la absorción intestinal de sustancias hidrosolubles y

FISIOLOGÍA ECOLÓGICA Y EVOLUTIVA DE ANIMALES Y PLANTAS : CONCEPTOS Y CASOS
DE ESTUDIO . Francisco Bozinovic & Marino Cabrera (eds). Ediciones Universidad
Católica de Chile. Santiago, Chile 2003, p XX-XX.
L A ABSORCIÓN INTESTINAL DE SUSTANCIAS HIDROSOLUBLES Y
SUS IMPLICANCIAS ECOLÓGICAS Y EVOLUTIVAS .
ENRIQUE CAVIEDES-VIDAL1
Palabras clave: absorción, intestino delgado, vía paracelular, compuestos hidrosolubles,
aves
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Departamento de Bioquímica y Ciencias Biológicas, Facultad de Química, Bioquímica y
Farmacia, Universidad Nacional de San Luis, Chacabuco 917. 5700 San Luis. Argentina.
Email: ecv@unsl.edu.ar
INTRODUCCIÓN.
¿POR QUÉ ESTUDIAR LAS VÍAS DE ABSORCIÓN DE LOS NUTRIENTES?
Un aspecto básico dentro del estudio de la fisiología digestiva y la ecología nutricional, lo
constituye la absorción de sustancias por el sistema gastrointestinal. La incorporación de
sustancias a través del epitelio del intestino delgado constituye la vía principal de ingreso
de nutrientes que ingresan al organismo y posibilitan la supervivencia de éstos, ya que
aportan energía y materiales esenciales que los animales no son capaces de manufacturar
por sí mismos. También pueden ingresar drogas terapéuticas, toxinas y otros compuestos
que se encuentren en el lumen del intestino. En este sentido, el epitelio del intestino
delgado juega un rol crucial en el transporte de nutrientes y otros solutos desde el lumen
intestinal a los líquidos corporales subyacentes, como la sangre y la linfa.
La sustancias presentes en el lumen intestinal encuentran dos barreras limitantes: (a)
una capa de células epiteliales denominadas enterocitos y (b) la uniones entre estas células.
Es decir, que estas dos barreras definen respectivamente dos vías posibles de absorción, la
transcelular y la paracelular.
La vía transcelular, compuesta por los enterocitos, muestra a la luz del intestino
delgado una membrana celular con una especialización formada por repliegues de ésta,
denominada “ribete en cepillo”. La naturaleza de esta membrana, constituida por una
bicapa de fosfolípidos con proteínas inmersas o adheridas a ésta, determina la tasa de
absorción intestinal de sustancias. El traspaso de sustancias a través de la bicapa está
positivamente correlacionado con el coeficiente de partición lípido-agua. De esta manera, la
bicapa restringe el paso a sustancias iónicas y polares, como los hidratos de carbono y los
aminoácidos. Estos compuestos hidrosolubles requieren de proteínas transportadoras para
atravesar la membrana. Los mecanismos descriptos en el transporte mediado (a través de
proteínas) puede ser pasivo (el pasaje de los compuestos ocurre a favor de un gradiente de
electroquímico, sin gasto de energía metabólica) o activo (el pasaje de los compuestos es en
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contra de un gradiente electroquímico y requiere de energía metabólica para su
funcionamiento).
En la vía pasiva, el paso de sustancias desde el lumen intestinal hacia el espacio
intercelular a través de la vía de transporte paracelular se encuentra restringido por los
complejos de unión (Anderson 2001) ubicados apicalmente y los espacios basolaterales.
Los complejos de unión están formados principalmente por las uniones estrechas (zónula
occludens o uniones estancas), desmo somas y uniones en hendidura, donde la estructura
más importante en la restricción del paso de solutos a través de la vía paracelular, son las
uniones estrechas (Ballard et al. 1995).
La absorción de sustancias hidrosolubles es relevante para los organismos por lo
que ha recibido una atención particular por parte de los investigadores, en especial la
absorción de D-glucosa ha sido estudiada ampliamente por constituir la fuente primaria de
energía química en los animales. A partir de 1961, cuando Crane y sus colaboradores
propusieron para el ingreso de glucosa a través del epitelio intestinal, el mecanismo del
cotransporte Na+-glucosa, éste se estableció firmemente en el campo de la fisiología de la
absorción. Así durante los 25 años siguientes prácticamente dominó el concepto que las
sustancias hidrosolubles debían incorporarse al organismo mediante proteínas
transportadoras adecuadas. Sin embargo, dos hechos que fueron y continúan siendo clave –
en los cuales existe consenso entre la mayoría de los investigadores- es que: (a) el
cotransportador Na+-glucosa se satura “in vivo” entre 30 y 50 mM y (b) que existen
numerosos estudios de que la tasa de absorción D- glucosa se incrementa en forma casi
lineal a partir de 50 mM hacia arriba (para revisión ver Kellett 2001). Estos dos hechos
permitieron proponer que debería existir otro/s mecanismo /s de absorción de la glucosa Dglucosa de tipo pasivo en adición al del cotransportador Na+-glucosa. Como se previó, se
han acumulado diversas evidencias acerca de este componente pasivo de la absorción de la
D-glucosa, que recibió un soporte mecanístico en 1987 cuando Pappenheimer y Reiss
proponen la teoría del arrastre por solvente a través de la vía paracelular como una
explicación para los fenómenos observados. De esta ma nera se generó una controversia
importante que ha dominado esta área de estudio en los últimos años, no acerca de si la vía
pasiva ocurre o no, sino más bien acerca de su magnitud, características y de sus posibles
implicancias tanto ecológicas como evolutivas.
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¿POR QUÉ EXISTE CONTROVERSIA ACERCA DE LA ABSORCIÓN PASIVA ,
Y POR QUÉ ESTA ES IM PORTANTE?
