Inmunidad Innata

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Inmunidad Innata
Línea temporal de la respuesta inmune
Sistema de Complemento
Componente termosensible del plasma con la capacidad para
aumentar la opsonización de microorganismos mediada por
anticuerpos
Activación en cascada por clivaje de precursores: AMPLIFICACION
Tres vías de activación
Sistema de Complemento
Sistema de Complemento
Cual es la consecuencia?
Producción de inflamación
Opsonización de microorganismos
Efecto citotóxico directo sobre microorganismos
Potenciación de la respuesta B
Sistema de Complemento
La activación del complemento por cualquiera de las tres vías
conduce a:
La generación de C3a y
quimiotáctica y anafiláctica
C5a
que
poseen
actividad
La generación de C3b y C4b que actúan como opsoninas
La generación del complejo de ataque lítico (C5-C9)
¿En que se diferencian las tres vías?
Clásica
Activada por anticuerpos (IgM, IgG1-3) unidos al antígeno
Actúa en etapas mas tardías de la infección ya que se empieza
a observar una concentración mayor de anticuerpos a los 4-7
días post-infección
Alterna
Se activa, en forma directa, por ciertas estructuras presentes en
la superficie de los microorganismos
Opera en etapas tempranas cuando el organismo aún no ha
podido generar grandes cantidades de anticuerpos
¿En que se diferencian las tres vías?
De la lectinas
Se activa por lectinas que se unen a la superficie de los
microorganismos
Todas las vías de activación conducen a la generación
del complejo proteico denominado C3 convertasa que
es central en la cascada de activación
Vía Clásica
Activada por anticuerpos circulantes unidos a antígenos
Los anticuerpos libres NO la activan
Complejo C1:
Inicia cascada
Vía Clásica
Vía Clásica
C1q se une a IgM o IgG1-3 que han sufrido un cambio
conformacional por unión al antígeno
IgM Polimérica
C
μ4
IgM forma pentameros y hexameros
C
μ3
Cμ2 Cμ
1
N.B. Only
constant heavy
chain domains
are shown
Cμ3 binds C1q to initiate
activation of the classical
complement pathway
Cμ1 binds C3b to facilitate
uptake of opsonised antigens by
macrophages
Cμ4 mediates multimerisation
(Cμ3 may also be involved)
Cambio de conformación de IgM mediada por el antígeno
Planar or ‘Starfish’ conformation found in
solution.
Does not fix complement
Staple or ‘crab’ conformation of IgM
Conformation change induced by
binding to antigen.
Efficient at fixing complement
Activación de la vía clásica
Vía Clásica
C1q activa a C1r que cliva y
activa a C1s
C1s cliva a C4 y C4b se une
covalentemente a la superficie
de la célula
C4b unido a la membrana une
a C2 que a su vez es clivado
por C1s en C2a (fase fluida) y
C2b. C2b forma con C4b unido
en la membraba el complejo
C3 convertasa
Vía Clásica
C3 convertasa escinde a C3 en:
C3a (fase fluida) y C3b
C3b se compleja con la C3
convertasa y forma el
complejo C5 convertasa
C5 convertasa cliva a C5 en:
C5a (fase fluida) y C5b que
inicia la formación del poro
lítico
Vía Clásica: RESUMEN
Se activa por anticuerpos
Se activa mas tardíamente
C3 convertasa puede activar
centenares de moléculas C3:
AMPLIFICACION
Vía Alterna
La activación depende de la opsonización del microorganismo
por C3b
Ocurre en ausencia de anticuerpos
La cascada de activación depende de si se activó o no la vía
clásica: LA ACTIVACION DE LA VIA CLASICA ACTIVA LA VIA
ALTERNA
Vía Alterna
Componentes: C3
Factor B
Factor D
Properdina
Vía Alterna
Si hay activación de la vía clásica se produce C3b por acción
de la C3 convertasa clásica
C3b unida covalentemente a la superficie celular se une al
Factor B y este es clivado por el Factor D en Ba y Bb
Bb queda unido a C3b formando C3bBb que es estabilizado
por properdina : C3 convertasa de la vía alternativa
C3bBb cliva a C3 generando mas C3b que amplifica la señal
Vía Alterna
Vía Alterna
¿Qué ocurre si no hay activación de la vía clásica?
