.09.06
29.09.06
30.10.06
10.11.06
20.11.06
26.01.07
26.01.07
24.02.07
01.03.07
09.03.07
02.07.07
02.07.07
02.07.07
13.07.07
13.07.07
23.07.07
23.07.07
30.07.07
06.08.07
13.08.08
13.08.08
No. secuencial
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
Media
Dst
Media + 2sd
Media -2sd
+2
EC50 Cu
0.0305
0.0336
0.0366
0.0328
0.0297
0.0357
0.0330
0.0284
0.0466
0.0390
0.0480
0.0404
0.0497
0.0437
0.0455
0.0403
0.0366
0.0469
0.0380
0.0340
0.0480
0.0390
0.0510
0.0350
0.0380
0.0310
0.0370
Media - 2sd
Media
Media +2sd
0.0257
0.0257
0.0257
0.0257
0.0257
0.0257
0.0257
0.0257
0.0257
0.0257
0.0257
0.0257
0.0257
0.0257
0.0257
0.0257
0.0257
0.0257
0.0257
0.0257
0.0257
0.0257
0.0257
0.0257
0.0257
0.0257
0.0257
0.0257
0.0388
0.0388
0.0388
0.0388
0.0388
0.0388
0.0388
0.0388
0.0388
0.0388
0.0388
0.0388
0.0388
0.0388
0.0388
0.0388
0.0388
0.0388
0.0388
0.0388
0.0388
0.0388
0.0388
0.0388
0.0388
0.0388
0.0388
0.0388
0.0519
0.0519
0.0519
0.0519
0.0519
0.0519
0.0519
0.0519
0.0519
0.0519
0.0519
0.0519
0.0519
0.0519
0.0519
0.0519
0.0519
0.0519
0.0519
0.0519
0.0519
0.0519
0.0519
0.0519
0.0519
0.0519
0.0519
0.0519
0.0413
0.0413
0.0413
0.0413
0.0413
0.0413
0.0413
0.0413
0.0413
0.0413
0.0413
0.0413
0.0413
0.0413
0.0413
0.0413
0.0413
0.0413
0.0413
0.0413
0.0413
0.0413
0.0413
0.0413
0.0413
0.0413
0.0413
0.0413
0.0363
0.0363
0.0363
0.0363
0.0363
0.0363
0.0363
0.0363
0.0363
0.0363
0.0363
0.0363
0.0363
0.0363
0.0363
0.0363
0.0363
0.0363
0.0363
0.0363
0.0363
0.0363
0.0363
0.0363
0.0363
0.0363
0.0363
0.0363
0.0388
0.00655
0.0519
0.0257
Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592
Correo electrónico cenica@ine.gob.mx
DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE
INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL
(CENICA)
Instituto Politécnico Nacional
Escuela Nacional de Ciencias Biológicas
Laboratorio de Hidrobiología Experimental
PROYECTO
“Pruebas biológicas para la evaluación ecotoxicológica de sustancias químicas
CARTA CONTROL Selenastrum capricornutum
07.05.07
13.11.06
13.11.06*
06.05.07
06.05.07*
02.07.07
02.07.07
02.07.07
02.07.07
02.07.07*
03.09.07
03.09.07
03.09.07
03.09.07
* = Lamparas
No. secuencial
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
Media
Dst
Media + 2sd
Media -2sd
C:V
+2
EC50 Cu
0.049
0.0498
0.05
0.0545
0.0545
0.0485
0.0428
0.0523
0.0534
0.0553
0.0387
0.0474
0.0365
0.0443
Organismo: Selenastrum capricornutum 72h inhibición
Tóxico de referencia: Cu+2 en medio mineral
Promedio +2σ.= 0.0601
0.06
0.055
CL 50 (mg/L)
FECHA
Promedio = 0.0484
0.05
0.045
0.04
0.035
0.0484
0.00590
0.0601
0.0366
12.1934
Promedio -2σ.= 0.0366
0.03
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
Número de experimento
INSTITUCIÓN: IPN, ENCB
FECHA
07.05.07
13.11.06
13.11.06*
06.05.07
06.05.07*
02.07.07
02.07.07
02.07.07
02.07.07
02.07.07*
03.09.07
03.09.07
03.09.07
03.09.07
No. secuencial
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
Media
Dst
Media + 2sd
Media -2sd
C:V
EC50 Cu+2
0.049
0.0498
0.05
0.0545
0.0545
0.0485
0.0428
0.0523
0.0534
0.0553
0.0387
0.0474
0.0365
0.0443
Media - 2sd
0.0366
0.0366
0.0366
0.0366
0.0366
0.0366
0.0366
0.0366
0.0366
0.0366
0.0366
0.0366
0.0366
0.0366
Media
0.04835714
0.04835714
0.04835714
0.04835714
0.04835714
0.04835714
0.04835714
0.04835714
0.04835714
0.04835714
0.04835714
0.04835714
0.04835714
0.04835714
Media +2sd
0.0601
0.0601
0.0601
0.0601
0.0601
0.0601
0.0601
0.0601
0.0601
0.0601
0.0601
0.0601
0.0601
0.0601
0.0484
0.00590
0.0601
0.0366
12.1934
Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592
Correo electrónico cenica@ine.gob.mx
DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE
INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL
(CENICA)
PROYECTO
“Pruebas biológicas para la evaluación ecotoxicológica de sustancias químicas
CARTA CONTROL Selenastrum capricornutum
INSTITUCIÓN: UAM-I
No. secuencial
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Media
Dst
Media + 2sd
Media -2sd
Coef. Variación
LC50 Cr VI
0.036
0.043
0.039
0.029
0.038
0.036
0.041
0.034
0.039
0.037
0.0372
0.00388
0.0450
0.0294
10.43
Organismo: S. capricornutum 72h inhibición
Tóxico de referencia: Cu II
0.05
Promedio +2σ.= 0.0886
0.045
CL 50 (mg/L)
07-Sep-06
11-Sep-06
14-Sep-06
15-Sep-06
12-Ene-07
03-Sep-07
10-se-07
01-Oct-07
11-Oct-07
29-Oct-07
0.04
Promedio = 0.0762
0.035
0.03
Promedio -2σ= 0.0637
0.025
0.02
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
Número de experimento
07-Sep-06
11-Sep-06
14-Sep-06
15-Sep-06
12-Ene-07
03-Sep-07
10-se-07
01-Oct-07
11-Oct-07
29-Oct-07
No. secuencial
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Media
Dst
Media + 2sd
Media -2sd
Coef. Variación
LC50 Cr VI
0.036
0.043
0.039
0.029
0.038
0.036
0.041
0.034
0.039
0.037
0.0372
0.00388
0.0450
0.0294
10.43
Media - 2sd
0.0372
0.0372
0.0372
0.0372
0.0372
0.0372
0.0372
0.0372
0.0372
0.0372
Media
Media + 2sd
0.0294
0.0450
0.0294
0.0450
0.0294
0.0450
0.0294
0.0450
0.0294
0.0450
0.0294
0.0450
0.0294
0.0450
0.0294
0.0450
0.0294
0.0450
0.0294
0.0450
Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592
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(CENICA)
EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM
USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES
Version 1.5
Muestra Ciega 10: Exilis
EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM
USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES
Version 1.5
Conc.
0.1500
0.3000
0.7500
1.5000
3.0000
Number
Exposed
30
30
30
30
30
Number
Resp.
5
20
22
30
30
Observed
Proportion
Responding
Proportion
Responding
Adjusted for
Controls
Predicted
Proportion
Responding
0.1667
0.6667
0.7333
1.0000
1.0000
0.1667
0.6667
0.7333
1.0000
1.0000
0.2241
0.5124
0.8588
0.9689
0.9960
Chi - Square for Heterogeneity (calculated)
Chi - Square for Heterogeneity
(tabular value at 0.05 level)
=
8.403
=
7.815
***************************************************************
*
WARNING
*
*
*
*
The tabular chi-square value exceeds the calculated
*
*
chi-square value for heterogeneity. This is evidence that *
*
the probit model may not be appropriate for these data.
*
Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592
Correo electrónico cenica@ine.gob.mx
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INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL
(CENICA)
*
The results reported for this data set may not be valid, *
*
and should be interpreted with appropriate caution.
*
***************************************************************
Mu
Sigma
=
=
-0.534739
0.381235
Parameter
Estimate
Std. Err.
95% Confidence Limits
--------------------------------------------------------------------Intercept
6.402648
0.367787
(
5.232349,
7.572948)
Slope
2.623051
0.662664
(
0.514454,
4.731649)
Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000
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EXILIS
Estimated LC/EC Values and Confidence Limits
Exposure
Conc.
Point
LC/EC
LC/EC
LC/EC
LC/EC
LC/EC
LC/EC
LC/EC
LC/EC
LC/EC
1.00
5.00
10.00
15.00
50.00
85.00
90.00
95.00
99.00
0.038
0.069
0.095
0.118
0.292
0.725
0.899
1.237
2.250
95% Confidence Limits
Lower
Upper
0.000
0.000
0.000
0.001
0.057
0.381
0.461
0.588
0.874
0.117
0.169
0.209
0.243
0.635
16.264
45.356
215.929
4271.367
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EXILIS
PLOT OF ADJUSTED PROBITS AND PREDICTED REGRESSION LINE
Probit
10+
9+
8+
7+
6+
5+
4+
-
o
o
.
.
..
..
...
....
....
....
...
o
o
....
....
...
....
....
...
....
.... o
....
...
..
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(CENICA)
..
3+
.
-.
2+
1+
0+
-+--------------+--------+---------+---------+--------+--------------+EC01
EC10
EC25
EC50
EC75
EC90
EC99
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EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM
USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES
Version 1.5
MUESTRA CIEGA 10 DEFINITIVA Daphnia exilis(2) 2007/09/11
Proportion
Observed Responding Predicted
Number Number Proportion Adjusted for Proportion
Conc. Exposed Resp. Responding Controls
Responding
20.0000
30.0000
40.0000
50.0000
30
30
30
30
15
20
30
30
0.5000
0.6667
1.0000
1.0000
0.5000
0.6667
1.0000
1.0000
0.4266
0.8128
0.9505
0.9875
Chi - Square for Heterogeneity (calculated) = 6.812
Chi - Square for Heterogeneity
(tabular value at 0.05 level)
= 5.991
***************************************************************
*
WARNING
*
* The tabular chi-square value exceeds the calculated
*
* chi-square value for heterogeneity. This is evidence that *
* the probit model may not be appropriate for these data. *
* The results reported for this data set may not be valid, *
* and should be interpreted with appropriate caution.
*
***************************************************************
*
NOTE
*
* Slope not significantly different from zero.
*
* LC/EC fiducial limits cannot be computed.
*
***************************************************************
Mu
= 1.331405
Sigma = 0.164059
Parameter
Estimate
Std. Err.
95% Confidence Limits
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(CENICA)
--------------------------------------------------------------------Intercept
-3.115416 3.111219 ( -16.502991, 10.272159)
Slope
6.095379 2.163985 ( -3.216249, 15.407008)
Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000
Estimated LC/EC Values and Confidence Limits
Exposure
Point
Conc.
LC/EC 1.00
8.907
LC/EC 5.00
11.522
LC/EC 10.00
13.217
LC/EC 15.00
14.500
LC/EC 50.00
21.449
LC/EC 85.00
31.727
LC/EC 90.00
34.807
LC/EC 95.00
39.927
LC/EC 99.00
51.648
95% Confidence Limits
Lower
Upper
0.0858 Cr
PLOT OF ADJUSTED PROBITS AND PREDICTED REGRESSION LINE
Probit
10+
9+
8+
7+
-
o
o
.
.
..
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(CENICA)
..
...
....
6+
....
....
...
.... o
....
5+
o ...
....
....
...
....
4+
....
....
...
..
..
3+ .
-.
2+
1+
0+
-+--------------+--------+---------+---------+--------+--------------+EC01
EC10 EC25
EC50
EC75 EC90
EC99
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USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES
Version 1.5
MUESTRA CIEGA 11 DEFINITIVA (2) 2007/09/05 D. exilis
Proportion
Observed Responding Predicted
Number Number Proportion Adjusted for Proportion
Conc. Exposed Resp. Responding Controls
Responding
0.5000
1.0000
2.0000
3.0000
30
30
30
30
0
0
17
24
0.0000
0.0000
0.5667
0.8000
0.0000
0.0000
0.5667
0.8000
0.0000
0.0232
0.4707
0.8528
Chi - Square for Heterogeneity (calculated) = 2.489
Chi - Square for Heterogeneity
(tabular value at 0.05 level)
= 5.991
Mu
= 0.312561
Sigma = 0.156961
Parameter
Estimate Std. Err.
95% Confidence Limits
--------------------------------------------------------------------Intercept
3.008670 0.419233 ( 2.186973, 3.830367)
Slope
6.371010 1.166937 ( 4.083814, 8.658206)
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(CENICA)
Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000
Estimated LC/EC Values and Confidence Limits
Point
Exposure
Conc.
LC/EC 1.00
LC/EC 5.00
LC/EC 10.00
LC/EC 15.00
LC/EC 50.00
LC/EC 85.00
LC/EC 90.00
LC/EC 95.00
LC/EC 99.00
0.886
1.133
1.292
1.412
2.054
2.987
3.264
3.722
4.761
95% Confidence Limits
Lower
Upper
0.530
0.772
0.941
1.074
1.797
2.602
2.800
3.110
3.762
1.142
1.380
1.530
1.643
2.321
3.788
4.314
5.250
7.638
0.02054 Hg
PLOT OF ADJUSTED PROBITS AND PREDICTED REGRESSION LINE
Probit
10+
9+
8+
-
.
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7+
.
..
..
...
....
6+
....
.... o
...
....
o ....