Los estudios con mamíferos y peces omnívoros han provisto de una amplia evidencia que los
transportadores intestinales de nutrientes son modulados de varias maneras: a veces irreversible y
específicamente durante el desarrollo, reversible y no específicamente cuando cambia el nivel de
ingesta, reversible y específicamente cuando varía la composición de la dieta (Buddington &
Diamond 1989, Ferraris & Diamond 1989, Karasov 1988, Karasov & Hume 1997). Diamond (1991)
plantea que estos cambios tendrían un significado fisiológico cuestionable si hubiese capacidades
absortivas de nutrientes en exceso o sobredimensionadas. Asimismo, este investigador junto a otros
colegas interpretan estos cambios diciendo que la capacidad de transporte de los transportadores
apicales de azúcares y aminoácidos están equilibrados con las demandas metabólicas (Diamond
1993, Caviedes-Vidal & Karasov 1996) más un cierto margen de seguridad (Diamond & Hammond
1992). Sin embargo, otros autores (Pappenheimer & Reiss 1987, Pappenheimer 1993) sugieren en
cambio, que la capacidad del intestino de los mamíferos de absorber glucosa vía cotransporte Na+glucosa es inadecuada para transportar la ingesta diaria de glucosa y que la absorción ocurre
principalmente mediante un mecanismo de arrastre de solvente a través de la uniones estrechas
intestinales y secundariamente a través de un transporte activo de azúcares y aminoácidos.
Pappenheimer (1993) además sugiere, que los cambios de tipo adaptativos o durante el desarrollo
que ocurren en el transporte activo debieran ser interpretados como parte del mecanismo de arrastre
por solvente.
LA
ABSORCIÓN
INTESTINAL
EN
AVES
Y
SUS
IMPLICANCIAS
ECOLÓGICAS.
Durante los últimos quince años ha habido un esfuerzo de parte de un grupo de
ecofisiólogos por estudiar la fisiología digestiva de aves y sus implicancias ecológicas. Uno
de los objetivos perseguidos fue el de clarificar de qué manera las características de los
procesos digestivos (e.g. morfología del tracto digestivo, digestión enzimática, absorción,
etc.) de estos animales están adecuados a sus dietas y, a distintos niveles de ingesta de
alimento en diferentes periodos de los ciclos anual y/o de vida (para revisión ver Karasov
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1996). Un hecho notable que surge de estas investigaciones lo constituye la ausencia de
cambios o modulación de las tasas de transporte activo de nutrientes en el intestino delgado
de las aves estudiadas, que cabía esperar sobre la base de lo planteado por Diamond en
1991. Este autor propuso que a través de la acción de la selección natural, la capacidad
absortiva del intestino delgado de los vertebrados está equilibrada con el nivel de ingesta de
alimento. Justificó esta especulación diciendo que, si no hubiese existiese equilibrio,
entonces una parte valiosa de energía de los alimentos podría ser desperdiciada en las
excretas cuando se alimentaran dietas con alto contenido de sustratos que no son
absorbidos. Además, los costos metabólicos de sintetizar y mantener la maquinaria
molecular para absorber sustratos sería también desperdiciada si se forrajearan dietas con
muy bajos niveles de sustratos. Entonces, de acuerdo con esta hipótesis de modulación
adaptativa, el transporte de los monosacáridos o aminoácidos debe estar positivamente
correlacionado con el nivel de los sustratos en la dieta (Diamond 1991).
A la fecha, se ha investigado en al menos cuatro especies de aves omnívoras (Levey &
Karasov 1992, Caviedes-Vidal & Karasov 1996, Afik et al. 1997, Karasov et al. 1996) su
capacidad para incrementar la absorción mediada intestinal de D- glucosa cuando se las
aclimata a dietas con alto contenido en carbohidratos y, la capacidad de absorción de
aminoácidos cuando se las aclimata a dietas hiperproteicas. Al igual que otros vertebrados,
los pájaros exhibieron transporte mediado de D- glucosa in vitro con una constante de
Michaelis aparente en el rango de 1 a 10 mM (Karasov & Hume 1997). Sin embargo, a
diferencia de los mamíferos y peces omnívoros que pueden doblar la tasa de absorción de
glucosa con dietas ricas en carbohidratos (Karasov 1992), los mirlos americanos (Turdus
migratorius; Levey & Karasov 1992), las reinitas coronadas (Dendroica coronata; Afik et
al. 1997), los gorriones (Passer domesticus) (Caviedes-Vidal & Karasov 1996) y las
codornices cotuí (Colinus virginianus; Karasov et al. 1996) mostraron muy pequeña o
ninguna modulación de la actividad de transporte de D- glucosa mediado (i.e. activo) in
vitro. Más aun, en todas estas especies las tasas de transporte activo de glucosa obtenidas in
vitro dieron valores mucho más bajos (30% o menos) que las tasas de absorción de Dglucosa estimadas a partir de medida de eficiencia de extracción en aves intactas. Estos
resultados llevaron a cuestionarse si el transporte activo era verdaderamente la vía primaria
para la absorción de azúcares en estas aves.
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Un supuesto implícito que subyace en la hipótesis de modulación adaptativa es que
la absorción mediada es la vía primaria de absorción de glucosa y por lo tanto su regulación
es el objeto de la selección natural. Por otro lado, Pappenheimer (1990) propuso – como se
menciona más arriba - que la absorción pasiva es relativamente más importante que le
transporte mediado. Como consecuencia entonces, en una serie de estudios (Karasov &
Cork 1994, Caviedes-Vidal & Karasov 1996, Karasov et al. 1996, Levey & Cipollini 1996,
Afik et al. 1997), se sometió a prueba la importancia de la absorción pasiva. En estos
experimentos se utilizó un método farmacocinético en pájaros que se alimentaban
libremente con el que se estimó la absorción de [3 H] L- glucosa, el estereoisómero de la Dglucosa que no interacciona con el cotransportador intestinal Na+-glucosa.
