1 Material, descripción y propiedades cinéticas - Ignacio

Facultad de Farmacia
Prácticas de Bioquímica clínica, 2011
Determinación de parámetros cinéticos de peroxidasa salivar
GENERAL
Fundamento de la práctica:
En la cavidad bucal existe una serie de grupos enzimáticos, los cuales defienden al organismo de la acción de agentes
microbianos, así como de algunos compuestos tóxicos que se forman en los tejidos humanos, sobre todo, compuestos
derivados del oxígeno, de alta toxicidad para la célula. Dentro de ellas se encuentran: glicoproteínas salivales,
lactoferrina salival y peroxidasas salivares.
la actividad peroxidasa en saliva humana comprende a dos principales componentes las peroxidasas de origen
glandular (80%) y las mieloperoxidasas de origen leucocitario (20%) que en conjunto e denominan oral peroxidasas
(OP). La actividad enzimática de las OP requiere la participación de dos sustratos (reacción bisustrato) un oxidante
como el H2O2 y un aceptor de electrones como el guaiacol tal y como se muestra en la figura
para el ensayo clínico (determinación de la velocidad de la reacción) se utiliza la espectrofotometría de luz
visible/UV y que aprovecha el incremento de absorción del producto de la reacción para determinar la actividad de
estas enzimas. Se sigue el protocolo de R. A. COWMAN 1983. Para que los datos de este parámetro (Actividad OP)
sean validos es preciso ajustar algunos parámetros experimentales que en esta práctica han sido optimizados
previamente:
fase lag,
tiempo de ensayo lineal,
pH optimo y temperatura
valores de Km y Vmax.
con ello se cumple la ley de lambert que se resume en que:
[ES] está en steady state
La velocidad es al inicio de la reacción donde Vo es = k3 [ES],
en estas condiciones podemos medir el valor de Vmax. (Vo) es decir, conoceremos la velocidad máxima que es el
valor que encontraremos en las tablas de referencia en Unidades Internacionales.
Material, descripción y propiedades cinéticas
Fuente de Enzima:
Saliva centrifugada a 12000 rpm /10 min.
Preparación congelada a 1:2 (p:v) en Tampón fosfato pH 6.0
ε 403 nm = (aproximadamente)102 mM-1 . cm-1.
Concentración OP en cubeta (300 μl /2ml)= 4,2 μM (aproximadamente  5 pmoles)
Dador electrónico-H2O2:
30% en H2O (ε 403 nm = 39,4 M-1 . cm-1) Concentración del stock: 5-6 Molar
Preparación: 10 microlitros en 1 ml de H2O (50 mM)
Concentración en cubeta: (20 μl /2ml)= 0,5 mM
Aceptor electrónico guaiacol:
Comercial al 99% líquido. Concentración del stock= 8 Molar
Preparación: 40 microlitros en 1 ml de etanol (320 mM)
Concentración en cubeta (20 μl /2ml): 3,2 mM
Citrato sódico:
8% en agua preparar 2 ml en tubos desechables
Tampón Fosfato:
preparar 100 ml de una disolución de PO4H Na2 100 mM
preparar 100 ml de una disolución de PO4H2Na 100mM
poner la primera en un pH meter y añadir de la segunda hasta obtener pH 6,0
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Desarrollo de la práctica
Sesión 1: Preparación de los extractos biológicos
Protocolo:
Muestra biológica de Enzimas:
Enjuagarse la boca con agua.
Enjuagarse con 2ml de citrato sódico 8% durante 3min, añadir la saliva a los tubos de recogida.
Volumen de saliva: al volumen obtenido (normalmente 5 ml) le quitamos el exceso de saliva hasta
quedarnos con 5ml (marcado en el tubo).
Añadir 0.1 ml de 0,1% NaOH, cerrar con parafilm y agitar.
Centrifugar (Centrifuga de Mesa) a 3000 rpm por 5 min.
Transferir 1000 μl del sobrenadante de la centrifugación a tubos eppendorff , cerrarlos, marcarlos y agitar.
Centrifugar (centrífuga “eppendorf”) a 12 000 rpm por 5min.
Pasar el sobrenadante a tubos eppendorf limpios, marcar.
(De forma adicional, en el laboratorio clínico, se debe medir la absorbancia del espécimen a λ 403 nm y
diluir si fuera necesario en H2O hasta que el valor sea inferir a 0.2 U.A. (evitando así concentrados de
fenoles, inhibidores como los derivados del tabaco, proteasas, etc. que actúan como contaminantes de la
actividad OP).
Sesión 2: Ensayos (hacerlo por duplicado para cada espécimen y de forma individual: 2 ensayos/alumno)
Determinación de actividad enzimática para el Guaicol
Mezclar en cubeta:
1.- Tampón PO4HNa-PO4HNa2
1660 ul.
2.- Guaiacol
20 μl
3.- Espécimen
300 ul.
Agitar con parafilm (3 veces), colocar la cubeta en el espectrofotómetro ajustado a 470 nm, poner la
absorbancia a 0, sacar la cubeta y añadir
4.- H2O2
20 ul.
Agitar con parafilm, colocar de nuevo la cubeta y registrar el incremento de absorbancia cada 20
segundos (durante 10 min.)
Cada espécimen tienen que duplicarse y comprobar la coherencia del resultado
Resultados
Sesión 3: Construcción del informe
Obtener el valor de referencia para cada experimento en U.I. (μmoles /segundo x L especimen)
La forma más fácil es la siguiente:
1.- represente en papel milimetrado la absorbancia obtenida frente al tiempo en segundos.
2.- dibuje la V0 (pendiente máxima inicial) calcular para esta pendiente el valor de Δ Ab/seg
3.- a partir del valor del ε del producto que absorbe en la reacción (tetraguaiacol)= 26000 M-1 cm-1
transforme el valor obtenido previamente de Ab/seg por su correspondiente Molar/seg
4.- transforme de Molar/seg a μmoles /segundo (la cubeta tiene 2 ml)
5.- sabemos que se emplearon 300 μL de especimen, calcule el valor para 1L de espécimen (U.I.)
6.- indique este valor y los límites para este parámetro en las tablas de referencia (Profesor)
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