5+
...
....
....
...
....
4+
....
....
...
..
..
3+ .
-.
2+
1+
0+o o
-+--------------+--------+---------+---------+--------+--------------+EC01
EC10 EC25
EC50
EC75 EC90
EC99
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EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM
USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES
Version 1.5
MUESTRA CIEGA 12 DEFINITIVA 2007/09/04
Proportion
Observed Responding Predicted
Number Number Proportion Adjusted for Proportion
Conc. Exposed Resp. Responding Controls
Responding
40.0000
60.0000
80.0000
100.0000
30
30
30
30
9
19
27
30
0.3000
0.6333
0.9000
1.0000
0.3000
0.6333
0.9000
1.0000
0.2627
0.6969
0.9085
0.9753
Chi - Square for Heterogeneity (calculated) = 1.576
Chi - Square for Heterogeneity
(tabular value at 0.05 level)
= 5.991
Mu
= 1.699240
Sigma = 0.153055
Parameter
Estimate Std. Err.
95% Confidence Limits
--------------------------------------------------------------------Intercept
-6.102115 1.910099 ( -9.845910, -2.358320)
Slope
6.533578 1.080761 ( 4.415287, 8.651869)
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(CENICA)
Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000
Estimated LC/EC Values and Confidence Limits
Point
Exposure
Conc.
LC/EC 1.00
LC/EC 5.00
LC/EC 10.00
LC/EC 15.00
LC/EC 50.00
LC/EC 85.00
LC/EC 90.00
LC/EC 95.00
LC/EC 99.00
22.039
28.021
31.848
34.723
50.031
72.089
78.595
89.331
113.578
95% Confidence Limits
Lower
Upper
13.656
19.389
23.340
26.428
43.708
64.802
69.895
77.770
94.200
28.352
34.154
37.772
40.465
55.349
84.450
94.976
113.638
160.461
4As
PLOT OF ADJUSTED PROBITS AND PREDICTED REGRESSION LINE
Probit
10+
9+
8+
-
o
.
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(CENICA)
7+
.
..
..
...
...o
6+
....
....
...
....o
....
5+
...
....
....
.o.
....
4+
....
....
...
..
..
3+ .
-.
2+
1+
0+
-+--------------+--------+---------+---------+--------+--------------+EC01
EC10 EC25
EC50
EC75 EC90
EC99
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USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES
Version 1.5
MUESTRA CIEGA 13 DEFINITIVA (2) 2007/09/15
Proportion
Observed Responding Predicted
Number Number Proportion Adjusted for Proportion
Conc. Exposed Resp. Responding Controls
Responding
10.0000
20.0000
35.0000
50.0000
30
30
30
30
0
0
5
13
0.0000
0.0000
0.1667
0.4333
0.0000
0.0000
0.1667
0.4333
0.0000
0.0057
0.1439
0.4494
Chi - Square for Heterogeneity (calculated) = 0.329
Chi - Square for Heterogeneity
(tabular value at 0.05 level)
= 5.991
Mu
= 1.720029
Sigma = 0.165512
Parameter
Estimate Std. Err.
95% Confidence Limits
--------------------------------------------------------------------Intercept
-5.392145 2.815425 ( -10.910379, 0.126089)
Slope
6.041845 1.731277 ( 2.648543, 9.435147)
Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000
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(CENICA)
Estimated LC/EC Values and Confidence Limits
Point
Exposure
Conc.
LC/EC 1.00
LC/EC 5.00
LC/EC 10.00
LC/EC 15.00
LC/EC 50.00
LC/EC 85.00
LC/EC 90.00
LC/EC 95.00
LC/EC 99.00
21.627
28.040
32.204
35.358
52.484
77.905
85.536
98.238
127.368
95% Confidence Limits
Lower
Upper
9.041
16.134
21.787
26.446
45.691
60.904
64.856
71.103
84.306
28.073
33.593
37.279
40.352
74.056
176.154
217.351
297.096
535.080
0.2099 cu
PLOT OF ADJUSTED PROBITS AND PREDICTED REGRESSION LINE
Probit
10+
9+
8+
-
.
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Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592
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7+
.
..
..
...
....
6+
....
....
...
....
....
5+
...
..o.
....
...
....
4+
o...
....
...
..
..
3+ .
-.
2+
1+
0+o
-+--------------+--------+---------+---------+--------+--------------+EC01
EC10 EC25
EC50
EC75 EC90
EC99
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PROYECTO
“Pruebas biológicas para la evaluación ecotoxicológica de sustancias
químicas
Resultados de la prueba de toxicidad con Daphnia exilis
Fecha de Inicio
INSTITUCIÓN________IMP-M-10
06/08/2007
Fecha de Término 08/08/2007
Reportar Número de Daphnias vivas RÉPLICA No. RÉPLICA No. RÉPLICA No.
TOTAL DE
2
3
1
ORGANISMOS
No.
No.
No.
No.
No.
No. Expuestos Muertos
a
b
Inicial Final Inicial Final Inicial Final
(t 0)
(t 48h)
CONTROL POSITIVO: Cr VI (
mg/L)
CONTROL NEGATIVO: Agua dura
No. MUESTRA 10
10
7
10
10
10
4
9
10
10
5
10
30
30
14
1
DILUCIÓN CE50
Obs.
(%) M-10
100
10
1.0
0.1
control
10
10
10
10
10
0
4
9
9
10
10
10
10
10
10
0
4
8
10
9
10
10
10
10
10
0
2
10
9
10
30
30
30
30
30
30
20
3
2
1
6.452 0.0258
M-11
100
7
4
1
control
10
10
10
10
10
0
0
1
9
10
10
10
10
10
10
0
0
2
8
9
10
10
10
10
10
0
0
2
9
9
30
30
30
30
30
30
30
25
4
2
2.391 0.0239
Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592
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M-12
M-13
% Efecto en:
(No org. muertos/30 x 100)
100
10
1.0
10
10
10
0
9
9
11
11
11
1
9
9
10
11
11
0
9
9
31
32
34
30
5
5
0.1
control
10
10
9
9
11
10
9
10
11
11
10
11
32
31
4
1
100
80
60
10
10
10
0
0
3
10
10
10
0
0
0
10
10
10
0
0
2
30
30
30
30
30
25
40
20
10
10
0
5
10
10
0
10
4
10
control
5
6
30
30
25
15
Control positivo________________ 11
00
29.14
0
2.33
21.32 0.0853
8
10
91
0
10
Control negativo______________
OBSERVACION
ES:
ANALISTA Ma. Cristina González
Lozano
FIRMA:
FECHA: 30-08-2007
RESPONSABLE
S
FIRMA
:
Juan C. Cid Núñez
FECHA: 30-08-2007
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30
1
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USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES Version 1.5 dem102007 IMTA Proportion Observed Responding Predicted Number Number Proportion Adjusted for Proportion Conc. Exposed Resp. Responding Controls Responding 0.1500 30 17 0.5667 0.5667 0.5399 0.2000 30 23 0.7667 0.7667 0.8217 0.2500 30 29 0.9667 0.9667 0.9406 Chi ‐ Square for Heterogeneity (calculated) = 1.074 Chi ‐ Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) = 3.841 Mu = ‐0.839125 Sigma = 0.152013 Parameter Estimate Std. Err. 95% Confidence Limits ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ Intercept 10.520085 1.359279 ( 7.855899, 13.184272) Slope 6.578384 1.825138 ( 3.001113, 10.155656) Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000 dem102007 Estimated LC/EC Values and Confidence Limits Exposure 95% Confidence Limits Point Conc. Lower Upper LC/EC 1.00 0.064 0.018 0.094 LC/EC 5.00 0.081 0.031 0.110 LC/EC 10.00 0.092 0.041 0.119 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
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LC/EC 15.00 0.101 0.049 0.126 LC/EC 50.00 0.145 0.106 0.164 LC/EC 85.00 0.208 0.187 0.260 LC/EC 90.00 0.227 0.201 0.308 LC/EC 95.00 0.258 0.221 0.401 LC/EC 99.00 0.327 0.261 0.669 CR 0.145 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592
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dem102007 PLOT OF ADJUSTED PROBITS AND PREDICTED REGRESSION LINE Probit 10+ ‐ ‐ ‐ ‐ 9+ ‐ ‐ ‐ ‐ 8+ ‐ ‐ ‐ . ‐ 7+ . ‐ o .. ‐ .. ‐ ... ‐ .... 6+ .... ‐ ...o ‐ ... ‐ .... ‐ o... 5+ ... ‐ .... ‐ .... ‐ ... ‐ .... 4+ .... ‐ .... ‐ ... Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592
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‐ .. ‐ .. 3+ . ‐ ‐. ‐ ‐ 2+ ‐ ‐ ‐ ‐ 1+ ‐ ‐ ‐ ‐ 0+ ‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐ EC01 EC10 EC25 EC50 EC75 EC90 EC99 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
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EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES Version 1.5 DEM112007 Proportion Observed Responding Predicted Number Number Proportion Adjusted for Proportion Conc. Exposed Resp. Responding Controls Responding 0.0620 30 16 0.5333 0.5333 0.5484 0.1250 30 25 0.8333 0.8333 0.8059 0.2500 30 28 0.9333 0.9333 0.9447 Chi ‐ Square for Heterogeneity (calculated) = 0.246 Chi ‐ Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) = 3.841 Mu = ‐1.257524 Sigma = 0.410840 Parameter Estimate Std. Err. 95% Confidence Limits ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ Intercept 8.060860 0.704409 ( 6.680218, 9.441502) Slope 2.434037 0.692079 ( 1.077562, 3.790512) Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000 DEM112007 Estimated LC/EC Values and Confidence Limits Exposure 95% Confidence Limits Point Conc. Lower Upper LC/EC 1.00 0.006 0.000 0.017 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592
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LC/EC 5.00 0.012 0.001 0.026 LC/EC 10.00 0.016 0.002 0.033 LC/EC 15.00 0.021 0.003 0.038 LC/EC 50.00 0.055 0.023 0.077 LC/EC 85.00 0.147 0.110 0.276 LC/EC 90.00 0.186 0.134 0.444 LC/EC 95.00 0.262 0.173 0.930 LC/EC 99.00 0.499 0.270 3.871 0.0210 hg Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
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DEM112007 PLOT OF ADJUSTED PROBITS AND PREDICTED REGRESSION LINE Probit 10+ ‐ ‐ ‐ ‐ 9+ ‐ ‐ ‐ ‐ 8+ ‐ ‐ ‐ . ‐ 7+ . ‐ .. ‐ o. ‐ ... ‐ .... 6+ o... ‐ .... ‐ ... ‐ .... ‐ .... 5+ ...o ‐ .... ‐ .... ‐ ... ‐ .... 4+ .... ‐ .... Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
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‐ ... ‐ .. ‐ .. 3+ . ‐ ‐. ‐ ‐ 2+ ‐ ‐ ‐ ‐ 1+ ‐ ‐ ‐ ‐ 0+ ‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐ EC01 EC10 EC25 EC50 EC75 EC90 EC99 EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES Version 1.5 DEM122007 Proportion Observed Responding Predicted Number Number Proportion Adjusted for Proportion Conc. Exposed Resp. Responding Controls Responding 0.6250 30 2 0.0667 0.0667 0.0713 1.2500 30 10 0.3333 0.3333 0.3218 2.5000 30 21 0.7000 0.7000 0.7057 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592
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Chi ‐ Square for Heterogeneity (calculated) = 0.033 Chi ‐ Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) = 3.841 Mu = 0.235698 Sigma = 0.299943 Parameter Estimate Std. Err. 95% Confidence Limits ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ Intercept 4.214191 0.186295 ( 3.849053, 4.579329) Slope 3.333966 0.681148 ( 1.998916, 4.669016) Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000 DEM122007 Estimated LC/EC Values and Confidence Limits Exposure 95% Confidence Limits Point Conc. Lower Upper LC/EC 1.00 0.345 0.128 0.538 LC/EC 5.00 0.552 0.277 0.765 LC/EC 10.00 0.710 0.414 0.930 LC/EC 15.00 0.841 0.540 1.067 LC/EC 50.00 1.721 1.400 2.264 1.721 as LC/EC 85.00 3.520 2.578 6.765 LC/EC 90.00 4.170 2.933 8.901 LC/EC 95.00 5.359 3.538 13.412 LC/EC 99.00 8.579 5.001 29.113 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592
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INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL
(CENICA)
DEM122007 PLOT OF ADJUSTED PROBITS AND PREDICTED REGRESSION LINE Probit 10+ ‐ ‐ ‐ ‐ 9+ ‐ ‐ ‐ ‐ 8+ ‐ ‐ ‐ . ‐ 7+ . ‐ .. ‐ .. ‐ ... ‐ .... 6+ .... ‐ .... ‐ o.. ‐ .... ‐ .... 5+ ... ‐ .... ‐ o... ‐ ... ‐ .... 4+ .... ‐ .... Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592
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(CENICA)
‐ ... ‐ .. o ‐ .. 3+ . ‐ ‐. ‐ ‐ 2+ ‐ ‐ ‐ ‐ 1+ ‐ ‐ ‐ ‐ 0+ ‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐ EC01 EC10 EC25 EC50 EC75 EC90 EC99 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592
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(CENICA)
EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES Version 1.5 DEM132007 Proportion Observed Responding Predicted Number Number Proportion Adjusted for Proportion Conc. Exposed Resp. Responding Controls Responding 0.0500 30 1 0.0333 0.0333 0.0263 0.1000 30 10 0.3333 0.3333 0.3613 0.1500 30 22 0.7333 0.7333 0.7161 Chi ‐ Square for Heterogeneity (calculated) = 0.204 Chi ‐ Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) = 3.841 Mu = ‐0.932532 Sigma = 0.190107 Parameter Estimate Std. Err. 95% Confidence Limits ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ Intercept 9.905293 1.051311 ( 7.844723, 11.965862) Slope 5.260186 1.085126 ( 3.133339, 7.387033) Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000 DEM132007 Estimated LC/EC Values and Confidence Limits Exposure 95% Confidence Limits Point Conc. Lower Upper LC/EC 1.00 0.042 0.021 0.057 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592
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LC/EC 5.00 0.057 0.035 0.071 LC/EC 10.00 0.067 0.045 0.080 LC/EC 15.00 0.074 0.054 0.088 LC/EC 50.00 0.117 0.101 0.138 LC/EC 85.00 0.184 0.152 0.271 LC/EC 90.00 0.205 0.165 0.323 LC/EC 95.00 0.240 0.186 0.419 LC/EC 99.00 0.323 0.232 0.686 0.117 cu Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592
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INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL
(CENICA)
DEM132007 PLOT OF ADJUSTED PROBITS AND PREDICTED REGRESSION LINE Probit 10+ ‐ ‐ ‐ ‐ 9+ ‐ ‐ ‐ ‐ 8+ ‐ ‐ ‐ . ‐ 7+ . ‐ .. ‐ .. ‐ ... ‐ .... 6+ .... ‐ .... ‐ o.. ‐ .... ‐ .... 5+ ... ‐ .... ‐ ..o. ‐ ... ‐ .... 4+ .... ‐ .... Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592
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INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL
(CENICA)
‐ ... ‐ .. ‐ o.. 3+ . ‐ ‐. ‐ ‐ 2+ ‐ ‐ ‐ ‐ 1+ ‐ ‐ ‐ ‐ 0+ ‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐ EC01 EC10 EC25 EC50 EC75 EC90 EC99 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592
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Instituto Politécnico Nacional
Escuela Nacional de Ciencias Biológicas
PROYECTO
“Pruebas biológicas para la evaluación ecotoxicológica de
sustancias químicas
Resultados de la prueba de toxicidad con Daphnia exilis
Fecha de Inicio
INSTITUCIÓN: __IPN-ENCB____
__21/AGO/07___
Fecha de Término _________
Reportar Número de Daphnias vivas RÉPLICA No. RÉPLICA No. RÉPLICA No.