Sorprendentemente, se encontró una absorción prácticamente total de la L-glucosa ingerida
en todas las especies: (a) , tricogloso de pecho rojo (Trichoglossus haematodus, 80%;
Karasov & Cork 1994), nectarívoro, (b) gorriones (80%, Caviedes-Vidal & Karasov 1996),
granívoro, (c) reinita coronada (91%; Afik et al. 1997), frugívoro/insectívoro y (d) codorniz
cotiú (92%; Karasov et al. 1996, Levey & Cipollini 1996), herbívoro. La semejanza de
estos hallazgos en aves con diferentes dietas y asociaciones taxonómicas sugieren una
generalidad de este fenómeno en aves.
Ahora bien, la medición de la absorción de la L-glucosa y su utilización en
conclusiones acerca de la absorción pasiva de la D-glucosa descansa sobre varios
supuestos. Se asume que la absorción de la L-glucosa medida in vivo es solamente pasiva.
Varios estud ios indican que no existe un transportador para la L-glucosa porque su
absorción no es inhibida por si misma, es decir que la absorción de de L-glucosa marcada
no es influenciada por la presencia de grandes cantidades de L-glucosa no marcada, al
menos en mamíferos (Meddings & Westergaard 1989, Thomson et al. 1982). También es
parte de los supuestos la L- glucosa no se metaboliza y se excreta totalmente. En el estudio
con los tricoglosos de pecho rojo no se observó indicio alguno de metabolización (Karasov
& Cork 1994) y la L-glucosa marcada fue excretada totalmente. Además también se validó
utilizando cromatografía de capa fina, que el 95% del tritio recuperable en el plasma de
gorriones y reinitas coronadas estaba ligado a la molécula de L-glucosa, de lo que se
concluye que la L- glucosa detectada en plasma fue absorbida como tal.
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Estos hallazgos descritos son muy relevantes. Por un lado, ayudan a resolver el
aparente desencuentro que se observa entre las altas concentraciones de azúcar absorbida in
vivo y la baja capacidad de transporte mediada de D-glucosa medida in vitro. También
permiten explicar por qué el transporte activo de D- glucosa no es modulado en las especies
de aves estudiadas. Por otro lado, ha sido propuesto que debido a que los alimentos pueden
contener toxinas, podría haber una selección en contra de la absorción pasiva y a favor de la
especificidad de absorción vía proteínas transportadoras específicas en el ribete en cepillo
del intestino delgado (Diamond 1991).
El descubrimiento de una magnitud importante de absorción de L- glucosa en
aves generó, un nueva etapa en el estudio de la absorción de sustancias hidrosolubles en
este grupo taxonómico. Esta comprendió, un avance en las metodologías de estudio de
la función absortiva, una extensión de la investigación a otras moléculas hidrosolubles
absorbibles, la caracterización funcional y fisicoquímica y, la visualización de la vía
paracelular, que se describen a continuación.
NUEVO DISEÑO EXPERIMENTAL : Recientemente, (Chediack et al. 2001, 2003) se ha
desarrollado una metodología para el estudio de la absorción de azúcares en aves
intactas. En ésta, los compuestos se administran en forma de un pulso intragástrico e
inyectan en el músculo pectoral. Luego de la administración/inyección se colectan
muestras de sangre en forma secuencial y se analizan mediante cromatografía gaseosa
con detector de masas (Figura 1, para L- glucosa). La fracción absorbida (F) o
biodisponibilidad de los azúcares fueron calculadas mediante ecuaciones
farmacocinéticas clásicas (Gibaldi & Perrier 1982, Shargel & Yu 1999, Riviere 1999):
(1) F = AUCo ⋅ S ⋅ K e Do ó,
(2) F = [ AUCo Do ] [ AUCi Di ]
Donde, AUC: área bajo la curva de la concentración del compuesto en plasma en
función del tiempo transcurrido luego de la administración oral (o)/inyección (i); S:
espacio o volumen de distribución del compuesto; Ke : constante de eliminación del
compuesto del plasma después de la inyección; D: dosis administrada (o)/inyectada (i).
En estos estudios se observó que en promedio, un 69% de la dosis oral de los azúcares
(D- manitol y L-arabinosa) fue absorbida independientemente de la concentración
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administrada. Además estos estudios dan soporte a las observaciones previas de una
absorción pasiva sustancial de L- glucosa en gorriones, usando distintos marcadores y
distinto diseño experimental y de análisis (farmacocinética de dosis única).
EFECTO NUTRIENTE: La vía propuesta para esta absorción sustancial de solutos
hidrosolubles es paracelular, es decir que el transporte solutos es a través de las uniones
estrechas entre enterocitos adyacentes y no a través de estos. El mecanismo, como lo
propuso por primera vez Pappenheimer y Reiss en 1987, puede ser arrastre por solvente
a través de los espacios basolaterales, activado por cotransportadores Na+- nutriente
(Madara & Pappenheimer 1987, Pappenheimer 1987, Pappenheimer & Reiss 1987,
Turner & Madara 1995, Turner et al. 1997). Esta hipótesis predice que la absorción de
solutos hidrosolubles será máxima cuando ellos se encuentren presente en el lumen del
intestino delgado en acompañados por D- glucosa y/o aminoácidos. Chang y col. (2003)
estudiaron este problema realizando experimentos con gorriones utilizando una nuevo
método farmacocinética que desarrollaron para medir absorción (Chediack et al. 2001,
Chang 2003). En el experimento que se muestra en la figura 2, la fracción absorbida de
L- glucosa marcada fue significativamente mayor cuando se administraba a pájaros en
ayunas en solución con 200 mM D- glucosa y 80 mM cloruro de sodio comparada contra
un control en el que se reemplazó la D- glucosa por D- manitol (0,78 + 0,016 vs. 0,69 +
0,029 respectivamente; test t de Student, T9 = -2,67, P = 0,013 test de una cola).
