1 Técnicas para el análisis de actividad enzimática en suelos

1 Técnicas para el análisis de actividad
enzimática en suelos
Marisol Montejo Martínez, Cinthya Paulina Torres López,
Ángeles Martínez Toledo, José Alfredo Tenorio López,
María del Rocío Cruz Colín, Fernando Rafael Ramos Morales
y María del Carmen Cuevas Díaz
Introducción
La calidad y la salud de los suelos se miden a través de distintos indicadores que
evalúan su funcionamiento (Doran et al., 1999). Para medir la calidad, se considera qué tan adecuadas son sus propiedades físicas y químicas para permitir el
intercambio de gases, la retención de humedad y de nutrientes, la penetración de
raíces, entre otros. Por su parte, para medir la salud del suelo se toma en cuenta la
eficiencia de procesos como los ciclos de nutrientes y los flujos de energía. En este
contexto, uno de los indicadores que se ha utilizado es la magnitud de la actividad
de diferentes enzimas involucradas en los procesos antes mencionados.
Las enzimas son moléculas de naturaleza proteínica producidas por los seres vivos
y que se encargan de acelerar reacciones químicas o hacer posibles aquellas reacciones que de otra manera no se producirían. Dicho de otro modo, son catalizadores biológicos que, al reducir la energía de activación necesaria para las reacciones, transforman las sustancias involucradas en el metabolismo celular (incluyendo el anabolismo
o reacciones de construcción, y el catabolismo o reacciones de destrucción). La velocidad de la reacción catalizada por una enzima depende del pH, de la fuerza iónica, de
la temperatura y de la presencia o ausencia de inhibidores (Burns, 1982). La mayoría
de las enzimas actúan dentro de las células, pero algunas son extracelulares.
La actividad enzimática del suelo es importante porque refleja el estado en
el que se encuentran sus poblaciones microbianas y su relación con la biolo19
gía del suelo, la producción de biomasa, la degradación de contaminantes y la
conservación de ecosistemas (Doran, 2002; Gianfreda y Ruggiero, 2006). En
agricultura, la actividad enzimática y otros indicadores biológicos, como la biomasa microbiana, se emplean como una medida de la fertilidad y del impacto de
esta actividad en los suelos (García-Ruiz et al., 2008); en análisis ambiental,
como un indicador de contaminación (Schinner et al., 1993), y en biotecnología, como medida de la eficiencia de los tratamientos biológicos para remediar
suelos impactados por diferentes contaminantes, incluyendo los hidrocarburos
(Margesin et al., 2000a).
La liberación de enzimas es un proceso constante y, aunque las plantas y animales intervienen, son los microorganismos los que contribuyen en mayor medida
a este proceso, debido a su gran biomasa, su alta actividad metabólica y su corto
ciclo de vida (Cerón y Melgarejo, 2005). Dicha liberación puede ocurrir por secreción o por lisis celular cuando los organismos mueren (Joinville et al., 2004).
De las enzimas liberadas, solo un pequeño porcentaje se encuentra estabilizado, lo
cual permite que estas enzimas pueda soportar procesos que naturalmente ocurren
en el suelo, como la desnaturalización abiótica, la adsorción, la inactivación o la
degradación por proteasas.
En el caso de suelos contaminados con hidrocarburos, Wyszkowska y Kucharski
(2000) han reportado una disminución de la actividad enzimática, en particular de
ureasas, deshidrogenasas y fosfatasas. Una diferencia se presenta con las lipasas,
las cuales muestran una gran actividad en suelo contaminado con hidrocarburos,
probablemente porque intervienen más directamente en el proceso de biodegradación de estos compuestos (Margesin, 2005).
En este capítulo se describen algunos métodos enzimáticos que son útiles para
evaluar el comportamiento enzimático de suelos contaminados y biorremediados.
Determinación de la actividad enzimática ureasa
Fundamento del método
La ureasa es una exoenzima que cataliza la reacción de hidrólisis de la urea, el
principal producto celular nitrogenado de la degradación de las proteínas y los
ácidos nucleicos, el cual es más fácil de eliminar que otras formas de nitrógeno
(como el amoniaco) porque es soluble en agua y menos tóxico (Science in
School, 2008). En dicha reacción, la urea se rompe para formar dióxido de
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Métodos ecotoxicológicos para la evaluación de suelos contaminados con hidrocarburos
carbono y amonio, como se describe en la siguiente reacción (Quintero-Lizaola
et al., 2005):
H2NCONH2 + H2O  2NH3 + CO2
La ureasa se encuentra principalmente en semillas, microorganismos e invertebrados. En las plantas, es un hexámero (consiste en seis cadenas idénticas) y
se encuentra en el citoplasma. En las bacterias, consiste en dos o tres subunidades diferentes. Para su activación necesita unir dos iones de níquel por subunidad
(Science in School, 2008). Su pH óptimo es 7.4, y su temperatura óptima 60 °C
(Kandeler y Gerber, 1988).
Muchos animales excretan urea en la orina. Los microorganismos del suelo se
alimentan de la orina del animal, produciendo ureasa para transformar la urea en
amoniaco, que es entonces fácilmente accesible a las plantas. Por ello, la ureasa es
abundante en el suelo (García et al., 2003). De esta manera, esta enzima participa
en ciclo del nitrógeno, el proceso por el cual el nitrógeno de las proteínas y otros
compuestos se recicla constantemente (Science in School, 2008). Además, como
la urea es aplicada como fertilizante, es común encontrar esta enzima en suelos
agrícolas.
