Importancia del Antígeno D
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Importancia del Antígeno D Sujetos Rh Negativo productores de Anti-D: 80% de los receptores de grandes volúmenes de sangre D positivo 20% de los transfundidos con plaquetas provenientes de dadores D positivo 10% de las pacientes que han tenido hijos D positivo y ABO compatibles Variaciones Cuantitativas del Antígeno D Antígenos D Débil El término Du es amplio e impreciso Los G.R. eran aglutinados por un anti-D pero no por otro Incluía Ags. D débil y D parcial No existe un anticuerpo Anti-Du La identificación de Du depende de los reactivos y los métodos empleados Variaciones Cualitativas del Antígeno D Corresponden a Fenotipos D Parcial, con o sin variaciones cuantitativas asociadas Antígenos D Parcial Antígenos D Parcial Débil Eritrocito con Antígenos Ag. constituido por Epitopes Anticuerpos dirigidos hacia sus correspondientes Epitopes Eritrocito con Antígenos Ag. constituido por Epitopes Anticuerpos dirigidos hacia sus correspondientes Epitopes Eritrocito con Antígenos Ag. constituido por Epitopes Anticuerpos dirigidos hacia sus correspondientes Epitopes Eritrocito con Antígenos Ag. constituido por Epitopes Anticuerpos dirigidos hacia sus correspondientes Epitopes Eritrocito con Antígenos Ag. constituido por Epitopes Anticuerpos dirigidos hacia sus correspondientes Epitopes Differences between normal D, D-weak and partial-D phenotypes Antígeno D Normal Differences between normal D, D-weak and partial-D phenotypes Antígeno D Normal Epitope: Normal Cantidad de Ag: Normal Epitope Antígeno Differences between normal D, D-weak and partial-D phenotypes Antígeno D Normal Epitope: Normal Cantidad de Ag: Normal Epitope Antígeno Differences between normal D, D-weak and partial-D phenotypes Antígeno D Normal D Débil Epitope: Normal Normal Cantidad de Ag: Normal Reducido Epitope Antígeno Differences between normal D, D-weak and partial-D phenotypes Antígeno D Normal D Débil Variante D Epitope: Normal Normal Mutados Cantidad de Ag: Normal Reducida Normal o Reducida Epitope Antígeno Fenotipos D Parcial originados comúnmente por genes “híbridos” Exones de Gen D Exones de Gen D Exones de Gen CE Exones de Gen CE Exones de Gen CE Exón de Gen D Ausencia de epitopes asociados con una expresión normal de antígeno D D Parcial como resultado de la inserción de un exón D dentro de un gen CE Vistazo de Variantes D Tipos de D Parcial de la Categoría DVI Gen RHD DVIcE ccDVI.Ee = Tipo I Raro 600 Ag/GR Caucásicos Gen RHD DVICe BARC = Tipo II CcDVI.ee Más frecuente 2400 Ag/GR Caucásicos y Japoneses Gen RHD DVICe BARC = Tipo III CcDVIee Muy raro 12000 Ag/GR Caucásicos Serología para Ag. D • El estado D puede ser determinado empleando sueros Policlonales o Monoclonales. Ambos, no arrojan exactamente las mismas divisiones. • El uso de Monoclonales permitió apreciar la diversidad y complejidad de los epitopes D. Anticuerpos Policlonales Anticuerpos Policlonales G.R. Transfundidos con Ag. extraño (p.ej. D) Ag. extraño D Epitopes diferentes Las células plasmáticas producen anticuerpos heterogéneos Anticuerpos con Paratopes diferentes Anticuerpos