Conjuntamente con la fracción absorbida, Chang y col. (2003) determinaron las tasas de
absorción aparentes con los valores obtenidos en el experimento anterior. La constante
de absorción, Ka, para L- glucosa determinada por el método de desglose de curva
(figura 2B) dio un valor 133% más alto en los gorriones a los que se les administró el
marcador en solución con D- glucosa comparado con los controles con D- manitol (0,22
+ 0,04 min-1 vs. 0,09 + 0,01 min-1 respectivamente; t-test de Student, T6 = -3,29, una
cola P = 0,009, figura 2B). Con este resultado es posible rechazar lo sugerido por
Schwartz et al. (1995) acerca de que la mayor fracción absorbida de L- glucosa en la
presencia de nutrientes luminares ocurre debido a que el proceso absortivo con una baja
constante de absorción (i.e. Ka sin nutrientes en el lumen) se extiende por un periodo de
tiempo mayor o porque el intestino incrementa su tamaño. En efecto, a los gorriones
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tratados con D- glucosa les tomó menor tiempo (no mayor) para incorporar el 99% de Lglucosa absorbida que a los tratados con D- manitol. Estos resultados pueden
interpretarse como consistentes con la hipótesis de arrastre por solvente, y revelan que
compuestos hidrosolubles de tamaño pequeño son absorbidos en mayor cantidad y más
rápido cuando hay nutrientes presentes en el intestino delgado. A este incremento de la
absorción por presencia de nutrientes en el lumen intestinal se lo denomina “efecto
nutriente”.
VISUALIZACIÓN DE LA VÍA PASIVA : Utilizando fluoresceína, un marcador de
tamaño pequeño (PM=376) e hidrosoluble (log P = -1,52; (96)), Chang 2002 sometió a
prueba la predicción acerca de que una importante cantidad de este marcador sería
absorbido a través de la vía paracelular. Con este propósito gorriones en ayuno fueron
administrados oralmente con 500 µl de una solución isotónica conteniendo 500 µg/ml
de flouresceinato de sodio, 100 mM de D- glucosa y 80 mM de cloruro de sodio. En un
primer grupo de experimentos, validó que la fluoresceína es absorbida, siendo su
biodisponibilidad de 35 ± 10% (n=6). Esta fracción absorbida es menor que para los
carbohidratos L-arabinosa o L- glucosa, probablemente por una serie de razones
incluyendo su PM mayor que los compuestos mencionados y su carga negativa (ver
próxima sección). En un segundo grupo de experimentos se estudió la distribución de
este marcador en el tejido intestinal de los gorriones mediante microscopía confocal
láser (detalles en la leyenda de la fig. 3). Con este técnica se puede determinarse si la
fluorescencia es apical – basolateral y/o intracelular, es decir si el marcador utiliza la
vía transcelular y/o paracelular (Hurni et al. 1993). Como puede observarse en la figura
3 la fluorescencia (i.e. la fluoresceína) fue detectada en el espacio basolateral y también
en los vasos sanguíneos de la vellosidad, pero no en el interior de los enterocitos. En
consecuencia, con esta evidencias se puede afirmar que la fluoresceína es absorbida a
través de la vía paracelular, aportando un sustento visual importante de la utilización de
esta vía.
EFECTO DEL TAMAÑO Y DE LA CARGA ELÉCTRICA EN ABSORCIÓN DE
SOLUTOS HIDROSOLUBLES: Chediack et al. 2003 estudiaron el efecto del tamaño
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molecular en la absorción pasiva de compuestos hidrosolubles a través del epitelio del
intestino delgado, administrando intraestomacal y simultáneamente azúcares que no son
transportados activamente con peso molecular (PM) creciente (L-arabinosa PM=150,1,
L-ramnosa PM=164,2, perseitol PM=212,2 y lactulosa PM=342,3), disueltos en una
solución 350 mosm/Kg, a gorriones. La concentración en plasma de los marcadores fue
medida en muestras de sangre seriales. Los carbohidratos fueron también inyectados en
el pectoral para estimar las constantes de eliminación de cada uno de los azúcares. La
fracción absorbida, calculada como se describió anteriormente, disminuyó con el
incremento del peso molecular de los marcadores (figura 4) en forma más rápida que los
coeficientes de difusión libre en agua de los azúcares, consistente con un fenómeno de
movimiento a través de poros efectivos en membranas (“tamices”) (Friedman 1987). La
absorción de todos los azúcares fue aumentada por la presencia intraluminal de Dglucosa o comida (“efecto nutriente”) si se compara contra control de manitol. Estos
hallazgos sugieren que la absorción paracelular a través del intestino delgado varía
inversamente con el tamaño del soluto y que la presencia de D- glucosa y nutrientes en
el lumen del intestino delgado incrementan la absorción. La vía paracelular ha sido
propuesta como catión selectiva (He et al. 1996; Madara et al. 1986; Pauletti et al.
1997). Chediack et al (2002) sometieron a prueba esto en gorriones usando péptidos
indigestibles (sintetizados utilizando D-aminoácidos) con peso molecular similar pero
positivamente (serina - lisina) o negativamente cargados (serina – ácido aspártico).
Usando la misma metodología descrita arriba, se encontró que la fracción absorbida del
péptido cargado negativamente fue alrededor de la mitad del cargado positivamente (18
+ 3 % vs. 30 + 3 % respectivamente, F1,7 = 16,3, P < 0,005).
¿Cuál es el significado funcional de estos experimentos? Recientemente, se ha sugerido
que los nutrientes intestinales reclutarían transportadores GLUT2 a la membrana apical
de los enterocitos, y que por lo tanto el componente difusivo sensible a los nutrientes
intraluminales observado sería en realidad transcelular y mediado (Kellet & Helliwell
2000). Sin embargo, esta hipótesis ignora la evidencias como las presentadas en las
figuras 2 y 3 de que la absorción de muchos tipos de solutos hidrosolubles (e.g.
carbohidratos, fluoresceína) es paracelular e incrementada por la presencia de nutrientes
en la luz del intestino.
