DETERMINACIÓN DEL NÚMERO DE COPIAS DE ADN

DETERMINACIÓN DEL NÚMERO DE COPIAS DE ADN
MITOCONDRIAL (ADNmt) COMO BIOMARCADOR DE
EXPOSICIÓN A HIDROCARBUROS AROMÁTICOS
Chagoyán Martínez Marcela María, Instituto Politécnico Nacional.
Alegría Torres Jorge Alejandro, Universidad de Guanajuato.
RESUMEN
Entre los efectos tempranos a nivel
celular asociados a la exposición a
benceno, se encuentra la disfunción
mitocondrial. Esto se debe a que las
mitocondrias
poseen
una
gran
susceptibilidad al estrés oxidativo, por
lo que el número de copias de ADN
mitocondrial (ADNmt) es considerado
un marcador molecular de efecto
temprano que puede ser utilizado como
indicador
de
daño
en
etapas
subclínicas. En el presente estudio se
determinó el número de copias de
ADNmt de 104 niños de cuatro
escuelas primarias ubicadas en el
corredor industrial de Salamanca, y
sólo en 40 niños se correlacionó este
marcador con los niveles de benceno
urinario.
INTRODUCCIÓN
El benceno es un hidrocarburo
aromático volátil considerado un tóxico
carcinógeno. Existen modelos in vitro
que muestran que algunos de los
metabolitos reactivos del benceno
pueden unirse y dañar el ADN (Ross,
2000) por la generación de especies
reactivas al oxígeno (ROS). La
mitocondria es un organelo de las
células eucarióticas que tiene como
función principal la producción de
energía mediante el consumo de
oxígeno. Al igual que el núcleo celular,
la mitocondria es una fuente de ADN
dentro de la célula. El genoma
mitocondrial
codifica
para
13
polipéptidos de la cadena respiratoria
(Yu et al., 2012). Lo que convierte a la
mitocondria en el principal objetivo de
los ROS. Cada célula humana y animal
contiene entre cientos y miles de
mitocondrias, cada una con 2 a 10
copias de ADNmt (Carugno et al.,
2012) y el número de copias de ADNmt
está relacionado con el número y
tamaño de este organelo (Lee y Wei,
2000). Comparado con el ADN nuclear,
el ADNmt carece de histonas
protectoras y por lo tanto, su capacidad
de reparación es menor (Carugno et
al., 2012). Se ha demostrado que las
células dañadas por ROS sintetizan un
mayor número de copias de ADNmt
para compensar el daño por el
incremento de la demanda respiratoria
requerida para la eliminación de ROS
(Lee y Wei, 2000). Las principales
fuentes de benceno en el aire son los
procesos industriales y sus niveles en
el aire pueden aumentar por emisiones
generadas principalmente por la
combustión de carbón y petróleo. En
mayo de 2007 un informe de la Cámara
de Diputados reveló que Salamanca
era la ciudad más contaminada de
México al contar con fuentes de
contaminación tales como la Refinería
de Pemex, la central Termoeléctrica
Salamanca
(CTS),
entre
otras
industrias que forman parte de su
corredor industrial (Álvarez, 2011). En
esta investigación se determinó el
número de copias de ADNmt como
marcador
molecular
de
efectos
tempranos asociado a la exposición a
benceno.
OBJETIVO
Determinar el número de copias de
ADNmt asociado a la exposición a
benceno en niños de Salamanca, Gto.
MATERIALES Y MÉTODOS
Se seleccionaron 104 niños de entre 6
y 12 años de cuatro escuelas primarias,
Mártires de Cananea (EMC), Artículo
123 Eduardo Soto Ines (ESI), Luis G.
Araujo (LGA) y Xidoo (XID) de la
ciudad de Salamanca, para determinar
el número de copias de ADN
mitocondrial. Estudiantes de posgrado
de la Universidad de Guanajuato
tomaron muestras de sangre venosa y
de orina, que se utilizaron para la
extracción de ADN y el análisis de
concentración
del
benceno,
respectivamente.
Extracción de ADN. 3 mL de sangre
periférica extraída por punción venosa,
se mezclaron con 2 mL de buffer de
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Alegría Torres Jorge Alejandro, Universidad de Guanajuato.
lisis (0.3M sacarosa, 10 mM Tris-HCl,
pH 7.5, 5mM MgCL2 y 1%tritón X100),
y se centrifugó a 3000 rpm 5 minutos.
El sobrenadante se desechó y el
sedimento se lavó dos veces con buffer
de lisis. El sedimento se resuspendió
en 150 μL de Tris-HCL 10 mM pH 8,0.
Posteriormente, se adicionaron 150 μL
de detergente doméstico a 20mg/mL.