La mayoría de las técnicas empleadas en la determinación de la ureasa cuantifican la liberación de amonio de un suelo incubado. Varias de ellas difieren en
el uso de soluciones tampón o de tolueno (Tabatabai y Bremner, 1972; Cerón y
Melgarejo, 2005). Otros métodos utilizan la urea residual para estimar la propia
hidrólisis de este compuesto (Douglas y Bremner, 1970).
En este manual se describe el método de Tabatabai y Bremner (1972) porque
es una técnica sencilla que puede realizarse con equipamiento y reactivos básicos de laboratorio. El método se basa en la determinación de amonio liberado en
muestras de suelo incubado con solución de urea durante 2 h a 37 oC en presencia
de tolueno, para inhibir el crecimiento de los microorganismos (Alef y Nannipieri,
1998; Quintero-Lizaola et al., 2005). Esta técnica es fácil de realizar y de bajo
costo, y sus resultados varían de 12.98 a 336.7 μmoles NH3/g h. Actualmente
existe un nuevo método para medir la actividad de la ureasa, el de Sinsabaugh et
al. (2000), que es más rápido, pero más costoso.
En los últimos años los estudios sobre la ureasa se han dirigido a determinar
la influencia de los parámetros biológicos y químicos sobre su actividad. Se ha
encontrado que la correlación con la biomasa microbiana no es significativa, y que
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para el análisis de actividad enzimática en suelos
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esta enzima es afectada por los metales pesados, la concentración de oxígeno y la
disponibilidad de nitrógeno en diferentes tipos de suelo (García et al., 2003). Los
estudios realizados por Trasar-Cepeda et al. (2000) indicaron que existe sensibilidad a la contaminación por hidrocarburos y efluentes de taninos al determinar un
índice de actividad del suelo con la inclusión de varias enzimas, como ureasas, fosfomonoestereasas y ß-glucosidasa, así como la biomasa microbiana y el contenido
de nitrógeno total.
Campo de aplicación
Esta técnica es útil para evaluar suelos contaminados con hidrocarburos, como
diésel y petróleo, para suelos biorremediados, y también para medir la actividad
enzimática en el ciclo del nitrógeno en suelos agrícolas y naturales.
Material y equipo
Bureta de 25 mL
Matraces volumétricos de 10, 25, 50, 100
y 1000 mL
Pinzas para bureta
Pipetas volumétricas de 1, 5 y 10 mL
Soporte universal
Autoclave
Balanza analítica
Estufa de incubación
Equipo de destilación microkjeldhal
Mufla
Potenciómetro
Es necesario esterilizar el material en autoclave.
Reactivos
Ácido bórico (H3BO4) de 99.5 % de pureza
Ácido sulfúrico (H2SO4) de 98 % de pureza
Agua destilada
Amortiguador TRIS (hidroxi metil aminometano) grado ultrapuro (≥ 99 %)
Cloruro de potasio (KCl) grado analítico
Etanol de 95 % de pureza
Hidróxido de sodio (NaOH) de 98.7 % de pureza
Indicador de rojo de metilo
Indicador de verde de bromocresol
Óxido de magnesio (MgO) grado analítico
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Métodos ecotoxicológicos para la evaluación de suelos contaminados con hidrocarburos
Sulfato de plata (Ag2SO4) grado analítico
Sulfato de amonio (NH4SO4) grado analítico
Tolueno grado analítico
Urea de 99.9 % de pureza
Soluciones
Solución de ácido sulfúrico 0.005 M. Disolver 0.2 mL de ácido sulfúrico al 98 %
en un matraz aforado que contenga 500 mL de agua destilada y aforar a 1000
mL.
Solución de amortiguador TRIS 50 mM pH 9. Disolver 6.1 g de TRIS en 700 mL
de agua destilada, ajustar el pH a 9.0 con H2SO4 (0.2 M) y aforar con agua
destilada a 1000 mL.
Solución de cloruro de potasio 2.5 M y sulfato de plata. Disolver 100 mg de
Ag2SO4 y 188 g de KCl en 700 mL de agua destilada y aforar a 1000 mL con
agua destilada.
Solución indicadora de ácido bórico. Disolver 0.066 g de verde de bromocresol y
0.033 g de rojo de metilo en etanol (95 %) y aforar a 100 mL. Tomar 10 mL
de la solución indicadora y agregarlos en un matraz volumétrico de 500 mL.
Mezclar 10 g de H3BO4 con 350 mL de agua destilada caliente hasta disolver
perfectamente. Después, enfriar y añadir la solución al matraz. Agregar gota a
gota la solución de NaOH0.05 M hasta observar un vire de color rosa a verde
ligero. Finalmente, aforar con agua destilada.
Solución estándar de amonio. Disolver 0.234 g de NH4SO4 en agua destilada y
diluir en 1000 mL. La concentración final de N-NH4 en esta solución es de
50 µg/mL.
Solución de hidróxido de sodio 0.05 M. Colocar 0.2 g de NaOH y adicionar 500
mL de agua destilada agitando lentamente y aforar a 1000 mL.
Solución de óxido de magnesio. Calentar 1 g de MgO por muestra de suelo a analizar a 600-700 °C en mufla durante 2 h. Esperar a que disminuya la temperatura en la mufla y guardar en un desecador.
Solución de urea 0.2 M. Disolver 0.12 g de urea en 8 mL de amortiguador TRIS
y aforar a 10 mL. Es necesario preparar la solución diariamente y guardar a 4
ºC.
Técnicas
para el análisis de actividad enzimática en suelos
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Procedimiento
Incubación de las muestras
Colocar 5 g de suelo en un matraz volumétrico de 50 mL, agregar 0.2 mL de tolueno y 9 mL del amortiguador TRIS, mezclar perfectamente. Adicionar al matraz
1 mL de la solución de urea y mezclar, tapar el matraz e incubar por 2 h a 37 ºC
(figura 1.1).