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¿Cuál es el mensaje ecológico de estos experimentos? Los investigadores que son
escépticos acerca de la importancia de la vía paracelular han argumentado que una alta
permeabilidad intestinal que permita una absorción pasiva puede ser menos selectiva
que un sistema mediado por transportadores para absorber nutrientes. Por esta razón
podría dejar más expuesto al animal al permitir que toxinas provenientes del material
animal y vegetal que se encuentra en el lumen intestinal sean absorbidas (Diamond
1991). Los casos de estudio presentados más arriba demarcan los posibles límites de
esta vulnerabilidad, ya que definen la selectividad de la vía en contra de las grandes
moléculas y de los compuestos cargados negativamente. Además, los casos de estudio
presentados pueden también ayudar a mejorar la capacidad de predicción de la
biodisponibilidad de toxinas. Por último, es importante agregar que los vertebrados son
bastante vulnerables a toxinas lipofílicas y que concordantemente han desarrollado
numerosos procesos de detoxificación. Por todo lo expresado, la los argumentos
presentados arriba, no constituye una crítica de peso respecto del concepto de absorción
paracelular a la luz del conocimiento actual.
LA RELEVANCIA DE LA VÍA PARACELULAR EN LA ABSORCIÓN DE
NUTRIENTES: La importancia de la absorción paracelular es robustecida por su
contribución a la absorción de nutrientes. Pappenheimer sugirió que la mayor parte de
absorción de la D- glucosa ocurre por un mecanismo de arrastre por solvente a través de
las uniones estrechas del epitelio del intestino delgado (absorción paracelular) y en
menor medida por transporte activo transcelular. Bajo esta hipótesis se pueden predecir
tasas de absorción in vivo muy similares para los estereoisómeros de la glucosa. Chang
y Karasov (2001) sometieron a prueba estas predicciones, administrando oralmente e
inyectando a gorriones, una mezcla de marcadores (a) [3 H]3-O- metil- D-glucosa (un
análogo no metabolizable de la D- glucosa que se transporta activamente utilizando el
cotransportador Na+- glucosa) y (b) [14 C]L- glucosa (estereoisómero también no
metabolizable y que no interactúa con el cotransportador Na+- glucosa) en una solución
conteniendo 200 mM de 3-O- metil- D- glucosa no marcada. Los niveles de los
marcadores en la sangre se analizaron utilizando un modelo abierto de dos
compartimientos y con cinética de eliminación de primer orden. Los valores obtenidos
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de fracción absorbida (F) de D- y L- glucosa no fueron significativamente diferentes
(0,80 + 0,053 vs. 0,79 + 0,042; n = 6; T = 0,39, P = 0,72 respectivamente). Las tasas
aparentes de absorción de ambos azúcares - determinadas mediante el procedimiento de
Loo-Riegelman (Gibaldi & Perrier 1982, Shargel & Yu 1999, Riviere 1999) – tampoco
difirieron significativamente (P = 0,35) (Fig. 5A,B). Además, la absorción de ambos
compuestos ocurrió mayoritariamente (95%) durante los 40 min siguientes a la
administración oral de éstos. La similitud de la magnitud y tasas de absorción de la Dy L-glucosa encontradas en este trabajo constituyen un resultado provocativo que es
consistente con la hipótesis de Pappenheimer (1987) acerca de una vía paracelular
importante para la absorción de azúcar.
DIRECCIONES FUTURAS.
A la luz del avance en el conocimiento de la función absortiva en aves, se desprende una
pregunta obvia: cuán significativa es la absorción paracelular en otros animales? Así por
ejemplo, tal vez la absorción paracelular es una caracterís tica general de los vertebrados
que ha sido magnificada dentro de un grupo de animales (e.g. las aves que vuelan, que se
sabe que poseen intestinos delgados relativamente más pequeños que las que no lo hacen
(Karasov & Hume 1997) de manera de reforzar o suplementar otros tipos de absorción de
nutrientes (e.g. transporte activo de glucosa y aminoácidos).
Desde el punto de vista de los niveles de integración organísmico o por encima de
este, lo importante –como se ha mencionado anteriormente- no es si el arrastre por solvente
ocurre o no, sino su magnitud y significado biológico en animales normales que viven
libremente en sus ambientes. La respuesta tiene tremenda importancia para las
investigaciones futuras en la fisiología digestiva ecológica y evolutiva. Por ejemplo, una
pregunta extensiva a toda la biología es, cuán generalizado se encuentra el hecho de que las
capacidades fisiológicas y bioquímicas excedan las demandas naturales? Este problema fue
específicamente abordado por primera vez estudiando el diseño del sistema respiratorio en
relación a la demanda metabólica de oxígeno (Taylor & Weibel 1981). Más recientemente
ha sido extendido esta consideración a la absorción intestinal de nutrientes en relación a la
ingesta de éstos (Chediack et al. 2003). Los intentos por medir el equilibrio entre la
capacidad de absorción de nutrientes con la ingesta (i.e., medir la capacidad de reserva o
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margen de seguridad) pueden no ser satisfactorios si la absorción pasiva es importante pero
no se toma en cuenta.
Otro asunto a considerar –que también lo hemos mencionado anteriormente- lo
constituye el hecho de que la vía pasiva con una alta permeabilidad intestinal inespecífica
comparada con el sistema de transporte mediado podría permitirles a las toxinas de la
materia vegetal y animal en el lumen intestinal a ser fácilmente absorbidas (Chediack et al.
2001). Esta vulnerabilidad a las toxinas podría constituir una importante fuerza directriz
ecológica, limitando las conductas exploratorias y limitando la amplitud del nicho dietario.