Monoclonales Anticuerpos Policlonales Anticuerpos Monoclonales Anticuerpos con Paratopes diferentes Producción de siempre el mismo clon (mismo paratope) Produce una variedad de anticuerpos Ag. extraño D Epitopes diferentes Selección de un anticuerpo específico Tipos de Reactivos Anti-D Policlonal c/ Alta Concentración Proteica Policlonal c/ Modificación Química Monoclonal Mezcla Policlonal/Monoclonal Mezcla Monoclonal/Monoclonal PRESENTACIONES COMERCIALES DE SUEROS HEMOTIPIFICADORES Sistema RH Policlonal Humano Anti-D Monoclonal Humano Mezclas (Blends) IgG – IgM Polic –Monoc Monoc-Monoc Anti-C Anti-E Anti-c IgG IgG Qca. Modif IgM Salino Monoclonal IgM Anti-e Anti-CDE Anti-Cw IgG – IgM Sal. - Criterios y Alcances del Uso Reactivos que detectan DVI y D débil Ideales para la clasificación de: donantes recién nacidos de madre Rh Negativo Es importante tipificar todas las presentaciones de Ag. D que puedan causar inmunización en sujetos Rh Negativo Criterios y Alcances del Uso Reactivos que NO detectan DVI y D débil Ideal para la tipificación de pacientes: receptores transfusionales obstétricas Esta es la política transfusional segura, ya que serán transfundidos con sangre Rh Negativo aunque pertenezcan a una clasificación de D muy débil. Anti-D Monoclonales según procedencia comercial Líneas celulares IgM IgG BS226 BS221 BS232 H4111B7 BAC-9 P3x 61 HM 10 P3x 21223 B10 P3x 212 11F1 HM16 P3x 290 P3x 35 P3x 241 P3x 249 P3x 290 TH-28 175-2 MS-201 Rs-1126 Marcas Comerciales (*) Biotest Biotest Biotest Biotest CNTS Diagast, Grifols Diagast Diagast, Grifols Diagast Diagast Diagast, Grifols Diagast, Grifols Diagast Diagast Diagast DiaMed, Immucor DiaMed, Immucor DiaMed, Immucor, Lorne DiaMed, Lorne Líneas celulares IgM IgG LDG169 LDG59 LDG70 LDG76 LDG77 LDMI MS-26 LHM50/3 (LDM1) LHM59/19 LHM 59/20 (LDM3) ESD1 ESD-1M HUMAN GAMA401 NELP-3 F8D8 Na TH 28-3 C 11 LORI MAD2 Marcas Comerciales (*) DiaMed DiaMed DiaMed DiaMed DiaMed DiaMed DiaMed, Immucor, Lorne DiaMed DiaMed DiaMed DiaMed DiaMed Gamma, Immucor, Ortho Gamma Gamma, Immucor Gamma Jacques Boy Jacques Boy Ortho ANTES AHORA Diferentes proveedores = Sin alternativa en la capacidad de elección Los diferentes productores de Clones ofrecen una variada gama o rango de especificidades hacia distintos epitopes ANTES AHORA Diferentes proveedores = Sin alternativa en la capacidad de elección Los diferentes productores de Clones ofrecen una variada gama o rango de especificidades hacia distintos epitopes Caracterización del tipo de D Parcial mediante Test en Gel Principle of gel technique Técnica en Gel Aglutinación Tarjeta de Gel para determinación de grupos sanguíneos Microtubo Caracterización del tipo de D Parcial mediante Test en Gel FORMAS DE ESTUDIAR LOS GRUPOS SANGUÍNEOS AGLUTINACIÓN RIA HEMÓLISIS ELISA INHIBICIÓN ABSORCIÓN Y ELUCIÓN PRECIPITACIÓN AGLUTINACIÓN y HEMÓLISIS. PRIMERA ETAPA Está influenciada por las siguientes variables: Temperatura: IgM reaccionan a 4ºC, IgG a37ºC Afinidad entre Ag y Ac PH optimo :6.5 y 7.6 Concentraciòn relativa del Ag y Ac.puede ocurrir disminuciòn de la aglutinaciòn cuando hay exceso de Ac(prozona) o exceso de Ag (postzona) Fuerza iónica del medio : al disminuir ,disminuye la nube de cationes que rodea lo GR favoreciendo la uniòn Ag- Ac Medios de potenciaciòn: *Soluciones de baja fuerza iònica :LISS: reduce la neutralizaciòn de cargas opuestas aumentando la velocidad de reacciòn y tambien la cantidad de Ac unido al hematíe. Tiempo de incubación: Las diferentes reacciones Ag-Ac alcanzan el equilibrio en tiempos diferentes. SEGUNDA ETAPA Potencial Z Densidad del Ag Clase de Ig involucrada Para potenciar las reacciones de aglutinaciòn se emplean diversos métodos: centrifugación controlada, adición de medios macromoleculares, de Enzimas proteolìticas y el uso del test de Coombs permite detectar la sesibilizaciòn de los GR por IgG que generalmente no producen aglutinaciòn ETAPAS DE LA AGLUTINACIÒN La aglutinación se produce en dos etapas: La primera es la unión Ag-Ac La segunda la formación de puentes intercelulares que producen el fenómeno visible de la aglutinación. Potencial Z Enzimas proteolíticas que eliminan las cargas (-) de la superfície celular Papaína Bromelina Tripsina Eliminan el Acido Sálico Otras sustancias: ● Albúmina bovina ● Dextrán GR con menos cargas negativas en su superficie, lo que permite que se aproximen lo suficiente para que se establezcan los puentes de unión por moléculas de IgG. Soluciòn salina de baja fuerza iónica :LISS Permite aumentar hasta 1000 veces la afinidad entre Ag y Ac. Aumenta la sensibilidad de la prueba de Coombs. Permite detectar Ac en baja concentración y de baja afinidad Permite reducir el Tiempo de incubaciòn de la Coombs de 30´ a 10´ Por esta razòn el TCI en LlSS es la prueba de elecciòn para la detecciòn e identificaciòn de Ac de tipo IgG Se la utiliza : Prueba de compatibilidad pretransfusional y detección de Ac irregulares en donantes y receptores, detección de Ac irregulares en embarazadas y tipificación de Ag eritrocitarios. PRUEBA ANTIGLOBULINICA ( Coombs) Detecta Acs de tipo IgG o fracciones del C`adheridos a los GR. Existen dos técnicas: a) Directa: Detecta Acs adheridos a los GR “in vivo”. b) Indirecta: Determina Acs existentes en el suero o plasma del paciente, previa incubación del suero con GR apropiados. DIRECTA: TCD ● Diagnostico de AH y EHRN. ● Investigación de reacciones dudosas en una transfusión. ● Investigación de enfermedades autoinmunes. INDIRECTA: TCI ● Screening de sueros de donantes y pacientes para Acs. ● Pruebas de compatibilidad previas a la transfusión. ●Identificación y titulación de Acs encontrados en sueros. LAVADO INADECUADO DE ERITROCITOS MALA INTERPRETACIÓN DE PRUEBAS DÉBILMENTE (+) PÉRDIDA DE ACTIVIDAD DE LOS REACTIVOS CENTRIFUGACIÓN INADECUADA. FALSOS POSITIVOS TUBOS DE VIDRIO MAL LAVADOS SOBRECENTRIFUGACIÓN QUE LOS ERITOCITOS AGLUTINEN ANTES DEL AGREGADO DEL SUERO DE COOMBS DETECCIÓN DE ACS IRREGULARES MUESTRA • SUERO FRESCO REACTIVO • PANEL SELECTOR TECNICA • LECTURA EN MEDIO SALINO Y TCI TITULACIÓN • SUERO PACIENTE MUESTRA • HEMATIES QUE EXPRESEN EL AG CORRESPONDIENTE AL AC • A TITULAR EN SUSP ENTRE 3—5 % REACTIVO • S F • VER CUADRO TECNICA TUBO SF 1 - 2 10 µL 3 10 µL 4 10 µL 5 10 µL 6 10 µL 7 10 µL 8 10 µL 9 10 µL 