Una vez concluido el periodo de incubación, agregar 35 mL de solución de KClAgSO42.5 M, agitar y dejar reposar la solución a temperatura ambiente durante 5
min. Aforar el contenido a 50 mL con KCl-AgSO4, con agitación.
Figura 1.1. Incubación de las muestras de suelo para determinar la actividad de la ureasa
Controles
Los controles se preparan mediante el procedimiento descrito anteriormente, pero
añadiendo 1 mL de la solución de urea 0.2 M después de haber agregado la solución de KCl-AgSO4 (Alef y Nannipieri, 1998; Quintero-Lizaola et al., 2005).
Estimación del amonio desprendido
Tomar 20 mL de la muestra incubada y verterlos en un matraz de destilación de
100 mL, agregar 0.2 g de MgO y destilar hasta colectar 20 mL en un matraz
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Métodos ecotoxicológicos para la evaluación de suelos contaminados con hidrocarburos
Erlenmeyer (colocado a la salida del equipo microkjeldahl) con 5 mL de la solución
indicadora del ácido bórico (figura 1.2).
Titular el destilado con H2SO40.005 M. Cada 1 mL de H2SO4 0.005 M es equivalente a 70 µg de N-NH4.
Figura 1.2. Destilación de muestras para estimar el amonio desprendido
Cálculos
La actividad de la ureasa en suelos se expresa en µg de N-NH4/g de suelo
seco por 2 h. Para obtener la actividad de cada muestra se utiliza la siguiente
fórmula:
V(M - C) x 70
Au =
sh x ss
Donde
µg N - NH4
Au = activudad de la ureasa, en
g de suelo sexo x 2h
Técnicas
para el análisis de actividad enzimática en suelos
25
M = volumen de H2SO4 gastado en la muestra, en mL
C = volumen de H2SO4 gastado en el control, en mL
µg N - NH4
70 = factor de conversión, en
mL de H2SO4
ss = peso en base seca de un gramo de suelo
sh = peso de suelo utilizado, en g
V = volumen total de la suspensión, en mL
Ejemplo: cálculo de la actividad enzimática de la ureasa de una muestra de
suelo en cuyo análisis se gastaron 6.0 mL de H2SO4. A su vez, en el blanco la cantidad de H2SO4 requerido fue de 5.7 mL. Se consideró lo siguiente: a) que para
tal análisis se utilizaron 5 g de suelo (sh); b) el peso en base seca de un gramo de
suelo es 0.70 g (ss); y c) el volumen de la suspensión fue de 50 mL (V).
Au = 300
Au =
µg N - NH4
g de suelo seco x 2
(50)(6.0 - 5.7) x 70
5 x 0.7
Control de calidad
La reacción de la ureasa sigue un curso lineal hasta por 5 h; pasado este tiempo
las soluciones no presentarán un resultado óptimo.
Todo el material debe encontrarse en condiciones estériles debido a que las
enzimas ureasas son muy sensibles y puede haber respuestas de interferencia por
factores diversos.
Cuadro 1.1. Resumen de las condiciones recomendadas para la prueba de la actividad enzimática de la ureasa
Duración de la prueba
Temperatura de incubación
26
3h
37 °C
Métodos ecotoxicológicos para la evaluación de suelos contaminados con hidrocarburos
Cuadro 1.1. Continúa
Tiempo de incubación
Cantidad de suelo
Número de réplicas
Respuesta a medir
Control positivo
2h
50 g
3 o más
Amonio liberado
Adición de urea posterior a la
adición de KCl-Ag2SO4
Determinación de la actividad enzimática de la lipasa
Fundamento del método
Las lipasas son enzimas ubicuas que se encuentran en prácticamente todos los seres vivos. Juegan un papel esencial en la digestión, el transporte y el procesamiento
de los lípidos (triglicéridos, ceras, grasas y aceites). Son importantes porque son
responsables de disgregar las grasas de los alimentos para que puedan ser absorbidas por los organismos. Son una subclase de esterasas que interviene en el catabolismo de las grasas y aceites, al romper y modificar los enlaces éster de los lípidos y
sus derivados. Su reacción principal es la hidrólisis de acilglicéridos, es decir, la ruptura del triacilglicerol a diacilglicerol y a monoacilglicerol, ácidos grasos y glicerol.
Sin embargo, también participan en reacciones de síntesis y transesterificación de
acilglicéridos y fosfoglicéridos. Estas enzimas pueden tener actividad intracelular
o extracelular. Su actividad óptima se encuentra a temperaturas cercanas a los 30
°C, pH neutro y en presencia de aireación (Sánchez-Ferrer, 1998).
Además de la digestión de grasas, las lipasas en los microorganismos se encargan de la reconstitución celular y del metabolismo lipoprotéico, funciones esenciales para su supervivencia y para el mantenimiento de su función ecológica como
organismos descomponedores en los ciclos biogeoquímicos naturales. Sin embargo, estas enzimas también han mostrado su utilidad en procesos industriales y en
la biorremediación de suelos contaminados.
La medición de la actividad de la lipasa ha resultado útil para monitorear la biorremediación de suelos contraminados con hidrocarburos de petróleo, en particular
con diésel (Margesin et al., 1999; Margesin et al.,2000b). Esta actividad aumenta
con el incremento inicial del contenido de aceites pesados, debido a que es inducida por los productos liberados durante la biodegradación y que actúan de sustrato
Técnicas
para el análisis de actividad enzimática en suelos
27
para las diferentes enzimas hidrolasas, incluidas las lipasas. Se ha observado que
esta actividad no aumenta en el caso de suelos contaminados con hidrocarburos aromáticos policíclicos, pero sí en suelos contaminados con diésel (Mills et al.,
1978; Margesin et al., 2000a).