TOTAL DE
2
3
1
ORGANISMOS
No.
No.
No.
No.
No.
No. Expuestos Muertos
a
b
Inicial Final Inicial Final Inicial Final
(t 0)
(t 48h)
CONTROL POSITIVO: Cr VI (
mg/L)
CONTROL NEGATIVO: Agua dura
No. MUESTRA 10
10
10
10
10
10
30
0
DILUCIÓN CE50
Obs.
23.9
0.0933
2
1.2
0.012
(%) 10
11
20
9
8
10
7
10
6
29
8
25
30
35
40
10
10
10
10
7
3
1
1
10
10
10
10
6
1
1
1
10
10
10
10
3
3
2
1
30
30
30
30
14
23
26
27
0.8
1.6
2.4
3.2
10
10
10
10
7
3
2
2
10
10
10
10
5
7
3
1
10
10
10
10
9
1
0
1
30
30
30
30
9
15
25
26
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Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592
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a
4.0
10
0
10
1
10
0
30
30
12
30
50
70
90
10
10
10
10
10
4
0
0
10
10
10
10
10
3
0
0
10
10
10
10
10
4
1
0
30
30
30
30
0
19
29
30
47.6
13
40
60
80
10
10
10
8
6
0
10
10
10
8
6
3
10
10
10
7
2
0
30
30
30
7
16
27
54.3 0.2172
= ∑ del No. inicial en la Réplica 1 + Rép. 2 + Rép. 3
% Efecto en:
(No org. muertos/30 x 100)
b
3.81
= a - (∑ del No. final en la Rep. 1 + Rép. 2 + Rép. 3 )
Control positivo________________ Control negativo______________
OBSERVACION
ES:
ANALISTA
FIRMA:
RESPONSABLE
S
FECHA:
FIRMA
:
FECHA:
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Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592
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RESULTADOS DE LOS BIOENSAYOS CON MUESTRAS CIEGAS 07 Y Daphnia exilis REALIZADOS EN LA UAMI EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES Version 1.5 bioensayo con muestra ciega 10 y daphnia exilis Proportion Observed Responding Predicted Number Number Proportion Adjusted for Proportion Conc. Exposed Resp. Responding Controls Responding 10.0000 30 2 0.0667 0.0667 0.0334 20.0000 30 5 0.1667 0.1667 0.2185 40.0000 30 18 0.6000 0.6000 0.6098 60.0000 30 23 0.7667 0.7667 0.8150 80.0000 30 29 0.9667 0.9667 0.9090 Chi ‐ Square for Heterogeneity (calculated) = 3.186 Chi ‐ Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) = 7.815 Mu = 1.522618 Sigma = 0.285027 Parameter Estimate Std. Err. 95% Confidence Limits ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ Intercept ‐0.342005 0.750221 ( ‐1.812438, 1.128429) Slope 3.508434 0.472253 ( 2.582819, 4.434049) Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000 bioensayo con muestra ciega 10 y daphnia exilis Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592
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Estimated LC/EC Values and Confidence Limits Exposure 95% Confidence Limits Point Conc. Lower Upper LC/EC 1.00 7.237 3.922 10.470 LC/EC 5.00 11.318 7.127 15.067 LC/EC 10.00 14.366 9.767 18.354 LC/EC 15.00 16.874 12.056 21.016 LC/EC 50.00 33.313 27.881 39.214 0.133 cr LC/EC 85.00 65.769 54.286 86.908 LC/EC 90.00 77.252 62.386 106.881 LC/EC 95.00 98.053 76.253 145.990 LC/EC 99.00 153.348 110.088 264.442 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592
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bioensayo con muestra ciega 10 y daphnia exilis PLOT OF ADJUSTED PROBITS AND PREDICTED REGRESSION LINE Probit 10+ ‐ ‐ ‐ ‐ 9+ ‐ ‐ ‐ ‐ 8+ ‐ ‐ ‐ . ‐ 7+ . ‐ o .. ‐ .. ‐ ... ‐ .... 6+ .... ‐ ...o ‐ ... ‐ .... ‐ ...o 5+ ... ‐ .... ‐ .... ‐ ... ‐ .... 4+ .... o ‐ .... Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592
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‐ ... ‐ o .. ‐ .. 3+ . ‐ ‐. ‐ ‐ 2+ ‐ ‐ ‐ ‐ 1+ ‐ ‐ ‐ ‐ 0+ ‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐ EC01 EC10 EC25 EC50 EC75 EC90 EC99 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
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EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES Version 1.5 Bioensayo con muestra ciega 11 y daphnia exilis Proportion Observed Responding Predicted Number Number Proportion Adjusted for Proportion Conc. Exposed Resp. Responding Controls Responding 0.7800 30 0 0.0000 0.0000 0.0194 1.5600 30 6 0.2000 0.2000 0.1402 3.1200 30 14 0.4667 0.4667 0.4631 6.2500 30 22 0.7333 0.7333 0.8150 12.5000 30 30 1.0000 1.0000 0.9702 25.0000 30 30 1.0000 1.0000 0.9979 Chi ‐ Square for Heterogeneity (calculated) = 3.796 Chi ‐ Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) = 9.488 Mu = 0.522437 Sigma = 0.305037 Parameter Estimate Std. Err. 95% Confidence Limits ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ Intercept 3.287298 0.257122 ( 2.783340, 3.791256) Slope 3.278291 0.413455 ( 2.467919, 4.088664) Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000 Bioensayo con muestra ciega 11 y daphnia exilis Estimated LC/EC Values and Confidence Limits Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
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Exposure 95% Confidence Limits Point Conc. Lower Upper LC/EC 1.00 0.650 0.363 0.938 LC/EC 5.00 1.049 0.676 1.397 LC/EC 10.00 1.354 0.937 1.736 LC/EC 15.00 1.608 1.165 2.016 LC/EC 50.00 3.330 2.744 4.0330.033 Hg LC/EC 85.00 6.896 5.519 9.454 LC/EC 90.00 8.192 6.413 11.743 LC/EC 95.00 10.573 7.970 16.272 LC/EC 99.00 17.063 11.874 30.274 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
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Bioensayo con muestra ciega 11 y daphnia exilis PLOT OF ADJUSTED PROBITS AND PREDICTED REGRESSION LINE Probit 10+ o o ‐ ‐ ‐ ‐ 9+ ‐ ‐ ‐ ‐ 8+ ‐ ‐ ‐ . ‐ 7+ . ‐ .. ‐ .. ‐ ... ‐ .... 6+ .... ‐ .... ‐ ... o ‐ .... ‐ .... 5+ o.. ‐ .... ‐ .... ‐ ... ‐ o .... 4+ .... ‐ .... Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
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‐ ... ‐ .. ‐ .. 3+ . ‐ ‐. ‐ ‐ 2+ ‐ ‐ ‐ ‐ 1+ ‐ ‐ ‐ ‐ 0+ o ‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐ EC01 EC10 EC25 EC50 EC75 EC90 EC99 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
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EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES Version 1.5 bioensayo con muestra ciega 12 y daphnia exilis Proportion Observed Responding Predicted Number Number Proportion Adjusted for Proportion Conc. Exposed Resp. Responding Controls Responding 10.0000 30 0 0.0000 0.0000 0.0023 20.0000 30 3 0.1000 0.1000 0.0596 40.0000 30 10 0.3333 0.3333 0.3886 60.0000 30 20 0.6667 0.6667 0.6784 80.0000 30 23 0.7667 0.7667 0.8395 100.0000 30 30 1.0000 1.0000 0.9197 Chi ‐ Square for Heterogeneity (calculated) = 5.151 Chi ‐ Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) = 9.488 Mu = 1.668829 Sigma = 0.236006 Parameter Estimate Std. Err. 95% Confidence Limits ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ Intercept ‐2.071122 0.979860 ( ‐3.991647, ‐0.150597) Slope 4.237176 0.564457 ( 3.130840, 5.343512) Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000 bioensayo con muestra ciega 12 y daphnia exilis Estimated LC/EC Values and Confidence Limits Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
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Exposure 95% Confidence Limits Point Conc. Lower Upper LC/EC 1.00 13.177 7.888 17.967 LC/EC 5.00 19.082 12.922 24.282 LC/EC 10.00 23.247 16.772 28.579 LC/EC 15.00 26.560 19.968 31.953 LC/EC 50.00 46.648 40.211 53.148 3.73 as LC/EC 85.00 81.927 70.463 101.591 LC/EC 90.00 93.604 79.130 120.415 LC/EC 95.00 114.034 93.516 155.655 LC/EC 99.00 165.139 126.870 254.009 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
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bioensayo con muestra ciega 12 y daphnia exilis PLOT OF ADJUSTED PROBITS AND PREDICTED REGRESSION LINE Probit 10+ o ‐ ‐ ‐ ‐ 9+ ‐ ‐ ‐ ‐ 8+ ‐ ‐ ‐ . ‐ 7+ . ‐ .. ‐ .. ‐ ... ‐ .... 6+ .... ‐ .... o ‐ ... ‐ ...o ‐ .... 5+ ... ‐ .... ‐ ...o ‐ ... ‐ .... 4+ .... ‐ o .... Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
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EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES Version 1.5 bioensayo con muestra ciega 13 y daphnia exilis Proportion Observed Responding Predicted Number Number Proportion Adjusted for Proportion Conc. Exposed Resp. Responding Controls Responding 10.0000 30 0 0.0000 0.0000 0.0031 20.0000 30 4 0.1333 0.1333 0.0453 40.0000 30 5 0.1667 0.1667 0.2574 60.0000 30 11 0.3667 0.3667 0.4829 80.0000 30 15 0.5000 0.5000 0.6514 100.0000 30 30 1.0000 1.0000 0.7655 Chi ‐ Square for Heterogeneity (calculated) = 20.601 Chi ‐ Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) = 9.488 *************************************************************** * WARNING * * * * The tabular chi‐square value exceeds the calculated * * chi‐square value for heterogeneity. This is evidence that * * the probit model may not be appropriate for these data. * * The results reported for this data set may not be valid, * * and should be interpreted with appropriate caution. * *************************************************************** Mu = 1.790522 Sigma = 0.289270 Parameter Estimate Std. Err. 95% Confidence Limits ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
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Intercept ‐1.189789 2.154590 ( ‐7.170931, 4.791353) Slope 3.456975 1.210097 ( 0.097745, 6.816206) Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000 bioensayo con muestra ciega 13 y daphnia exilis Estimated LC/EC Values and Confidence Limits Exposure 95% Confidence Limits Point Conc. Lower Upper LC/EC 1.00 13.110 0.000 29.666 LC/EC 5.00 20.640 0.000 38.646 LC/EC 10.00 26.290 0.000 45.200 LC/EC 15.00 30.954 0.000 50.964 LC/EC 50.00 61.734 16.228 1410.444 0.24 Cu LC/EC 85.00 123.118 72.843 %17881983090688.000 LC/EC 90.00 144.961 81.405 % 560660735.853E+07 LC/EC 95.00 184.647 94.580 % 284234135.170E+11 LC/EC 99.00 290.704 122.573 % 100000002.004E+12 NOTE ‐ Upper limits greater than or equal to 1.E20 are really infinite Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592
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bioensayo con muestra ciega 13 y daphnia exilis PLOT OF ADJUSTED PROBITS AND PREDICTED REGRESSION LINE Probit 10+ o ‐ ‐ ‐ ‐ 9+ ‐ ‐ ‐ ‐ 8+ ‐ ‐ ‐ . ‐ 7+ . ‐ .. ‐ .. ‐ ... ‐ .... 6+ .... ‐ .... ‐ ... ‐ .... ‐ .... 5+ ... o ‐ .... ‐ .... o ‐ ... ‐ .... 4+ .... o ‐ o .... Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
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EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM
USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES
Version 1.5
Muestra ciega 10: MAGNA
Number
Exposed
Conc.