En fase fluida hay clivaje espontáneo de C3 a C3b y C3a en
muy baja proporción
C3b puede unirse a la superficie de células propias y extrañas
lo que le permite formar la convertasa C3 de la vía alterna
¿Cómo distingue propio de extraño?
Vía Alterna
Vía Alterna
Los inhibidores se encuentran en la membrana de células
propias
Inhiben la formación de la C3 convertasa
Factor I: cliva a C3b unida a la membrana formando iC3b
que es incapaz de continuar la cascada
Vía Alterna
Inhibición por desplazamiento
Vía Alterna
Factor H: Inhibe la formación de la C3 convertasa alterna
Factor H: Soluble
¿Cómo reconoce lo propio?
Solo se asocia a la membrana cuando esta posee altas
concentraciones
de
ácido
siálico:
esto
ocurre
preferentemente en células eucariotas
La incapacidad del Factor H de asociarse con la superficie
de un microorganismo es la condición crítica permisiva que
conduce a la activación de la vía alterna
Vía de las Lectinas
Activación de C4 y C2 en ausencia de anticuerpos y el
complejo C1
Componentes: MBL (lectina que une manosa)
MASP-1
MASP-2
MASP-1 y MASP-2 son proteasas que una vez unidas a
MBL clivan a C4 y C2 que forman la convertasa C3
Vía de las Lectinas
Semejanza estructural
Lectinas
Clásica
Mecanismo de acción de C3
Marcado radiactivo de C3
Incubación de C3* con glóbulos rojos de oveja
Solubilización de las membranas y electroforesis desnaturalizante
Coomassie
Autoradiografía
a.
Membranas sin marcar
b.
Membranas incubadas con
C3 marcada
c.
C3 marcada
d.
Sobrenadante del
tratamiento con C3 marcada
Marcado radiactivo de C3 y de la membrana de los glóbulos
rojos con dos isótopos de vida media distinta
Incubación de C3* con glóbulos rojos de oveja marcados o no
Solubilización de las membranas y electroforesis desnaturalizante
a.
Marca en C3
b.
Doble marca
c.
Marca en glóbulos rojos
d.
Sobrenadante de la reacción
¿Cuál es la naturaleza de la unión?
Marca radiactiva de alto peso molecular resistente a:
Extracción salina
Congelado/descongelado
pH
Detergentes
Urea en la electroforesis
Tratamiento con
hidroxilamina
Unión de tipo ester
¿Cómo afecta la actividad hemolítica si se evita la unión
covalente?
Inactivación con hidroxilamina (amina primaria)
Medición de actividad hemolítica y de unión al glóbulo rojo
Correlación de
orden 1 entre
inactivación y
unión
El tratamiento no
afecta el
procesamiento C3
¿Cómo distinguir que polipéptido queda unido?
La radiactividad se va
al polipéptido α
Modelo propuesto en la publicación original
Resumiendo
Fase final de la activación del complemento:
formación del poro lítico (MAC)
Componentes: C5, C6, C7, C8 y C9
Ensamblado del MAC (Membrane Attack Pore)
El poro posee alrededor de 100 Å de diámetro y permite el libre
paso de iones y agua generando lisis
El canal se forma por
la polimerización de
C9
Componentes inhibitorios de la formación del MAC
CD59
Proteína de membrana unida a glicofosfatidilinositol que se
expresa en muchos tipos celulares pero está ausente en los
microorganismos
Se une a C8 e inhibe la polimerización de C9
Componentes inhibitorios de la formación del MAC
Proteína-S
Proteína plasmática que impide la inserción de C5b,6,7 en la
membrana
Actúa secuestrando el complejo
La proteína-S secuestra complejo libre que es capaz de ensamblar
el poro en membranas en las cuales no se ha iniciado la cascada
Funciones del complemento
Promover la fagocitosis de las células sobre las cuales
se ha activado
Estimular el proceso inflamatorio
Inducir la lisis directa del microorganismo
Opsonización y fagocitosis
Los fragmentos C3b, iC3b y C4b unidos al microorganismo
actúan como opsoninas
Existen receptores específicos presentes en neutrófilos y
macrófagos para estos fragmentos
En fase sólida
En suspensión
Efecto sinérgico de IgG y C3b
Estimulación de la respuesta inflamatoria
Los fragmentos C3a, C4a y C5a inducen una inflamación
aguda activando mastocitos y neutrófilos