Existen varios métodos para determinar la actividad de la lipasa, que incluyen los basados en titulación, los que detectan productos fluorescentes (Cooper y
Morgan, 1981) y los colorimétricos, que usan cromógenos como los p-nitrofenilésteres (Shirai y Jackson, 1982). El método que aquí se describe es el colorimétrico desarrollado por Margesin et al. (2002). En este método, el p-nitrofenilbutirato
(p-NPB) actúa como sustrato, y la actividad catalítica de la lipasa se determina
al cuantificar el p-nitrofenol (p-NP) producido por la hidrólisis del sustrato, a pH
óptimo (7.25). La actividad de la lipasa se incrementa a medida que hay mayor
contaminación por hidrocarburos (Margesin et al., 2002; Margesin, 2005). Esta
técnica es rápida y sencilla, y no es costosa como los métodos fluorimétricos.
Campo de aplicación
Esta técnica puede aplicarse a suelos contaminados con hidrocarburos, como
diésel y petróleo, así como para controlar los procesos de biorremediación de
suelos.
Material y equipo
Matraces aforados de 10, 25, 100 y
500 mL
Pipetas de 5 mL
Tubos de 10 mL
Tubos de ensaye de 10 mL
Autoclave
Balanza analítica
Baño maría
Centrífuga refrigerada
Espectrofotómetro UV-VIS
Es necesario esterilizar el material en autoclave.
Reactivos
Agua destilada
Fosfato monobásico de sodio (NaH2PO4)
Hidróxido de sodio (NaOH)
p-nitrofenilbutirato (p-NPB) de 98 % de pureza
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Métodos ecotoxicológicos para la evaluación de suelos contaminados con hidrocarburos
p-nitrofenol (p-NP) de 98 % de pureza
2-propanol de 99.7 % de pureza
Soluciones
Solución amortiguadora de fosfatos 100 mM pH 7.25. Pesar 6 g de NaH2PO4 y
disolverlos en 400 mL de agua destilada, ajustar el pH a 7.25 con una solución
de NaOH 1N y aforar a 500 mL con agua destilada. Guardar en refrigeración a
4 °C durante 15 días.
Solución de hidróxido de sodio 1N. Disolver 4 g de NaOH en agua destilada (fría
y previamente hervida) y aforar a 100 mL. La solución puede permanecer a
temperatura ambiente durante 15 días.
Solución de p-nitrofenol (p-NP) 100 µg/mL. Disolver 2.5 mg de pNP en la solución amortiguadora de fosfatos y aforar a 25 mL con la misma solución.
Guardar en refrigeración a 4 °C durante una semana. Antes de utilizarla, verificar que el pH de la solución sea de 7.25.
Solución de p-nitrofenilbutirato (p-NPB)100 mM. Tomar 175.8 µL equivalente a
209.2 mg de pNPB, disolver y aforar a 10 mL con 2-propanol. Guardar a -20
°C durante 15 días o preparar cada vez que se utilice.
Procedimiento
Incubación de la muestra y cuantificación del p-nitrofenol
Agregar en un tubo para centrífuga 0.1 g de suelo húmedo, adicionar 5 mL de la
solución amortiguadora de fosfatos y preincubar en baño maría a 30 °C durante
10 min.
Posteriormente, adicionar 50 µL de solución de p-NPB, mezclar e incubar en
baño maría a la misma temperatura durante 10 min. Inmediatamente después,
colocar los tubos en un baño con hielo durante 10 min, con el objetivo de detener
la reacción.
Centrifugar los tubos a 2000 rpm durante 5 min a una temperatura de 2 a 4°
C. Enseguida, introducir los tubos en el baño de hielo, pipetear el sobrenadante y
medir su absorbancia a 400 nm (Margesin, 2005). Si los valores de absorbancia
son muy altos, diluir las muestras con la solución amortiguadora de fosfatos.
Técnicas
para el análisis de actividad enzimática en suelos
29
Preparación de la curva de calibración
Para cuantificar la actividad enzimática en función de la concentración de p-NP
se utiliza la solución amortiguadora de fosfatos para mantener el pH en un valor
óptimo.
Se preparan 5 muestras de 0.1 g de suelo en los tubos para centrífuga, los
cuales tendrán concentraciones desde 25 hasta 125 µg de p-NP. A cada tubo se
agregan las soluciones de p-NP y amortiguadora de fosfatos, como se muestra en
el cuadro 1.2. Se agita cada uno de los tubos durante unos segundos en el vórtex.
Cuadro 1.2. Relación de reactivos a adicionar
Número de muestra
mL de solución p-NP 100 µg/mL
mL de solución amortiguadora de
fosfatos
Concentración final de p-NP (μg)
1
0.25
4.75
2
0.50
4.50
3
0.75
4.15
4
1.00
4.00
5
1.25
3.75
25
50
75
100
125
Posteriormente, se incuban los tubos durante 10 min a 30 oC en baño maría.
Terminado el tiempo de incubación, se centrifugan a 2000 g durante 5 min a una
temperatura de 2 a 4oC. Inmediatamente después de haber centrifugado los tubos, se mide la absorbancia a 400 nm en el espectrofotómetro, utilizando como
blanco los reactivos sin adición de estándar.
Controles
Los controles para cada suelo que se analice se preparan de la misma manera que
las muestras, pero sin adicionar suelo. Para ello se realizan cuando menos 3 réplicas
en las que se agregan únicamente 5 mL de solución amortiguadora de fosfatos, se
preincuban en baño maría a 30 °C durante 10 min y se continúa el mismo procedimiento que se usó para las muestras.