Esto claramente constituye una línea para futuras investigaciones acerca de los costos
asociados con la detoxificación de toxinas naturales absorbidas (e.g., Day et al. 2000) y tal
vez la sensibilidad de animales de vida silvestre a las nuevas generaciones de herbicidas y
pesticidas hidrosolubles producidas por el hombre.
Aunque uno podría predecir una acción de la selección natural en contra de una
dependencia de la absorción pasiva, y a favor de una especificidad de absorción por una vía
que utilice proteínas específicas de transporte en el ribete en cepillo intestinal, las
evidencias se están acumulando en el sentido de que en algunos vertebrados ciertos solutos
hidrofílicos, de tamaño pequeño y mediano, atraviesan el intestino en cantidades
sustanciales por la ruta pasiva. Por ejemplo, en las ratas la creatinina y un octapéptido
hidrosoluble fue absorbido entre un 50 a 60% y luego excretado intacto en orina
(Pappenheimer 1990, Pappenheimer et al. 1994), y manitol, polietilenglicol (PEG) 4000
(Ma et al. 1993) e inulina (Ma et al. 1993) fueron absorbidos mayoritariamente por vía
paracelular. En aves sin restricción de alimentación comiendo dietas naturales, la mayoría
de la L- glucosa fue absorbida (Afik et al. 1997, Caviedes-Vidal & Karasov 1996, Karasov
& Cork 1994, Karasov et al. 1996). De estas observaciones para L-glucosa y otras
evidencias preliminares de absorción de dextrano 8000 Da (Caviedes-Vidal et al. 1998) en
otra especie de ave y la evidencia reciente de Gilardi (1996) de absorción de un alcaloide
hidrosoluble por un ave provee una buena evidencia de que una considerable cantidad de
absorción pasiva ocurre en aves y que posiblemente tenga importantes implicancias
ecológicas y evolutivas.
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Agradecimientos Este trabajo ha sido financiado por subsidios FONCYT 1-3101, CYTUNSL 9502, NSF IBN 9723793 & 0216709.
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Leyenda de figuras.
Figura 1. Absorción pasiva de solutos hidrosolubles estudiada con cinética de pulso único.
En la figura de arriba (1A), la L-glucosa aparece en el plasma luego de la administración
oral con manitol (triángulos) o D- glucosa (círculos: administración oral en presencia del
análogo de la D- glucosa no metabolizable, 3-O-metil- D-glucosa). La toma de muestras de
plasma se comienza durante la fase de incremento, dominada por la absorción.
La
concentración declina post-absortivamente a medida que el compuesto desaparece del
plasma debido a su excreción; la pendiente expresa la tasa de eliminación. Estos datos en
conjunto con información acerca del espacio o volumen de distribución (obtenido de
experimentos con inyección de L-glucosa) son usados para calcular la fracción absorbida,
que fue en este caso superior cuando se estimó en presencia de D-glucosa (“efecto
nutriente”).
La figura de abajo (1B) muestra la determinación de la tasa aparente de
absorción, Ka, a partir de los datos de la figura 1A mediante la técnica del desglose de
curva, un procedimiento estándar en farmacocinética) Los símbolos vacíos representan los
datos originales de la figura 1A, y los símbolos llenos constituyen los valores residuales
derivados del desglosamiento de la curva, utilizados para calcular Ka. La tasa de absorción
de L- glucosa fue aproximadamente el doble cuando se estimó en presencia de D-glucosa,
como se desprende de la mayor pendiente observada de los círculos llenos comparados con
los triángulos llenos.
Figura 2. Absorción de fluoresceína a través de la vía paracelular en el intestino de
gorriones. La micrografía muestra la distribución de la fluorescencia entre (no dentro)
de las células epiteliales en un corte de vellosidad intestinal. El intestino fue colectado
15
10 minutos después de que el gorrión fuese administrado oralmente con una solución
que contenía 500 µg/ml de fluoresceinato de sodio, 100 mM D- glucosa, y 80 mM de
cloruro de sodio. Trozos de tejido fueron extraídos, incluidos y se obtuvieron cortes de
20 ~ 25 µm, teñidos con Sudán Black y etanol al 70 % para eliminar autofluorescencia
(Clancy & Cauller 1998; Schnell, Staines, and Wessendorf, 1999). Los cortes se
observaron mediante microscopio láser confocal. Las imágenes obtenidas fueron
procesadas digitalmente para determinar de la distribución de la sonda en el intestino
del ave.
Figura. 3. La absorción de compuestos hidrosolubles depende del tamaño de la molécula y
se incrementa en la presencia de nutrientes. (PM: peso molecular en Daltons; L-arabinosa
PM 150,1, L-ramnosa PM 164,2, perseitol PM 212,2 y lactulosa PM 342,3).
Figura 4. En la figura superior 4A. se representa la actividad específica de L- glucosa y 3O-metil- D-glucosa radiomarcada en plasma como una función del tiempo transcurrido
luego de la administración oral de las dos sondas simultáneamente en un gorrión. Las áreas
bajo cada curva, normalizadas por la dosis administrada son utilizadas para calcular la
fracción de cada isótopo que fue absorbida. Observar la similitud de curso temporal de
ambas sondas, que sugiere tasas similares de absorción. La diferencia en altura de las
curvas se debe a diferencias en la dosis de compuestos radiomarcados administrados y no a
diferencias en las cantidades absorbidas de cada sonda (ver texto). En la figura inferior 4B
está graficada la media acumulada de seis gorriones de la fracción absorbida de L- glucosa
y de 3-O-metil-D-glucosa luego de la administración simultánea de las sondas (gráfica
interna superior). La figura mayor muestra las tasas aparentes de absorción de las dos
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sondas, obtenidas de las pendientes instantáneas de la gráfica interna superior. La similitud
en las tasas aparentes implica que la mayor parte de la 3-O-metil- D-glucosa es absorbida
por el mismo proceso pasivo que la L-glucosa. Estas figuras están confeccionadas con los
datos de la figura 4A tratados con el procedimiento farmacocinético de Loo-Riegelman (ver
texto).