12.0000
25.0000
50.0000
100.0000
20
20
20
20
Number
Resp.
3
11
19
20
Observed
Proportion
Responding
Proportion
Responding
Adjusted for
Controls
Predicted
Proportion
Responding
0.1500
0.5500
0.9500
1.0000
0.1500
0.5500
0.9500
1.0000
0.1293
0.5950
0.9375
0.9977
Chi - Square for Heterogeneity (calculated)
Chi - Square for Heterogeneity
(tabular value at 0.05 level)
Mu
Sigma
=
=
=
0.344
=
5.991
1.342022
0.232697
Parameter
Estimate
Std. Err.
95% Confidence Limits
--------------------------------------------------------------------Intercept
-0.767244
1.168410
(
-3.057328,
1.522840)
Slope
4.297430
0.839783
(
2.651454,
5.943405)
Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000
Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592
Correo electrónico cenica@ine.gob.mx
DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE
INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL
(CENICA)
MAGNA
Estimated LC/EC Values and Confidence Limits
Exposure
Conc.
Point
LC/EC
LC/EC
LC/EC
LC/EC
LC/EC
LC/EC
LC/EC
LC/EC
LC/EC
1.00
5.00
10.00
15.00
50.00
85.00
90.00
95.00
99.00
6.320
9.105
11.061
12.614
21.980
38.299
43.676
53.062
76.444
95% Confidence Limits
Lower
Upper
2.683
4.781
6.476
7.923
17.345
30.472
34.022
39.785
52.726
9.473
12.510
14.575
16.207
27.209
56.916
69.362
93.606
166.201
Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592
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INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL
(CENICA)
MAGNA
PLOT OF ADJUSTED PROBITS AND PREDICTED REGRESSION LINE
Probit
10+
9+
8+
7+
6+
5+
4+
-
o
.
.
..
o..
...
....
....
....
...
....
...o
...
....
....
...
....
o....
....
...
..
Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
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INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL
(CENICA)
..
3+
.
-.
2+
1+
0+
-+--------------+--------+---------+---------+--------+--------------+EC01
EC10
EC25
EC50
EC75
EC90
EC99
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Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592
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INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL
(CENICA)
EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM
USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES
Version 1.5
Selenastrum capricornutum
MUESTRA CIEGA 10
2007/09/04
Proportion
Observed Responding Predicted
Number Number Proportion Adjusted for Proportion
Conc. Exposed Resp. Responding Controls
Responding
10.0000
25.0000
50.0000
100
100
100
31
66
97
0.3100
0.6600
0.9700
0.3100
0.6600
0.9700
0.2788
0.7321
0.9371
Chi - Square for Heterogeneity (calculated) = 4.968
Chi - Square for Heterogeneity
(tabular value at 0.05 level)
= 3.841
***************************************************************
*
WARNING
*
* The tabular chi-square value exceeds the calculated
*
* chi-square value for heterogeneity. This is evidence that *
* the probit model may not be appropriate for these data. *
* The results reported for this data set may not be valid, *
* and should be interpreted with appropriate caution.
*
***************************************************************
*
NOTE
*
* Slope not significantly different from zero.
*
* LC/EC fiducial limits cannot be computed.
*
***************************************************************
Mu
= 1.193570
Sigma = 0.330079
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INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL
(CENICA)
Parameter
Estimate Std. Err.
95% Confidence Limits
--------------------------------------------------------------------Intercept
1.383990 0.944209 ( -10.613124, 13.381104)
Slope
3.029574 0.715767 ( -6.064964, 12.124112)
Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000
Estimated LC/EC Values and Confidence Limits
Exposure
Point
Conc.
LC/EC 1.00
2.665
LC/EC 5.00
4.473
LC/EC 10.00
5.896
LC/EC 15.00
7.104
LC/EC 50.00
15.616
LC/EC 85.00
34.329
LC/EC 90.00
41.362
LC/EC 95.00
54.515
LC/EC 99.00
91.503
95% Confidence Limits
Lower
Upper
0.062 cR
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INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL
(CENICA)
PLOT OF ADJUSTED PROBITS AND PREDICTED REGRESSION LINE
Probit
10+
9+
8+
.
7+
.
o ..
..
...
....
6+
....
....
...
.... o
....
5+
...
....
o ....
...
....
4+
....
....
...
..
..
3+ .
Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
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INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL
(CENICA)
-.
2+
1+
0+
-+--------------+--------+---------+---------+--------+--------------+EC01
EC10 EC25
EC50
EC75 EC90
EC99
EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM
USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES
Version 1.5
MUESTRA CIEGA 11
2007/09/04
Proportion
Observed Responding Predicted
Number Number Proportion Adjusted for Proportion
Conc. Exposed Resp. Responding Controls
Responding
2.5000 100
49
0.4900
0.4900
0.4172
5.0000 100
60
0.6000
0.6000
0.7352
7.5000 100
86
0.8600
0.8600
0.8684
10.0000 100
99
0.9900
0.9900
0.9287
Chi - Square for Heterogeneity (calculated) = 17.303
Chi - Square for Heterogeneity
(tabular value at 0.05 level)
= 5.991
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INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL
(CENICA)
***************************************************************
*
WARNING
*
* The tabular chi-square value exceeds the calculated
*
* chi-square value for heterogeneity. This is evidence that *
* the probit model may not be appropriate for these data. *
* The results reported for this data set may not be valid, *
* and should be interpreted with appropriate caution.
*
***************************************************************
*
NOTE
*
* Slope not significantly different from zero.
*
* LC/EC fiducial limits cannot be computed.
*
***************************************************************
Mu
= 0.473093
Sigma = 0.359340
Parameter
Estimate Std. Err.
95% Confidence Limits
--------------------------------------------------------------------Intercept
3.683439 0.688076 ( 0.722649, 6.644229)
Slope
2.782878 0.959982 ( -1.347925, 6.913682)
Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000
Estimated LC/EC Values and Confidence Limits
Point
Exposure
Conc.
LC/EC 1.00
LC/EC 5.00
LC/EC 10.00
LC/EC 15.00
LC/EC 50.00
LC/EC 85.00
LC/EC 90.00
LC/EC 95.00
LC/EC 99.00
0.434
0.762
1.029
1.261
2.972
7.007
8.583
11.592
20.372
95% Confidence Limits
Lower
Upper
0.029 Hg
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INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL
(CENICA)
PLOT OF ADJUSTED PROBITS AND PREDICTED REGRESSION LINE
Probit
10+
9+
8+
7+
6+
5+
4+
-
o
.
.
..
..
...
....
...o
....
...
....
.... o
o ...
....
....
...
....
....
....
...
..
..
Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592
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INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL
(CENICA)
3+ .
-.
2+
1+
0+
-+--------------+--------+---------+---------+--------+--------------+EC01
EC10 EC25
EC50
EC75 EC90
EC99
EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM
USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES
Version 1.5
MUETRA CIEGA 12
Proportion
Observed Responding Predicted
Number Number Proportion Adjusted for Proportion
Conc. Exposed Resp. Responding Controls
Responding
0.1000
0.5000
1.0000
2.5000
100
100
100
100
0
18
40
90
0.0000
0.1800
0.4000
0.9000
0.0000
0.1800
0.4000
0.9000
0.0005
0.1470
0.4622
0.8784
Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
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DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE
INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL
(CENICA)
Chi - Square for Heterogeneity (calculated) = 2.917
Chi - Square for Heterogeneity
(tabular value at 0.05 level)
= 5.991
Mu
= 0.029904
Sigma = 0.315406
Parameter
Estimate Std. Err.
95% Confidence Limits
--------------------------------------------------------------------Intercept
4.905189 0.083274 ( 4.741972, 5.068406)
Slope
3.170518 0.308182 ( 2.566482, 3.774554)
Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000
Estimated LC/EC Values and Confidence Limits
Point
Exposure
Conc.
LC/EC 1.00
LC/EC 5.00
LC/EC 10.00
LC/EC 15.00
LC/EC 50.00
LC/EC 85.00
LC/EC 90.00
LC/EC 95.00
LC/EC 99.00
0.198
0.324
0.422
0.505
1.071
2.274
2.717
3.538
5.803
95% Confidence Limits
Lower
Upper
0.131
0.240
0.330
0.408
0.951
1.923
2.247
2.823
4.310
0.263
0.402
0.506
0.591
1.211
2.855
3.536
4.866
8.900
0.0856 As
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DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE
INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL
(CENICA)
PLOT OF ADJUSTED PROBITS AND PREDICTED REGRESSION LINE
Probit
10+
9+
8+
7+
..
..
...
.o..
6+
....
....
...
....
....
5+
...
...o
....
...
....
4+
.o..
....
...
..
..
3+ .
.
.
Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
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DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE
INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL
(CENICA)
-.
2+
1+
0+o
-+--------------+--------+---------+---------+--------+--------------+EC01
EC10 EC25
EC50
EC75 EC90
EC99
EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM
USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES
Version 1.5
MUESTRA CIEGA 13
2007/09/03
Proportion
Observed Responding Predicted
Number Number Proportion Adjusted for Proportion
Conc. Exposed Resp. Responding Controls
Responding
60.0000
80.0000
100.0000
100
100
100
43
93
98
0.4300
0.9300
0.9800
0.4300
0.9300
0.9800
0.4454
0.9010
0.9916
Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592
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DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE
INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL
(CENICA)
Chi - Square for Heterogeneity (calculated) = 2.659
Chi - Square for Heterogeneity
(tabular value at 0.05 level)
= 3.841
Mu
= 1.790183
Sigma = 0.087713
Parameter
Estimate Std. Err.
95% Confidence Limits
--------------------------------------------------------------------Intercept -15.409530 2.514245 ( -20.337450, -10.481609)
Slope
11.400805 1.370869 ( 8.713902, 14.087709)
Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000
Estimated LC/EC Values and Confidence Limits
Point
Exposure
Conc.
LC/EC 1.00
LC/EC 5.00
LC/EC 10.00
LC/EC 15.00
LC/EC 50.00
LC/EC 85.00
LC/EC 90.00
LC/EC 95.00
LC/EC 99.00
38.560
44.249
47.618
50.035
61.686
76.048
79.909
85.993
98.680
95% Confidence Limits
Lower
Upper
32.190
38.475
42.294
45.070
58.523
72.906
76.221
81.220
91.164
43.208
48.379
51.409
53.578
64.276
80.374
85.378
93.591
111.594
0.2467 cu
Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592
Correo electrónico cenica@ine.gob.mx
DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE
INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL
(CENICA)
PLOT OF ADJUSTED PROBITS AND PREDICTED REGRESSION LINE
Probit
10+
9+
8+
7+
..
..
o...
....
6+
....
....
...
....
....
5+
...
..o.
....
...
....
4+
....
....
...
..
..
3+ .
.
.
o
Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592
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DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE
INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL
(CENICA)
-.
2+
1+
0+
-+--------------+--------+---------+---------+--------+--------------+EC01
EC10 EC25
EC50
EC75 EC90
EC99
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Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592
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INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL
(CENICA)
Instituto Politécnico Nacional
Escuela Nacional de Ciencias Biológicas
PROYECTO
“Pruebas biológicas para la evaluación ecotoxicológica de
sustancias químicas
Resultados de la prueba de toxicidad con Selenastrum capricornutum
Fecha de Inicio
INSTITUCIÓN: IPN, ENCB
13 Agosto 2007
Fecha de Término 25 Agosto 2007
Reportar Número de células x campo RÉPLICA No.
1
CONTROL NEGATIVO:
Medio mineral
2
3
TOTAL DE ORGANISMOS
4
5
137. 122. 137.
5
5
5 140 143
PROMEDIO
%
1
2
(No. cél x mL) INHIBICIÓN
136.1
0
DILUCIÓN CE50
Obs.
(µg/L) 20
40
60
80
100
CONTROL
POSITIVO
+2
(Cu )
No. MUESTRA 117 112 107
75 85 92.5
48 52 38.5
14.5 29.5 15
13.5 13.5
9
112
84.167
46.167
19.667
12
17.708 42.89
38.158
66.079
85.550
91.183
DILUCIÓN (%) 10 IPN
50
100
85 120
102.
5 65
70
91.67
5.172
95
87.50
9.483
No tóxica
Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592
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DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE
INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL
(CENICA)
12 IPN
10
25
50
100
130 105 92.5
87.5 80 40
29 37.5 54.5
5
4 7.5
109.2
69.2
40.3
5.5
6.429 31.77
40.714
65.429
95.286
2.59
13 IPN
10
25
50
100
160 130 105
125 110 125
55 52 53
1
2
1
131.67
120.00
53.33
1.33
6.064 36.95
14.388
61.950
99.049
0.21
1) No de células x campo x 10,000
2) 100 – ( (Prom cé/mL muestra/ Prom.células/mL control-)x100)
Control negativo________________ Control positivo_______________ OBSERVACION
ES:
ANALISTA
FIRMA:
RESPONSABLE
FECHA:
Instituto Politécnico Nacional
Escuela Nacional de Ciencias Biológicas
FIRMA
:
FECHA:
PROYECTO
“Pruebas biológicas para la evaluación ecotoxicológica de
sustancias químicas
Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592
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Resultados de la prueba de toxicidad con Selenastrum capricornutum
Fecha de Inicio
INSTITUCIÓN: IPN, ENCB
13 Agosto 2007
Fecha de Término 25 Agosto 2007
Reportar Número de células x campo RÉPLICA No.
1
CONTROL NEGATIVO:
Medio mineral
225
2
3
TOTAL DE ORGANISMOS
4
5
237. 267.