Cálculos
La actividad de la lipasa en suelos se expresa en µg de p-NP/g de suelo seco por 10
min. Los valores obtenidos de absorbancia en las muestras analizadas son interpo30
Métodos ecotoxicológicos para la evaluación de suelos contaminados con hidrocarburos
lados en la curva de calibración para obtener la concentración de p-NP. Para obtener la actividad de cada muestra se utiliza la siguiente fórmula (Margesin, 2005):
AL =
M-C
sh x sc
Donde
AL = actividad de la lipasa, en
µg p - NP
g de suelo seco x 10 min
M = concentración de p-NP de la muestra de suelo, en μg
C = concentración de p-NP del control, en μg
sh = peso del suelo (0.1 g)
sc = peso del suelo seco, en g
Ejemplo. Cálculo de la actividad enzimática de la lipasa de una muestra de suelo
que contiene 267.47 µg de p-NP. El control tiene una concentración de p-NP de
122.75 g, y el peso del suelo seco (sc) es igual a 0.0766 g.
AL =
(267.47 - 122.75) µg p - NP
0.1 x 0.0788 g
AL = 18,892.87
µg p - NP
g de suelo seco x 10 min
Control de calidad
Se recomienda hacer la curva de calibración de p-NP en presencia de una muestra de suelo, debido a que el p-NP producido durante la reacción se adsorbe a
esta matriz en diferentes proporciones dependiendo de las características del
suelo.
Este bioensayo requiere de mantener el pH dentro de los límites de 7.2 a 7.3
debido a que el enlace éster de p-NPB es muy lábil.
Técnicas
para el análisis de actividad enzimática en suelos
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Cuadro 1.3. Resumen de las condiciones recomendadas para la prueba de la actividad enzimática de la lipasa
Cantidad de suelo
Temperatura de incubación
Tiempo de incubación
pH
Número de réplicas
Control negativo
Material de los recipientes de prueba
10 g
30 °C
10 min
7.2 a 7.3
3 o más
Sin adición de suelo
Vidrio
Determinación de la actividad enzimática
de la deshidrogenasa
Fundamento del método
Las enzimas deshidrogenasas pertenecen al grupo de las oxidorreductasas, es
decir, a las enzimas que remueven electrones (oxidan) o añaden electrones
(reducen) a varios sustratos (Ríos-Velázquez et al., 2008; Rodríguez-Zavala,
2006). La principal actividad de las deshidrogenasas es eliminar átomos de
hidrógeno de la molécula del sustrato y transferirlos a un cofactor o coenzima
(como algunas vitaminas o los nucléotidos NAD, NADP, FAD y FMN) que es
reducido al recibir dichos átomos. De esta manera el sustrato queda oxidado
y normalmente aparece con un doble enlace entre el oxígeno y el carbono, en
las posiciones en las que antes estaba presente un grupo hidroxilo (OH) (RíosVelázquez et al., 2008).
Las deshidrogenasas están presentes en todos los seres vivos, en particular en
levaduras y bacterias. Son claves en el metabolismo energético de las células, ya
que participan en la glucólisis (degradación de la glucosa a piruvato), la fermentación (degradación anaerobia de la glucosa para obtener energía en forma de ATP)
y el ciclo de Krebs (ciclo subsiguiente a la glucólisis de donde se obtiene más ATP)
(Ríos-Velázquez et al., 2008). Estas enzimas intervienen en los procesos de destoxificación y en el metabolismo de la vitamina A (Ríos-Velázquez et al., 2008).
La actividad de la deshidrogenasa ha sido utilizada como un indicador de la
actividad microbiana del suelo (Barajas-Aceves, 2008). La actividad de la deshi32
Métodos ecotoxicológicos para la evaluación de suelos contaminados con hidrocarburos
drogenasa es mayor en suelos anaeróbicos o en inundados en comparación a los
suelos incubados en condiciones aerobias (Makoi y Ndakidemi, 2008; Subhani et
al., 2001). La medición de esta actividad comprende distintos sistemas de enzimas, las cuales intervienen en procesos de deshidrogenación, representados por la
siguiente reacción (Paolini, 2003):
XH2 + A  X + AH2
Donde
XH2 = compuesto orgánico (donador de hidrógenos)
A = aceptor de hidrógenos
Se ha encontrado una correlación positiva entre esta actividad y el contenido de hidrocarburos en el suelo. En una primera fase se observa un aumento de
la actividad de las deshidrogenasas en el suelo como reflejo de la adaptación y
el crecimiento exponencial de los microorganismos, debido a la disponibilidad de
nuevas fuentes de carbono introducidas por los hidrocarburos. Posteriormente, y
como una consecuencia de la biodegradación, esta actividad decrece cuando el
contenido de hidrocarburos disminuye debido a una menor disponibilidad de los
compuestos (Margesin, 2005).
En esta sección se describe el método de Casida (Casida et al., 1964; Casida,
1977; Barajas-Aceves, 2008), el cual se basa en el uso de una sal soluble, en este
caso cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolium (TTC), como aceptor terminal de electrones. Después de incubar las muestras de suelo 24 h a 37 oC, esta sal es reducida formando trifeniltetrazoliumformazan (TPF) de color rojo. Una vez extraído el
TPF con un disolvente como metanol o acetona, su concentración es cuantificada
por colorimetría (Trevors, 1984; Alef y Nannipieri, 1998).
Esta técnica es fácil de realizar y sus resultados son confiables; sin embargo,
tiene las desventajas de que algunos de los reactivos que requiere no son fáciles
de adquirir y de que, comparado con el método del iodonitrotetrazolioformazán
(INT), el TTC es menos soluble en agua y puede reducirse en presencia de grandes
cantidades de oxígeno (Von Mersi y Schinner, 1991).