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LITERATURA CITADA
AFIK D, BW DARKEN & WH KARASOV (1997) Is diet-shifting facilitated by modulation of
intestinal nutrient uptake? Test of an adaptational hypothesis in yellow-rumped
warblers. Physiological Zoology. 70: 213-221.
AFIK D, SR MCW ILLIAMS & WH KARASOV (1997) A test for passive absorption of glucose
in yellow-rumped warblers and its ecological significance. Physiological Zoology
70(3): 370-377.
ANDERSON JM (2001) Molecular structure of tight junctions and their role in epithelial
transport. News in Physiological Science 16: 126-130
BALLARD ST, JH HUNTER & AE TAYLOR (1995) Regulation of tight-junction permeability
during nutrient absorption across the intestinal epithelium. Annual Reviews in
Nutrition 15: 35–55.
BUDDINGTON RK & JM DIAMOND (1989) Ontogenetic development of intestinal nutrient
transporters. Annual Reviews in Physiology 51: 602-619.
CAVIEDES -VIDAL E, D AFIK, C MARTINEZ DEL RIO & WH KARASOV (2000) Dietary
modulation of intestinal enzymes of the house sparrow (Passer domesticus): testing
an adaptive hypothesis. Comparative Biochemistry and Physiology A 125: 11-24.
CAVIEDES -VIDAL E, JG CHEDIACK & E CAVIEDES CODELIA (1998). Preliminar data of
passive absorption of dextran 8.8 kDa in Saltator aurentiirostris. Biocell 22: 3
(abstract).
CAVIEDES -VIDAL E & WH KARASOV (1996) Glucose and amino acid absorption in house
sparrow intestine and its dietary modulation. American Journal of Physiology 271:
R561-R568.
CHANG MH (2002) The magnitude and significance of passive absorption in intact house
sparrows, Passer domesticus. Ph.D. Dissertation, University of Wisconsin, Madison.
CHANG MH, JG CHEDIACK, E CAVIEDES -VIDAL & WH KARASOV (2003) Enhanced passive
absorption in the presence of luminal nutrients in house sparrows (Passer
domesticus). (submitted BMC Physiology).
CHANG MH & WH KARASOV (2001) Similar extent and rate of absorption of D- and Lglucose in house sparrows, Passer domesticus. FASEB Journal 15(5), A830. Ref
Type: Abstract
18
CHEDIACK JG, E CAVIEDES -VIDAL & WH KARASOV (2002) Electroaffinity of the passive
intestinal absorption pathway of birds. Biocell (in press). Ref Type: Abstract
CHEDIACK JG, E CAVIEDES -VIDAL & WH KARASOV (2003) Intestinal passive absorption of
hydrosoluble compounds is size dependent and modulated by luminal nutrients in
house sparrows (Passer domesticus). Journal of Comparative Physiology B (In
press).
CHEDIACK JG, E CAVIEDES -VIDAL, WH KARASOV & M PESTCHANKER (2001) Passive
absorption of hydrophilic probes by house sparrows, Passer domesticus. Journal of
Experimental Biology 204: 723-731
CLANCY B, LJ CAULLER (1999) Widespread projections from subgriseal neurons (layer VII)
to layer I in adult rat cortex. Journal of Comparative Neurology 407:275-86.
CRANE RK, D MILLER & I BIHLER (1961) En: Membrane transport and metabolism.
Kleinzeller A & A Kotyk (eds): 439-449. Academic Press, New York.
DAY AJ, FJ CANADA , JC DIAZ, PA KROON, R M CLAUCHLAN, CB FAULDS, GW P LUMB, RA
MORGAN & G WILLIAMSON (2000) Dietary flavonoid and isoflavone glycosides are
hydrolysed by the lactase site of lactase phlorizin hydrolase. FEBS Letters 468:166170.
DIAMOND JM (1991) Evolutionary design of intestinal nutrient absorption: enough but not
too much. News in Physiological Science 6:92-96.
DIAMOND JM (1993) Evolutionary physiology. En: The logic of life: The challenge of
integrative physiology. Boyd CAR & D Noble (eds). Oxford University Press, New
York.
DIAMOND JM & K HAMMOND (1992) The matches, achieved by natural selection, between
biological capacities and their natural loads. Experientia 48: 551-557.
FERRARIS RP & JM DIAMOND (1989) Specific regulation of intestinal nutrient transporters
by their dietary substrates. Annual Reviews in Physiology 51: 125-141.
FRIEDMAN MH (1987) Principles and Models of Biological Transport. Berlin, SpringerVerlag. 1-260.
GIBALDI M & D P ERRIER (1982) Pharmacokinetics. New York, Marcel Dekker, Inc. 1-494.
19
GILARDI, JD (1996) Ecology of parrots in the Peruvian Amazon: habitat use, nutrition, and
geophagy. Ph.D. Dissertation. Davis: University of California.
HE YL, S MURBY, L GIFFORD, A COLLETT, G WARHURST, KT DOUGLAS, M ROWLAND & J
AYRTON (1996) Oral absorption of Doligopeptides in rats via the paracellular route.
Pharmaceutical Research 113(11):1673-1678.
HURNI MA, ARJ NOACH, MCM BLOM-ROOSEMALEN , A DE BOER, JF NAGELKERKE & DD
BREIMER (1993) Permeability enhancement in Caco-2 cell monolayers by sodium
salicylate and sodium taurodihydrofusid ate: assessment of effect-reversibility and
imaging of transepithelial transport routes by confocal laser scanning microscopy.
Journal of Pharmacology and Experimental Techniques 267:942-950.