Se adicionaron 100 μL de NaCl 5 M
para precipitar proteínas. Se centrifugó
a 13 400 rpm por 10 minutos y el
sobrenadante se transfirió a un
microtubo con 1 mL de etanol al 96%
previamente
enfriado
a
-20°C
incubándose por 30 min. El ADN se
obtuvo por centrigación a 14000 rpm
por 10 min y se lavó dos veces con 500
μL de etanol al 70%, centrifugando a
14000 rpm por 2 minutos. El ADN se
resuspendió en 200 μL de agua grado
biología molecular y se colocó a baño
maría 70°C 1 h para su resuspensión
(García, et al.,2009).
Calidad de ADN. Se realizó un análisis
espectrofotométrico mediante lecturas
a 230, 260 y 280 nanómetros utilizando
el equipo xMark Microplate Absorbance
Spetrophotometer de BioRad®. Se
consideraron óptimas las relaciones
260/230 y 260/280 comprendidas entre
1.4 y 2. Todas las muestras se
diluyeron en agua libre de nucleasas a
una concentración final de 7 ng/μL y se
almacenaron a -80°C.
Número de copias de ANDmt por
PCR en tiempo real. La reacción de
qPCR se realizó en un termociclador
CFX96 Touch real-time detection
system de BioRad®. Se generó una
curva estándar seleccionando 23
muestras al azar produciendo un pool
de ADN de 50 ng/μL, del cual se
realizaron diferentes diluciones (22, 11,
5.5 ,2.75 ,1.37 y 0.687ng/μL). Se
amplificó un fragmento del gen
mitocondrial ND1 y uno del gen de
betaglobina como referencia. Las
condiciones de amplificación para
ambos genes fueron: 3 min a 95°C, 35
ciclos a 98°C 15s y 58°C 1 min, 95°C
15 seg, 60°C 15 seg y 45°C 15 seg.
Cada muestra se realizó por triplicado y
se utilizó Evagreen como reportero.
Análisis de datos. Se utilizó el
software del sistema de detección
CFX96 de BioRad®. Las curvas
cumplieron con los parámetros de
calidad (r=0.99, pendiente de -3.4 y
eficiencia entre 90% y 105%). Sólo
fueron aceptados los promedios con
desviaciones estándar menores a 0.25.
Para
obtener
el
cociente
ND1/betaglobina (M/S) se dividió el
promedio de la concentración del
producto de amplificación del gen
mitocondrial entre el de betaglobina,
obtenido a partir del valor Cq
extrapolado en la curva estándar.
RESULTADOS
Figura 1. Media del número de copias de
ADNmt en cada escuela
CONCLUSIONES Y DISCUSIÓN
El estudio indica que las medias del
número de copias de ADNmt es distinta
entre los niños de las cuatro escuelas,
distinguiéndose la escuela Mártires de
Cananea del resto (P<0.0001) (Figura
1). Debido a que este es un estudio
reciente, aún no se cuenta con el nivel
de exposición de benceno para todos
los niños, solamente se tienen los
datos de 40 niños de tres escuelas
(EMC, LGA, ESI). La media del ácido tt- mucónico (biomarcador de benceno)
fue de: 233 μg/g de creatinina estando
por debajo del límite de exposición
reportado por la Administración de
Seguridad y Salud (OSHA) de 500 μg
de ac.t-t-mucónico/g Cr (OSHA, 2012);
sin embargo, este es un valor de
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Alegría Torres Jorge Alejandro, Universidad de Guanajuato.
referencia para trabajadores y este
estudio se realizó en población infantil.
Por lo anterior, se plantea como
perspectiva realizar un análisis de
regresión para correlacionar el nivel de
exposición a benceno con el número de
copias de ADNmt. La importancia de
este tipo de estudios radica reconocer
el impacto de los contaminantes
ambientales a niveles subclínicos antes
del desarrollo de enfermedades
(Rosso, 2014). Se han realizado
estudios previos en donde han
correlacionado el número de copias de
ADNmt con la exposición a benceno
pero en escenario de exposición
ocupacional (Carugno et al., 2012;
Shen et al., 2008), relacionando este
efecto con el riesgo de padecer cáncer
de pulmón y leucemia (Hosgood et al
2010; Carugno et al., 2012). La
relevancia de este estudio se debe a
que se ha utilizado este marcador en
población infantil bajo un contexto de
exposición ambiental a benceno. De
acuerdo a lo anterior se concluyen los
siguientes puntos:
-Los niños de la escuela primaria
Mártires de Cananea presentaron en
promedio un mayor número de copias
de ADNmt, comparado con los demás.
-La cercanía de las escuelas al
corredor industrial constituye un factor
de riesgo para el daño a la salud de los
niños.
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