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL SUEROS 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL DEL TUBO 2 SE TOMA 100 µL Y SE LO PASA A LOS DEMAS EN FORMA SUCECIVA RESERVAR 100 µL DEL TUBO 10 100 µL 100 µL GR DILUCION 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL 1 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 EL TÍTULO ES LA INVERSA DE LA MAYOR DILUCIÓN DE SUERO QUE PRODUCE AGLUTINACIÓN VISIBLE E H F N Conjunto de manifestaciones patológicas causadas por aloimunización materna a Ag celulares presentes en el feto heredados del padre que producen una respuesta inmune (Ac) en la madre Causas de inmunización Embarazo (parto 0,25 ml hasta 25 ml - 3er trimestre?) Transfusión Inyecciones de sangre (intramuscular) Puede afectar 1er emb Transplantes Drogadicción CLASIFICACIÓN Según la especificidad del Ac EHFN: por acs contra ags del sistema RH ( más severa ) Madres RH ( neg) sensibilizadas con anti-D EHFN: por acs contra ags del sistema ABO ( menos severa ) Madres de grupo “ 0 “ EHFN : por acs contra ags de otros sistemas ENFERMEDED HEMOLÍTICA DEL RECIÉN NACIDO (EHRN) * Ictericia Signos Causas + común ( Incompatibilidad sanguínea materno-fetal) * Anemia * Esplenomegalia * Hepatomegalia ESTUDIOS EN LA MUJER EMBARAZADA •Acs irregulares : título e identificación 16 / 18 sem Si es ( - ) repetir 28 / 32 sem Si es ( + ) repetir 20 / 22 sem ó c/ 15 dias si aumenta Estudios de LA ( mujeres con título > 16 + historia obstetrica * Genotipificación R H D fetal * Feto – Ultrasonido -----EC ( hígado- bazo ) _ Muestra sangre fetal ( 18 sem ) PRUEBAS DE CONFIRMACIÓN *A la madre : Tipificación ABO Y RH ( VARIANTES DU ) Panel selector ( aloanticuerpos maternos ) * En el niño : Tipificación A B O y R H PCD H b , Hto cordón , BRR I de cordón Reticulocitos Determinación prenatal del genotipo RHD Protocolo de estudio Estudios inmunohematológicos en sangre materna: RhD y Anticuerpos Irregulares. Extracción de ADN de sangre periférica materna y 4.TRANSFUSION.ppt líquido amniótico. Genotipificación RHD en ADN fetal. Determinación del origen fetal del ADN obtenido del líquido amniótico. Determinación de la cigosidad RHD paterna. E H F N ----A B O Caso más frecuente Madre “ O “ Y feto “ A “ Frecuentemente sin significado clínico Se puede presentar en el primer embarazo ESTUDIOS A REALIZAR Prenatal (embarazadas): Podría investigarse en embarazada de grupo O y esposo A/B los Ac anti-A/B de clase IgG (2-ME) pero solamente 1 de 3000 incompatibilidades ABO potenciales necesita exanguinotransfusión. Imposibilidad e inutilidad de un despitaje prenatal Posnatal Recién nacido: Grupo ABO y RhD TCD, TCD potenciado Medios macromoleculares Elución e identificación del Ac Madre Estudio de Ac anti-A y/o anti-B de origen inmune y titulación. ESTUDIOS A REALIZAR PRENATAL : ( embarazada ) madre “ O “ – esposo A / B Determinar título de Ig G _ POS NATAL : recien nacido grupo A B O y R H P C D ( +, - débil ) HALLAZGOS HEMATOLÓGICOS EN EL RECIEN NACIDO * Aumento de reticulocitos . 10- 30 % evidencia de proceso hemolítico compensado * Eritroblastos en sangre periférica 8---15 % * Microesferocitos 80 %