KARASOV WH (1988) Nutrient transport across vertebrate intestine. En: Advances in
comparative and environmental physiology. Gilles R (ed.): 131-172,
Springer-Verlag. Berlin.
KARASOV WH (1992) Tests of the adaptive modulation hypothesis for dietary control of
intestinal nutrient transport. American Journal of Physiolo gy 263: R496-R502.
KARASOV WH (1996) Digestive plasticity in avian energetics and feeding ecology. En:
Avian Energetics and Nutritional Ecology. CAREY C (ed) New York, Chapman and
Hall. 61-84.
KARASOV WH, D AFIK & BW DARKEN (1996) Do northern bobwhite quail modulate
intestinal nutrient absorption in response to dietary change? A test of an adaptational
hypothesis. Comparative and Biochemical Physiology A 113:233-238.
KARASOV WH & SJ CORK (1994) Glucose absorption by a nectarivorous bird: the passive
pathway is paramount. American Journal of Physiology 267:G18-G26.
KARASOV WH & ID HUME (1997) Vertebrate gastrointestinal system. En: Handbook of
Comparative Physiology. DANTZLER W (ed) Bethesda. MD. American Physiological
Society. pp 409-480.
KELLET GL (2001) The facilitated component of intestinal glucose absorption. Journal of
Physiology 531: 585-595.
KELLETT G & PA HELLIWELL (2000) The diffusive component of intestinal glucose
absorption is mediated by the glucose- induced recruitment of GLUT2 to the brus hborder membrane. Biochemical Journal 350:155-162.
LEVEY DJ & ML CIPOLLINI (1996) Is most glucose absorbed passively in northern
bobwhite? Comparative and Biochemical Physiology A 113:225-231.
20
LEVEY DJ & WH KARASOV (1992) Digestive modulation in a seasonal frugivore, the
American robin (Turdus migratorius ). American Journal of Physiology 262:G711G718.
MA TY, D HOLLANDER, RA ERICKSON, H TRUONG, H N GUYEN & P KRUGLIAK (1995)
Mechanism of colonic permeation of inulin: Is rat colon more permeable than small
intestine? Gastroenterology 108: 12-20.
MA TY, D HOLLANDER, R RIGA , & D. BHALLA (1993) Autoradiographic determination of
permeation pathway of permeability probes across intestinal and tracheal epithelia.
Journal of Laboratory and Clinical Medicine 122: 590-600.
MADARA JL, D BARENBERG & S CARLSON (1986) Effects of cytochalasin D on occluding
junctions of intestinal absorptive cells: further evidence that the cytoskeleton may
influence paracellular permeability and junctional charge selectivity. Journal of Cell
Biology 102: 2125-2136.
MADARA JL & JR PAPPENHEIMER (1987) Structural basis for physiological regulation of
paracellular pathways in intestinal epithelia. Journal of Membrane Biology 100:149164.
MEDDINGS JB & H WESTERGAARD (1989) Intestinal glucose transport using perfused rat
jejunum in vivo: Model analysis and derivation of corrected kinetic constants.
Clinical Sciences 76: 403-414.
PAPPENHEIMER JR (1987) Physological regulation of transepithelial impedance in the
intestinal mucosa of rats and hamsters. Journal of Membrane Biology 100:137-148.
PAPPENHEIMER JR (1990) Paracellular intestinal absorption of glucose, creatinine, and
mannitol in normal animals: Relation to body size. American Journal of Physiology
259:G290-G299.
PAPPENHEIMER JR (1993) On the coupling of membrane digestion with intestinal absorption
of sugars and amino acids. American Journal of Physiology 265:G409-G417.
PAPPENHEIMER JR, CE DAHL, ML KARNOVSKY & JE MAGGIO (1994) Intestinal absorption
and excretion of octapeptides composed of D amino acids. Proceedings of the
National Academy of Sciences of the United States 91: 1942-1945.
PAPPENHEIMER JR & KZ REISS (1987) Contribution of solvent drag through intercellular
junctions to absorption of nutrients by the small intestine of the rat. Journal of
Membrane Biology 100:123-136.
21
PAULETTI GM, FW OKUMU & RT BORCHARDT (1997) Effect of size and charge on the
passive diffusion of peptides across Caco2 cell monolayers via the paracellular
pathway. Pharmaceutical Research (New York) 14:164-168.
RIVIERE JE (1999) Comparative Pharmacokinetics: Principles, Techniques, and
Applications. Iowa State University Press.
SCHWARTZ RM, JK FURNER & MD LEVITT (1995) Paracellular intestinal transport of sixcarbon sugars is negligible in the rat. Gastroenterology 109:1206-1213.
SCHNELL SA, WA STAINES & MW W ESSENDORF (1999) Reduction of lipofuscin- like
autofluorescence in fluorescently labeled tissue. Journal of Histochemistry and
Cytochemistry 47:719-30.
SHARGEL A & BC YU (1999) Applied Biopharmaceutics and Pharmacokinetics. McGrawHill/Appleton & Lange.
TAYLOR CR & ER W EIBEL (1981) Design of the mammalian respiratory system. I. Problem
and strategy. Respiration Physiology 44: 1-10.
THOMSON ABR, CA HOTKE & WM W EINSTEIN (1982). Comparison of kinetic constants of
hexose uptake in four animal species and man. Comparative Biochemistry &
Physiology 72A: 225-236.
TURNER JR & JL MADARA (1995) Physiological regulation of intestinal epithelial tight
junctions as a consequence of Na+-coupled nutrie nt transport. Gastroenterology
109:1391-1396.
TURNER JR, BK RILL, SL CARLSON, D CARNES, R K ERNER, RJ MRSNY & JL MADARA
(1997) Physiological regulation of epithelial tight junctions is associated with
myosin light-chain phosphorylation. American Journal of Physiology 273:C1378C1385.
22