5
5 252 265
PROMEDIO
%
1
2
(No. cél x mL) INHIBICIÓN
249.4
0
DILUCIÓN CE50
Obs.
(PPM) CONTROL
POSITIVO
+2
(Cu )
No. MUESTRA 40
60
80
100
192.
5
79.5
23.5
4.5
192.
195
5
135 110
21.5 17.5
3.5
6
193.333
108.167
20.833
4.667
20.55 55.35
55.55
91.44
98.08
215
11.64 16.89
DILUCIÓN (%) 11 IPN
6.25
12.5
25
50
215 220 210
127. 112.
105
5
5
57.5 65 105
65 62.5 70
115
75.83
65.83
52.74
68.84
72.95
Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592
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1) No de células x campo x 10,000
2) 100 – ( (Prom cé/mL muestra/ Prom.células/mL control-)x100)
Control negativo________________ Control positivo_______________ OBSERVACION
ES:
ANALISTA
FIRMA:
RESPONSABLE
FECHA:
FIRMA
:
FECHA:
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RESULTADOS DE LOS BIOENSAYOS CON MUESTRAS CIEGAS Y Selenastrun capricornatum REALIZADOS EN LA UAMI PROBIT ANALYSIS PROGRAM USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES Version 1.5 bioensayo con muestra ciega 10 y selenastrum‐UAMI Proportion Observed Responding Predicted Number Number Proportion Adjusted for Proportion Conc. Exposed Resp. Responding Controls Responding 20.0000 100 16 0.1600 0.1600 0.1762 40.0000 100 69 0.6900 0.6900 0.6445 60.0000 100 85 0.8500 0.8500 0.8710 80.0000 100 95 0.9500 0.9500 0.9526 Chi ‐ Square for Heterogeneity (calculated) = 1.494 Chi ‐ Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) = 5.991 Mu = 1.516310 Sigma = 0.231459 Parameter Estimate Std. Err. 95% Confidence Limits ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ Intercept ‐1.551091 0.594456 ( ‐2.716224, ‐0.385957) Slope 4.320415 0.368534 ( 3.598088, 5.042743) Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000 bioensayo con muestra ciega 10 y selenastrum‐UAMI Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
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Estimated LC/EC Values and Confidence Limits Exposure 95% Confidence Limits Point Conc. Lower Upper LC/EC 1.00 9.503 7.036 11.821 LC/EC 5.00 13.664 10.837 16.202 LC/EC 10.00 16.583 13.627 19.191 LC/EC 15.00 18.898 15.893 21.532 LC/EC 50.00 32.833 29.897 35.663 0.1313 Cr LC/EC 85.00 57.042 52.011 63.872 LC/EC 90.00 65.005 58.612 74.165 LC/EC 95.00 78.893 69.707 92.879 LC/EC 99.00 113.437 95.905 142.514 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
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bioensayo con muestra ciega 10 y selenastrum‐UAMI PLOT OF ADJUSTED PROBITS AND PREDICTED REGRESSION LINE Probit 10+ ‐ ‐ ‐ ‐ 9+ ‐ ‐ ‐ ‐ 8+ ‐ ‐ ‐ . ‐ 7+ . ‐ .. ‐ .o ‐ ... ‐ .... 6+ ....o ‐ .... ‐ ... ‐ .o.. ‐ .... 5+ ... ‐ .... ‐ .... ‐ ... ‐ .... 4+ ..o. ‐ .... Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
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‐ ... ‐ .. ‐ .. 3+ . ‐ ‐. ‐ ‐ 2+ ‐ ‐ ‐ ‐ 1+ ‐ ‐ ‐ ‐ 0+ ‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐ EC01 EC10 EC25 EC50 EC75 EC90 EC99 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
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EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES Version 1.5 bioensayo con muestra ciega 11 y Selenastrum‐UAMI Proportion Observed Responding Predicted Number Number Proportion Adjusted for Proportion Conc. Exposed Resp. Responding Controls Responding 0.3100 100 0 0.0000 0.0000 0.0188 1.2500 100 26 0.2600 0.2600 0.2678 2.5000 100 61 0.6100 0.6100 0.5421 5.0000 100 83 0.8300 0.8300 0.7970 10.0000 100 89 0.8900 0.8900 0.9402 Chi ‐ Square for Heterogeneity (calculated) = 8.954 Chi ‐ Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) = 7.815 *************************************************************** * WARNING * * * * The tabular chi‐square value exceeds the calculated * * chi‐square value for heterogeneity. This is evidence that * * the probit model may not be appropriate for these data. * * The results reported for this data set may not be valid, * * and should be interpreted with appropriate caution. * *************************************************************** Mu = 0.354023 Sigma = 0.415098 Parameter Estimate Std. Err. 95% Confidence Limits ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
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Intercept 4.147134 0.180901 ( 3.571509, 4.722760) Slope 2.409067 0.326693 ( 1.369531, 3.448602) Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000 bioensayo con muestra ciega 11 y Selenastrum Estimated LC/EC Values and Confidence Limits Exposure 95% Confidence Limits Point Conc. Lower Upper LC/EC 1.00 0.245 0.038 0.531 LC/EC 5.00 0.469 0.118 0.856 LC/EC 10.00 0.664 0.213 1.113 LC/EC 15.00 0.839 0.315 1.336 LC/EC 50.00 2.260 1.449 3.313 0.0226 LC/EC 85.00 6.085 4.022 13.622 LC/EC 90.00 7.692 4.866 20.028 LC/EC 95.00 10.885 6.372 35.905 LC/EC 99.00 20.877 10.344 109.625 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
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bioensayo con muestra ciega 11 y Selenastrum‐UAMI PLOT OF ADJUSTED PROBITS AND PREDICTED REGRESSION LINE Probit 10+ ‐ ‐ ‐ ‐ 9+ ‐ ‐ ‐ ‐ 8+ ‐ ‐ ‐ . ‐ 7+ . ‐ .. ‐ .. ‐ ... ‐ .... o 6+ o.... ‐ .... ‐ ... ‐ .... ‐ .o.. 5+ ... ‐ .... ‐ .... ‐ .o. ‐ .... 4+ .... ‐ .... Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
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‐ ... ‐ .. ‐ .. 3+ . ‐ ‐. ‐ ‐ 2+ ‐ ‐ ‐ ‐ 1+ ‐ ‐ ‐ ‐ 0+ o ‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐ EC01 EC10 EC25 EC50 EC75 EC90 EC99 EPA EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES Version 1.5 bioensayo con muestra ciega 12 y selenastrum‐UAMI Proportion Observed Responding Predicted Number Number Proportion Adjusted for Proportion Conc. Exposed Resp. Responding Controls Responding 1.0000 100 13 0.1300 0.1300 0.1050 5.0000 100 37 0.3700 0.3700 0.3549 10.0000 100 44 0.4400 0.4400 0.5030 50.0000 100 76 0.7600 0.7600 0.8129 100.0000 100 96 0.9600 0.9600 0.8977 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
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Chi ‐ Square for Heterogeneity (calculated) = 8.421 Chi ‐ Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) = 7.815 *************************************************************** * WARNING * * * * The tabular chi‐square value exceeds the calculated * * chi‐square value for heterogeneity. This is evidence that * * the probit model may not be appropriate for these data. * * The results reported for this data set may not be valid, * * and should be interpreted with appropriate caution. * *************************************************************** Mu = 0.994114 Sigma = 0.793090 Parameter Estimate Std. Err. 95% Confidence Limits ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ Intercept 3.746532 0.209519 ( 3.079844, 4.413220) Slope 1.260890 0.169503 ( 0.721533, 1.800248) Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000 bioensayo con muestra ciega 12 y selenastrum‐UAMI Estimated LC/EC Values and Confidence Limits Exposure 95% Confidence Limits Point Conc. Lower Upper LC/EC 1.00 0.141 0.005 0.583 LC/EC 5.00 0.489 0.040 1.448 LC/EC 10.00 0.950 0.124 2.382 LC/EC 15.00 1.486 0.263 3.366 LC/EC 50.00 9.865 4.747 19.156 0.7892 As Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
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LC/EC 85.00 65.475 30.770 303.885 LC/EC 90.00 102.456 43.834 638.341 LC/EC 95.00 198.915 72.629 1954.661 LC/EC 99.00 690.367 181.397 16460.193 bioensayo con muestra ciega 12 y selenastrum‐UAMI PLOT OF ADJUSTED PROBITS AND PREDICTED REGRESSION LINE Probit 10+ ‐ ‐ ‐ ‐ 9+ ‐ ‐ ‐ ‐ 8+ ‐ ‐ ‐ . ‐ 7+ . ‐ o .. ‐ .. ‐ ... ‐ .... 6+ .... ‐ ...o ‐ ... ‐ .... ‐ .... Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
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5+ ... ‐ ....o ‐ ..o. ‐ ... ‐ .... 4+ .... ‐ .o.. ‐ ... ‐ .. ‐ .. 3+ . ‐ ‐. ‐ ‐ 2+ ‐ ‐ ‐ ‐ 1+ ‐ ‐ ‐ ‐ 0+ ‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐ EC01 EC10 EC25 EC50 EC75 EC90 EC99 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
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EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES Version 1.5 bioensayo con muestra ciega 13 y selenastrum‐UAMI Proportion Observed Responding Predicted Number Number Proportion Adjusted for Proportion Conc. Exposed Resp. Responding Controls Responding 10.0000 100 28 0.2800 0.2800 0.2909 20.0000 100 45 0.4500 0.4500 0.4049 40.0000 100 50 0.5000 0.5000 0.5277 60.0000 100 53 0.5300 0.5300 0.5990 80.0000 100 71 0.7100 0.7100 0.6479 Chi ‐ Square for Heterogeneity (calculated) = 4.886 Chi ‐ Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) = 7.815 Mu = 1.534580 Sigma = 0.970845 Parameter Estimate Std. Err. 95% Confidence Limits ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ Intercept 3.419336 0.276081 ( 2.878217, 3.960454) Slope 1.030030 0.177253 ( 0.682615, 1.377446) Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000 bioensayo con muestra ciega 13 y selenastrum‐UAMI Estimated LC/EC Values and Confidence Limits Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
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Exposure 95% Confidence Limits Point Conc. Lower Upper LC/EC 1.00 0.189 0.013 0.709 LC/EC 5.00 0.866 0.132 2.232 LC/EC 10.00 1.951 0.445 4.125 LC/EC 15.00 3.376 1.011 6.262 LC/EC 50.00 34.244 26.318 44.843 0.1369 cu LC/EC 85.00 347.348 185.074 1189.282 LC/EC 90.00 600.918 280.843 2700.129 LC/EC 95.00 1353.704 519.015 9133.452 LC/EC 99.00 6209.519 1633.007 90309.078 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592
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bioensayo con muestra ciega 13 y selenastrum‐UAMI PLOT OF ADJUSTED PROBITS AND PREDICTED REGRESSION LINE Probit 10+ ‐ ‐ ‐ ‐ 9+ ‐ ‐ ‐ ‐ 8+ ‐ ‐ ‐ . ‐ 7+ . ‐ .. ‐ .. ‐ ... ‐ .... 6+ .... ‐ .... ‐ o ... ‐ .... ‐ .... 5+ ..o o ‐ o... ‐ .... ‐ ..o ‐ .... 4+ .... ‐ .... Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592
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‐ ... ‐ .. ‐ .. 3+ . ‐ ‐. ‐ ‐ 2+ ‐ ‐ ‐ ‐ 1+ ‐ ‐ ‐ ‐ 0+ ‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐ EC01 EC10 EC25 EC50 EC75 EC90 EC99 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
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EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM
USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES
Version 1.5
Muestra ciega 10: MAGNA
Number
Exposed
Conc.
12.0000
25.0000
50.0000
100.0000
20
20
20
20
Number
Resp.
3
11
19
20
Observed
Proportion
Responding
Proportion
Responding
Adjusted for
Controls
Predicted
Proportion
Responding
0.1500
0.5500
0.9500
1.0000
0.1500
0.5500
0.9500
1.0000
0.1293
0.5950
0.9375
0.9977
Chi - Square for Heterogeneity (calculated)
Chi - Square for Heterogeneity
(tabular value at 0.05 level)
Mu
Sigma
=
=
=
0.344
=
5.991
1.342022
0.232697
Parameter
Estimate
Std. Err.
95% Confidence Limits
--------------------------------------------------------------------Intercept
-0.767244
1.168410
(
-3.057328,
1.522840)
Slope
4.297430
0.839783
(
2.651454,
5.943405)
Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000
Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592
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MAGNA
Estimated LC/EC Values and Confidence Limits
Exposure
Conc.
Point
LC/EC
LC/EC
LC/EC
LC/EC
LC/EC
LC/EC
LC/EC
LC/EC
LC/EC
1.00
5.00
10.00
15.00
50.00
85.00
90.00
95.00
99.00
6.320
9.105
11.061
12.614
21.980
38.299
43.676
53.062
76.444
95% Confidence Limits
Lower
Upper
2.683
4.781
6.476
7.923
17.345
30.472
34.022
39.785
52.726
9.473
12.510
14.575
16.207
27.209
56.916
69.362
93.606
166.201
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MAGNA
PLOT OF ADJUSTED PROBITS AND PREDICTED REGRESSION LINE
Probit
10+
9+
8+
7+
6+
5+
4+
-
o
.
.
..
o..
...
....
....
....
...
....
...o
...
....
....
...
....
o....
....
...
..
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..
3+
.
-.
2+
1+
0+
-+--------------+--------+---------+---------+--------+--------------+EC01
EC10
EC25
EC50
EC75
EC90
EC99
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EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM
USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES
Version 1.5
Muestra Ciega 11;MAGNA
Number
Exposed
Conc.