Técnicas
para el análisis de actividad enzimática en suelos
33
Campo de aplicación
La actividad de la deshidrogenasa es utilizada para monitorear los suelos contaminados con hidrocarburos de petróleo, como el diésel, y durante los procesos
para su biorremediación.
Material y equipo
Embudos de separación
Matraces aforados de 50 y 100 mL
Papel aluminio
Pipetas graduadas de 1, 5 y 10 mL
Tubos de ensayo de 16 x 150 mm
Balanza analítica
Espectrofotómetro UV-VIS
Estufa de incubación
Vórtex
Reactivos
Acetona o metanol grado analítico
Ácido clorhídrico grado analítico
Agua destilada
Amortiguador TRIS (hidroxi metil aminometano) grado ultrapuro (≥ 99 %)
Carbonato de calcio (CaCO3) grado analítico
Cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC) de 98 % de pureza
1,3,5-trifenilformazano (TPF) de 98 % de pureza
Soluciones
Solución de ácido clorhídrico 0.2 M. Disolver 8.14 mL de ácido clorhídrico al 38 % en
un matraz aforado que contenga 250 mL de agua destilada y aforar a 500 mL.
Solución amortiguadora de TRIS pH 7.6.
Disolver 12.1 g de TRIS en 700 mL de agua destilada, ajustar el pH a 7.6 con HCl
(0.2 M) y aforar con agua destilada a 1000 mL.
Solución de 1,3,5-trifenilformazano (TPF). Disolver 50 mg de TPF en 80 mL de
metanol (o acetona) y aforar a 100 mL con el mismo disolvente.
Solución de cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC) al 3% (en peso/volumen).
Disolver 3 g de cloruro de 2,3,5-TTC en 75 mL de agua destilada y aforar a
100 mL.
34
Métodos ecotoxicológicos para la evaluación de suelos contaminados con hidrocarburos
Procedimiento
Incubación de las muestra
Se pesan, por separado, tres porciones de suelo de 2 g cada una y se colocan en
tubos de ensayo forrados con papel aluminio (ya que el TTC y el TPF son sensibles
a la luz). A cada tubo se le adicionan 0.0335 g de CaCO3, 0.5 mL de la solución
de TTC al 3 % y 1.75 mL de agua destilada. Los contenidos son mezclados en el
vórtex. Los tubos son incubados durante 24 h a 37 oC. Todo este procedimiento
debe realizarse con luz difusa.
Extracción y medición del 1,3,5-trifenilformazano
Al finalizar la incubación, el TPF formado por la reducción del TTC se extrae en
un embudo de separación con 5 mL de metanol (figura 1.3), agitando durante 5
minutos. Después, se filtra. Este procedimiento se repite añadiendo metanol hasta
llegar a un volumen de 40 mL. El extracto total se deposita en un matraz de 50
mL para aforar. Se analizan las muestras en el espectrofotómetro a una longitud de
onda 485 nm, usando metanol como blanco.
Figura 1.3. Extracción de 1,3,5-trifenilformazano (TPF)
Técnicas
para el análisis de actividad enzimática en suelos
35
Preparación de la curva de calibración de 1,3,5-trifenilformazano
Se toman 0, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0 y 4.0 mL de la solución de TPF en matraces volumétricos de 50 mL. Se adicionan 8.3 mL de solución de amortiguador TRIS pH 7.6
a cada matraz y se aforan con metanol (o acetona) a 50 mL. Las concentraciones
finales que se obtienen son 0, 5, 10, 20, 30 y 40 µg TPF/mL. Se lee en espectrofotómetro a una longitud de onda de 485 nm.
Controles
Los controles se preparan con 5 mL de solución amortiguadora TRIS sin adicionar
TTC, y se tratan igual que las muestras.
Cálculos
La actividad de la deshidrogenasa en suelos se expresa como µg TPF/g suelo
por día. Los valores obtenidos de absorbancia en las muestras analizadas son
interpolados en la curva de calibración para obtener la concentración del TPF.
Como blanco se utilizan los controles de suelo. Para obtener la actividad de
cada muestra se utiliza la siguiente fórmula:
AD =
V {[TPF]M - [TPF]C}
sc
Donde:
AD = actividad de la lipasa, en
µg TPF
g de suelo seco x d
[TPF]M = concentración de TPF en la muestra de suelo, en µg/mL
[TPF]C = concentración de TPF en la muestra de suelo, en µg/mL
sc = peso del suelo en base seca de 1 g de suelo húmedo, en g
V = volumen de metanol (o acetona) adicionado a la suspensión, en mL
36
Métodos ecotoxicológicos para la evaluación de suelos contaminados con hidrocarburos
Ejemplo
Cálculo de la actividad enzimática de la deshidrogenasa de una muestra de suelo
cuyo análisis reporta que contiene 2.72 µg TPF/mL. Para este cálculo se considera los siguiente: a) el peso seco de 1 g de suelo sin secar es 0.6634 g; b) la
concentración de TPF del blanco es 0.82 µg TPF/mL; y c) el volumen de metanol
adicionado a la suspensión fue de 40 mL.
AD = 114.56
µg TPF
g de suelo seco x d
Control de calidad
Este método no debe utilizarse en suelos contaminados con cobre, ya que este
elemento puede inhibir la actividad de la deshidrogenasa, por reducción de la absorbancia de TPF (García et al., 2003). El TTC puede ser tóxico para los microorganismos (Howard, 1972).
La lectura debe realizarse en oscuridad o luz difusa para evitar que los resultados se alteren.