Estos péptidos actúan sobre receptores específicos presentes
en una variedad de células para mediar su acción
C5a es un potente inductor de la motilidad, adhesión y producción
de productos reactivos del oxígeno por parte de neutrófilos
Estimulación de la respuesta inflamatoria
Los pequeños péptidos C3a, C4a y C5a pueden inducir
vasodilatación e inflamación local
C5a>C3a>C4a
Aumentan el flujo
sanguíneo,
permeabilidad vascular
y la unión de fagocitos
al endotelio
El aumento de flujo sanguíneo
aumenta la acumulación de
fluidos que a su vez incrementa
el drenaje linfático que llevan al
patógeno y sus antígenos al
nodos linfáticos cercanos
Estimulación de la respuesta inflamatoria
El fragmento C3b generado por la C3 convertasa es a su vez
clivado en C3d y C3g
C3d y C3g son reconocidos por el receptor CR2 y funcionan
estimulando la respuesta humoral aumentando la activación
de los linfocitos B y promoviendo la captura de complejos
antígeno-anticuerpo en los centros germinales
Activación de linfocitos B por complemento
Enfermedades por alteración del complemento
• Rare
• C1esterase deficiency with angioneurotic edema• Deficiencies in C2, C4 associated with AI diseases
like Lupus
• Homozygous C3 is lethal
• Deficiencies in the alternate path very rare
• Individual component deficiency in C5,C6,C7, C8 and
C9 are associated with Neisserial bacteremia
Activación de la respuesta inmune innata
Respuesta inmune innata inducida
Depende del patrón de citoquinas y quimiocinas que se
producen en respuesta al patógeno
Si esta respuesta no es suficientemente efectiva para
limpiar la infección al menos la contiene hasta que se
desarrolle una respuesta inmune adaptativa robusta
Activación de la respuesta inmune innata
Macrófago activado: cuando se “encuentra” con un
microorganismo
La combinación de receptores que el patógeno activa determina el
patrón de citoquinas inducidas y por la tanto el tipo de respuesta
Tumor Necrosis Factor-α (TNF-α)
Citoquina muy importante que gatilla la contención local de la
infección pero genera shock séptico si es liberado en forma
sistémica
Si la infección se hace sistémica (en sangre) los macrófagos
liberan TNF-α que actúan sobre el hígado, bazo y otros tejidos
induciendo vasodilatación y coagulación generalizada
Ratones mutantes para TNF-α son resistentes al shock séptico
pero incapaces de controlar infecciones locales
Diferencias entre TNF-α
local o sistémico
Pirógenos endógenos
TNF-α, IL-1,IL-6
Altas temperaturas
Aumentan la temperatura corporal
Inhibe el crecimiento
microbiano
Respuesta inmune adaptativa
mas robusta
Se protegen las células propias
del efecto negativo del TNF-α
Toll-like receptors (TLRs): cascada de señalización
En sepsis por gram
negativas: LPS es el
principal inductor de TNF-α
y por lo tanto responsable
del shock séptico
Aislamiento del gen responsable del shock séptico
Ratones resistentes al shock séptico inducido por LPS
Se mapea la mutación por genética clásica: Tlr4
Primera descripción de un Toll-like receptor humano
Búsqueda in silico en mamíferos de un dominio similar al
dominio Tir de los Toll de plantas e insectos
Activación de NFκΒ frente a la
transfección con hToll
dominante positivo
¿Cómo se identifica
MyD88?
Componente central
en la cascada de
activación
Dominio Tir del receptor
de IL-1se sabia que
usaba como adaptador el
dominio Tir del MyD88
NF-κΒ
Inducción de NF-κΒ en
presencia de un MyD88
dominante negativo
MyDNM: sin el
dominio Tir
Precipitación
con anti- hToll
Co-inmunoprecipitación
de hToll con MyD88
MyD88-/- no puede
activar citoquinas
pro-inflamatorias
MyD88-/- no tiene
afectado la expresión
de varios receptores
del macrófago
Producción de diferentes
citoquinas por parte de
macrófagos frente a un
desafío con LPS
Proliferación de linfocitos
B frente a un desafío con
LPS
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