0.3000
0.7500
1.5000
3.0000
6.0000
30
30
30
30
30
Number
Resp.
2
24
29
30
30
Observed
Proportion
Responding
Proportion
Responding
Adjusted for
Controls
Predicted
Proportion
Responding
0.0667
0.8000
0.9667
1.0000
1.0000
0.0667
0.8000
0.9667
1.0000
1.0000
0.0857
0.7476
0.9863
0.9999
1.0000
Chi - Square for Heterogeneity (calculated)
Chi - Square for Heterogeneity
(tabular value at 0.05 level)
Mu
Sigma
=
=
=
1.436
=
7.815
-0.255396
0.195558
Parameter
Estimate
Std. Err.
95% Confidence Limits
--------------------------------------------------------------------Intercept
6.305986
0.265782
(
5.785053,
6.826920)
Slope
5.113570
0.829355
(
3.488035,
6.739105)
Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000
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Estimated LC/EC Values and Confidence Limits
Exposure
Conc.
Point
LC/EC
LC/EC
LC/EC
LC/EC
LC/EC
LC/EC
LC/EC
LC/EC
LC/EC
1.00
5.00
10.00
15.00
50.00
85.00
90.00
95.00
99.00
0.195
0.265
0.312
0.348
0.555
0.886
0.989
1.165
1.583
95% Confidence Limits
Lower
Upper
0.112
0.173
0.218
0.254
0.462
0.740
0.815
0.935
1.199
0.264
0.338
0.386
0.424
0.658
1.160
1.347
1.689
2.608
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MAGNA
PLOT OF ADJUSTED PROBITS AND PREDICTED REGRESSION LINE
Probit
10+
9+
8+
7+
6+
5+
4+
-
o
.
.
..
o
..
...
....
....
o...
...
....
....
...
....
....
...
....
....
....
...
.. o
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..
3+
.
-.
2+
1+
0+
-+--------------+--------+---------+---------+--------+--------------+EC01
EC10
EC25
EC50
EC75
EC90
EC99
EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM
USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES
Version 1.5
Muestra Ciega 12:MAGNA
Conc.
6.0000
Number
Exposed
20
Number
Resp.
0
Observed
Proportion
Responding
Proportion
Responding
Adjusted for
Controls
Predicted
Proportion
Responding
0.0000
0.0000
0.0422
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12.0000
25.0000
50.0000
100.0000
20
20
20
20
2
2
2
2
0.1000
0.1000
0.1000
0.1000
Chi - Square for Heterogeneity (calculated)
Chi - Square for Heterogeneity
(tabular value at 0.05 level)
0.1000
0.1000
0.1000
0.1000
=
1.866
=
7.815
0.0567
0.0762
0.0988
0.1261
***************************************************************
*
NOTE
*
*
*
*
Slope not significantly different from zero.
*
*
LC/EC fiducial limits cannot be computed.
*
***************************************************************
Mu
Sigma
=
=
4.408896
2.103648
Parameter
Estimate
Std. Err.
95% Confidence Limits
--------------------------------------------------------------------Intercept
2.904166
0.677868
(
1.575544,
4.232789)
Slope
0.475365
0.437643
(
-0.382416,
1.333145)
Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000
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(CENICA)
MAGNA
Estimated LC/EC Values and Confidence Limits
Exposure
Conc.
Point
LC/EC
LC/EC
LC/EC
LC/EC
LC/EC
LC/EC
LC/EC
LC/EC
LC/EC
1.00
5.00
10.00
15.00
50.00
85.00
90.00
95.00
99.00
95% Confidence Limits
Lower
Upper
0.327
8.884
51.625
169.307
25638.697
3882541.500
12733004.000
73992200.000
%2007300096.000
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MAGNA
PLOT OF ADJUSTED PROBITS AND PREDICTED REGRESSION LINE
Probit
10+
9+
8+
7+
6+
5+
4+
-
.
.
..
..
...
....
....
....
...
....
....
...
....
....
...
....
....
o o o.o.
...
..
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..
3+
.
-.
2+
1+
0+
o
-+--------------+--------+---------+---------+--------+--------------+EC01
EC10
EC25
EC50
EC75
EC90
EC99
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EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM
USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES
Version 1.5
Muestra Ciega 13:MAGNA
Number
Exposed
Conc.
12.0000
25.0000
50.0000
100.0000
30
30
30
30
Number
Resp.
0
3
6
25
Observed
Proportion
Responding
Proportion
Responding
Adjusted for
Controls
Predicted
Proportion
Responding
0.0000
0.1000
0.2000
0.8333
0.0000
0.1000
0.2000
0.8333
0.0017
0.0488
0.3260
0.7749
Chi - Square for Heterogeneity (calculated)
Chi - Square for Heterogeneity
(tabular value at 0.05 level)
Mu
Sigma
=
=
=
4.503
=
5.991
1.811516
0.249624
Parameter
Estimate
Std. Err.
95% Confidence Limits
--------------------------------------------------------------------Intercept
-2.256974
1.232535
(
-4.672744,
0.158795)
Slope
4.006022
0.695713
(
2.642425,
5.369619)
Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000
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(CENICA)
MAGNA
Estimated LC/EC Values and Confidence Limits
Exposure
Conc.
Point
LC/EC
LC/EC
LC/EC
LC/EC
LC/EC
LC/EC
LC/EC
LC/EC
LC/EC
1.00
5.00
10.00
15.00
50.00
85.00
90.00
95.00
99.00
17.014
25.172
31.017
35.711
64.791
117.551
135.343
166.772
246.727
95% Confidence Limits
Lower
Upper
8.776
15.649
21.174
25.850
54.211
92.365
103.447
121.949
165.034
24.010
32.657
38.708
43.611
80.021
180.723
221.953
301.957
541.153
Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592
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MAGNA
PLOT OF ADJUSTED PROBITS AND PREDICTED REGRESSION LINE
Probit
10+
9+
8+
7+
6+
5+
4+
-
.
.
..
..
...
....
o ....
....
...
....
....
...
....
....
...
.... o
....
o
....
...
..
Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
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(CENICA)
..
3+
.
-.
2+
1+
0+o
-+--------------+--------+---------+---------+--------+--------------+EC01
EC10
EC25
EC50
EC75
EC90
EC99
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(CENICA)
EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM
USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES
Version 1.5
MUESTRA CIEGA 10 DEFINITIVA 2007/09/11 D. magna
Proportion
Observed Responding Predicted
Number Number Proportion Adjusted for Proportion
Conc. Exposed Resp. Responding Controls
Responding
20.0000
30.0000
40.0000
50.0000
30
30
30
30
0
10
28
30
0.0000
0.3333
0.9333
1.0000
0.0000
0.3333
0.9333
1.0000
0.0006
0.3285
0.9378
0.9989
Chi - Square for Heterogeneity (calculated) = 0.065
Chi - Square for Heterogeneity
(tabular value at 0.05 level)
= 5.991
Mu
= 1.505133
Sigma = 0.063093
Parameter
Estimate Std. Err.
95% Confidence Limits
--------------------------------------------------------------------Intercept -18.855776 4.651087 ( -27.971907, -9.739646)
Slope
15.849614 3.065975 ( 9.840302, 21.858927)
Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000
Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
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DIRECCIÓN GENERAL DEL CENTRO NACIONAL DE
INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL
(CENICA)
Estimated LC/EC Values and Confidence Limits
Point
Exposure
Conc.
LC/EC 1.00
LC/EC 5.00
LC/EC 10.00
LC/EC 15.00
LC/EC 50.00
LC/EC 85.00
LC/EC 90.00
LC/EC 95.00
LC/EC 99.00
22.822
25.197
26.563
27.526
31.999
37.198
38.547
40.636
44.865
95% Confidence Limits
Lower
Upper
18.095
21.144
22.948
24.232
29.977
34.996
36.068
37.643
40.646
25.489
27.488
28.650
29.485
33.880
41.252
43.499
47.148
55.023
0.128 Cr
PLOT OF ADJUSTED PROBITS AND PREDICTED REGRESSION LINE
Probit
10+
9+
8+
-
o
Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592
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INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL
(CENICA)
.
7+
.
..
o..
...
....
6+
....
....
...
....
....
5+
...
....
.o..
...
....
4+
....
....
...
..
..
3+ .
-.
2+
1+
0+o
-+--------------+--------+---------+---------+--------+--------------+Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592
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INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL
(CENICA)
EC01
EC10
EC25
EC50
EC75
EC90
EC99
EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM
USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES
Version 1.5
MUESTRA CIEGA 11 DEFINITIVA (2) 2007/09/05
Proportion
Observed Responding Predicted
Number Number Proportion Adjusted for Proportion
Conc. Exposed Resp. Responding Controls
Responding
0.5000
1.0000
2.0000
3.0000
30
30
30
30
0
0
18
24
0.0000
0.0000
0.6000
0.8000
0.0000
0.0000
0.6000
0.8000
0.0001
0.0273
0.4894
0.8603
Chi - Square for Heterogeneity (calculated) = 3.223
Chi - Square for Heterogeneity
(tabular value at 0.05 level)
= 5.991
Mu
= 0.305267
Sigma = 0.158856
Parameter
Estimate Std. Err.
95% Confidence Limits
--------------------------------------------------------------------Intercept
3.078333 0.402000 ( 2.290413, 3.866253)
Slope
6.295027 1.130930 ( 4.078405, 8.511650)
Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592
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Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000
Estimated LC/EC Values and Confidence Limits
Point
Exposure
Conc.
LC/EC 1.00
LC/EC 5.00
LC/EC 10.00
LC/EC 15.00
LC/EC 50.00
LC/EC 85.00
LC/EC 90.00
LC/EC 95.00
LC/EC 99.00
0.862
1.107
1.264
1.382
2.020
2.951
3.227
3.686
4.729
95% Confidence Limits
Lower
Upper
0.519
0.757
0.923
1.054
1.765
2.569
2.768
3.080
3.739
1.112
1.348
1.497
1.610
2.284
3.729
4.247
5.169
7.522
0.0202 Hg
PLOT OF ADJUSTED PROBITS AND PREDICTED REGRESSION LINE
Probit
10+
9+
8+
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.
7+
.
..
..
...
....
6+
....
.... o
...
....
o....
5+
...
....
....
...
....
4+
....
....
...
..
..
3+ .
-.
2+
1+
0+o o
-+--------------+--------+---------+---------+--------+--------------+EC01
EC10 EC25
EC50
EC75 EC90
EC99
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EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM
USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES
Version 1.5
MUESTRA CIEGA 12 DEFINITIVA 2007/09/12
Proportion
Observed Responding Predicted
Number Number Proportion Adjusted for Proportion
Conc. Exposed Resp. Responding Controls
Responding
40.0000
60.0000
80.0000
100.0000
30
30
30
30
0
0
3
23
0.0000
0.0000
0.1000
0.7667
0.0000
0.0000
0.1000
0.7667
0.0000
0.0001
0.0998
0.7668
Chi - Square for Heterogeneity (calculated) = 0.005
Chi - Square for Heterogeneity
(tabular value at 0.05 level)
= 5.991
Mu
= 1.964904
Sigma = 0.048186
Parameter
Estimate Std. Err.
95% Confidence Limits
--------------------------------------------------------------------Intercept -35.777157 8.065721 ( -51.585972, -19.968344)
Slope
20.752745 4.110723 ( 12.695728, 28.809761)
Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592
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Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000
Estimated LC/EC Values and Confidence Limits
Point
Exposure
Conc.
LC/EC 1.00
LC/EC 5.00
LC/EC 10.00
LC/EC 15.00
LC/EC 50.00
LC/EC 85.00
LC/EC 90.00
LC/EC 95.00
LC/EC 99.00
71.254
76.850
80.011
82.217
92.237
103.477
106.331
110.705
119.399
95% Confidence Limits
Lower
Upper
60.241
67.932
72.339
75.408
88.174
98.337
100.530
103.763
109.903
77.113
81.709
84.373
86.294
96.753
113.736
118.615
126.363
142.553
7.37 As
PLOT OF ADJUSTED PROBITS AND PREDICTED REGRESSION LINE
Probit
10+
9+
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8+
7+
6+
5+
4+
3+
-.
2+
1+
-
.
.
..
..
...
....
....
.o..
...
....
....
...
....
....
...
....
....
o...
...
..
..
.
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0+o
-+--------------+--------+---------+---------+--------+--------------+EC01
EC10 EC25
EC50
EC75 EC90
EC99
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PROYECTO
“Pruebas biológicas para la evaluación ecotoxicológica de sustancias
químicas
Resultados de la prueba de toxicidad con Daphnia magna
Fecha de Inicio
INSTITUCIÓN__________IMP-M-10
07/08/2007
Fecha de Término 09/08/2007
Reportar Número de Daphnias vivas RÉPLICA No. RÉPLICA No. RÉPLICA No.
TOTAL DE
2
3
1
ORGANISMOS
No.
No.
No.
No.
No.
No. Expuestos Muertos
a
b
Inicial Final Inicial Final Inicial Final
(t 0)
(t 48h)
CONTROL POSITIVO: Cr VI (
mg/L)
CONTROL NEGATIVO: Agua dura
No. MUESTRA 11
10
7
10
11
10
4
10
11
10
6
9
33
30
16
1
DILUCIÓN CE50
Obs.