Cuadro 1.4. Resumen de las condiciones recomendadas para la prueba de la actividad enzimática de la deshidrogenasa
Cantidad de suelo
Luz
Temperatura de incubación
Tiempo de incubación
Número de réplicas
Control negativo
Cuantificación
Material de los recipientes de prueba
Técnicas
20 g
Difusa u oscuridad
37 °C
24 h
3 o más
5 mL de TRIS, sin adición de TTC
Espectrofotométrica 485 nm
Vidrio
para el análisis de actividad enzimática en suelos
37
Determinación de la actividad enzimática de la catalasa
Fundamento del método
Durante los procesos biológicos (metabolismo) se generan especies químicas
conocidas como radicales libres, los cuales se caracterizan por presentar un
electrón desapareado y por ser muy reactivas. Entre estos radicales, las especies reactivas derivadas del oxígeno (EROS) resultan de gran interés debido a
su estructura birradical y al gran número de procesos que las generan y en los
que pueden verse involucradas. Las principales EROS son el anión superóxido
(O2-), el radical hidroxilo (OH), el oxígeno singlete y el peróxido de hidrogeno (también llamado agua oxigenada) (H2O2). Estas especies oxidantes están
implicadas en el daño celular que se ha asociado con el desarrollo de cáncer,
enfermedades inflamatorias, senectud celular y enfermedades neurodegenerativas, entre otros procesos patológicos. En los organismos existe un sistema
de protección antioxidante formado por enzimas y compuestos de bajo peso
molecular. Una de las enzimas que intervienen en esta protección y en el mantenimiento del balance oxidante/antioxidante es la catalasa (UACH, 2009).
La catalasa forma parte de los sistemas de destoxificación de las células animales y vegetales, y de bacterias aerobias y anaerobias facultativas. La reacción
específica que cataliza es la ruptura del H2O2 para formar agua y oxígeno. El H2O2
se forma en el transporte de electrones de la cadena respiratoria y en ciertas reacciones de hidroxilación y oxigenación (Alef y Nannipieri, 1998).
La catalasa se relaciona con la actividad microbiana del suelo por ser una enzima intracelular presente en microorganismos aerobios y en la mayoría de los anaerobios facultativos.
Se han empleado muchos métodos para determinar la actividad de la catalasa,
los cuales miden la cantidad de oxígeno liberado (O2) o el H2O2 remanente. El
oxígeno puede cuantificarse por volumetría de gases o cromatografía de gases. El
H2O2 se determina por volumetría o colorimetría (García et al., 2003).
En esta sección se describe el método de Johnson y Temple (1964) descrito
por García et al., (2003), que mide el H2O2 residual, para lo cual se adiciona una
cantidad determinada de H2O2 al suelo incubando a 20 °C durante un tiempo determinado en el que actúa la enzima, según la siguiente reacción:
2H2O2  2H2O + O2
38
Métodos ecotoxicológicos para la evaluación de suelos contaminados con hidrocarburos
El H2O2 residual se valora con permanganato potásico. Esta valoración se basa
en la reducción del permanganato potásico por el H2O2 en solución ácida, según la
siguiente reacción:
5H2O2 + 2MnO4- + 6H+  5O2 + 2Mn++ + 8H2O
Campo de aplicación
Este ensayo es aplicable a suelo contaminado con hidrocarburos (como petróleo o diésel) y a suelo biorremediado.
Material y equipo
Cantidad de suelo
Luz
Temperatura de incubación
Tiempo de incubación
Número de réplicas
Control negativo
Cuantificación
Material de los recipientes de prueba
20 g
Difusa u oscuridad
37 °C
24 h
3 o más
5 mL de TRIS, sin adición de TTC
Espectrofotométrica 485 nm
Vidrio
Reactivos
Ácido sulfúrico (H2SO4) al 98 % de pureza
Agua destilada
Permanganato de potasio (KMnO4) grado analítico
Peróxido de hidrógeno (H2O2) al 30 % de pureza
Oxalato de sodio grado analítico
Soluciones
Solución de ácido sulfúrico 1.5 M. Se depositan 82.6 mL de H2SO4 de 98 % en
matraz aforado y se lleva a 1000 mL.
Solución de permanganato de potasio 0.01 M. Se pesan 1.5804 g de KMnO4 y se
Técnicas
para el análisis de actividad enzimática en suelos
39
depositan en un matraz Erlenmeyer. Se adicionan 400 mL de agua destilada,
agitando con agitador magnético y calentando hasta su disolución completa.
Se deja enfriar, se filtra y se afora a 1 000 mL utilizando un matraz aforado. Se
guarda en frasco ámbar. La solución se debe valorar cada vez que se utilice con
oxalato de sodio para conocer su normalidad.
Solución de peróxido de hidrógeno 1:100. Se toma una alícuota de 1 mL de H2O2
(agua oxigenada) al 30 %, se afora a 100 mL. Esta solución debe prepararse
inmediatamente antes de su uso.
Procedimiento
Pesar 0.5 g de suelo (tamizado en una malla con tamaño de poro < 2 mm) y
depositarlo en un matraz Erlenmeyer, agregar 40 mL de agua destilada, tapar el
matraz y agitar por 30 min en agitador rotatorio (a una velocidad aproximada
de 30 vueltas por min).
Transcurrido el tiempo, adicionar 5 mL de la solución de H2O2 (1:100), tapar
nuevamente y agitar por 10 min. Añadir 5 mL de la solución de H2SO41.5 M con
la finalidad de parar la reacción enzimática y estabilizar el H2O2 remanente; posteriormente se filtra.
Medición del peróxido de hidrógeno remanente
Se toma una alícuota de 25 mL del filtrado de cada muestra y se titula lentamente
con la solución de KMnO4 0.01M, con agitación (con agitador magnético). Para
llegar al vire se debe ser muy observador, ya que las primeras gotas del permanganato se decoloran lentamente pero luego la reacción se hace más rápida. El punto
final de la valoración lo señala la aparición del primer color rosa permanente.