(%) M-10
M-11
100
10.0
1.0
10
10
10
2
8
9
10
10
10
1
8
9
11
10
10
0
8
10
31
30
30
28
6
2
0.1
control
10
10
10
10
10
11
9
11
10
10
9
9
30
31
2
1
100
10.0
5.0
1.0
10
10
10
10
0
0
1
9
10
10
10
10
0
0
5
9
10
10
10
10
0
0
1
9
30
30
30
30
30
30
23
3
27.90 0.1116
1
3.006 0.0306
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M-12
M-13
a
control
10
10
10
9
10
10
30
1
100.0
10.0
5.0
10
10
10
3
7
8
10
10
10
4
8
9
10
10
10
4
8
8
30
30
30
19
7
5
1.0
control
10
10
8
10
10
10
9
9
10
10
9
10
30
30
4
1
50
40
30
10
10
11
0
2
6
10
10
10
0
2
3
10
10
12
0
4
4
30
30
33
30
22
20
20
10
control
11
11
10
8
9
10
11
12
10
7
11
9
11
10
10
8
7
10
33
33
30
10
6
1
= ∑ del No. inicial en la Réplica 1 + Rép. 2 + Rép. 3
% Efecto en:
(No org. muertos/30 x 100)
b
57.97 4.54
0
28.20 0.112
8
= a - (∑ del No. final en la Rep. 1 + Rép. 2 + Rép. 3 )
Control positivo________________ Control negativo______________
OBSERVACION
ES:
ANALISTA Ma. Cristina González
RESPONSABLE
Juan C. Cid Núñez
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Lozano
FIRMA:
S
FECHA: 30-08-2007
FIRMA
:
FECHA: 30-08-2007
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EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES Version 1.5 dmm102007 IMTA Proportion Observed Responding Predicted Number Number Proportion Adjusted for Proportion Conc. Exposed Resp. Responding Controls Responding 0.1000 30 1 0.0333 0.0333 0.0315 0.1500 30 10 0.3333 0.3333 0.3396 0.2000 30 22 0.7333 0.7333 0.7298 Chi ‐ Square for Heterogeneity (calculated) = 0.010 Chi ‐ Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) = 3.841 Mu = ‐0.773533 Sigma = 0.121812 Parameter Estimate Std. Err. 95% Confidence Limits ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ Intercept 11.350205 1.303700 ( 8.794953, 13.905457) Slope 8.209358 1.631138 ( 5.012327, 11.406389) Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000 dmm102007 Estimated LC/EC Values and Confidence Limits Exposure 95% Confidence Limits Point Conc. Lower Upper LC/EC 1.00 0.088 0.059 0.106 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
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LC/EC 5.00 0.106 0.080 0.122 LC/EC 10.00 0.118 0.094 0.132 LC/EC 15.00 0.126 0.104 0.140 LC/EC 50.00 0.168 0.154 0.187 LC/EC 85.00 0.225 0.200 0.287 LC/EC 90.00 0.241 0.211 0.320 LC/EC 95.00 0.267 0.228 0.376 LC/EC 99.00 0.323 0.262 0.512 0.168 cr Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
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dmm102007 PLOT OF ADJUSTED PROBITS AND PREDICTED REGRESSION LINE Probit 10+ ‐ ‐ ‐ ‐ 9+ ‐ ‐ ‐ ‐ 8+ ‐ ‐ ‐ . ‐ 7+ . ‐ .. ‐ .. ‐ ... ‐ .... 6+ .... ‐ .... ‐ .o. ‐ .... ‐ .... 5+ ... ‐ .... ‐ .o.. ‐ ... ‐ .... 4+ .... ‐ .... ‐ ... Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
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‐ .. ‐ o. 3+ . ‐ ‐. ‐ ‐ 2+ ‐ ‐ ‐ ‐ 1+ ‐ ‐ ‐ ‐ 0+ ‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐ EC01 EC10 EC25 EC50 EC75 EC90 EC99 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
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EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES Version 1.5 dmm112007 Proportion Observed Responding Predicted Number Number Proportion Adjusted for Proportion Conc. Exposed Resp. Responding Controls Responding 0.0062 30 2 0.0667 0.0667 0.0719 0.0125 30 16 0.5333 0.5333 0.5197 0.0250 30 28 0.9333 0.9333 0.9386 Chi ‐ Square for Heterogeneity (calculated) = 0.049 Chi ‐ Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) = 3.841 Mu = ‐1.913027 Sigma = 0.201570 Parameter Estimate Std. Err. 95% Confidence Limits ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ Intercept 14.490635 1.581769 ( 11.390368, 17.590902) Slope 4.961055 0.823153 ( 3.347674, 6.574436) Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000 dmm112007 Estimated LC/EC Values and Confidence Limits Exposure 95% Confidence Limits Point Conc. Lower Upper LC/EC 1.00 0.004 0.002 0.006 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
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LC/EC 5.00 0.006 0.004 0.007 LC/EC 10.00 0.007 0.005 0.008 LC/EC 15.00 0.008 0.006 0.009 LC/EC 50.00 0.012 0.010 0.014 LC/EC 85.00 0.020 0.016 0.027 LC/EC 90.00 0.022 0.018 0.031 LC/EC 95.00 0.026 0.021 0.039 LC/EC 99.00 0.036 0.027 0.062 0.22 hg Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
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dmm112007 PLOT OF ADJUSTED PROBITS AND PREDICTED REGRESSION LINE Probit 10+ ‐ ‐ ‐ ‐ 9+ ‐ ‐ ‐ ‐ 8+ ‐ ‐ ‐ . ‐ 7+ . ‐ .. ‐ o. ‐ ... ‐ .... 6+ .... ‐ .... ‐ ... ‐ .... ‐ .... 5+ ..o ‐ .... ‐ .... ‐ ... ‐ .... 4+ .... ‐ .... ‐ ... Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
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‐ .. o ‐ .. 3+ . ‐ ‐. ‐ ‐ 2+ ‐ ‐ ‐ ‐ 1+ ‐ ‐ ‐ ‐ 0+ ‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐ EC01 EC10 EC25 EC50 EC75 EC90 EC99 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
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EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES Version 1.5 dmm122007 Proportion Observed Responding Predicted Number Number Proportion Adjusted for Proportion Conc. Exposed Resp. Responding Controls Responding 6.2500 30 5 0.1667 0.1667 0.1937 12.5000 30 24 0.8000 0.8000 0.7438 25.0000 30 29 0.9667 0.9667 0.9852 Chi ‐ Square for Heterogeneity (calculated) = 1.340 Chi ‐ Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) = 3.841 Mu = 0.967137 Sigma = 0.198115 Parameter Estimate Std. Err. 95% Confidence Limits ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ Intercept 0.118301 0.918373 ( ‐1.681711, 1.918313) Slope 5.047576 0.908152 ( 3.267598, 6.827555) Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000 dmm122007 Estimated LC/EC Values and Confidence Limits Exposure 95% Confidence Limits Point Conc. Lower Upper LC/EC 1.00 3.208 1.692 4.424 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592
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LC/EC 5.00 4.378 2.707 5.624 LC/EC 10.00 5.167 3.467 6.412 LC/EC 15.00 5.778 4.087 7.021 LC/EC 50.00 9.271 7.783 10.857 LC/EC 85.00 14.875 12.483 19.929 LC/EC 90.00 16.636 13.712 23.425 LC/EC 95.00 19.634 15.678 29.914 LC/EC 99.00 26.792 19.982 47.737 9.271 As Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592
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dmm122007 PLOT OF ADJUSTED PROBITS AND PREDICTED REGRESSION LINE Probit 10+ ‐ ‐ ‐ ‐ 9+ ‐ ‐ ‐ ‐ 8+ ‐ ‐ ‐ . ‐ 7+ . ‐ .. o ‐ .. ‐ ... ‐ .... 6+ .... ‐ o... ‐ ... ‐ .... ‐ .... 5+ ... ‐ .... ‐ .... ‐ ... ‐ .... 4+ ...o ‐ .... Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
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‐ ... ‐ .. ‐ .. 3+ . ‐ ‐. ‐ ‐ 2+ ‐ ‐ ‐ ‐ 1+ ‐ ‐ ‐ ‐ 0+ ‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐ EC01 EC10 EC25 EC50 EC75 EC90 EC99 EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES Version 1.5 dmm132007 Proportion Observed Responding Predicted Number Number Proportion Adjusted for Proportion Conc. Exposed Resp. Responding Controls Responding 0.0250 30 5 0.1667 0.1667 0.1426 0.0500 30 15 0.5000 0.5000 0.5554 0.1000 30 28 0.9333 0.9333 0.9110 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
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Chi ‐ Square for Heterogeneity (calculated) = 0.698 Chi ‐ Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) = 3.841 Mu = ‐1.335740 Sigma = 0.249229 Parameter Estimate Std. Err. 95% Confidence Limits ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ Intercept 10.359500 0.952228 ( 8.493132, 12.225868) Slope 4.012382 0.710523 ( 2.619756, 5.405007) Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000 dmm132007 Estimated LC/EC Values and Confidence Limits Exposure 95% Confidence Limits Point Conc. Lower Upper LC/EC 1.00 0.012 0.006 0.018 LC/EC 5.00 0.018 0.010 0.024 LC/EC 10.00 0.022 0.014 0.028 LC/EC 15.00 0.025 0.017 0.032 LC/EC 50.00 0.046 0.038 0.055 LC/EC 85.00 0.084 0.068 0.121 LC/EC 90.00 0.096 0.076 0.148 LC/EC 95.00 0.119 0.090 0.202 LC/EC 99.00 0.175 0.121 0.362 0.046 Cu Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
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dmm132007 PLOT OF ADJUSTED PROBITS AND PREDICTED REGRESSION LINE Probit 10+ ‐ ‐ ‐ ‐ 9+ ‐ ‐ ‐ ‐ 8+ ‐ ‐ ‐ . ‐ 7+ . ‐ .. ‐ o .. ‐ ... ‐ .... 6+ .... ‐ .... ‐ ... ‐ .... ‐ .... 5+ ...o ‐ .... ‐ .... ‐ ... ‐ .... 4+ o... ‐ .... ‐ ... Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592
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‐ .. ‐ .. 3+ . ‐ ‐. ‐ ‐ 2+ ‐ ‐ ‐ ‐ 1+ ‐ ‐ ‐ ‐ 0+ ‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐ EC01 EC10 EC25 EC50 EC75 EC90 EC99 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
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Instituto Politécnico Nacional
Escuela Nacional de Ciencias Biológicas
PROYECTO
“Pruebas biológicas para la evaluación ecotoxicológica de
sustancias químicas
Resultados de la prueba de toxicidad con Daphnia magna
Fecha de Inicio
INSTITUCIÓN: __IPN-ENCB__
____________
Fecha de Término ________ ______
Reportar Número de Daphnias vivas RÉPLICA No. RÉPLICA No. RÉPLICA No.
TOTAL DE
2
3
1
ORGANISMOS
No.
No.
No.
No.
No.
No. Expuestos Muertos
a
b
Inicial Final Inicial Final Inicial Final
(t 0)
(t 48h)
CONTROL POSITIVO: Cr VI (
mg/L)
CONTROL NEGATIVO: Agua dura
No. MUESTRA 10
10
10
10
10
10
30
0
DILUCIÓN CE50
Obs.
39
0.161
(%) 10
30
40
50
60
70
11
10
10
10
10
7
7
4
0
0
10
10
10
10
10
8
2
3
0
0
10
10
10
10
10
7
6
6
0
0
31
30
30
30
30
9
15
17
30
30
11
1.6
2.4
3.2
4.0
10
10
10
10
10
7
2
0
10
10
10
10
10
4
1
0
10
10
10
10
10
3
1
2
30
30
30
30
0
16
26
28
2.48 0.0248
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a
12
50
75
100
10
10
10
9
4
2
10
10
10
10
6
6
10
10
10
1
10
3
30
30
30
2
10
19
88.05 6.972
13
25
50
75
100
10
10
10
10
10
7
0
0
10
10
10
10
10
5
0
0
10
10
10
10
10
6
0
0
30
30
30
30
0
12
30
30
51.99
= ∑ del No. inicial en la Réplica 1 + Rép. 2 + Rép. 3
% Efecto en:
(No org. muertos/30 x 100)
b
Ajuste Logit
0.196
= a - (∑ del No. final en la Rep. 1 + Rép. 2 + Rép. 3 )
Control positivo________________ Control negativo______________
OBSERVACION
ES:
ANALISTA
FIRMA:
RESPONSABLE
S
FECHA:
FIRMA
:
FECHA:
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RESULTADOS DE LOS BIOENSAYOS CON MUESTRAS CIEGAS 07 Y Daphnia magna imta REALIZADOS EN LA UAMI EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES Version 1.5 bioensayo con muestra ciega 10 y daphnia magna imta Proportion Observed Responding Predicted Number Number Proportion Adjusted for Proportion Conc. Exposed Resp. Responding Controls Responding 1.0000 30 2 0.0667 0.0667 0.0271 3.1250 30 3 0.1000 0.1000 0.0977 6.2500 30 5 0.1667 0.1667 0.1810 12.5000 30 7 0.2333 0.2333 0.2987 25.0000 30 11 0.3667 0.3667 0.4425 50.0000 30 18 0.6000 0.6000 0.5944 75.0000 30 21 0.7000 0.7000 0.6784 100.0000 30 24 0.8000 0.8000 0.7331 Chi ‐ Square for Heterogeneity (calculated) = 3.891 Chi ‐ Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) = 12.592 Mu = 1.511443 Sigma = 0.785075 Parameter Estimate Std. Err. 95% Confidence Limits ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ Intercept 3.074779 0.246654 ( 2.591337, 3.558221) Slope 1.273764 0.168761 ( 0.942991, 1.604536) Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
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bioensayo con muestra ciega 10 y daphnia magna imta Estimated LC/EC Values and Confidence Limits Exposure 95% Confidence Limits Point Conc. Lower Upper LC/EC 1.00 0.484 0.119 1.128 LC/EC 5.00 1.660 0.616 3.066 LC/EC 10.00 3.201 1.463 5.278 LC/EC 15.00 4.986 2.603 7.674 LC/EC 50.00 32.467 23.420 47.405 0.129 cr LC/EC 85.00 211.395 122.433 504.063 LC/EC 90.00 329.303 176.322 905.558 LC/EC 95.00 635.057 301.003 2169.386 LC/EC 99.00 2176.522 812.762 11277.423 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
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bioensayo con muestra ciega 10 y daphnia magna imta PLOT OF ADJUSTED PROBITS AND PREDICTED REGRESSION LINE Probit 10+ ‐ ‐ ‐ ‐ 9+ ‐ ‐ ‐ ‐ 8+ ‐ ‐ ‐ . ‐ 7+ . ‐ .. ‐ .. ‐ ... ‐ .... 6+ .... ‐ o.... ‐ o... ‐ .... ‐ ..o. 5+ ... ‐ .... ‐ .... o ‐ ... ‐ .... o 4+ ...o ‐ o... Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592
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‐ ... ‐ o .. ‐ .. 3+ . ‐ ‐. ‐ ‐ 2+ ‐ ‐ ‐ ‐ 1+ ‐ ‐ ‐ ‐ 0+ ‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐ EC01 EC10 EC25 EC50 EC75 EC90 EC99 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
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EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES Version 1.5 bioensayo con muestra ciega 11 y daphnia magna imta Proportion Observed Responding Predicted Number Number Proportion Adjusted for Proportion Conc. Exposed Resp. Responding Controls Responding 1.0000 30 3 0.1000 0.1000 0.0571 5.0000 30 8 0.2667 0.2667 0.3628 10.0000 30 18 0.6000 0.6000 0.5707 30.0000 30 23 0.7667 0.7667 0.8454 50.0000 30 30 1.0000 1.0000 0.9203 Chi ‐ Square for Heterogeneity (calculated) = 6.351 Chi ‐ Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) = 7.815 Mu = 0.898600 Sigma = 0.568931 Parameter Estimate Std. Err. 95% Confidence Limits ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ Intercept 3.420547 0.275167 ( 2.881220, 3.959874) Slope 1.757682 0.247535 ( 1.272513, 2.242851) Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000 bioensayo con muestra ciega 11 y daphnia magna imta Estimated LC/EC Values and Confidence Limits Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
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Exposure 95% Confidence Limits Point Conc. Lower Upper LC/EC 1.00 0.376 0.102 0.804 LC/EC 5.00 0.918 0.345 1.649 LC/EC 10.00 1.477 0.656 2.433 LC/EC 15.00 2.037 1.007 3.176 LC/EC 50.00 7.918 5.564 10.861 0.079 Hg LC/EC 85.00 30.778 21.088 54.175 LC/EC 90.00 42.437 27.751 82.522 LC/EC 95.00 68.302 41.236 155.614 LC/EC 99.00 166.765 85.115 520.727 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
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bioensayo con muestra ciega 11 y daphnia magna imta PLOT OF ADJUSTED PROBITS AND PREDICTED REGRESSION LINE Probit 10+ o ‐ ‐ ‐ ‐ 9+ ‐ ‐ ‐ ‐ 8+ ‐ ‐ ‐ . ‐ 7+ . ‐ .. ‐ .. ‐ ... ‐ .... 6+ .... ‐ .... o ‐ ... ‐ .... ‐ ..o. 5+ ... ‐ .... ‐ .... ‐ ... o ‐ .... 4+ .... ‐ o .... Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
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‐ ... ‐ .. ‐ .. 3+ . ‐ ‐. ‐ ‐ 2+ ‐ ‐ ‐ ‐ 1+ ‐ ‐ ‐ ‐ 0+ ‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐ EC01 EC10 EC25 EC50 EC75 EC90 EC99 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
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(CENICA)
EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES Version 1.5 bioensayo con daphnia magna imta m. 12 Proportion Observed Responding Predicted Number Number Proportion Adjusted for Proportion Conc. Exposed Resp. Responding Controls Responding 10.0000 30 1 0.0333 0.0333 0.0203 20.0000 30 2 0.0667 0.0667 0.0711 40.0000 30 5 0.1667 0.1667 0.1874 60.0000 30 8 0.2667 0.2667 0.2919 80.0000 30 11 0.3667 0.3667 0.3795 100.0000 30 15 0.5000 0.5000 0.4523 Chi ‐ Square for Heterogeneity (calculated) = 0.742 Chi ‐ Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) = 9.488 Mu = 2.062135 Sigma = 0.518486 Parameter Estimate Std. Err. 95% Confidence Limits ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ Intercept 1.022778 0.740639 ( ‐0.428875, 2.474432) Slope 1.928691 0.420006 ( 1.105480, 2.751903) Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000 bioensayo con daphnia magna imta Estimated LC/EC Values and Confidence Limits Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592
Correo electrónico cenica@ine.gob.mx
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INVESTIGACIÓN Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL
(CENICA)
Exposure 95% Confidence Limits Point Conc. Lower Upper LC/EC 1.00 7.178 1.509 13.741 LC/EC 5.00 16.191 6.092 24.877 LC/EC 10.00 24.983 12.621 34.684 LC/EC 15.00 33.479 20.269 44.189 LC/EC 50.00 115.381 84.152 219.384 extrapolada. 9‐23 as LC/EC 85.00 397.644 211.957 1795.334 LC/EC 90.00 532.877 261.518 2977.138 LC/EC 95.00 822.229 356.351 6310.671 LC/EC 99.00 1854.768 634.420 25916.201 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592
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bioensayo con daphnia magna imta PLOT OF ADJUSTED PROBITS AND PREDICTED REGRESSION LINE Probit 10+ ‐ ‐ ‐ ‐ 9+ ‐ ‐ ‐ ‐ 8+ ‐ ‐ ‐ . ‐ 7+ . ‐ .. ‐ .. ‐ ... ‐ .... 6+ .... ‐ .... ‐ ... ‐ .... ‐ .... 5+ o... ‐ .... ‐ ...o ‐ ..o ‐ .... 4+ ...o ‐ .... Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592
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‐ ... ‐ .. o ‐ o .. 3+ . ‐ ‐. ‐ ‐ 2+ ‐ ‐ ‐ ‐ 1+ ‐ ‐ ‐ ‐ 0+ ‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐ EC01 EC10 EC25 EC50 EC75 EC90 EC99 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592
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EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES Version 1.5 bioensayo con muestra ciega 13 y daphnia magna imta Proportion Observed Responding Predicted Number Number Proportion Adjusted for Proportion Conc. Exposed Resp. Responding Controls Responding 10.0000 30 0 0.0000 0.0000 0.0034 20.0000 30 4 0.1333 0.1333 0.0736 40.0000 30 11 0.3667 0.3667 0.4248 60.0000 30 18 0.6000 0.6000 0.7080 80.0000 30 26 0.8667 0.8667 0.8578 100.0000 30 30 1.0000 1.0000 0.9301 Chi ‐ Square for Heterogeneity (calculated) = 6.057 Chi ‐ Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) = 9.488 Mu = 1.647344 Sigma = 0.238869 Parameter Estimate Std. Err. 95% Confidence Limits ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ Intercept ‐1.896429 0.939587 ( ‐3.738021, ‐0.054838) Slope 4.186393 0.545775 ( 3.116673, 5.256112) Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000 bioensayo con muestra ciega 13 y daphnia magna imta Estimated LC/EC Values and Confidence Limits Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592
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Exposure 95% Confidence Limits Point Conc. Lower Upper LC/EC 1.00 12.350 7.419 16.868 LC/EC 5.00 17.965 12.179 22.912 LC/EC 10.00 21.939 15.825 27.039 LC/EC 15.00 25.106 18.856 30.285 LC/EC 50.00 44.396 38.150 50.686 0.177 cu LC/EC 85.00 78.507 67.513 96.987 LC/EC 90.00 89.842 75.991 114.991 LC/EC 95.00 109.713 90.090 148.741 LC/EC 99.00 159.597 122.898 243.128 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592
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bioensayo con muestra ciega 13 y daphnia magna imta PLOT OF ADJUSTED PROBITS AND PREDICTED REGRESSION LINE Probit 10+ o ‐ ‐ ‐ ‐ 9+ ‐ ‐ ‐ ‐ 8+ ‐ ‐ ‐ . ‐ 7+ . ‐ .. ‐ .. ‐ ... ‐ o... 6+ .... ‐ .... ‐ ... ‐ .... ‐ .... o 5+ ... ‐ .... ‐ ....o ‐ ... ‐ .... 4+ .... ‐ o .... Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592
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‐ ... ‐ .. ‐ .. 3+ . ‐ ‐. ‐ ‐ 2+ ‐ ‐ ‐ ‐ 1+ ‐ ‐ ‐ ‐ 0+o ‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐+‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐+‐ EC01 EC10 EC25 EC50 EC75 EC90 EC99 Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592
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Taller de transferencia de tecnología:
“Pruebas biológicas para la evaluación ecotoxicológica de sustancias
químicas
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Resultados de la prueba de toxicidad con Selenastrum capricornutum
Fecha de Inicio
No. de Evento :Elutriado A,B
y soxhlet
15/10/07
Fecha de Término 15/11/07
Reportar Número de células x campo RÉPLICA No.
1
1
2
CONTROL NEGATIVO:
medio mineral
RÉPLICA
No. 2
3
4
RÉPLICA No. 3
5
6
169 171 195 183 158 164
TOTAL DE
ORGANISMOS
PROMEDIO
1
(No. cél x mL)
%
2
INHIBICIÓN
173.33
DILUCIÓN CE50
Obs.
(%) (PPM) CONTRO
L
POSITIVO
+2
(Cu )
No. MUESTRA 0.020
0.040
0.060
0.080
112
68
57
35
114
66
58
33
116
67
53
32
114
64
54
31
113
69
54
30
115
67
51
33
114
66.83
54.50
32.33
32
60
67
81
161
5
0.033
DILUCIÓN (%) Elutriad
o A
100
159 158 160 162 162 165
Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592
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Elutriad
oB
100
152 153 155 154 151 150
152.5
10
Soxhlet
A
1
160 159 161 159 158 157
159
6
Soxhlet
B
1
149 148 145 143 146 145
162
14
Blanco
1
162 161 163 165 161 160
154.5
5
2) 100 – ( (Prom cé/mL muestra/ Prom.células/mL control-)x100)
Control positivo________________ Control negativo________________ OBSERV
ACIONE
S:
ANALISTA
FIRMA:
RESPONSABLE
FECHA:
FIRMA
:
FECHA:
Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592
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Taller de transferencia de tecnología:
“Pruebas biológicas para la evaluación ecotoxicológica de sustancias
químicas
Resultados de Extracción de Sedimento Daphnia magna
Fecha de Inicio
No. de Evento: A-DMCEN – B- DMCEN
15-10-2007
Fecha de Término 15-11-2007
Reportar Número de Daphnias vivas RÉPLICA No.
1
No.
No.
Inicial Final
CONTROL POSITIVO: Cr VI (
No.
Inicial
No.
Final
No.
Inicial
10
10
10
TOTAL DE
ORGANISMOS
No. Expuestos
a
Final
(t 0)
Muertos
b
(t 48h)
mg/L)
CONTROL NEGATIVO: Agua dura
No. MUESTRA RÉPLICA No. RÉPLICA No.
2
3
10
10
10
30
0
DILUCIÓN CE50
Obs.
(%) ELUTRIADO A
100
10
0
10
0
ELUTRIADO B
100
10
0
10
0
SOXHLET A
1%
10
0
10
0
10
0
20
0
30
0
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Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592
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(CENICA)
a
SOXHLET B
1%
10
0
10
0
10
0
30
0
BLANCO
1%
10
0
10
0
10
0
30
0
= ∑ del No. inicial en la Réplica 1 + Rép. 2 + Rép. 3
% Efecto en:
(No org. muertos/30 x 100)
b
= a - (∑ del No. final en la Rep. 1 + Rép. 2 + Rép. 3 )
Control positivo________________ Control negativo______________
OBSERVACION
ES:
ANALISTA
FIRMA:
RESPONSABLE
S
FECHA:
FIRMA
:
FECHA:
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Taller de transferencia de tecnología:
“Pruebas biológicas para la evaluación ecotoxicológica de sustancias
químicas
Resultados de Extracción de Sedimento con Daphnia exilis
Fecha de Inicio
No. de Evento: A-DECEN – B- DECEN
15-10-2007
Fecha de Término 15-11-2007
Reportar Número de Daphnias vivas RÉPLICA No. RÉPLICA No. RÉPLICA No.
TOTAL DE
2
3
1
ORGANISMOS
No.
No.
No.
No.
No.
No. Expuestos Muertos
a
b
Inicial Final Inicial Final Inicial Final
(t 0)
(t 48h)
CONTROL POSITIVO: Cr VI (
mg/L)
CONTROL NEGATIVO: Agua dura
No. MUESTRA 10
10
10
10
10
10
30
0
DILUCIÓN CE50
Obs.
(%) ELUTRIADO A
100
10
0
10
0
20
0
ELUTRIADO B
100
10
0
10
0
20
0
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Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592
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(CENICA)
a
SOXHLET A
1%
10
0
10
0
10
0
30
0
SOXHLET B
1%
10
0
9
1
9
1
30
2
BLANCO
1%
10
0
10
0
10
0
30
0
= ∑ del No. inicial en la Réplica 1 + Rép. 2 + Rép. 3
% Efecto en:
(No org. muertos/30 x 100)
b
= a - (∑ del No. final en la Rep. 1 + Rép. 2 + Rép. 3 )
Control positivo________________ Control negativo______________
OBSERVACION
ES:
ANALISTA
RESPONSABLE
S
Av. San Rafael Atlixco No. 186, Col. Vicentina, Delegación Iztapalapa. C.P. 09340 UAM-I Edificio de la Ciencia y
Tecnología Ambiental “W” piso 2. Tel/Fax 5613 3787, 5613 3821, 5613 3662 y 5804 4600 Ext. 2592
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