Controles
Los controles se preparan sustituyendo los 5 mL de H2O2 por un volumen igual de
agua destilada y se adicionan al suelo; se procede de la misma forma que para las
muestras problema.
También se prepara un blanco con 40 mL de agua destilada, 5 mL de H2O2
(1:100) y 5 mL de H2SO41.5 M. A este blanco no se le adiciona suelo, pero sí
40
Métodos ecotoxicológicos para la evaluación de suelos contaminados con hidrocarburos
H2O2. Sirve para indicar la cantidad de H2O2 que podría poseer la muestra como
remanente al final de la incubación, si la actividad de la catalasa fuese nula. Se obtiene una solución de peróxido 8.8 mM (con 0.44 mmoles de H2O2).
El procedimiento de titulación es igual, tanto para los controles como para el
blanco. La concentración inicial del H2O2 que se añade al suelo se determina por la
valoración con la solución de KMnO4 0.01M del blanco sin suelo y con H2O2.
Cálculos
Para calcular la actividad de la catalasa del suelo, se emplea la siguiente
fórmula:
[B - (M - C)] x N x V x 1
AC =
SS
Donde
AC = actividad de la catalasa, en
mmoles de H2O2 consumidos
g de suelo seco x h
B = cantidad de KMnO4 (en mL) gastados en la valoración del blanco sin suelo
y con H2O2
M = cantidad de KMnO4 (en mL) gastados en la valoración de las muestras
C = cantidad de KMnO4 (en mL) gastados en la valoración del control correspondiente a cada muestra de suelo
N = normalidad exacta de la solución de KMnO4
0.5 = valor constante que procede del cálculo para conocer los mg de H2O2 que
reaccionan con el KMnO4 [peso molecular del H2O2 (34 dividido por estado de
oxidación de (2)] y del cálculo para obtener la cantidad de H2O2 en mmoles (1/
peso molecular del H2O2)
V = factor de dilución; en este caso es 50 mL/25 mL
ss = factor relativo a la cantidad de suelo seco utilizado (aquí se toma una
muestra de 0.5 g de suelo húmedo y se pone a secar en la balanza de humedad.
Al final se reporta el peso que corresponde en suelo seco y ese valor es al que se
refiere G)
t = factor de tiempo (6) porque son 10 minutos; se reporta hora (60/10
=6)
Técnicas
para el análisis de actividad enzimática en suelos
41
Ejemplo
Cálculo de la actividad enzimática de la catalasa de una muestra de suelo de la
cual se tienen los siguientes datos:
B = 10.4 mL de KMnO4
M = 10.7 mL de KMnO4
C = 0.1 mL de KMnO4
N = 0.0145 N
V=2
G = 0.3770 g de suelo seco
Al sustituir en la fórmula se obtiene el siguiente resultado:
AC = 0.2076
mmoles de H2O2 consumidos
g de suelo seco x h
Control de calidad
En esta técnica enzimática el color rosa pálido indica el viraje. Ya que el H2O2
es muy inestable y la muestra antes de titular es de color transparente, se debe
finalizar la titulación en cuanto aparezca el primer color rosa permanente durante la titulación.
Cuadro 1.5. Resumen de las condiciones recomendadas para la prueba de la actividad enzimática de la catalasa
Cantidad de suelo
Número de réplicas
Control negativo
Blanco de prueba
Cuantificación
Material de los recipientes de prueba
Cuantificación
Material de los recipientes de prueba
42
10 g
3 o más
5 mL de agua destilada sustituyen a 5
mL de H2O2
Sin suelo pero con H2O2
Permanganimetría
Vidrio
Espectrofotométrica 485 nm
Vidrio
Métodos ecotoxicológicos para la evaluación de suelos contaminados con hidrocarburos
Consideraciones generales para el control
de calidad en los métodos enzimáticos
Para garantizar resultados reproducibles en los métodos descritos en este capítulo, deben atenderse las siguientes consideraciones:
La limpieza del material de vidrio y su protección del polvo son muy importantes para evitar interferencias. Se recomienda lavar el material de vidrio con un
detergente no iónico.
Con la finalidad de asegurar un buen procedimiento, los materiales para las
determinaciones enzimáticas se deben separar. Los recipientes de prueba deben
ser resistentes a las reacciones y no deben adsorber el sustrato o los productos
generados en la reacción.
Cada técnica debe realizarse de acuerdo con el procedimiento descrito ya que
si se cambian algunos valores, como por ejemplo la concentración del sustrato, se
pueden obtener resultados incorrectos.
En cuanto a la utilización de solución tampón o amortiguadora, existen diferencias según los métodos; algunos autores (Kandeler y Gerber, 1988; Von Mersi
y Schinner, 1991) no utilizan ninguna, pero otros sí la utilizan para ajustar el pH
del suelo (Sinsabaugh et al., 2000). En la mayoría de los métodos enzimáticos
descritos la solución amortiguadora empleada es la que se añade al suelo antes de
su incubación. Cualquier cambio de tipo o concentración de tampón puede afectar
los resultados, por lo cual deben comprobarse los efectos que el cambio tendría
sobre la actividad enzimática.
La temperatura y el tiempo de incubación deben ser los indicados para cada
técnica, usualmente 37° C. El incremento de la temperatura aumenta la velocidad
de reacción; sin embargo, si esta llega a ser muy alta, las enzimas pueden desnaturalizarse. Si el tiempo no es correcto se obtendrían resultados erróneos porque la
relación de actividad por unidad de tiempo cambiará (García et al., 2003).
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